BR112013024757B1

BR112013024757B1 - processo para produzir uma composição glicosil stevia altamente purificada

Info

Publication number: BR112013024757B1
Application number: BR112013024757-6A
Authority: BR
Inventors: Markosyan Avetik
Original assignee: Purecircle Usa Inc
Priority date: 2011-03-29
Filing date: 2011-04-25
Publication date: 2019-11-12
Also published as: BR112013024757A2; EP3123873B1; ES2604491T3; EP2690972A4; EP3653064A1; ES2784791T3; EP2690972B1; MX351897B; EP2690972A1; WO2012134502A1; PL3123873T3; PL2690972T3; EP3123873A1; MX2013011076A

Abstract

composição de glucosil stévia composições de glicosil stevia são preparadas a partir de glicosídeos steviol de stevia rebaudiana bertoni. a glicosilação foi realizada por ciclodextrina glucanotransferase usando o amido como fonte de resíduos de glicose. as composições de glicosil stevia de cadeia curta foram purificadas a >95% de glicosídeos steviol totais. as composições podem ser usadas como melhoradores de doçura, melhoradores de sabor e adoçantes em alimentos, bebidas, cosméticos e produtos farmacêuticos.

Description

[001]Este pedido é um pedido de continuação em parte de e reivindica o benefício da prioridade de pedido de patente U.S. No. Serial 13/029.263, depositado em 17 de fevereiro de 2011.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Campo da invenção [002]A invenção refere-se a um processo para produzir um ingrediente alimentar altamente purificado a partir do extrato da planta Stevia rebaudiana Bertoni e seu uso em vários produtos alimentares e bebidas.

Descrição da técnica relacionada [003]Nos dias de hoje, alternativas ao açúcar estão recebendo crescente atenção devido à consciência de muitas doenças em conjunto com consumo de alimentos e bebidas com alto conteúdo em açúcar. No entanto, muitos adoçantes artificias como dulcina, ciclamato de sódio e sacarina foram banidos ou restritos em alguns países devido à questões em suas seguranças. Portanto, adoçantes não calóricos de origem natural estão se tornando cada vez mais populares. A erva doce Stevia rebaudiana Bertoni, produz um número de glicosídeos diterpênicos que caracterizam alta doçura e propriedades sensoriais superioras em relação a outros adoçantes de potência alta.

[004]Os glicosídeos doces acima mencionados têm uma aglicona comum, esteviol, e diferem pelo número e tipo de resíduos de carboidrato nas posições C13 e C19. As folhas da Stevia são capazes de acumular até 10-20% (em uma base seca) de esteviol glicosídeos. Os principais glicosídeos encontrados nas folhas de Stevia são Rebaudiosídeo A (2-10%), Esteviosídeo (2-10%), e Rebaudiosídeo C (1-2%). Outros glicosídeos como Rebaudiosídeo B, D, E, e F, Esteviolbiosídeo e Rubusosídeo são encontrados em níveis muito menores (aproximadamente0-0,2%).

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2/24 [005]Dois glicosídeos principais, Esteviosídeo e Rebaudiosídeo A foram extensivamente estudados e caracterizados em termos de suas adequabilidades como adoçantes comerciais de alta intensidade.

[006]Estudos de estabilidade em bebidas gasosas confirmaram sua estabilidade ao calor e pH (Chang S.S., Cook, J.M. (1983) Stability studies of stevioside and Rebaudioside A in carbonated beverages. J. Agric. Food Chem. 31 : 409-412.) [007]Esteviol glicosídeos diferem de cada outro não somente por estrutura molecular, mas também por suas propriedades de sabor. Geralmente esteviosídeo demonstra ser 110-270 vezes mais doce do que a sacarose, Rebaudiosídeo A entre 150 e 320 vezes, e Rebaudiosídeo C entre 40-60 vezes mais doce do que a sacarose. Dulcosídeo A é 30 vezes mais doce do que a sacarose. Rebaudiosídeo A tem o sabor menor adstringente, menos amargo, e o gosto posterior menos persistente, assim, possuindo os atributos sensoriais mais favoráveis nos principais esteviol glicosídeos (Tanaka O. (1987) Improvement of taste of natural sweetners. Pure Appl. Chem. 69:675-683; Phillips K.C. (1989) Stevia: steps in developing a new sweetener. In: Grenby T.H. ed. Developments in sweeteners, vol. 3. Elsevier Applied Science, London. 1-43.) [008]Métodos para a extração e purificação de glicosídeos doces da planta Stevia rebaudiana usando água ou solventes orgânicos são descritos em, por exemplo, Números de patente U.S. 4.361.697; 4.082.858; 4.892.938; 5.972. 120; 5.962.678; 7.838.044 e 7.862.845.

[009]No entanto, mesmo em um estado altamente purificado, esteviol glicosídeos ainda possui atributos de sabor indesejáveis como amargor, gosto posterior doce, sabor de licor, etc. Um dos principais obstáculos para a comercialização bem sucedida de adoçantes de stevia são estes atributos de sabor indesejáveis. Foi demonstrado que estas notas de sabor se tornam mais proeminentes conforme a concentração de esteviol glicosídeos aumenta (Prakash I., DuBois G.E., Clos J.F.,

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Wilkens K.L., Fosdick L.E. (2008) Development of rebiana, a natural, non-caloric sweetener. Food Chem. Toxicol., 46, S75-S82.) [010]Algumas destas propriedades indesejáveis podem ser reduzidas ou eliminadas submetendo esteviol glicosídeos à reação de transglicosilação intermolecular, quando novos resíduos de carboidratos são ligados à molécula inicial nas posições C13 e C19. Dependendo do número de resíduos de carboidratos nestas posições a qualidade e potência do sabor dos compostos irá variar.

[011]Pululanase, isomaltase (Lobov S.V., Jasai R., Ohtani K., Tanaka O. Yamasaki K. (1991) Enzymatic production of sweet estevioside derivatives: transglycosylation by glucosidases. Agric. Biol. Chem. 55: 2959-2965), β-galactosidase (Kitahata S., Ishikawa S., Miyata T., Tanaka O. (1989) Production of rubusosídeo derivatives by transglycosylation of various β-galactosidase. Agric. Biol. Chem. 53: 29232928), e dextrano sacarase (Yamamoto K., Yoshikawa K., Okada S. (1994) Effective production of glicosil-stevioside by a-1,6-transglicosilation of dextran dextranase. Biosci. Biotech. Biochem. 58: 1657-1661) foram usados como enzimas de transglicosilação, junto com pululano, maltose, lactose, e amidos parcialmente hidrolisados, respectivamente, como doadores de resíduos glicosídicos.

[012]A transglicosilação de esteviol glicosídeos foi ainda realizada por ação de ciclodextrina glucanotransferases (CGTase) produzidas por Bacillus stearothermophilus (números de patentes U.S. 4.219.571, e 7.807.206) como um resultado derivados a-1,4-glicosil foram formados com grau de polimerização até 10.

[013]Foi demonstrado que o perfil de sabor e poder adoçante de derivados glicosil são amplamente dependentes do número de derivados adicionais de glicosil, ou seja, o grau de polimerização de cadeia a-l,4-glicosil. O aumento no número de resíduos de a-l,4-glicosil melhorou a qualidade de sabor, mas ao mesmo tempo, reduziu o nível de adoçante. O tratamento de esteviosídeo transglicosilado com β-amilase resultou em um produto que consiste de derivados mono ou di-a-l,4-glicosil com

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4/24 melhor perfil de sabor e nível adoçante ideal (Tanaka, 1987). No entanto, em ditos processos, o produto resultante contém um alto nível de glicosídeos não reagidos (não modificados) (geralmente >20%) que o torna não conforme com os requisitos regulatórios de menos do que 15% de glicosídeos não reagidos (α-Glucosyltransferase Treated Stevia, Japan's Specifications and Standards for Food Additives, VIII edition, 2009, p. 257). Portanto, etapas adicionais para separação cromatográfica de esteviol glicosídeos não reagidos são usadas para reduzir o teor de glicosídeos iniciais não reagidos (não modificados). No entanto, técnicas de separação cromatográfica geralmente envolvem alto custo e não são apropriadas para produção em grande escala.

[014]Deve ser notado ainda que muitos produtos de glicosil stevia contêm até 20% de dextrinas residuais que não possuem propriedades funcionais significativas e reduzem o teor de esteviol glicosídeos no produto.

[015]Portanto, é necessário desenvolver um processo simples de preparação de produtos de glicosil stevia de alta pureza com comprimento de cadeia ideal a-l,4glicosil e nível baixo de glicosídeos não reagidos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [016]A presente invenção é objetivada para superar as desvantagens de adoçantes Stevie existentes. A invenção descreve um processo para produzir um ingrediente alimentar de alta pureza a partir do extrato da planta Stevia rebaudiana Bertoni e uso do mesmo em vários produtos alimentares e bebidas como um adoçante e modificador de sabor.

[017]A invenção, em parte, pertence a um ingrediente compreendendo derivados glicosilados de esteviol glicosídeos da planta Stevia rebaudiana Bertoni. Os glicosídeos steviol são selecionados do grupo que consiste em steviosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, steviolbiosídeo, rubusosídeo, bem como outros esteviol glicosídeos encontrados na planta Stevia rebaudiana Bertoni e misturas dos

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5/24 mesmos.

[018]A invenção, em parte, pertence a um processo para produzir um ingrediente contendo formas glicosiladas de esteviosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, steviolbiosídeo, rubusosídeo, bem como outros esteviol glicosídeos encontrados na planta Stevia rebaudiana Bertoni. O processo pode ser um processo de transglicosilação enzimática usando CGTases produzidas por culturas de Bacillus stearothermophilus. O processo pode incluir a etapa de reduzir cadeias glicosil por β-amilase. O processo pode ainda ter as etapas de descolorir, dessalgar e remover maltooligosacarídeos e esteviol glicosídeos não modificados (não reagidos). A descoloração pode ser realizada usando carbono ativado. A dessalga pode ser realizada passando por resinas de troca iônica e/ou filtros de membrana. A remoção dos maltooligosacarídeos pode ser realizada ao passar por resina polimérica macroporosa. A remoção de esteviol glicosídeos não modificados (não reagidos) pode ser realizada por suspensão do produto em álcool aquoso.

[019]Na invenção, o extrato de Stevia comercializado por PureCircle (JiangXi) Co., Ltd. (China), contendo esteviosídeo (28-30%), Rebaudiosídeo A (50-55%), Rebaudiosídeo C (9-12%), Rebaudiosídeo F (1 -3%) e outros glicosídeos correspondendo a um teor total de esteviol glicosídeos de pelo menos 95%, foi usado como um material de partida. Alternativamente, extratos de stevia com diferentes proporções de esteviol glicosídeos bem como esteviol glicosídeos altamente purificados como Rebaudiosídeo A, esteviosídeo, Rebaudiosídeo D, rubusosídeo etc, podem ser usados como materiais de partida.

[020]O material de partida foi submetido à transglicosilação enzimática por ação de ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) na presença de amido como doador de glicose. Como um resultado derivados de a-l,4-glicosil foram formados com um grau de polimerização até 10. Então, os derivados formados foram submetidos a

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6/24 tratamento com β-amilase para produzir um derivado α-1,4-glicosil que possui um grau de polimerização até 2.

[021]Os oligossacarídeos da mistura de reação obtida foram removidos por resina Amberlite XAD7 HP, e então descoloridos, deionizados, concentrados e liofilizados.

[022]Os esteviol glicosídeos não reagidos foram subsequentemente removidos por suspensão do produto seco em solvente orgânico e separando os sólidos suspensos contendo nível reduzido de esteviol glicosídeos não reagidos.

[023]Os produtos obtidos foram aplicados em vários alimentos e bebidas como adoçantes, melhoradores de adoçante, e modificadores de sabor, incluindo sorvetes, biscoitos, pães, sucos de fruta, laticínios, produtos assados e produtos de confeitaria.

[024]Deve ser entendido que ambas a descrição geral acima e a descrição detalhada a seguir são exemplares e explanatórias e pretendem fornecer outra explanação da invenção como reivindicada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [025]Os desenhos que acompanham são incluídos para fornecer melhor entendimento da invenção. Os desenhos ilustram modalidades da invenção e juntos com a descrição servem para explicar os princípios das modalidades da invenção.

[026]A FIG. 1 mostra um cromatograma de cromatografia líquida de alto desempenho de extrato purificado de Stevia transglicosilada sem tratamento com β-amilase contendo derivados a-l,4-glicosil de cadeia longa com até nove resíduos de a-l,4glicosil;

[027]A FIG. 2 mostra um gráfico de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) de produto tratado com β-amilase contendo derivados mono e di-a-l,4-glicosil de esteviol glicosídeos, bem como alto nível de glicosídeo steviol não reagido;

[028]A FIG. 3 mostra um gráfico de cromatografia líquida de alto desempenho

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7/24 (HPLC) de produto tratado com β-amilase contendo derivados mono e di-a-l,4-glicosil de esteviol glicosídeos, bem como nível baixo de esteviol glicosídeos não reagidos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [029]Vantagens da presente invenção ficarão mais aparentes a partir da descrição detalhada apresentada a seguir. No entanto, deve ser entendido que a descrição detalhada e exemplos específicos, enquanto indicando modalidades preferenciais da invenção, são demonstradas por meio de ilustração somente, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção ficarão aparentes aos especialistas na técnica a partir desta descrição detalhada.

[030]Extrato de stevia comercializado por PureCircle (JiangXi) Co., Ltd. (China), contendo esteviosídeo (28-30%), Rebaudiosídeo A (50-55%), Rebaudiosídeo C (9-12%), Rebaudiosídeo F (1-3%) e outros glicosídeos (doravante coletivamente, “esteviol glicosídeos”) quantificando a um total de teor de esteviol glicosídeos de pelo menos 95%, foi usado como um material de partida. Alternativamente extratos de stevia com diferente proporção de esteviol glicosídeos bem como esteviol glicosídeos altamente purificados como Rebaudiosídeo A, esteviosídeo, Rebaudiosídeo D, rubusosídeo etc, podem ser usado como materiais de partida.

[031]A análise de HPLC das matérias-primas e produtos foi realizada em cromatografia líquida Agilent Technologies 1200 Series (USA), equipada com coluna Zorbax-NH2 (4,6X250mm). A fase móvel foi acetonitrila-água gradiente de 80:20, v/v (02 min) a 50:50, v/v (2-70 min). Um detector de arranjo de diodo ajustado a 210 nm foi usado como o detector.

[032]A transglicosilação foi obtida por ciclomaltodextrina glucanotransferases (CGTases; EC 2.4.1.19) produzida por Bacillus stearothermophilus St-100 (PureCircle Sdn Bhd Collection of Industrial Microorganisms - Malásia). No entanto, qualquer outra CGTase ou enzima que possui atividade de transglicosilação intermolecular pode ser aplicada como tal. A enzima pode estar na forma de um caldo de cultura livre de

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8/24 células, caldo de cultura livre de células líquido concentrado, caldo de cultura livre de célula liofilizado, ou proteína de alta pureza. Preparações de enzimas livres e imobilizadas podem ser usadas.

[033]A atividade de preparações de CGTase foi determinada de acordo com o procedimento descrito em Hale W.S., Rawlins L.C. (1951) Amilase of Bacillus macerans. Cereal Chem. 28, 49-58.

[034]Amidos de origens diferentes podem ser usados como doadores de unidades glicosil como, derivados de trigo, milho, batata, tapioca, e sagu.

[035]O amido foi submetido a hidrólise parcial (liquefação) antes da reação de transglicosilação. O equivalente em dextrose de amido parcialmente hidrolisado pode estar na faixa de cerca de 10-25, preferencialmente cerca de12-16. Qualquer enzima capaz de hid rolisar amido pode ser usada para liquefação, como α-amilases, β-amilases etc. Em uma modalidade, misturas de CGTase e α-amilase como enzimas de liquefação são preferenciais.

[036]A atividade e de α-amilase é expressão em Unidades de α-amilase Kilo Novo (KNU). Uma KNU é a quantidade de α-amilase que, em condições padrões (pH 7,1; 37°C), dextriniza 5,26 g de substância de amido seco por hora.

[037]A mistura de liquefação contém cerca de 0,001-0,2 KNU, preferencialmente cerca de 0,05-0,1 KNU de α-amilase por uma unidade de CGTase.

[038]O uso de α-amilase em liquefação permite obter rendimentos maiores do em outra filtração de carbono ativado. Quando a CGTase é usado como a única enzima de liquefação a taxa de filtração é aproximadamente 10-15 L/hr por 1 m² de superfície de filtro. Em caso de mistura de enzima de liquefação (compreendendo αamilase e CGTase) a taxa de filtração é duas vezes mais rápida - aproximadamente 20-30 L/hr por 1 m² de superfície de filtro.

[039]A proporção de amido e CGTase na mistura de liquefação é cerca de 0,1-0,5 unidades por um grama de amido, preferencialmente cerca de 0,2-0,4

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9/24 unidades por grama.

[040]A concentração de amido na mistura de liquefação é cerca de 15-40% (p/p), preferencialmente cerca de 20-30%.

[041]A liquefação é conduzida em cerca de 70-90°C durante cerca de 0,5-5 horas, preferencialmente cerca de 1-2 horas.

[042]Após a liquefação, a mistura de reação é submetida a inativação térmica de α-amilase em condições de pH baixo. A faixa de pH preferencial para inativação é cerca de pH 2,5 a pH 3,0 e a temperatura preferencial é cerca de 95-105°C. A duração da inativação térmica é cerca de 5-10 minutos.

[043]Após a inativação, o pH da mistura de reação é ajustado a cerca de pH 5,5-6,5 e os esteviol glicosídeos são adicionados à mistura e dissolvidos. A proporção preferencial de esteviol glicosídeos ao amido (kg de esteviol glicosídeos por 1 kg de amido) é cerca de 0,5-1,5, preferencialmente cerca de 0,8-1,2.

[044]Uma segunda parte da preparação de CGTase é adicionada e a reação de transglicosilação é conduzida em cerca de 65°C por cerca de 24-48 horas. A quantidade da segunda parte de CGTase é cerca de 0,2-4 unidades de CGTase por grama de sólidos, preferencialmente cerca de 0,5-1,2 unidades por grama de sólidos.

[045]Na conclusão da reação de transglicosilação, cerca de 30-50 unidades por grama de sólidos de β-amilase foi adicionado e a reação foi continuada por cerca de 12-16 horas em cerca de 35-55°C, preferencialmente cerca de 45°C. β-amilase produzida por Bacillu polymyxa St-3504 (PureCircle Sdn Bhd Collection of Industrial Microorganisms - Malásia) foi usada neste estágio. No entanto, β-amilases, e outras enzimas que hidrolisa amido derivadas de qualquer fonte incluindo semente de soja, cevada, bacteriana, de fungo e outras podem ser usadas como tal.

[046]Unidade de atividade de β-amilase (1 AUN) é definida como a atividade que libera 100 pg de açúcar redutor (expresso por equivalente em dextrose) por minuto sob as condições seguintes: 1 mL de solução de enzima é misturada com 5mL

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10/24 de 1,2% solução de amido (pH 5,5, M/20 tampão acetato) e mantida por 20 min a 40°C.

[047]A reação foi interrompida por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 15 minutos para inativar as enzimas, e a solução foi tratada com carbono ativado, para obter mistura de reação descolorida. A quantidade de carbono ativado foi cerca de 0,02-0,4 gramas por grama de sólidos, preferencialmente cerca de 0,05-0,2 gramas pro grama de sólidos.

[048]A mistura de reação descolorida foi dessalgada passando por resinas de troca iônica, como Amberlite FPC23 (tipo H+) e Amberlite FPA51 (tipo OH^-). Outros métodos apropriados de descoloração e dessalga, como filtração em membrana ou outros métodos conhecidos na técnica podem ser usados.

[049]A mistura de reação dessalgada foi ainda concentração por evaporador em vácuo e seca por meio de um liofilizador. Outros métodos apropriados de concentração e secagem, como filtração em membrana, liofilização ou outros conhecidos na técnica podem ser usados.

[050]O pó seco foi suspenso em álcool aquoso. A proporção de pó para álcool aquoso (p/v) foi 1:1 a 1: 20, preferencialmente 1:3 a 1: 10. O álcool aquoso continha 0-50% (vol), preferencialmente 1-10% água. A suspensão é agitada a 30-100°C, preferencialmente 50-85°C durante 1-24 horas, preferencialmente 2-15 horas. Então os sólidos suspensos são separados por meio de filtração. Qualquer outra técnica conhecida na técnica apropriada para separar sólidos suspensos de líquidos como centrifugação, decantação, etc. podem ser usadas. Os sólidos obtidos são secos em secador em tambor giratório a vácuo. Qualquer outro secador conhecido na técnica pode ser usado como tal. Alternativamente, os sólidos separados podem ser dissolvidos em água, evaporados de traços de álcool e liofilizados.

[051]Os álcoois empregados na invenção podem ser selecionados do grupo que consiste em alcanois, e são preferencialmente selecionados do grupo incluindo

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11/24 metanol, etanol, n-propanol, 2-propanol, 1-butanol, e 2-butanol.

[052]O produto resultante contém glicosídeos não modificados de baixo nível, derivados de cadeia curta (contendo dois ou menos resíduos a-1,4-glicosil) e uma mistura de maltooligosacarídeos (Amostra 1). Como usado aqui, as expressões “glicosídeos não modificados de nível baixo” ou “glicosídeos não reagidos de nível baixo” devem se referir aos níveis de glicosídeo de menos do que cerca de 20%, e preferencialmente menos do que cerca de 15%, em uma base anidra. Em algumas modalidades, um nível de glicosídeo não reagido de cerca de 12%, cerca de 10% ou ainda inferior pode ser retido usando este método.

[053]Para preparar um produto com teor maior de glicosídeos doces totais (a soma de glicosídeos glicosilados e não glicosilados), os maltooligosacarídeos foram removidos usando Amberlite XAD7 HP antes do tratamento de dessalga. Os esteviol glicosídeos e seus derivados glicosilados foram adsorvidos na resina e subsequentemente eluídos por etanol aquoso. O eluato de etanol aquoso resultante, contendo glicosil esteviol glicosídeos, foi subsequentemente descolorido e dessalgado como descrito acima e a solução de glicosídeos, após a evaporação de solvente eluindo, foi transformado em pó por liofilização. O pó seco foi suspenso em álcool aquoso e processado como descrito acima para remover os esteviol glicosídeos não modificados (não reagidos). O produto resultante contém glicosídeos não modificados em baixo nível e derivados de cadeia curta (contendo dois ou menos resíduos a-1,4-glicosil) (Amostra 2).

[054]As modalidades da invenção exemplificadas por Amostras 1 e 2 são derivados glicosilados livres ou substancialmente livres ou superiores contendo mais do que 2 resíduos glicosil. De acordo com esta invenção, a composição de glicosil stevia altamente purificada preferencialmente compreende mais do que cerca de 50% em peso de mono, e diglicosil esteviol glicosídeos.

[055]Usando um processo semelhante como para a Amostra 2, com exclusão

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12/24 de estágios de tratamento de β-amilase e álcool aquoso, um produto contendo glicosídeos não modificados e derivados de cadeia longa de a-l,4-glicosil (com até nove resíduos a-1,4-glicosil) foi preparado (Amostra 3).

[056]Usando um processo semelhante como para a amostra 2, com exclusão do estágio de tratamento de álcool aquoso, um produto contendo glicosídeos não modificados de nível alto, e derivados de cadeia curta (contendo dois ou menos resíduos de a-1,4-glicosil) foi preparado (Amostra 4). A composição da amostra é sumarizada na Tabela 1.

Tabela 1 [057]Composição de amostras de glicosil esteviol glicosídeos

Compostos	Teor
Amostra 1	Amostra 2	Amostra 3	Amostra 4
Steviosídeo	2,4	3,2	3,1	13,2
Rebaudiosídeo C	0,7	1,0	1,0	3,0
Rebaudiosídeo A	5,6	7,5	6,1	12,3
Monoglicosil-steviosídeo (StevG1)	16,2	21,9	7,5	22,2
Monoglicosil-Rebaudiosídeo A(RebAG1)	20,9	28,1	11,2	22,4
Diglicosil-steviosídeo (StevG2)	10,1	13,6	8,5	8,9
Diglicosil-Rebaudiosídeo A (RebAG2)	13,8	18,6	9,7	11,4
Derivados glicosilados superiores	1,3	1,7	48,8	11,4
Teor total de glicosídeos não reagidos	8,7	11,7	10,2	28,5

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Teor total de glicosídeos

71,0

95,5

95,8

95,3

[058]A avaliação sensorial de amostras foi realizada usando soluções aquosas, como 20 painelistas. Baseado na aceitação geral as amostras mais desejáveis e mais indesejáveis foram escolhidas. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2

Avaliação sensorial de amos	tras em sistema de água
Julgamento	Amostra 1	Amostra 2	Amostra 3	Amostra 4
Mais desejável	6	10	1	3
Mais indesejá- vel	1	0	12	7
Poder ado- çante	150	160	110	160
Comentários	Doce, leve, macio, redondo, prazeroso, quase semelhante à sacarose, sem gosto posterior prolongado, início de doçura é rápido	Doce, leve, macio, redondo, prazeroso, semelhante à sacarose, sem gosto posterior prolongado, início de doçura é rápido	Doce, ligeiramente amargo, adstringente, gosto posterior prolongado leve, início de doçura é moderado	Doce, ligeiramente amargo, adstringente, gosto posterior prolongado leve, início de doçura é lento

[059]Como aparente a partir dos resultados na tabela 2, a qualidade de doçura das Amostra 1 e 2 e classificados como mais superior. Em geral, as amostras com derivados de cadeia curta (contendo dois ou menos resíduos α-1,4-glicosil) e glicosídeos não reagidos em baixo nível (Amostras 1 e 2) possuíram perfis de sabor

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14/24 melhores em comparação às amostras com derivados de glicosil de cadeia longa (Amostra 3) e derivados de cadeia curta (contendo dois ou menos resíduos de α-1,4glicosil) e glicosídeos não reagidos em alto nível (Amostra 4).

[060]Amostras 1 e 2 mostram poder adoçante comparável (150-160 vezes mais doce em comparação a uma solução de 5% de sacarose) com Amostra de controle 4 (160 vezes); no entanto, seus perfis de sabores foram claramente superiores à Amostra controle 4.

[061]As composições podem ser usadas como melhoradores de doçura, melhoradores de sabor, e adoçantes em vários produtos alimentícios e bebidas. Exemplos não limitantes de produtos alimentícios e bebidas incluem refrigerantes gasosos, bebidas prontas para beber, bebidas energéticas, bebidas isotônicas, bebidas de baixas calorias, bebidas de zero calorias, bebidas esportivas, chás, sucos de frutas e vegetais, bebidas de fruta, bebidas lácteas, bebidas iogurte, bebidas alcoólicas, bebidas em pó, produtos assados, cookies, biscoitos, misturas para assar, cereais, confeitos, doces, balas, gomas de mascar, laticínios, leite com sabor, iogurtes, iogurtes com sabor, leite cultivado, molho de soja e outros produtos a base de soja, molhos para salada, maionese, vinagre, sobremesas congeladas, produtos de carne, produtos de peixe, produtos engarrafados e enlatados, adoçantes de mesa, frutas e vegetais.

[062]Além disso, as composições podem ser usadas nas preparações de droga ou farmacêuticas e cosméticas, incluindo, entre outras, pastas de dentes, enxaguatórios bucais, xaropes para tosse, comprimidos mastigáveis, pastilhas, preparações para vitaminas e semelhantes.

[063]As composições podem ser usadas “como são” ou em combinação com outros adoçantes, sabores e ingredientes alimentares.

[064]Exemplos não limitantes de adoçantes incluem esteviol glicosídeos, esteviosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo D,

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Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, steviolbiosídeo, rubusosídeo, bem como outros esteviol glicosídeos encontrados na planta Stevia rebaudiana Bertoni e misturas dos mesmos, extrato de stevia, extrato de Luo Han Guo, mogrosídeos, xarope de milho com alto teor de frutose, xarope de milho, açúcar invertido, frutooligosacarídeos, inulina, inulooligosacarídeos, açúcar de acoplamento, maltooligosacarídeos, maltodextinas, sólidos de xarope de milho, glicose, maltose, sacarose, lactose, aspartame, sacarina, sucralose, álcoois de açúcar.

[065]Exemplos não limitantes de sabores incluem sabores de limão, laranja, frutal, banana, uva, pera, abacaxi, amêndoa amarga, cola, canela, açúcar, algodão doce, baunilha.

[066]Exemplos não limitantes de outros ingredientes alimentares incluem sabores, acidulantes, aminoácidos e orgânicos, agentes corantes, agentes de volume, amidos modificados, gomas, texturizantes, preservativos, antioxidantes, emulsificantes, estabilizadores, espessantes, agentes de gelificação.

[067]Os seguintes exemplos ilustram várias modalidades da invenção. Será entendido que a invenção não é limitada aos materiais, proporções, condições e procedimentos estabelecidos nos exemplos que são somente ilustrativos.

EXEMPLO 1

Preparação de CGTase [068]Uma cepa de Bacillus stearothermophilus St-100 foi inoculada em 2.000 litros de meio de cultura esterilizado contendo 1,0% amido, 0,25% extrato de milho, 0,5% (NH4)2SO4, e 0,2% CaCO3 (pH 7,0-7,5) a 56°C por 24 horas com aeração contínua (2.000 L/min) e agitação (150rpm). O caldo de cultura obtido foi filtrado usando membrana de cerâmica Kerasep 0,1 pm (Novasep, France) para separar as células. O permeato isento de célula foi ainda concentrado 2 vezes em ultrafiltros Persep 10kDa (Orelis, França). A atividade da enzima foi determinada de acordo com Hale, Rawlins (1951). Uma preparação de enzima bruta com atividade de cerca de 2

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16/24 unidade/mL foi obtida.

EXEMPLO 2

Preparação de β-amilase [069]Uma cepa de Bacillus polymyxa St-3504 foi inoculada em 2.000 litros de meio de cultura esterilizado contendo 1,0% amido, 0,5% peptona, 0,5% extrato de milho, 0,5% NaCl, 0,02% MnSO4 e 0,1% CaCOs (pH 7,0-7,5) a 32°C por 24 horas com aeração contínua (2.000 L/min) e agitação (150rpm). O caldo de cultura obtido foi filtrado usando membrana de cerâmica Kerasep 0,1 pm (Novasep, France) para separar as células. 10% de glicose foi adicionado ao permeato isento de célula foi ainda concentrado em ultrafiltros Persep 10 kDa (Orelis, França) e seco usando unidade Alpha 1-4 LSC freeze drier (Christ, Alemanha) para obter um pó com uma atividade de 20.000 AU/g. Unidade de atividade de β-amilase (1 AUN) foi definido conforme a atividade que libera 100 pg de açúcar redutor (expresso por equivalente em dextrose) por minuto sob as seguintes condições: L mL de solução de enzima é misturado com 5mL de 1,2% solução de amido (pH 5,5, M/20 tampão de Acetato) e mantido por 20 min a 40°C.

EXEMPLO 3

Preparação de composição glicosil stevia de cadeia curta [070]100 g de amido de tapioca foram suspensos em 300 mL de água (pH

6,5). 2 KNU de α-amilase (Termamyl Classic, Novozymes, Dinamarca) e 30 unidades de CGTase obtidas de acordo com o Exemplo 1 foram adicionados, e a liquefação de amido foi realizada a 80°C por cerca de uma hora ao equivalente em dextrose de cerca de 15. O pH da mistura de reação foi ajustado para pH 2,8 por ácido clorídrico e a mistura foi evaporada a 100°C durante 5 minutos para inativar as enzimas. Após resfriamento a 65°C, o pH foi ajustado a pH 6,0 com solução de hidróxido de sódio. 100 g de extrato de stevia produzido por PureCircle (JiangXi) Co., Ltd. (China), contendo esteviosídeo 29,2%, Rebaudiosídeo A 54,3%, Rebaudiosídeo C 9,0%, Rebaudiosídeo F (1,7%) e outros glicosídeos quantificando um teor total de esteviol

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17/24 glicosídeos de cerca de 96,4% foi adicionado para liquefazer o amido e agitado até um solução homogênea ser obtida. 200 unidades de CGTase foram adicionados à solução e a mistura foi mantida em uma temperatura de 65°C pro 24 horas em agitação contínua. Então a temperatura foi reduzida a 45°C, e 8.000 unidades de β-amilase obtida de acordo com o EXEMPLO 2 foi adicionado à mistura de reação. A reação foi continuada por mais 12 horas. A mistura de reação obtida foi aquecida a 95°C por 15 minutos para inativar as enzimas. 20 gramas de carbono ativado foram adicionados e a mistura foi aquecida a 75°C e mantidos por 30 minutos. A mistura foi filtrada e o filtrado foi diluído com água para teor de sólidos de 5% e passou por colunas empacotadas com resinas de troca iônica Amberlite FPC23 (H+) e Amberlite FPA51 (OH^-). A solução dessalgada foi concentrada a 60°C em vácuo, e seca em uma forma de pó usando liofilizador de laboratório. O pó seco foi suspenso em 5 volumes de 95% etanol aquoso. A suspensão foi agitada a 80°C, durante 12 horas. Então os sólidos suspensos foram separados por filtração. Os sólidos obtidos foram secos em secador em tambor a 90°C durante 5 horas. 170 gramas de produto foram obtidas (Amostra 1).

EXEMPLO 4

Preparação de composição stevia glicosil de cadeia curta altamente purificada [071]100 g de amido de tapioca foram suspensos em 300 mL de água (pH

6,5). 2 KNU de α-amilase (Termamyl Classic, Novozymes, Dinamarca) e 30 unidades de CGTase obtidos de acordo com EXEMPLO 1 foram adicionados, e a liquefação do amido foi realizada a 80°C por cerca de uma hora para equivalente em dextrose cerca de 15. O pH da mistura de reação foi ajustado a pH 2,8 por ácido clorídrico e a mistura foi evaporada a 100°C durante 5 minutos para inativar as enzimas. Após resfriamento a 65°C, o pH foi ajustado a pH 6,0 com solução de hidróxido de sódio. 100 g de extrato de stevia produzido por PureCircle (JiangXi) Co., Ltd. (China), contendo esteviosídeo 29,2%, Rebaudiosídeo A 54,3%, Rebaudiosídeo C 9,0%, Rebaudiosídeo F (1,7%) e outros glicosídeos quantificando um teor total de esteviol glicosídeos de cerca de

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96,4% foi adicionado para liquefazer o amido e agitado até um solução homogênea ser obtida. 200 unidades de CGTase foram adicionados à solução e a mistura foi mantida em uma temperatura de 65°C pro 24 horas em agitação contínua. Então a temperatura foi reduzida a 45°C, e 8.000 unidades de β-amilase obtida de acordo com o EXEMPLO 2 foi adicionado à mistura de reação. A reação foi continuada por mais 12 horas. A mistura de reação obtida foi aquecida a 95°C por 15 minutos para inativar as enzimas. 20 gramas de carbono ativado foram adicionados e a mistura foi aquecida a 75°C e mantidos por 30 minutos. A mistura foi filtrada e o filtrado foi diluído com água para teor de sólidos de 5% e passou por colunas empacotadas cada uma empacotada com 4000 mL de resina adsorvente macroporosa Amberlite XAD 7HP. As colunas foram lavadas com 5 volumes de água e 2 volumes de 20% (v/v) etanol. Os glicosídeos adsorvidos foram eluídos com 50% etanol. Eluato obtido foi passado por colunas empacotadas com resinas de troca iônica Amberlite FPC23 (H⁺) e Amberlite FPA51 (OH). O etanol foi evaporado e a solução aquosa dessalgada e descolorida foi concentrada a 60°C em vácuo, e em seguida, seca em uma forma de pó usando liofilizador de laboratório. O pó seco foi suspenso em 5 volumes de 95% etanol aquoso. A suspensão foi agitada a 80°C, durante 12 horas. Então os sólidos suspensos foram separados por filtração. Os sólidos obtidos foram secos em secador em tambor a 90°C durante 5 horas. 121 gramas de produto foram obtidas (Amostra 2).

EXEMPLO 5

Preparação de composição stevia glicosil de cadeia longa altamente purificada [072]100 g de amido de tapioca foram suspensos em 300 mL de água (pH

6,5). 2 KNU de α-amilase (Termamyl Classic, , Dinamarca) e 30 unidades de CGTase obtidos de acordo com EXEMPLO 1 foram adicionados, e a liquefação do amido foi realizada a 80°C por cerca de uma hora para equivalente em dextrose cerca de 15. O pH da mistura de reação foi ajustado a pH 2,8 por ácido clorídrico e a mistura foi

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19/24 evaporada a 100°C durante 5 minutos para inativar as enzimas. Após resfriamento a 65°C, o pH foi ajustado a pH 6,0 com solução de hidróxido de sódio. 100 g de extrato de stevia produzido por PureCircle (JiangXi) Co., Ltd. (China), contendo esteviosídeo 29,2%, Rebaudiosídeo A 54,3%, Rebaudiosídeo C 9,0%, Rebaudiosídeo F (1,7%) e outros glicosídeos quantificando um teor total de esteviol glicosídeos de cerca de 96,4% foi adicionado para liquefazer o amido e agitado até um solução homogênea ser obtida. 200 unidades de CGTase foram adicionados à solução e a mistura foi mantida em uma temperatura de 65°C pro 24 horas em agitação contínua. A mistura de reação obtida foi aquecida a 95°C por 15 minutos para inativar as enzimas. 20 gramas de carbono ativado foi adicionado e a mistura foi aquecida a 75°C e mantida durante 30 min. A mistura foi filtrada e o filtrado foi diluído com água para um teor de sólidos de 5% e passou por colunas cada uma empacotada com 4000 mL de resina adsorvente macroporsa Amberlite XAD 7HP. As colunas foram lavadas com 5 volumes de água e 2 volumes de 20% (v/v) etanol. Os glicosídeos adsorvidos foram eluídos com 50% etanol. Eluato obtido foi passado por colunas empacotadas com resinas de troca iônica Amberlite FPC23 (H+) e Amberlite FPA51 (OH^-). O etanol foi evaporado e a solução aquosa dessalgada e descolorida foi concentrada a 60°C em vácuo, e em seguida, seca em uma forma de pó usando liofilizador de laboratório. 165 gramas de produto foram obtidas (Amostra 3).

EXEMPLO 6

Preparação de composição stevia glicosil de cadeia curta altamente purificada [073]100 g de amido de tapioca foram suspensos em 300 mL de água (pH

6,5). 2 KNU de α-amilase (Termamyl Classic, , Dinamarca) e 30 unidades de CGTase obtidos de acordo com EXEMPLO 1 foram adicionados, e a liquefação do amido foi realizada a 80°C por cerca de uma hora para equivalente em dextrose cerca de 15. O pH da mistura de reação foi ajustado a pH 2,8 por ácido clorídrico e a mistura foi evaporada a 100°C durante 5 minutos para inativar as enzimas. Após resfriamento a

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65°C, o pH foi ajustado a pH 6,0 com solução de hidróxido de sódio. 100 g de extrato de stevia produzido por PureCircle (JiangXi) Co., Ltd. (China), contendo esteviosídeo 29,2%, Rebaudiosídeo A 54,3%, Rebaudiosídeo C 9,0%, Rebaudiosídeo F (1,7%) e outros glicosídeos quantificando um teor total de esteviol glicosídeos de cerca de 96,4% foi adicionado para liquefazer o amido e agitado até um solução homogênea ser obtida. 200 unidades de CGTase foram adicionados à solução e a mistura foi mantida em uma temperatura de 65°C pro 24 horas em agitação contínua. Então a temperatura foi reduzida a 45°C, e 8.000 unidades de β-amilase obtida de acordo com o EXEMPLO 2 foi adicionado à mistura de reação. A reação foi continuada por mais 12 horas. A mistura de reação obtida foi aquecida a 95°C por 15 minutos para inativar as enzimas. 20 gramas de carbono ativado foram adicionados e a mistura foi aquecida a 75°C e mantidos por 30 minutos. A mistura foi filtrada e o filtrado foi diluído com água para teor de sólidos de 5% e passou por colunas empacotadas cada uma empacotada com 4000 mL de resina adsorvente macroporosa Amberlite XAD 7HP. As colunas foram lavadas com 5 volumes de água e 2 volumes de 20% (v/v) etanol. Os glicosídeos adsorvidos foram eluídos com 50% etanol. Eluato obtido foi passado por colunas empacotadas com resinas de troca iônica Amberlite FPC23 (H+) e Amberlite FPA51 (OH). O etanol foi evaporado e a solução aquosa dessalgada e descolorida foi concentrada a 60°C em vácuo, e em seguida, seca em uma forma de pó usando liofilizador de laboratório. 154 gramas de produto foram obtidas (Amostra 4).

EXEMPLO 7

Bebida suco de laranja de baixas calorias [074]Concentrado de laranja (35%), ácido cítrico (0,35%), ácido ascórbico (0,05%), cor vermelho laranja (0,01%), sabor de laranja (0,20%), Rebaudiosídeo A (0,003%) e diferentes composições de glicosil stevia (0,03%) foram misturados e dissolvidos completamente em água (até100%) e pasteurizados. Composições de glicosil stevia foram representadas por Amostras 1, 2, 3 e 4, obtidas de acordo com os

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EXEMPLOS 3, 4, 5 e 6, respectivamente.

[075]As avaliações sensoriais das amostras são sumarizadas na tabela 3. Os dados mostram que os melhores resultados podem ser obtidos usando as composições de alta pureza de glicosil stevia de cadeia curta (contendo dois ou menos resíduos de a-1,4-glicosil e esteviol glicosídeos não reagidos baixos) (Amostras 1 e 2). Particularmente as bebidas preparadas com as Amostras 1 e 2 apresentaram um perfil de sabor e paladar completos.

Tabela 3

Ava	iação de amostras de bebida suco de laranja
Amostra	Comentários
Sabor	Gosto posterior	Paladar
No. 1	Doçura de alta qualidade, sabor prazeroso semelhante à sacarose, sabor arredondado e balanceado	Limpo, quase nenhum amargor, nenhum gosto posterior	Completo
No. 2	Doçura de alta qualidade, sabor prazeroso semelhante à sacarose, sabor arredondado e balanceado	Limpo, nenhum amargor e nenhum gosto posterior	Completo
No. 3	Doçura de alta qualidade, sabor prazeroso quase semelhante à sacarose, sabor arredondado e balanceado	Limpo, quase nenhum amargor, nenhum gosto posterior	Quase aceitável
No. 4	Doce, notas licoradas	Amargor leve e	Não aceitável

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gosto posterior

[076]O mesmo método pode ser usado para preparar sucos e bebidas de sucos de outras frutas como maçãs, limões, damascos, cerejas, abacaxis, mangas, etc.

EXEMPLO 8

Bebida gasosa de baixa caloria [077]Uma bebida gasosa de acordo com a fórmula apresentada abaixo foi preparada._____________________________________________________________________

Ingredientes	Quantidade, %
Sacarose	5,5
Sabor de cola	0,340
Ácido orto-fosfórico	0,100
Citrato de sódio	0,310
Benzoato de sódio	0,018
Ácido cítrico	0,018
Rebaudiosídeo A	0,003
Composição de glicosil stevia	0,05
Água gasosa	até 100

[078]As propriedades sensoriais foram avaliadas por 20 painelistas. Os resultados são sumarizados na Tabela 4.

Tabela 4 [079]Avaliação de amostras de bebida gasosa de baixa caloria

Atributo de sabor	Número de painelistas detectados por atributo
Sabor amargo	Amostra No. 1	Amostra No. 2	Amostra No. 3	Amostra No. 4
Sabor amargo	0	0	10	12
Sabor adstringente	1	0	15	15

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Gosto poste- rior	1	0	13	18
Comentários
Qualidade de	Limpo (18 de	Limpo (20 de	Limpo (14 de	Gosto posterior
sabor doce	20)	20)	20)	amargo (10 de 20)
Avaliação ge-	Satisfatório	Satisfatório	Satisfatório	Satisfatório (9 de
ral	(19 de 20)	(20 de 20)	(11 de 20)	20)

[080]Os resultados acima mostram que as bebidas preparadas usando Amostras 1 e 2 possuíram as melhores características organolépticas.

EXEMPLO 9

Biscoitos dietéticos [081]Farinha (50,0%), margarina (30,0%) frutose (10,0%), maltitol (8,0%), leite integral (1,0%), sal (0,2%), fermento em pó (0,15%), baunilha (0,1 %) e diferentes composições de glicosil stevia (0,03%) foram amassadas bem em máquina para mistura de massa de pão. A massa de pão obtida foi moldada e assada em forno a 200°C por 15 minutos. Composições de glicosil stevia foram representadas por Amostras 1,2, 3 e 4, obtidas de acordo com os EXEMPLOS 3, 4, 5 e 6, respectivamente.

[082]As propriedades sensoriais foram avaliadas por 20 painelistas. Os melhores resultados foram obtidos nas amostras preparadas por composições de glicosil stevia de cadeia curta de alta pureza derivados (contendo dois ou menos resíduos α-

1,4-glicosil) (Amostras 1 e 2). Os painelistas notaram perfil de sabor e paladar arredondado e completo nos biscoitos preparados com as Amostras 1 e 2.

EXEMPLO 10

Iogurte [083]Diferentes composições de glicosil stevia (0,03%) e sacarose (4%) foram dissolvidas em leite com pouca gordura. Composições de glicosil stevia foram

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24/24 representadas por Amostras 1, 2, 3 e 4, obtidas de acordo com os EXEMPLOS 3, 4, 5 e 6, respectivamente. Após pasteurização a 82°C por 20 minutos, o leite foi resfriado a 37°C. Uma cultura de arranque (3%) foi adicionada e a mistura foi incubada a 37°C por 6 horas então a 5°C por 12 horas.

[084]As propriedades sensoriais foram avaliados por 20 painelistas. Os melhores resultados foram obtidos nas amostras preparadas por composições de glicosil stevia de cadeia curta de alta pureza derivados (contendo dois ou menos resíduos α- l,4-glicosil) (Amostras 1 e 2). Os painelistas notaram perfil de sabor e paladar arredondado e completo em amostras preparadas com as Amostras 1 e 2.

[085]Deve ser entendido que a descrição acima e modalidades específicas mostradas aqui são meramente ilustrativas do melhor modo da invenção e os princípios dos mesmos, e que modificações e adições podem ser facilmente feitas pelos especialistas na técnica sem se afastar do espírito e escopo da invenção, que é, portanto, entendido para ser limitada somente pelo escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Processo para produzir uma composição glicosil stevia altamente purificada, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:

adicionar amido em água para formar uma suspensão de amido;

adicionar uma mistura de α-amilase e CGTase na suspensão de amido e incubar por 0,5 a 2 horas a 75-80°C, resultando em uma suspensão de amido liquefeita;

inativar a α-amilase por tratamento térmico em baixo pH a um pH de 2,5 a 3,0 em 95 a 105°C por 5 a 10 minutos;

resfriar a suspensão de amido liquefeita e ajustar o pH a 5,5 a 7,0;

adicionar esteviol glicosídeos na suspensão de amido liquefeita, resultando em uma mistura de reação;

adicionar um segundo lote de CGTase na mistura de reação e incubar por 12 a 48 horas a 55-75°C;

adicionar β-amilase à mistura de reação e incubar por 12-24 horas a 35-55°C;

inativar as enzimas na mistura de reação por tratamento térmico em 95°C por 15 minutos;

descolorir a mistura de reação;

remover compostos não diterpênicos contatando a mistura de reação descolorida com resina adsorvente macroporosa e subsequentemente eluir glicosídeos diterpênicos adsorvidos com etanol aquoso para resultar em um eluato de etanol aquoso contendo glicosídeo;

dessalgar o eluato de etanol aquoso contendo glicosídeo com resinas de troca iônica;

remover etanol do eluato de etanol aquoso, resultando em um eluato aquoso;

concentrar e secar o eluato aquoso para obter a composição de glicosil stevia seca, suspender a composição de glicosil stevia seca em álcool aquoso para formar

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2/4 uma suspensão, remover esteviol glicosídeos não modificados a partir da suspensão, e separar e secar a composição de glicosil stevia altamente purificada;

em que a composição de glicosil stevia altamente purificada compreende derivados de steviol glicosídeo de cadeia curta contendo dois ou menos resíduos de α-

1,4-glicosil, e menos do que15% de esteviol glicosídeos não modificados.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de α-amilase e CGTase contém 0,001-0,2 KNU de α-amilase por uma unidade de CGTase.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de α-amilase e CGTase contém 0,05-0,1 KNU de α-amilase por uma unidade de CGTase.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o peso de esteviol glicosídeos adicionado é igual ao de amido.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que os esteviol glicosídeos adicionados são selecionados do grupo que consiste em esteviosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, steviolbiosídeo, rubusosídeo, bem como outros esteviol glicosídeos encontrados na planta Stevia rebaudiana Bertoni e misturas dos mesmos.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a CGTase é produzida por culturas de Bacillus stearothemophilus.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo lote de CGTase tem 0,2-4 unidades de CGTase por grama de sólidos.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo lote de CGTase tem 0,5-1,2 unidades de CGTase por grama de sólidos.

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9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a β-amilase é produzida por culturas de Bacillus polymyxa.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a β-amilase é derivada de uma ou mais fontes selecionadas do grupo que consiste em fontes animal, vegetal, bacteriana e fúngica.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a β-amilase é adicionada a 30-50 unidades por grama de sólidos totais e o tratamento é conduzido em uma temperatura de 40-60°C, por uma duração de 3-16 horas.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que após o tratamento de β-amilase, os derivados glicosilados de cadeia curta de esteviosídeo e Rebaudiosídeo A têm dois ou menos resíduos de α-glicosil.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que em vez de adicionar β-amilase à mistura de reação, uma enzima que hidrolisa oligo ou polissacarídeo, derivada de uma ou mais fontes selecionadas do grupo que consiste em fontes animal, vegetal, bacteriana e fúngica, é adicionada à mistura de reação.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a descoloração é realizada usando carbono ativado.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a descoloração é realizada usando resinas ou membranas de troca iônica, ditas membranas sendo selecionadas do grupo que consiste em membranas de ultrafiltração, nanofiltração e osmose reversa.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a remoção de compostos não diterpênicos é conduzida com uma pluralidade de colunas sequencialmente conectadas empacotadas com uma resina adsorvente macroporosa, seguida por lavagem das colunas com água, em seguida, lavagem

Petição 870180138988, de 08/10/2018, pág. 34/41

4/4 com10-50% (v/v) de etanol, desconexão das colunas, e então, eluição de cada coluna individualmente com 30-100% de etanol.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dessalga é realizada passando o eluato pelas colunas empacotadas com resinas ou membranas de troca iônica, ditas membranas sendo selecionadas do grupo que consiste em membranas de ultrafiltração, nanofiltração e osmose reversa.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o álcool aquoso compreende 0-50% (vol), água, e ainda compreende as etapas de agitação da suspensão a 30-100°C, por um período de1 -24 horas antes de separar a composição de glicosil stevia altamente purificada.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de glicosil stevia altamente purificada tem pelo menos95% de esteviol glicosídeos totais em uma base anidra.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de glicosil stevia altamente purificada tem menos do que 15% de esteviol glicosídeos não reagidos em uma base anidra.