CN112626094A - 环糊精葡萄糖基转移酶的基因、氨基酸序列和应用 - Google Patents

环糊精葡萄糖基转移酶的基因、氨基酸序列和应用 Download PDF

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cyclodextrin glucosyltransferase
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孙晶晶
王伟
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Abstract

本发明涉及环糊精葡萄糖基转移酶的基因、氨基酸序列和应用，属于生物技术领域。所述环糊精葡萄糖基转移酶核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。利用SEQ ID No:1所示核苷酸序列进行重组表达，表达载体为pET‑24a(+)，菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。本发明重组表达的环糊精葡萄糖基转移酶能以低成本的β‑环糊精作为糖基供体实现高效的葡萄糖基转移功能。该环糊精葡萄糖基转移酶在转化维生素C制备2‑O‑α‑D‑吡喃葡萄糖基‑L‑抗坏血酸具有广阔的应用前景。

Description

环糊精葡萄糖基转移酶的基因、氨基酸序列和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种微生物来源的高葡萄糖基转移活性的环糊精葡萄糖基转移酶的基因、氨基酸序列和应用。
背景技术
环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucanotransferase CGTase；EC2.4.1.19)属于α淀粉酶家族(糖基水解酶家族13)中的一员，能够催化四种反应。三种转糖苷反应包括环化，耦联，歧化反应以及一种水解反应。其中环化反应是CGTase的特征反应，通过分子内转糖基反应生成环糊精。歧化反应和耦联反应能够将麦芽低聚糖转移至各种受体分子以产生糖基化衍生物，因此，CGTase被广泛应用于高附加值产品的生产，例如环糊精、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)。而正是由于其广泛的应用，对于CGTase的制备已成为当今研究的热点。
L-抗坏血酸(L-ascorbic-acid，L-AA，维生素C，VC)，是一种人体不能合成的水溶性维生素，参与人体内各种生理活动，包括铁的吸收，胶原蛋白的合成等，在维持和促进人类健康中起重要作用。但是其C-2上的羟基非常不稳定，在存在氧气，光，热和金属离子的情况下容易氧化，降低了生物活性极大限制了其应用，因此需要开发VC的衍生物，提高维生素C的稳定性。在L-抗坏血酸的衍生物中，2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)由于其出色的耐光、耐热、抗氧化性，被认为是最佳的L-抗坏血酸替代品。而且L-抗坏血酸在人体内通过α-葡萄糖苷酶的作用，可重新分解为维生素C与D-葡萄糖。AA-2G作为维生素C的前体分子，是迄今为止人们发现的最稳定，性能最佳的维生素C衍生物，在食品，药品，化妆品领域拥有着广泛的应用潜力。
在环糊精葡萄糖基转移酶法合成AA-2G时，参与AA-2G形成的糖基供体有多种，其中用α-环糊精作为糖基供体，通过反应条件优化后，AA-2G产量能达到143g/L。但糖基供体α-环糊精的成本极高，造成AA-2G成本居高不下，极大的限制了其应用。因此迫切需要优良催化特性，转糖基效率较高，且能利用低成本β-环糊精作为糖基供体的环糊精葡萄糖基转移酶。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有的环糊精葡萄糖基转移酶转糖基效率较低、糖基供体成本较高的问题，提供了一种高转糖基效率的环糊精葡萄糖基转移酶的表达和应用，所述的环糊精葡萄糖基转移酶具有较高的转糖基效率，且能利用低成本β-环糊精作为糖基供体的环糊精葡萄糖基转移酶。在转化维生素C(VC)制备2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)中具有广阔的应用前景。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
本发明提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
一种上述核苷酸序列编码的环糊精葡萄糖基转移酶，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
一种重组表达载体，它包含了SEQ ID No:1所示核苷酸序列；重组表达载体为pET-24a(+)。
一种重组菌，它包含了SEQ ID No:1所示核苷酸序列，所述的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
利用上述环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列制备重组环糊精葡萄糖基转移酶的方法，步骤如下：
(1)将环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列SEQ ID No:1克隆到大肠杆菌表达载体pET-24a中，构建重组表达载体pET-cgtase，将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用卡那霉素抗性筛选出含环糊精葡萄糖基转移酶基因的重组菌株；
(2)将步骤(1)筛选出的菌株接种于LB液体培养基中，37℃培养10-12小时，获得种子液；将种子液以体积比1％-2％的量接种于LB液体培养基中，待生长到OD600为0.6-0.8时，加入终浓度0.2-1mmol/L的IPTG诱导，诱导温度为16-37℃，诱导时间为9-24小时；
(3)收集步骤(2)诱导后获得的菌体，超声破碎后，使用亲和层析柱对重组环糊精葡萄糖基转移酶进行纯化，获得电泳纯的重组环糊精葡萄糖基转移酶。
本发明还提供上述重组环糊精葡萄糖基转移酶在维生素C生物转化制备2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)中的应用，所述应用中糖基供体为β-CD。
上述重组环糊精葡萄糖基转移酶具有如下酶学性质:
(1)重组环糊精葡萄糖基转移酶的最适温度为80℃，在温度为40℃时，酶活只保留最高酶活的75％；在反应温度为100℃时，酶的活力仍然保留80％。
(3)重组环糊精葡萄糖基转移酶在20－80℃，表现出高稳定性；在90℃温度下作用2小时后，重组环糊精葡萄糖基转移酶的活力丧失90％。
(4)重组环糊精葡萄糖基转移酶的最适pH为7，在pH 4-10的较广范围内，重组环糊精葡萄糖基转移酶能维持80％以上活性，适用于工业化生产的需要；在反应pH为11时，酶活仅保留40％。
(5)重组环糊精葡萄糖基转移酶在pH范围4-10之间具有良好的稳定性，放置12小时后，酶活基本不发生变化，其中pH范围在4-6之间具有最好的稳定性，这一特性可以在转化VC制备AA-2G酸性条件下具有优良的酶学特性。
(6)金属离子Ca2+，EDTA对该重组环糊精葡萄糖基转移酶的活性有一定的激活作用；K+、Mn2+、Ba2+、Mg2+和Li+对重组环糊精葡萄糖基转移酶的活性影响较小；Fe2+和Cu2+对重组环糊精葡萄糖基转移酶有较强的抑制作用。
(7)重组环糊精葡萄糖基转移酶对可溶性淀粉底物的Km值率为5.10g/L，最大反应速率Vmax为0.65umol/L/min，kcat为28.50s-1,kcat/Km为5.50s-1mM-1。
本发明所述环糊精葡萄糖基转移酶在维生素C生物转化中的应用是指：
重组环糊精葡萄糖基转移酶转化维生素C制备2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)，当底物VC浓度为10-50g/L，糖基供体β-CD为10-50g/L，反应时间6-48h，加酶量25-150U/gβ-CD，反应pH3-9，反应温度20-60℃。其中优选的反应条件为当底物VC浓度为50g/L，糖基供体β-CD为50g/L，反应时间24h，加酶量75U/gβ-CD，反应pH 4，反应温度40℃，此条件下AA-2G生成量达到28g/L，转化率为56％。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列，利用所述基因表达的重组环糊精葡萄糖基转移酶与已知的酶相比具有较强的转葡萄糖基效率和成本较低的糖基供体选择，其中以β-CD为糖基供体时AA-2G生成量达到28g/L，转化率为56％，在AA-2G酶法制备中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1、重组环糊精葡萄糖基转移酶的表达和纯化电泳图；泳道M，蛋白Marker；泳道1，环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液；泳道2，纯化后的重组环糊精葡萄糖基转移酶；
图2、重组环糊精葡萄糖基转移酶的最适反应温度曲线；
图3、重组环糊精葡萄糖基转移酶的热稳定性曲线；
图4、重组环糊精葡萄糖基转移酶的最适反应pH曲线；
图5、重组环糊精葡萄糖基转移酶的pH稳定性曲线；
图6、重组环糊精葡萄糖基转移酶转化VC制备AA-2G反应液HPLC图。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1环糊精葡萄糖基转移酶基因表达载体的构建
从马里亚纳海沟深海水样宏基因组中筛选具有环糊精葡萄糖基转移酶功能的基因，如SEQ ID No:1所示，经大肠杆菌表达体系密码子优化后进行基因合成，连接到表达质粒pET-24a上，连接子转化到大肠杆菌DH5α中，通过抗生素卡那霉素筛选出阳性克隆，并进行测序分析，从而获得带有环糊精葡萄糖基转移酶新基因的重组表达载体pET-cgtase。
实施例2重组环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法
将实施例1所述重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌株。将菌株分别接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃过夜培养。取1％培养液接种，培养至OD600值0.6，加入IPTG至终浓度0.4mM，20℃诱导18小时。4℃，8000rpm离心10min收集菌体，菌体用20mM PBS缓冲液(pH 7)重悬。超声破碎细胞，破碎液在4℃，8000rpm离心20min，收集上清液，获得粗酶液。用平衡缓冲液(20mM PBS缓冲液,500mM NaCl,pH 7)将亲和层析柱Ni-NTA Agarose冲洗5个柱体积，粗酶液经过0.22μm滤膜过滤后进入柱子，随后用平衡缓冲液冲洗5个柱体积，非特异性条带通过含有20mM咪唑的平衡液冲洗5个柱体积来去除。用含20-250mM咪唑的平衡液进行梯度洗脱，获得纯的重组环糊精葡萄糖基转移酶。SDS-PAGE检测蛋白纯度，其结果如图1所示。BCA法测定蛋白浓度，以BSA为标准蛋白。重组环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID No:2所示。
实施例3重组环糊精葡萄糖基转移酶的酶学性质
重组环糊精葡萄糖基转移酶的最适反应温度是在温度范围40-100℃内测定的，其温度与酶活的关系如图2所示，重组环糊精葡萄糖基转移酶最适反应温度为80℃，在温度为40℃时，酶活只保留最高酶活的75％，在温度为100℃时，酶的活力仍然保留80％。重组环糊精葡萄糖基转移酶的热稳定性是通过将纯酶在温度范围40-90℃内作用2小时，测定其残余酶活来实现的，重组环糊精葡萄糖基转移酶的热稳定性实验结果如图3所示。重组环糊精葡萄糖基转移酶在20-80℃时，表现出良好的稳定性，在90℃温度下作用2小时后，重组环糊精葡萄糖基转移酶的活力丧失90％。重组环糊精葡萄糖基转移酶的pH与酶活的关系如图5所示，最适pH是在pH 3-6(柠檬酸缓冲液)，pH 6-8(磷酸钠缓冲液)，pH 8-10(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，pH 10-11(磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液)的不同pH范围内缓冲液中进行测定的，其温度与酶活的关系如图3所示。重组环糊精葡萄糖基转移酶的最适pH为7，在pH 4-10的较广范围内，重组环糊精葡萄糖基转移酶能维持80％以上活性，适用于工业化生产的需要；在反应pH为11时，酶活仅保留40％。重组环糊精葡萄糖基转移酶pH稳定性实验是通过将纯酶置于上述pH范围的缓冲液中作用12小时后，测定其残余酶活来实现的，实验结果如图4所示。重组环糊精葡萄糖基转移酶在pH范围4到10之间具有良好的稳定性，放置12小时后，酶活基本不发生变化，其中pH范围在4-6之间具有最好的稳定性，这一特性可以在转化VC制备AA-2G酸性条件下具有优良的酶学特性。
在酶活测定体系中加入终浓度为1mM的不同金属离子(Fe2+,K+,Ca2+,Mn2+,Ba2+,Li+,Cu2+,Mg2+)，以及表面活性剂SDS，金属螯合剂EDTA，测定其残余酶活，其实验结果如表1所示。金属离子Ca2+，EDTA对该重组环糊精葡萄糖基转移酶的活性有一定的激活作用；K+、Mn2+、Ba2+、Mg2+和Li+对重组环糊精葡萄糖基转移酶的活性影响较小；Fe2+和Cu2+对重组环糊精葡萄糖基转移酶有较强的抑制作用。
表1化学试剂对重组环糊精葡萄糖基转移酶活性的影响
Figure BDA0002900158160000071
重组环糊精葡萄糖基转移酶对可溶性淀粉的动力学参数如表2所示。测定缓冲液为50mM的磷酸盐缓冲液(pH 7)，其中可溶性淀粉浓度范围为5-50mg/ml，重组环糊精葡萄糖基转移酶测定温度为80℃，通过Lineweaver-Burk方法计算了Km，Vmax，kcat和kcat/Km等动力学参数。
表2重组β-葡萄糖苷酶及其突变体的动力学参数
Figure BDA0002900158160000072
实施例4重组环糊精葡萄糖基转移酶在维生素C生物转化中的应用
以维生素C为受体以及β-CD作为糖基供体，各取1ml作为底物，用氢氧化钠调节pH至5，加入一定量的纯化环糊精葡萄糖基转移酶酶液，在黑暗和无氧的条件下进行反应。底物VC浓度为10-50g/L，糖基供体β-CD为10-50g/L，反应时间6-48h，加酶量25-150U/gβ-CD，反应pH 3-9，反应温度20-60度。
使用HPLC进行检测，检测条件：Agilent 1260HPLC系统，安谱Athena C-18WP色谱柱(4.6nmx250nm)，PDA检测器，吸收波长242nm，流动相为20mM H3PO4，流速0.8ml/min，柱温25度。根据标准样品AA-2G峰面积计算AA-2G的产量。
其中优选的反应条件为当底物VC浓度为50g/L，糖基供体β-CD为50g/L，反应时间24h，加酶量75U/gβ-CD，反应pH 4，反应温度40度，此条件下AA-2G生成量达到28g/L，转化率为56％。实验结果如图6所示，重组环糊精葡萄糖基转移酶在维生素C生物转化中具有较高的应用前景。
序列表
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 环糊精葡萄糖基转移酶的基因、氨基酸序列和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2076
<212> DNA
<213> 环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucanotransferas)
<400> 1
ggatccgcac cggatacatc agtttcgaat gttgttaact attcaaccga tgttatctat 60
caaattgtta cagatagatt tctggatggc aacccgaaca ataaccctac gggcgatctg 120
tatgatccga cacatacatc actgaaaaaa tattttggcg gcgattggca aggcattatt 180
aataaaatta atgatggcta tctgacgggc atgggcatta cagcaatttg gatttcacaa 240
ccggttgaaa atatttatgc agttctgccg gattcaacat ttggcggctc aacatcatac 300
catgggtatt gggcaagaga tttcaaaaaa actaatccgt tttttggctc atttacagat 360
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ccgtttacac tggcaccggg cgaagttgca gtttggcaat atgtttcaac aacaaatccg 1500
ccgctgattg gccatgttgg cccgacaatg acaaaagcgg gccaaacaat tacaattgat 1560
ggcagaggct ttggcaccac agctggccaa gttctgttcg gcacaacacc ggctacaatt 1620
gtttcatggg aagatacaga agttaaagtt aaagttccgg cactgacacc gggcaaatat 1680
aatgttacac tgaaaacagc aagcggcgtt acatcaaatt catataataa tattaatgtt 1740
ctgactggca atcaagtttg cgttagattt gttgttaata atgcatcaac agtttggggc 1800
gaaaatgttt acctgactgg caacgttgca gaactgggct catgggatac atcaaaagca 1860
attggcccga tgtttaatca agttgtttat caatatccga catggtatta tgatgtttca 1920
gttcccgccg gaacaacaat tgaatttaaa tttattaaaa aaaatggctc aacagttaca 1980
tgggaaggcg gctataatca tgtttataca acaccgacaa gcggcacagc aacagttatt 2040
gttaattggc aaaatcatca tcatcatcat cattaa 2076
<210> 2
<211> 691
<212> PRT
<213> 环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucanotransferas)
<400> 2
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1 5 10 15
Asp Val Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Leu Asp Gly Asn Pro
20 25 30
Asn Asn Asn Pro Thr Gly Asp Leu Tyr Asp Pro Thr His Thr Ser Leu
35 40 45
Lys Lys Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn
50 55 60
Asp Gly Tyr Leu Thr Gly Met Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln
65 70 75 80
Pro Val Glu Asn Ile Tyr Ala Val Leu Pro Asp Ser Thr Phe Gly Gly
85 90 95
Ser Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn
100 105 110
Pro Phe Phe Gly Ser Phe Thr Asp Phe Gln Asn Leu Ile Ala Thr Ala
115 120 125
His Ala His Asn Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr
130 135 140
Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asp Pro Thr Tyr Gly Glu Asn Gly Arg Leu
145 150 155 160
Tyr Asp Asn Gly Val Leu Leu Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Asn Gly
165 170 175
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180 185 190
Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp Leu Ala Asp Leu Asp Gln Gln Asn Asn
195 200 205
Thr Ile Asp Ser Tyr Leu Lys Ala Ala Ile Lys Leu Trp Leu Asp Met
210 215 220
Gly Ile Asp Gly Ile Arg Met Asp Ala Val Lys His Met Ala Phe Gly
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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Asn Asp Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Tyr
325 330 335
Thr Gly Gly Ser Thr Arg Pro Val Glu Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu
340 345 350
Thr Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met
355 360 365
Thr Gly Asn Gly Asp Pro Tyr Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asp
370 375 380
Thr Thr Thr Thr Ala Tyr Asn Val Ile Lys Lys Leu Ala Pro Leu Arg
385 390 395 400
Lys Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Lys Gln Arg Trp Ile
405 410 415
Asn Asn Asp Val Tyr Ile Tyr Glu Arg Gln Phe Gly Asn Asn Val Ala
420 425 430
Leu Val Ala Ile Asn Arg Asn Leu Ser Thr Ser Tyr Tyr Ile Thr Gly
435 440 445
Leu Tyr Thr Ala Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Gly Gly
450 455 460
Leu Leu Asn Gly Asn Asn Ile Ser Val Ala Ser Asp Gly Ser Val Thr
465 470 475 480
Pro Phe Thr Leu Ala Pro Gly Glu Val Ala Val Trp Gln Tyr Val Ser
485 490 495
Thr Thr Asn Pro Pro Leu Ile Gly His Val Gly Pro Thr Met Thr Lys
500 505 510
Ala Gly Gln Thr Ile Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Thr Thr Ala
515 520 525
Gly Gln Val Leu Phe Gly Thr Thr Pro Ala Thr Ile Val Ser Trp Glu
530 535 540
Asp Thr Glu Val Lys Val Lys Val Pro Ala Leu Thr Pro Gly Lys Tyr
545 550 555 560
Asn Val Thr Leu Lys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ser Asn Ser Tyr Asn
565 570 575
Asn Ile Asn Val Leu Thr Gly Asn Gln Val Cys Val Arg Phe Val Val
580 585 590
Asn Asn Ala Ser Thr Val Trp Gly Glu Asn Val Tyr Leu Thr Gly Asn
595 600 605
Val Ala Glu Leu Gly Ser Trp Asp Thr Ser Lys Ala Ile Gly Pro Met
610 615 620
Phe Asn Gln Val Val Tyr Gln Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr Asp Val Ser
625 630 635 640
Val Pro Ala Gly Thr Thr Ile Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asn Gly
645 650 655
Ser Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Tyr Asn His Val Tyr Thr Thr Pro
660 665 670
Thr Ser Gly Thr Ala Thr Val Ile Val Asn Trp Gln Asn His His His
675 680 685
His His His
690

Claims (5)

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶基因，其特征在于所述核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.权利要求1所述核苷酸序列编码的环糊精葡萄糖基转移酶，其特征在于所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于所述载体包含了权利要求1所述的SEQ ID No:1核苷酸序列；所述载体为pET-24a(+)。
4.一种重组菌，它包含了权利要求3所述重组表达载体，菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
5.权利要求2所述重组环糊精葡萄糖基转移酶在转化维生素C制备2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸中的应用，其特征在于所述应用中的糖基供体为β-CD。
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熊艳军: "环糊精葡萄糖基转移酶合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑》 *

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