CN103502260A

CN103502260A - 含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末的制造方法

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Publication number: CN103502260A
Application number: CN201280010888.6A
Authority: CN
Inventors: 涩谷孝; 伊泽精祐; 西本友之; 福田惠温; 三宅俊雄
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Co Ltd; Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 2011-03-07
Filing date: 2012-03-07
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2032-03-07
Also published as: JP2014139236A; JP6309562B2; ZA201307116B; JP2016166235A; EP2653475A4; US20130295618A1; US9186368B2; US9872872B2; JP5242833B2; KR20140039177A; JP2013055933A; JP5242831B2; AU2012226907B2; CN106220696A; AU2012226907A1; JP5242832B2; JP5553899B2; JP5931997B2; JP5308590B2; RU2013144731A

Abstract

以提供即便在抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率不满35质量%时也能制造显著地难固结的粉末的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造方法作为课题。通过提供包括使CGT酶作用于含液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液，接下来向其作用葡萄糖淀粉酶而得到抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是27质量%以上的溶液的步骤；将得到的溶液纯化，使抗坏血酸2-葡萄糖苷含量超86质量%的步骤；通过控制冷却法或拟似控制冷却法析出抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶的步骤；采集析出的抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶，成熟、干燥的步骤的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造方法来解决。

Description

含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末的制造方法

【技术领域】

本发明涉及含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末的制造方法，具体而言，涉及相比以往品显著地难固结的含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末的制造方法。

【背景技术】

L-抗坏血酸由于其优良的生理活性或抗氧化作用，一直以来在包括食品、化妆品等的各种的用途中使用。反面、L-抗坏血酸由于直接还原性而有不稳定，容易受氧化分解，易失生理活性的大的缺点。为解消此L-抗坏血酸的缺点，本申请人，在专利文献1中，作为共同申请人之一人，公开了向L-抗坏血酸的2位的羟基结合1分子的D-葡萄糖的2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸（以下，在本说明书将其简称为“抗坏血酸2-葡萄糖苷”。）。此抗坏血酸2-葡萄糖苷不示直接还原性，从而有稳定，并且，在活体内，由在活体内原本存在的酶分解为L-抗坏血酸和D-葡萄糖而发挥L-抗坏血酸原本的生理活性的划时代的的特性。根据专利文献1中公开的制造方法，抗坏血酸2-葡萄糖苷通过使环麦芽糖糊精－葡聚糖转移酶（以下，简称为“CGT酶”。）或α-葡萄糖苷酶等的糖转移酶作用于含有L-抗坏血酸和α-葡萄糖基糖化合物的溶液而生成。

本申请人，再者，在专利文献2中，成功于从抗坏血酸2-葡萄糖苷的过饱和溶液将抗坏血酸2-葡萄糖苷晶析，公开了结晶抗坏血酸2-葡萄糖苷和含其的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷结晶的粉末。另外，本申请人，在非专利文献1中，公开了大规模的高含抗坏血酸2-葡萄糖苷的物的制造方法。再有，作为抗坏血酸2-葡萄糖苷结晶，目前，仅知无水结晶。顺便而言，在非专利文献2及3中，对于抗坏血酸2-葡萄糖苷结晶报告由Ｘ射线的结构解析的结果。

本申请人，再者，在专利文献3及4中公开了，将含有由酶反应生成的抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液供于使用强酸性阳离子交换树脂的柱层析而采集高含抗坏血酸2-葡萄糖苷的级分的抗坏血酸2-葡萄糖苷高含有物的制造方法。另外，本申请人，在专利文献5中公开了，从含有由酶反应生成的抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液通过使用阴离子交换膜的电透析除去L-抗坏血酸或糖类等的杂质的抗坏血酸2-葡萄糖苷高含有物的制造方法，在专利文献6中公开了，使含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液与阴离子离子交换树脂接触，使吸附于阴离子离子交换树脂的成分选择性地脱离而得到高含抗坏血酸2-葡萄糖苷的级分的抗坏血酸2-葡萄糖苷高含有物的制造方法。

顺便而言，在专利文献7～11中公开了，嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearotheromophilus、现在被分类为嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus））来源的CGT酶和编码该CGT酶蛋白的基因的碱基序列、由碱基序列确定的氨基酸序列、还有，人为地导入变异而制备的变体CGT酶和使用其的糖质的制造方法。另外，在非专利文献4及5中公开了，通过使嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearotheromophilus）来源的CGT酶作用于含淀粉质和L-抗坏血酸的溶液，接下来使葡萄糖淀粉酶作用于其而生成抗坏血酸2-葡萄糖苷。

再者，本申请人在专利文献12中公开了使α-异麦芽糖基葡萄糖糖质生成酶、或者，α-异麦芽糖基葡萄糖糖质生成酶和CGT酶作用于含有L-抗坏血酸和α-葡萄糖基糖化合物的溶液而生成抗坏血酸2-葡萄糖苷的抗坏血酸2-葡萄糖苷的制造方法。另外，在由本申请人的专利文献13及14中各自公开了，α-异麦芽糖基葡萄糖糖质生成酶及α-异麦芽糖基转移酶催化向L-抗坏血酸的糖转移而生成抗坏血酸2-葡萄糖苷。

另外，关于抗坏血酸2-葡萄糖苷的用途，如例如专利文献15～34所示，有多数的提案。抗坏血酸2-葡萄糖苷，由于其优良的特性，不仅具有作为食品原料、食品添加物原料、化妆品原料、准药品原料、或者药品原料，具有一直以来的L-抗坏血酸的用途，还达到在由于L-抗坏血酸不稳定而以往无法使用L-抗坏血酸的其他用途中广泛使用。

如上所述，抗坏血酸2-葡萄糖苷，在现在知道，可以L-抗坏血酸和淀粉质作为原料，使用各种的糖转移酶制造。但是，根据本申请人至今得到的见解，作为糖转移酶使CGT酶作用于含有液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液的方法的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率最高，是工业上优良的方法。基于此见解，本申请人，通过使CGT酶作用于含有液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液的方法制造含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，将其作为化妆品－准药品原料及食品原料、食品添加物原料，分别作为商品名“AA2G”（株式会社林原生物化学研究所销售）及商品名“アスコフレッシュ”（株式会社林原商事销售）销售（以下，将这些作为化妆品－准药品原料、食品原料及食品添加物原料销售的以往的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末简称为“准药品级的粉末”。）。

但是，准药品级的粉末是制品规格上的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度是98.0质量%以上的比较高纯度，尽管在制造后立即具备作为粉末的良好的流动性，但有如果在高温、高湿的环境下长期间放置，则由自重或吸湿而固结的缺点。鉴于这样的缺点，准药品级的粉末以将其各10kg填充于聚乙烯制的袋，与干燥剂一同放入带盖的钢罐的商品形态销售，根据本发明人得到的其后的见解，即使是这样的商品形态，准药品级的粉末有如果保存期间经长期，则往往固结，作为粉末的有用性损害的问题。作为化妆品原料或准药品原料、或者食品原料、食品添加物原料使用的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末固结，原本、在制造厂前提设计原材料是有流动性的粉末时，有给原材料的输送或筛分，混合等的步骤导致障碍的担忧。

另一方面，本申请人作为分析用的标准试剂销售的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末（商品名“抗坏血酸2-葡萄糖苷999”、编码编号：AG124、株式会社林原生物化学研究所销售。）（以下，简称为“试剂级的粉末”。）（参照非专利文献6）在准药品级的粉末固结的条件下也不固结，保持作为粉末的性状。此试剂级的粉末是与准药品级的粉末相同，经使CGT酶作用于含有L-抗坏血酸和淀粉质的溶液的步骤，将得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液纯化、浓缩，析出抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶，通过采集其而制造的粉末，除了通常的步骤之外，在通过追加用将得到的结晶溶解而再晶析的再结晶步骤或，将再结晶步骤得到的结晶使用纯水等重复清洗的清洗步骤，将抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度提高至99.9质量%以上的极其高纯度的水平的点与准药品级的粉末不同。从而推测，是否在准药品级的粉末中，将抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度提高至99.9质量%以上，就会得到难固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。

但是，为了将抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度提高至99.9质量%以上的高纯度，如上所述，除了通常的制造步骤外，有必要追加再结晶步骤，或使用纯水等的重复的清洗步骤，不仅制造所要求的时间和劳力增加，无法避免再结晶步骤或清洗步骤中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的损失，制品的收率降低，制造成本大幅地升高而不适合。因此，以得到相比准药品级的粉末更难固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末作为目的而单纯将抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度提高至99.9质量%以上的选项不现实。另外，根据本发明人的见解，在试剂级的粉末中，与1,3-丁二醇水溶液等的在化妆品及准药品中广泛使用的亲水性溶剂混合时有溶解性变差的缺点。

这样的状况下、本申请人在重复各种试行错误的结果发现，在使CGT酶作用于含有液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液，接下来使葡萄糖淀粉酶作用于其的制造方法中，在由酶反应将得到的反应溶液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率提高到35质量%以上时，不溶解、再结晶采集的抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶，而通过以往的制造准药品级的粉末大致相同的步骤，可制造相比以往的准药品级的粉末更显著地难固结的粉末，在专利文献35中公开。但是，在上述的制造方法中，为了将由酶反应得到的反应溶液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率提高到35质量%以上，有必要将限定的特定的CGT酶单独，或者与异淀粉酶等的淀粉脱支酶联用而使用，从而有作为制造方法的泛用性差的不适合。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1:特开平3-139288号公报

专利文献2:特开平3-135992号公报

专利文献3:特开平3-183492号公报

专利文献4:特开平5-117290号公报

专利文献5:特开平5-208991号公报

专利文献6:特开2002-088095号公报

专利文献7:特开昭50-63189号公报

专利文献8:特开昭63-39597号公报

专利文献9:特开平5-244945号公报

专利文献10:国际公开WO96033267号单行本

专利文献11:国际公开WO99015633号单行本

专利文献12:特开2004-065098号公报

专利文献13:国际公开WO02010361号单行本

专利文献14:国际公开WO01090338号单行本

专利文献15:国际公开WO05087182号单行本

专利文献16:特开平4-046112号公报

专利文献17:特开平4-182412号公报

专利文献18:特开平4-182413号公报

专利文献19:特开平4-182419号公报

专利文献20:特开平4-182415号公报

专利文献21:特开平4-182414号公报

专利文献22:特开平8-333260号公报

专利文献23:特开2005-239653号公报

专利文献24:国际公开WO06033412号单行本

专利文献25:特开2002-326924号公报

专利文献26:特开2003-171290号公报

专利文献27:特开2004-217597号公报

专利文献28:国际公开WO05034938号单行本

专利文献29:特开2006-225327号公报

专利文献30:国际公开WO06137129号单行本

专利文献31:国际公开WO06022174号单行本

专利文献32:特开2007-063177号公报

专利文献33:国际公开WO06132310号单行本

专利文献34:国际公开WO07086327号单行本

专利文献35:国际公开WO2011/027790号单行本

【非专利文献】

非专利文献1：“山阳技术杂志”、第45卷、1号、63～69页（1997年）

非专利文献2:マンダイ·タカヒコ等，Carbohydrate Research、第232卷、197～205页（1992年）

非专利文献3:イノウエ·ユタカ等，International Journal ofPharmaceutics、第331卷、38～45页（2007年）

非专利文献4：Applied Biochemistry and Microbiology、第l43卷、1号、36-40页（2007年）

非专利文献5：Agricultural Biological Chemistry、第7卷、1751-1756页（1991年）

非专利文献6：Wako Analytical Circle、29号、6页（2003年）

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明，为了解决上述的不适合，以提供在由酶反应得到的反应溶液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率不满35质量%时也能制造相比准药品级的粉末显著地难固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造方法作为课题。

【解决课题的技术方案】

为了解决上述的课题，本发明人对于含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造方法重复再研究，重复各种试行错误的结果发现，从含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液析出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶时通过适用后述的控制冷却法或拟似控制冷却法，则即便由酶反应得到的反应溶液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率不满35质量%的水平，可以与一直以来进行的准药品级的粉末的制造方法大致无变化的步骤制造相比准药品级的粉末显著地难固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。

即，本发明通过提供包括下述（A）～（E）的步骤的，含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造方法解决了上述的课题：

（A）使CGT酶作用于作为原料的含液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液，接下来向其作用葡萄糖淀粉酶而得到抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是27质量%以上的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液的步骤；

（B）将得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液纯化，使抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算超86质量%的步骤；

（C）从含有以无水物换算超86质量%的抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液通过控制冷却法或拟似控制冷却法析出抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶的步骤；

（D）采集析出的抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶的步骤；及，

（E）通过对采集的抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶不进行溶解、再结晶化而进行成熟、干燥，根据需要粉碎，得到含有以无水物换算超98.0质量%但不足99.9质量%的抗坏血酸2-葡萄糖苷，基于粉末Ｘ射线衍射特征算出的对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度是90%以上的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的步骤。

如此根据本发明的制造方法，即便由酶反应得到的反应溶液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率达不到35质量%的水平，只要至少27质量%以上，通过将上述反应溶液适宜纯化而从得到的抗坏血酸2-葡萄糖苷溶液通过后述的控制冷却法或拟似控制冷却法将抗坏血酸的无水结晶析出，可得到含有以无水物换算超98.0质量%但不足99.9质量%的抗坏血酸2-葡萄糖苷，基于粉末Ｘ射线衍射特征算出的对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度是90%以上的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。

由这样的制造方法得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，其粉末中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度是超98.0质量%但不足99.9质量%，这尽管是与以往的准药品级的粉末同程度或不满其的水平，对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度（以下，本说明书中简写为“结晶化度”。）高达90%以上，不仅是相比准药品级的粉末显著地难固结的粉末，抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度不满99.9质量%，且是相比试剂级的粉末更在化妆品及准药品中泛用的向亲水性溶剂的溶解性优良的粉末。这样的粉末容易作为食品原料、食品添加物原料、化妆品原料、准药品原料、及药品作为原料，可适宜地使用。

顺便而言，在本发明的制造方法中，由酶反应得到的反应溶液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是27质量%以上即可，根据情况是35质量%以上也可。本发明的制造方法，在即便上述生成率是不满35质量%的27质量%以上但不足35质量%的水平，如果除去适用控制冷却法或拟似控制冷却法的点则能以与以往进行的准药品级的粉末的制造方法大致无变化的步骤，制造相比准药品级的粉末显著地难固结的粉末的点上特别优良。另外，本发明的制造方法有，在上述生成率是35质量%以上时，如果除去适用控制冷却法或拟似控制冷却法的点则能以与以往进行的准药品级的粉末的制造方法大致无变化的步骤，制造相比通过自然冷却法结晶化度更高，相比准药品级的粉末显著地难固结的粉末的益处。再有，在本发明的制造方法中，在得到抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是27质量%以上的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液的上述（A）的步骤中，如果必要，将异淀粉酶、支链淀粉酶等的淀粉脱支酶与CGT酶联用，再提高反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率也可。

再者，在本发明的制造方法中，将含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液纯化，在使抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算超86质量%的上述（B）的步骤中，进行将阴离子交换树脂作为填充剂使用的柱层析和将强酸性阳离子交换树脂作为填充剂使用的拟似移动床式的柱层析也可。在上述（B）的步骤中，在组合进行上述将阴离子交换树脂作为填充剂使用的柱层析和将强酸性阳离子交换树脂作为填充剂使用的拟似移动床式的柱层析时，得到可更有效得到抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算超86质量%的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液的益处。

再者，本发明人重复研究的结果判明，在上述（A）的步骤中，在由酶反应得到的反应溶液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率成27质量%以上的CGT酶中，有在氨基酸水平共通的特征。

即，本发明通过提供使用作为上述CGT酶，有下述（a）～（d）所示的部分氨基酸序列的CGT酶的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造方法也解决上述的课题；

（a）Asn-Glu-Val-Asp-X₁-Asn-Asn；

（b）Met-Ile-Gln-X₂-Thr-Ala；

（c）Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn-Ile；

（d）Val-X₃-Ser-Asn-Gly-Ser-Val。

（但是，X₁表示Pro或Ala，X₂表示Ser或Asp，X₃表示Ser或Gly。）

作为有上述（a）乃至（d）所示的部分氨基酸序列的CGT酶，可举出例如，嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）或嗜热产硫嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter thermosulfurigenes）来源的天然型或重组型的酶，更具体而言，可举出例如，有序列表中的SEQ ID NO:1、3、4及5之任何所示的氨基酸序列的CGT酶，这些CGT酶可在本发明中适宜地使用。

由本发明的制造方法得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，适宜地，不仅含有以无水物换算超98.0质量%但不足99.9质量%的抗坏血酸2-葡萄糖苷，基于粉末Ｘ射线衍射特征算出的对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度是90%以上，还具备含有原料来源的L-抗坏血酸及/或D-葡萄糖，L-抗坏血酸量是以无水物换算0.1质量%以下，粉末全体的还原力是不足1质量%的特性。

【发明效果】

根据本发明的制造方法，即便由酶反应得到的反应溶液中的在抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率不满35质量%时也可制造相比准药品级的粉末显著地难固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，所以得到关于酶反应中使用的酶、特别是CGT酶选择面大地扩大的大益处。另外，根据本发明的制造方法，由于提供了对于在酶反应中可实现27质量%以上的生成率的CGT酶共有的部分氨基酸序列的信息，得到基于此部分氨基酸序列，检索本发明的制造方法中能使用的CGT酶变得可能的益处。再者，根据本发明的制造方法得到，如果在从由酶反应得到的反应溶液析出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶析步骤中除去使用控制冷却法或拟似控制冷却法的点，以液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸作为原料，通过与以往的准药品级的粉末的制造方法步骤无变化的制造方法，可制造相比准药品级的粉末更显著地难固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，通过准药品级的粉末的制造中以往必要的时间、劳力、制造设备、及成本无大差的时间、劳力、制造设备、及成本，可制造相比准药品级的粉末显著地难固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的优良的益处。

顺便而言，由本发明的制造方法制造的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末在将其作为粉末状的食品原料、食品添加物原料、化妆品原料、准药品原料、及药品原料等使用时，由于构成粉末状原料的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末显著地难固结，得到不仅保存、储存，处理容易，而且在原料是有流动性的粉末作为前提制作的制造厂中使用，在原料的输送或，筛分，混合等的过程中无导致障碍的担忧的益处。

另外，由本发明的制造方法制造的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末可容易地调节为食品原料等中要求的粒度分布、即，含有粒径不足150μm的粒子至粉末全体的70质量%以上、并且，含有粒径53μm以上但不足150μm的粒子至粉末全体的40～60质量%的粒度分布，所以将其作为食品原料、食品添加物原料、化妆品原料、准药品原料、或者药品原料使用，也能得到不改变从前的制造步骤或原料规格而，可如从前使用的益处。再者，由本发明的制造方法制造的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末含有L-抗坏血酸及/或D-葡萄糖，并且，由于粉末全体的还原力超0质量%但不足1质量%，所以得到即便是以液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸作为原料制造的粉末，与氨基酸或蛋白质等的在分子内有氨基的他成分混合也不引发变色等的品质降低的担忧的益处。再者，由本发明的制造方法制造的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的L-抗坏血酸含量以无水物换算超0质量%但0.1质量%以下，所以以粉末单独长期间保存时，也无粉末自体着色为淡褐色的担忧，作为实质上无着色且白色的粉末，可作为食品原料、食品添加物原料、化妆品原料、准药品原料、及药品原料利用。

【附图说明】

【图1】是基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶组成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的由特征性Ｘ射线的粉末Ｘ射线衍射图之一例。

【图2】是基本上由无定形部分组成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的粉末的由特征性Ｘ射线的粉末Ｘ射线衍射图之一例。

【图3】是基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶组成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的由同步放射光的粉末Ｘ射线衍射图之一例。

【图4】是基本上由无定形部分组成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的粉末的由同步放射光的粉末Ｘ射线衍射图之一例。

【图5】是表示本发明中使用的含嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）Tc-91来源的CGT酶基因的重组DNA“pRSET-iBTC12”的结构及限制酶识别部位的图。

【图6】是示各种冷却图的图。

【实施方式】

1.用语的定义

在本说明书中以下的用语有以下的含义。

<结晶化度>

本说明书中所说的“对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度”是指由下述式［1］定义的数值。

式［1］：

【数1】

H₁₀₀：对于由基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶组成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末标准样品的粉末Ｘ射线衍射特征求出的结晶化度的解析值

H₀：对于由基本上由无定形部分组成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的粉末标准样品的粉末Ｘ射线衍射特征求出的结晶化度的解析值

H_s：对于由成为被验样品的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的粉末标准样品的粉末Ｘ射线衍射特征求出的结晶化度的解析值

在式［1］中，成为求出解析值H₁₀₀、H₀、H_s的基础的粉末Ｘ射线衍射特征（profile），通常、可由具备反射式或透过式的光学系统的粉末Ｘ射线衍射装置测定。粉末Ｘ射线衍射特征包括对于被验样品或标准样品中含的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的衍射角及衍射强度，作为从这样的粉末Ｘ射线衍射特征确定对于结晶化度的解析值的方法，可举出例如，Hermans法、Vonk法等。这些解析方法之中，使用Hermans法在简便性和精度的方面适宜。今日、这些的解析方法均被计算机软件化，使用具备搭载这样的计算机软件之任何的解析装置的粉末Ｘ射线衍射装置即可。

另外，作为求出解析值H₁₀₀的“基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶组成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末标准样品”，是对于抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度是99.9质量%以上（以下，只要无特别说明，在本说明书中将质量%简写为“%”。但是，本说明书中所说的对于结晶化度的%无此限制。）的粉末或单晶，在粉末Ｘ射线衍射图中，示对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶特有的衍射峰，使用基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶组成的。作为这样的粉末或单晶，可举出上述的试剂级的粉末、或者将其再结晶化得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末或抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的单晶。顺便而言，将基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶组成的含有上述抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末标准样品的粉末Ｘ射线衍射特征用由Hermans法的计算机软件解析时的解析值H₁₀₀，通常成为70.2～70.5%左右。

另一方面，作为求出解析值H₀的“基本上由无定形部分组成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的粉末标准样品”，使用是对于抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度是99.1%以上的粉末，其粉末Ｘ射线衍射图仅由无定形部分来源的光晕组成，基本上不示抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶所特有的衍射峰的粉末。作为这样的粉末，可举出例如，将求出上述的解析值H₁₀₀的标准样品溶解于适量的纯化水，浓缩之后，冷冻干燥，再者，通过真空干燥得到的由卡尔-费休法确定的水分含量成为2.0%以下的粉末。在实施这样的处理时，经验上知得到基本上由无定形部分组成的粉末。顺便而言，将基本上由无定形部分组成的含有上述抗坏血酸2-葡萄糖苷的粉末标准样品的粉末Ｘ射线衍射特征用由Hermans法的计算机软件解析时的解析值H₀通常成为7.3～7.6%左右。

再有，作为求出解析值H₀的标准样品，对于抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度高的是优选是无需多言的，从求出解析值H₁₀₀的标准样品如上述一样制备的求出解析值H₀的标准样品中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度如后述的实验1-1所示止于99.1%，尽管求出解析值H₁₀₀的标准样品的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度是99.9%以上而极其高。从而，“基本上由无定形部分组成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的粉末标准样品”的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度设为，如上所述，99.1%以上。

<平均微晶径>

一般而言，认为含有结晶的粉末中的1个粉末粒子由多个单晶、即，多个微晶构成。结晶粉末中的微晶的大小（微晶径）被认为反映在结晶粉末的特性上。本说明书中所说的“对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的平均微晶径”是指，将含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末供于粉末Ｘ射线衍射分析，在得到的粉末Ｘ射线衍射图中检测的衍射峰内、在由5个衍射峰、即，微晶的不均一歪所至的向衍射峰宽的影响少的比较低角的区域，选择与其他衍射峰良好分离的，衍射角（2θ）10.4°（米勒指数（hkl）：120）、13.2°（米勒指数：130）、18.3°（米勒指数：230）、21.9°（米勒指数：060）及22.6°（米勒指数：131）的衍射峰（参照图1的符号a～e），使用各自的半值幅（半宽）和衍射角，基于作为标准品使用硅（美国国立标准技术研究所（NIST）供给、Ｘ射线衍射用标准样品（“Si64℃”）时的测定值补正之后，由下述式［2］所示的“Scherrer的式”各自算出的微晶径的平均值。

式［2］：

【数2】

D = \frac{Kλ}{β \cos θ}

D：微晶的大小

λ：Ｘ射线的波长

β：衍射线幅（rad）

θ：衍射角（°）

K：常数（β使用半值幅（半宽）时0.9）

在一般粉末Ｘ射线衍射装置中搭载涉及的微晶径算出用的计算机软件，只要可得到含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，就可比较容易地测定所述结晶粉末中的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的平均微晶径。再有，被验样品在粉末Ｘ射线衍射的测定之前，将被验样品用研钵捣碎之后，由53μm的筛筛分，使用通过筛的粉末。

<还原力>

本说明书中所说的“粉末全体的还原力”是指，将D-葡萄糖作为标准物质使用，由本领域中广泛使用的Somongyi-Nelson法及蒽酮硫酸法分别求出基于D-葡萄糖换算的还原糖量及全糖量，可使用下述式［3］求出的，相对于所含的全糖量的还原糖量的百分率（%）。

式［3］：

【数3】

<粒度分布>

在本说明书中，粉末的粒度分布如以下一样确定。即，将根据日本工业规格（JISZ8801-1）的，开口是425、300、212、150、106、75及53μm的金属制网筛（株式会社饭田制作所制）正确地秤量之后，以此顺序重叠而安装到Ro-Tap筛振荡机（株式会社田中化学机械制造所制、商品名“R-1”），接下来，将秤取的一定量的样品载置到最上段的筛（开口425μm）上，在将筛重叠的状态下振荡15分钟之后，将各筛再度正确地秤量，通过从其质量减载置样品之前的质量，求出由各筛捕集的粉末的质量。其后，计算相对于载置到筛上的样品的质量的，由各筛捕集的有各粒度的粉末的质量的百分率（%），表示为粒度分布。

<抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率>

本说明书中所说的“抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率”是指使CGT酶等的酶作用于含有液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液而得到的酶反应液中的，无水物换算的抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量（%）。

<抗坏血酸2-葡萄糖苷的在无水物换算的含量>

抗坏血酸2-葡萄糖苷的在无水物换算的含量是指不含水分而计算时的全质量所占的抗坏血酸2-葡萄糖苷的质量百分率（%）。例如，溶液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的在无水物换算的含量是指不含溶液中含的水分而，相对于其余的全固体分的抗坏血酸2-葡萄糖苷的质量百分率。另外，粉末中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的在无水物换算的含量是指不含粉末中的水分而将余部作为粉末全质量计算时的相对于粉末全质量的抗坏血酸2-葡萄糖苷的质量百分率。

<CGT酶的活性>

在本说明书中“CGT酶的活性”如以下一样定义。即，对于含0.3%（w/v）可溶性淀粉、20mM醋酸缓冲液（pH5.5）、1mM氯化钙的底物水溶液5ml，加适宜稀释的酶液0.2ml，将底物溶液保持在40℃，反应第0分钟及反应第10分钟采样各0.5ml底物溶液，立即加到0.02N硫酸溶液15ml而停止反应之后，向各硫酸溶液各加0.2ml的0.1N碘溶液而呈色，10分钟后，由吸光光度计各自测定波长660nm中的吸光度，由下述式［4］作为淀粉分解活性算出。CGT酶的活性1单位定义为在这样的测定条件下，使溶液中的淀粉15mg的碘呈色完全地消失的酶的量。

式［4］：

【数4】

<异淀粉酶的活性>

在本说明书中“异淀粉酶的活性”如以下一样定义。即，对于含0.83%（w/v）Lintner可溶化蜡质玉米淀粉、0.1M醋酸缓冲液（pH3.5）的底物水溶液3ml加适宜稀释的酶液0.5ml，将底物溶液保持在40℃，反应第30秒钟和第30分钟30秒钟采样各0.5ml底物溶液，立即加各15ml的0.02N硫酸溶液而停止反应，向各硫酸溶液各加0.5ml的0.01N碘溶液，于25℃呈色15分钟之后，由吸光光度计分别测定在波长610nm的吸光度，由下述式［5］作为淀粉分解活性算出。异淀粉酶的活性1单位定义为，在这样的测定条件下，使波长610nm的吸光度增加0.004的酶的量。

式［5］：

【数5】

<支链淀粉酶的活性>

在本说明书中“支链淀粉酶的活性”如以下一样定义。即，将1.25%（w/v）出芽短梗孢糖（株式会社林原生物化学研究所制、支链淀粉酶活性测定用）水溶液作为底物溶液。将此底物溶液4ml和0.05M柠檬酸-磷酸缓冲液（pH5.8）0.5ml取到试管中，预热到30℃。通过加使用0.01M醋酸缓冲液（pH6.0）适宜稀释的酶液0.5ml，将底物溶液保持在30℃，在反应第30秒钟（对照液）和第30分钟30秒钟（反应液）各采样0.5ml的底物溶液，立即注入到Somongyi-铜液2ml而停止反应，供于Somongyi-Nelson法，由吸光光度计各自测定波长520nm中的吸光度来测定生成的还原力，由下述式［6］作为出芽短梗孢糖分解活性算出。支链淀粉酶的活性1单位定义为，在这样的测定条件下，1分钟游离相当于1微摩尔的麦芽三糖的还原力的酶的量。

式［6］：

【数6】

在标准液中使用D-葡萄糖（100μg/ml）

<控制冷却法>

本说明书中所说的“控制冷却法”是指由“控制的冷却”使结晶晶析的方法，作为晶析步骤设定的作业时间设为“τ”、晶析开始时的液温设为“T₀”、晶析结束时的目标液温设为“T_f”、时间“t”中的液温设为“T”，则时间t中的液温T在原则上由下述式［7］表示的冷却方法。

式［7］：

【数7】

T=T₀-(T₀-T_f)(t/τ)³

将控制冷却法使用将作为晶析步骤设定的作业时间作为横轴、将晶析时的液温作为纵轴的坐标图更具体（模式地）表示，则为如图6的符号a所示。如图6的符号a所示，根据控制冷却法，在液温高的晶析的初期液温缓慢降低，在液温在一定程度降低的晶析之后期成液温急速降低，t=τ/2的时间点、即，在晶析步骤之中间点的液温“T_m”维持至少T_m>［（T₀-T_f）/2+T_f］的关系（即，在晶析步骤之中间点的温度变化成总温度变化的不足50%）。在此液温的相对于时间的变化图中，控制冷却法与液温从T₀～T_f经时间τ直线性地降低的直线冷却（图6中的符号b）或，在液温高的晶析的初期液温以指数函数急速降低，越是到液温降低的晶析之后期液温越是缓慢降低的通常的自然冷却法（图6中的符号c）有明显区别。再有，为了使液温T作为由上述式［7］表示的时间t的函数而变化，优选使用例如，市售的泛用的晶析系统用程序恒温循环装置等。

在晶析步骤中适用这样的控制冷却法时，添加抗坏血酸2-葡萄糖苷的种晶之后，在晶析的初期，由于液温的冷却缓慢地进行，由冷却的急剧的过饱和度的升高和第二次的结晶核的形成被抑制，可使以添加的种晶作为结晶核的结晶优先成长。另一方面，在以添加的种晶作为结晶核的结晶形成的晶析的后期，通过将液温急速冷却，使形成的结晶同步成长，所以得到根据控制冷却法，得到含具备微晶少的粒径的结晶的糖膏的益处。再有，对于“制御冷却法”，例如，在「久保田德昭著、“分かり易いバッチ晶析”、分离技术会、2010年4月30日发行、32～47页」中详述。

<拟似控制冷却法>

本说明书中所说的“拟似控制冷却法”顾名思义是指与上述的控制冷却法拟似的冷却法，不是使液温T相对于时间t严密地根据上述式［7］变化，虽然也依赖于晶析中使用的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度、浓度、过饱和度、种晶的量等变化，但由于优选在作业时间t=τ/2的时间点（晶析步骤之中间点）结晶核大致形成，相对于时间t连续或阶段性地降低液温T至在t=τ/2的时间点的液温T的变化量（T₀-T_m）维持在总温度变化量（T₀-T_f）的5%以上但不足50%、优选为，10%以上但不足30%的范围的冷却法。在相对于时间t连续或阶段性地降低液温T至t=τ/2的时间点的液温T的变化量（T₀-T_m）是总温度变化量（T₀-T_f）的5%以上但不足50%时，在液温高的晶析的初期液温T相对于时间t缓慢地降低，在液温在一定程度降低的晶析之后期，液温T变得相对于时间t急速降低，作为结果，尽管有不及上述的控制冷却法的时候，得到含形成微晶少的粒径的结晶的糖膏，得到与控制冷却法大致同样的益处。

具体而言，例如，将作业时间τ分为至少2个，优选为3个以上的区间，在晶析步骤的初期的区间中，使冷却中的温度梯度趋缓（使冷却速度变慢），随着从初期乃至中期往后期，使温度梯度加大（使冷却速度变快），相对于时间t连续或阶段性地降低液温T至t=τ/2的时间点的液温T的变化量（T₀-T_m）成为总温度变化量（T₀-T_f）的5%以上但不足50%、优选为，10%以上但不足30%即可。在t=τ/2的时间点的液温T的变化量（T₀-T_m）是总温度变化量（T₀-T_f）的50%以上时，晶析的初期的冷却速度过快，通过由冷却的急剧的过饱和度的升高而有形成二次结晶核的担忧，在不足5%时，晶析的初期的冷却速度过慢，不充分地形成以添加的种晶作为结晶核的结晶而直接而迎对急速的冷却开始的晶析后期，无论如何，得到含具备微晶少的粒径的结晶的糖膏变得困难。

为了进行上述的控制冷却法，有将液温T作为以式［7］表示的时间t的函数而变化的必要，可以设定的程序控制液温的装置或晶析罐是必须的，但根据拟似控制冷却法，由于相对于时间t连续或阶段性地降低液温T至成为t=τ/2的时间点的液温T的变化量（T₀-T_m）是总温度变化量（T₀-T_f）的5%以上但不足50%、优选为，10%以上但不足30%即可，所以在拟似控制冷却法中，有即使在无精密地控制液温的设备的情况中，也可比较容易地实行的益处。

2.由本发明的制造方法得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末

以下，对于由本发明的制造方法得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末进行说明。

<抗坏血酸2-葡萄糖苷含量及其他杂质含量>

由本发明的制造方法得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，如上所述，是以无水物换算，抗坏血酸2-葡萄糖苷超98.0%但不足99.9%的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，在适宜的情况下，上述粉末含有原料来源的L-抗坏血酸及/或D-葡萄糖，粉末全体的还原力超0%但不足1%。如所熟知，L-抗坏血酸或D-葡萄糖有直接还原性，在氨基酸或蛋白质等的在分子内有氨基的化合物的共存下加热则引起褐色的着色，所以这些物质含在作为制品的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中是不优选的。但是，例如，在经使CGT酶等的酶作用于含有液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液的步骤而制造含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末时，量的多寡姑且不论，无法避免未反应的L-抗坏血酸，或作为原料的液化淀粉或糊精之任何中来源的D-葡萄糖等作为反应杂质混入作为制品的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。例如，在以往的准药品级的粉末中，所含的L-抗坏血酸和D-葡萄糖的量以无水物换算的两者的合计达约1%，作为食品原料等使用时有引起未预期的褐色的着色的情况。

从而，在本发明的制造方法中，容许必然无法避免的L-抗坏血酸及/或D-葡萄糖的混入的同时，使含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中的粉末全体的还原力调节为不足1%、具体而言超0%但不足1%。如后述的实验所示，在由本发明的制造方法制造本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末时，使粉末全体的还原力超0%但不足1%是容易的。即使含有L-抗坏血酸及/或D-葡萄糖，如果粉末全体的还原力超0%但不足1%，则在氨基酸或蛋白质等的在分子内有氨基的化合物的共存下加热也基本上不引起褐色的着色。从而，含有L-抗坏血酸及/或D-葡萄糖，并且，粉末全体的还原力超0%但不足1%的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末不会引起着色或变色，有可向食品、化妆品、准药品、药品一般配合使用的益处。顺便而言，粉末全体的还原力不足1%时，含的L-抗坏血酸的量是以无水物换算0.1%以下。

另外，由本发明的制造方法得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末是，L-抗坏血酸含量在以无水物换算0.1%以下，具体而言超0%但0.1%以下。L-抗坏血酸如作为氧化防止剂或脱氧剂在食品等中使用而与氧的反应性高。因此认为，L-抗坏血酸在分子内有氨基的化合物的共存下加热则不仅引起褐色的着色，与含有L-抗坏血酸的粉末自体的着色也深度相关。现在，如后述的实验所示，在准药品级的粉末中含0.2%左右L-抗坏血酸，但根据本发明人得到的见解，准药品级的粉末是，如果将其以前述的商品形态比较长期间保存，则往往见到，粉末自体着色为淡褐色的现象。对此，在含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中的L-抗坏血酸含量超0%但0.1%以下时，将此粉末与准药品级的粉末以同样的商品形态比较长期间保存也不会有粉末自体着色为淡褐色的悬念。顺便而言，根据本发明的制造方法，在纯化步骤，通过进行使用用于除去D-葡萄糖等的糖类的阴离子交换树脂的柱层析，接着进行使用阳离子交换树脂或多孔性树脂的柱层析，特别是，在作为使用阳离子交换树脂的柱层析而使用拟似移动床式时，可不升高制造成本而比较容易地，使含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中的L-抗坏血酸含量超0%但在0.1%以下。

<结晶化度及平均微晶径>

由本发明的制造方法得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的基于粉末Ｘ射线衍射特征算出的对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度是90%以上，并且，平均微晶径是

以上但不足

如以下的实验所示，结晶化度及平均微晶径在上述水平的本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末具备，抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度、即，在无水物换算的抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量是与准药品级的粉末大致相同的水平，或即使不满试剂级的粉末中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度，相比准药品级的粉末显著地难以固结，另外，相比试剂级的粉末在化妆品及准药品中广泛使用的向亲水性介质的溶解性优良的特性。

<粒度分布>

由本发明的制造方法得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，在其适宜的一实施方式中，含有粒径不足150μm的粒子占粉末全体的70%以上、并且，含有粒径53μm以上但不足150μm的粒子占粉末全体的40～60%。由本发明的制造方法得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，例如，可容易地调节到食品原料等中要求的上述的粒度分布，所以有作为食品原料、食品添加物原料、化妆品原料、准药品原料、或者药品原料，可不改变制造步骤或原料规格而如从前使用的益处。

3.本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造方法

以下，对于本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造方法进行说明。

本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造方法基本上包括以下的（A）乃至（E）的步骤：

（A）使CGT酶作用于含液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液，接下来，通过向其作用葡萄糖淀粉酶而生成抗坏血酸2-葡萄糖苷，得到葡萄糖淀粉酶处理后的反应液的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率是27%以上的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液的步骤；

（B）将得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液纯化，使抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算超86%的步骤；

（C）从含有以无水物换算超86%的抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液通过控制冷却法或拟似控制冷却法析出抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶的步骤；

（E）对采集的抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶不进行溶解、再结晶化而进行成熟、干燥，通过根据需要粉碎，得到以无水物换算含有超98.0%不足99.9%的抗坏血酸2-葡萄糖苷，基于粉末Ｘ射线衍射特征算出的对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度是90%以上的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的步骤。

以下，对各步骤进行说明。

<（A）的步骤>

（A）的步骤是通过使CGT酶作用于含液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液，接下来向其作用葡萄糖淀粉酶，使葡萄糖淀粉酶处理后的反应液的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率成为27%以上的步骤。首先，对使用的原料及酶进行说明，接下来，对于进行的酶反应进行说明。

A.使用原料及酶

【L-抗坏血酸】

作为使用的L-抗坏血酸，羟基酸的形态，碱金属盐、碱土金属盐等的金属盐的形态，还有，它们的混合物均可。

【液化淀粉或糊精】

另外，作为使用的液化淀粉或糊精，可举出将马铃薯淀粉、甘藷淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉等用耐热性α-淀粉酶液化而得到的液化淀粉或糊精。在反应时，与CGT酶一同，联用例如，异淀粉酶（EC3.2.1.68）、支链淀粉酶（EC3.3.1.41）等的淀粉脱支酶，将淀粉的分支部分切断是优选的。液化淀粉或糊精是，相比环糊精或直链淀粉，适宜于在工业规模的大量制造的原料。

【CGT酶】

作为使用的CGT酶（EC2.4.1.19），使CGT酶单独，或者与淀粉脱支酶一同作用于含有液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液，接下来，向其作用葡萄糖淀粉酶之时，只要可以27%以上的生成率生成抗坏血酸2-葡萄糖苷，对其起源或来源无特别的限制，可为天然的酶，也可为由基因重组得到的酶，还有也可为向天然或重组型酶导入氨基酸的取代、附加、缺失的变体酶。

再有，根据本发明人得到的见解，使CGT酶单独，或者与淀粉脱支酶一同作用于含有液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液，接下来，向其作用葡萄糖淀粉酶之时，可以27%以上的生成率生成抗坏血酸2-葡萄糖苷的CGT酶，通常作为共通的部分氨基酸序列，有下述（a）乃至（d）所示的部分氨基酸序列：

（a）Asn-Glu-Val-Asp-X₁-Asn-Asn；

（b）Met-Ile-Gln-X₂-Thr-Ala；

（c）Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn-Ile；

（d）Val-X₃-Ser-Asn-Gly-Ser-Val。

作为这样的CGT酶，可举出例如，嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）或嗜热产硫嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter thermosulfurigenes）来源的天然型或重组型酶，具体而言，可将嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus）Tc-91株来源的CGT酶、即有序列表中的SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的CGT酶或，通过向序列表中的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列由基因工程学方法导入氨基酸残基的取代、缺失、附加而制备的CGT酶变体、具体而言，有序列表中的SEQ ID NO:4或5所示的氨基酸序列的CGT酶变体、还有，有序列表中的SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列的嗜热产硫嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter thermosulfurigenes）来源的CGT酶或所述CGT酶的变体等作为适宜的例举出。

再有，嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）Tc-91株是由相同的申请人的特开昭50-63189号公报（特公昭53-27791号公报）中公开的微生物，当初、作为FERM-P2225在1973年7月30日国内保藏，在2010年8月6日以保藏号FERM BP-11273在茨城县筑波市东1-1-1中央第6所在的独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心国际保藏。顺便而言，已知嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）Tc-91株来源的CGT酶是有约68,000道尔顿的分子量的酶，相比其他微生物来源的CGT酶糖转移作用强。另外，所述CGT酶的其基因被克隆，由基因的碱基序列（序列表中的SEQ ID NO:2所示的碱基序列）确定成熟型CGT酶的氨基酸序列（序列表中的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列），已知在所述CGT酶的氨基酸序列上存在在被分类为α-淀粉酶家族的酶组中共存在的4个保守区域。另外，所述CGT酶蛋白的立体结构已经通过Ｘ射线结晶结构解析明了。再者，也判明所述CGT酶的3个催化剂残基、即，序列表中的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的第225天冬氨酸（D225）、第253谷氨酸（E253）、第324天冬氨酸（D324）（参照“工业用糖质酶手册”、讲谈社Scientific社编集、讲谈社发行、56～63页（1999年））。

另外，作为嗜热产硫嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacterthermosulfurigenes）来源的CGT酶，具体而言，所述微生物来源的CGT酶作为重组型酶制造的酶剂（商品名“Toruzyme3.0L”、Novozyme·日本公司制）已市售。对于嗜热产硫嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter thermosulfurigenes）来源的CGT酶，其理化学性质或氨基酸序列等也已经明了。

【淀粉脱支酶】

使CGT酶作用于含液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液之时，联用淀粉脱支酶，可提高抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率。作为淀粉脱支酶，异淀粉酶在酶活性及底物特异性等的方面易操作而特别优选。作为异淀粉酶，可举出例如，介支淀粉假单胞菌（Pseudomonasamyloderamosa）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、黄杆菌属（Flavobacterium sp.）来源的酶，将同微生物中的基因重组得到的变异异淀粉酶。再有，作为芳香黄杆菌（Flavobacterium odoratum）来源的异淀粉酶，可使用合同酒精株式会社制造的异淀粉酶剂（商品名“GODO-FIA”）。

另外，作为支链淀粉酶，可举出例如，芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、嗜酸普鲁兰芽孢杆菌（Bacillus acidopullulyticas）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、产气克雷伯菌（Klebsiella aerogenes）、Pennivorans黄杆菌（Flavobacterium pennivorans）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）来源的。

【葡萄糖淀粉酶】

对于使用的葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3）也无特别限制，只要在使CGT酶作用于含有液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液，接下来，向其作用葡萄糖淀粉酶之时，可生成抗坏血酸2-葡萄糖苷，对其起源或来源无特别的限制，天然的酶也可，由基因重组得到的酶也可。

葡萄糖淀粉酶由于，通常、将酶反应液加热而停止由CGT酶的糖转移反应后添加，可节约加热后的酶反应液的冷却所要求的能量和时间，可对于在比较高的温度、例如40～60℃左右的温度实用发挥足够的酶活性的是优选的。另外，使用的葡萄糖淀粉酶含α-葡萄糖苷酶时，由于生成的抗坏血酸2-葡萄糖苷被水解，作为葡萄糖淀粉酶使用基本上不含α-葡萄糖苷酶的是优选的。只要满足这样的条件，在使用的葡萄糖淀粉酶的给源、纯度上无特别的限制，例如，作为葡萄糖淀粉酶剂可适宜地使用市售的属于根霉（Rhizopus）属的微生物来源的酶剂（商品名“Glucozyme＃20000”Nagase ChemteX株式会社销售）或，曲霉（Aspergillus）属的微生物来源的酶剂（商品名“GluczymeAF6”天野酶株式会社销售）。

B.酶反应

接下来，对向L-抗坏血酸的糖转移反应进行说明。首先，使CGT酶作用于含有液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液（通常是水溶液）。使CGT酶作用于含液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的水溶液，则由CGT酶的酶作用，1个或2个以上的D-葡萄糖转移到L-抗坏血酸的2位的羟基，生成1个的D-葡萄糖结合到上述2位的羟基的抗坏血酸2-葡萄糖苷的同时，生成2个以上的D-葡萄糖结合到上述2位的羟基的2-O-α-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽三糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽四糖基-L-抗坏血酸等的α-糖基-L-抗坏血酸。

通常、对于将液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸溶解至底物浓度成1～40%的水溶液以每1g底物1～500单位的比例添加CGT酶，将所述溶液保持在pH约3～10、温度30～70℃，反应6小时以上、优选为约12～96小时。由于L-抗坏血酸易由氧化分解，反应中，优选将溶液在厌氧或还原状态保持的同时，阻断光，根据需要，向反应溶液共存，例如，硫脲、硫化氢等的还原剂。

溶液中的液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的质量比优选设定为以无水物换算8:2～3:7的范围。如果与液化淀粉或糊精之任何的比例相比此范围更大，则虽然向L-抗坏血酸的糖转移有效进行，抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率受由L-抗坏血酸的始发浓度的制约，止于低水平。相反，如果L-抗坏血酸的比例相比上述的范围更大，则未反应的L-抗坏血酸大量残留而对于工业的生产不优选。从而，具有上述的比率的范围最好。

再有，除了CGT酶，作为淀粉脱支酶联用异淀粉酶时，使异淀粉酶在含有液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液中与CGT酶共存的状态下作用于液化淀粉或糊精之任何是优选的，作为添加量，虽然也随异淀粉酶的种类、最适温度、最适pH等变化，但通常、每1g底物200～2,500单位，在55℃以下反应。另外，作为淀粉脱支酶使用支链淀粉酶时，通常、每1g底物1～500单位，以异淀粉酶基准使用即可。

由CGT酶、或者CGT酶和淀粉脱支酶的酶反应完全结束之后，将酶反应液立即加热而使CGT酶、或者CGT酶和淀粉脱支酶失活而停止酶反应，接下来，使葡萄糖淀粉酶作用于此酶反应液。使葡萄糖淀粉酶作用，则与L-抗坏血酸的2位的羟基结合的2个以上的D-葡萄糖链被切断，2-O-α-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽三糖基-L-抗坏血酸等的α-糖基-L-抗坏血酸转变为抗坏血酸2-葡萄糖苷。

<（B）的步骤>

（B）的步骤是，将在上述（A）的步骤得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液纯化，使抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算超86%的步骤。即，将在（A）的步骤中得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液由活性炭等脱色过滤，将滤液由阳离子交换树脂脱盐，再者，通过适用柱层析，使溶液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算超86%、优选纯化至88%以上。作为纯化中使用的柱层析，只要可提高溶液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算超86%，则原则上使用任何柱层析均可，但作为适宜的例，使用用于除去D-葡萄糖等的糖类的阴离子交换树脂的柱层析，接着使用阳离子交换树脂或多孔性树脂的柱层析进行即可。作为用于除去D-葡萄糖等的糖类的优选的阴离子交换树脂，可举出“AmberliteIRA411S”、“AmberliteIRA478RF”（以上、Rohm&Hass公司制）、“DIAIONWA30”（三菱化学株式会社制）等。作为用于分离抗坏血酸2-葡萄糖苷和L-抗坏血酸的优选的阳离子交换树脂，可举出“Dowex50W×8”（Dow Chemical公司制）、“AmberliteCG120”（Rohm&Hass公司制）、“XT-1022E”（东京有机化学工业株式会社制）、“DIAIONSK104”、“DIAIONUBK550”（以上、三菱化学株式会社制）等。作为多孔性树脂，可举出“TOYOPEARLHW-40”（Tosoh株式会社制）、“CellfineGH-25”（CHISSO株式会社制）等。使用阳离子交换树脂或多孔性树脂进行柱层析时，向柱负荷的原料液的浓度是固体分约10～50%、向树脂的负荷量是湿润树脂容积的约1/1000～1/20、将与湿润树脂容积大致等量的纯化水以线速度0.5～5m/时间通液是优选的。在其中也是，在作为使用阳离子交换树脂的柱层析使用拟似移动床式时，纯化得到的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度升高，L-抗坏血酸或D-葡萄糖等的杂质、特别是，L-抗坏血酸含量降低，得到L-抗坏血酸含量以无水物换算0.1%以下而少的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的而是优选的。顺便而言，作为将阳离子交换树脂作为填充剂使用的拟似移动床式的柱层析中的洗脱条件，虽也随操作温度、设定流速等变化，供于拟似移动床式的柱层析的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液的浓度以无水物换算是60%以下，含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液的负荷量相对于湿润树脂容积以容积比是1/20以下，作为洗脱液使用的纯化水量以容积比是上述负荷量的至30倍，通常、3～20倍左右是优选的。

在溶液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量以无水物换算86%以下时，即便经后续的（C）～（E）的步骤，也难得到对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度是90%以上的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。其理由被认为是因为，在溶液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量以无水物换算是86%以下时，经其后的步骤得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度低，结晶化无法平顺进行。

将抗坏血酸2-葡萄糖苷含量纯化至以无水物换算超86%、优选为88%以上的溶液，在使抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶析出的步骤之前，浓缩至指定的浓度、通常是，抗坏血酸2-葡萄糖苷浓度约65～85%。浓缩液的温度，通常、调节为约30～45℃。此浓度及温度作为对于抗坏血酸2-葡萄糖苷的过饱和度相当于1.05～1.50。

<（C）的步骤>

（C）的步骤是从以无水物换算超86%、优选为88%以上含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液通过控制冷却法或拟似控制冷却法析出抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶的步骤。即，将纯化、浓缩至上述（B）的步骤中指定的纯度及浓度，调节到指定的温度的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液移到结晶罐，使含有0.1～5%（w/v）、适宜地为0.5～2%（w/v）的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的种晶，缓慢地搅拌着，通过控制冷却法或拟似控制冷却法在晶析步骤的初期使液温缓慢地降低，在晶析步骤之后期使液温急速降低而结晶。晶析所要求的时间尽管随抗坏血酸2-葡萄糖苷的种晶的添加量而不同，例如，在通过拟似控制冷却法时，将全晶析时间分为至少2个，优选为3个以上的区间，在各区间内相对于时间使温度大致直线性地降低，相对于时间t连续或阶段性地降低液温T至作业时间t=τ/2的时间点（晶析步骤之中间点）的液温T的变化量（T₀-T_m）维持在总温度变化量（T₀-T_f）的5%以上但不足50%、优选为，10%以上但不足30%的范围即可。例如，在经48小时使液温从40℃冷却至15℃而使结晶晶析时，将冷却时间分为36小时和12小时的2个区间，液温经36小时从40℃冷却至30℃，接下来，经12小时从30℃冷却至15℃，或者，使液温经30小时从40℃冷却至35℃，接下来，经18小时从35℃冷却至15℃是优选的，再优选为，将冷却时间分为24小时、12小时、12小时的3个区间，在最初的区间经24小时使液温从40℃冷却至35℃，在接下来的区间经12小时从35℃冷却至27.5℃，再者，在最后的区间经12小时使液温从27.5℃冷却至15℃是优选的。

如此，在通过控制冷却法或拟似控制冷却法时，相比不进行温度控制而自然冷却的晶析法，难以生成抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的微晶，可得含具备粒径的结晶的糖膏。另外，如后所述，得到的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶粉末，相比由自然冷却法得到的粉末，在抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度、及成为固结性的重要的指标的对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度的方面也具备高的特征。另外，在由控制冷却法或拟似控制冷却法时，相比由自然冷却的晶析法得到的粉末，有得到更具备粒度分布的粉末的益处。

<（D）的步骤>

此步骤是，从（C）的晶析步骤得到的糖膏，根据常规方法的固液分离方式，将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶通过离心分离采集的步骤。采集的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶，为了除去附着于表面的非晶的蜜，喷雾少量的纯化水（淋浴）而清洗。再有，结晶的清洗中使用的纯化水的量，通常、相对于离心分离前的糖膏的重量，3%以上、至10%是优选的。即，清洗中使用的纯化水的量不足3%，则清洗无法充分地进行，非晶的蜜残留，有得不到期望的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度的担忧。另一方面，清洗中使用的纯化水的量超10%，则由清洗溶解、除去的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的量增加，有结晶的收率降低的担忧。

<（E）的步骤>

（E）的步骤是对采集的抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶不进行溶解、再结晶化，而进行成熟、干燥，根据需要粉碎的步骤。即，将由离心分离采集的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶用少量的脱离子水或蒸馏水等的纯化水等清洗，冲洗附着于结晶表面的杂质。对清洗中使用的水的量无特别的限制，但如果过多，则不仅表面的杂质，晶体自身也溶解而收率降低，而且，清洗水的成本也上升，所以通常是，使用结晶质量的至30%，优选为15～25%的量的清洗水清洗结晶表面是优选的。清洗的结晶通过在指定的温度及湿度气氛中保持一定时间而成熟、干燥，作为含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。尽管成熟、干燥步骤中的含有结晶的粉末的产品温度或气氛的相对湿度、以及，成熟、干燥时间，只要得到示期望的结晶化度的粉末，则无特别的限制，但在成熟、干燥步骤中，含有结晶的粉末的产品温度保持在20～55℃、气氛的相对湿度保持在60～90%是优选的。另外，成熟、干燥时间以两者的合计，约5～24小时是优选的。经成熟、干燥步骤的含有结晶的粉末，接下来，自然放冷却至室温。另外，也可有利地实施吹室温程度的清洁的空气而强制冷却到至室温程度的产品温度。将得到的结晶粉末直接，或者，根据需要粉碎而作为制品。

上述（A）乃至（E）的步骤，除上述（D）的由控制冷却法或拟似控制冷却法的晶析步骤外，与准药品级的粉末的制造步骤基本上相同，不含在试剂级的粉末的制造步骤中必须的，再结晶步骤或，重复清洗结晶的步骤。

如此得到的粉末是以无水物换算含有抗坏血酸2-葡萄糖苷超98.0%但不足99.9%，基于粉末Ｘ射线衍射特征算出的对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度是90%以上的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，更优选为，是以无水物换算含有抗坏血酸2-葡萄糖苷超98.0%但不足99.9%，基于粉末Ｘ射线衍射特征算出的对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度是90%以上，并且，含有原料来源的L-抗坏血酸及/或D-葡萄糖，L-抗坏血酸量以无水物换算是0.1%以下，粉末全体的还原力不足1%的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。这样的粉末是，在以往的准药品级的粉末固结的条件下也不固结，相比准药品级的粉末显著地难固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。再者，所述粉末也有，相比试剂级的粉末，在化妆品及准药品中广泛使用的向亲水性溶剂的溶解性也优良的益处。

由本发明的制造方法制造的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，由于相比以往的准药品级的粉末显著地难固结，具备在包括使用将处理粉末原料设计为前提的制造厂的饮料的食品制造、化妆品制造、准药品制造、还有药品制造的各领域中，其他单独或多个粉末状的食品原料、食品添加物原料、化妆品原料、准药品原料、药品原料等中可安心含有的优良的益处。

以下，由实验具体说明本发明。

<实验1：结晶化度对含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的固结性的影响>

制备结晶化度在0～100%的范围的多种含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，通过测试它们的固结性，研究含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中的结晶化度和固结性的关联性。详细如下。

<实验1-1：被验样品的制备>

<被验样品1>

作为基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶组成的标准样品，使用试剂级的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末（商品名“抗坏血酸2-葡萄糖苷999”、编码编号：AG124、纯度99.9%以上），将其作为被验样品1。

<被验样品2>

作为基本上由无定形部分组成的标准样品，使用将被验样品1溶解于适量的纯化水，冷冻干燥3天之后，在40℃以下真空干燥1晚而得到的，基本上由无定形部分组成的粉末，将其作为被验样品2。再有，将被验样品2的水分含量由卡尔-费休法测定是2.0%。

<被验样品3、4>

作为被验样品3、4，由以下的顺序制备结晶化度落在被验样品1和被验样品2之间的样品。即，将由如同被验样品2制备的无定形部分组成的粉末在金属制托盘内延展，通过在调节到温度25℃、相对湿度90%的恒温、恒湿的室内收容24小时或72小时来促进结晶化，将粉末部分结晶化。其后，金属制托盘从室中取出，通过于38℃真空干燥一晚来制备2种粉末。在恒温、恒湿的室内的收容时间是24小时的作为被验样品3、72小时的作为被验样品4。再有，被验样品3及4在供于分析试验前在带盖的瓶内密封，与干燥剂一同在干燥器内密封保存。

<实验1-2：被验样品1～4的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度和结晶化度>

<抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度>

如以下一样求出被验样品1～4的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度。即，将被验样品1～4之任何由纯化水制成2%溶液，由0.45μm膜滤器过滤之后，供于由下述条件的液相层析（HPLC）分析，从由示差折射计的层析谱中出现的峰的面积计算，进行无水物换算。结果示于表1。

·分析条件

HPLC装置：“LC-10AD”（株式会社岛津制作所制）

脱气器：“DGU-12AM”（株式会社岛津制作所制）

柱：“WakopakWakobeadsT-330”（和光纯药工业株式会社销售H⁺型）

样品注入量：10μl

洗脱液：0.01%（容积/容积）硝酸水溶液

流速：0.5ml/分

温度：25℃

示差折射计：“RID-10A”（株式会社岛津制作所制）

数据处理装置：“ChromatoPacC-R7A”（株式会社岛津制作所制）

<结晶化度>

如以下一样求出被验样品1～4中的结晶化度。即，使用市售的由反射光方式的粉末Ｘ射线衍射装置（Spectris株式会社制、商品名“X’PertPROMPD”），基于作为从Cu对阴极放射的特性Ｘ射线的由CuKα线（Ｘ射线管电流40mA、Ｘ射线管电压45kV、波长

）的粉末Ｘ射线衍射特征，使用搭载在同粉末Ｘ射线衍射装置的专用的解析计算机软件，对于各被验样品1～4求出由Hermans法的结晶化度的解析值。在由Hermans法的结晶化度的解析之前，检查各粉末Ｘ射线衍射图中的峰的重成，衍射强度、散射强度等，将软件中设定的粒状度及弯曲因子调整到各自适宜的水平至得到被判断为最适的基线，。再有，对于Hermans法，在P.H.Harmans和A.Weidinger、“Journal of Applied Physics”、第19卷、491～506页（1948年）、及，P.H.Harmans和A.Weidinger、“Journal of Polymer Science”、第4卷、135～144页（1949年）中详述。

通过将对于被验样品1的结晶化度的解析值作为解析值H₁₀₀、将对于被验样品2的结晶化度的解析值作为解析值H₀，将对于各被验样品的结晶化度的解析值作为H_s而代入上述的式［1］来求出结晶化度。顺便而言，对于被验样品1的由Hermans法的结晶化度的解析值（解析值H₁₀₀）及对于被验样品2的同解析值（解析值H₀）分别是70.23%及7.57%。结果集中示于表1。再有，对于作为标准样品的被验样品1及2，将粉末Ｘ射线衍射图分别示于图1及图2。

如图1所示，在被验样品1的粉末Ｘ射线衍射图中，抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶所特有的衍射峰明显并且锐利地出现在衍射角（2θ）4～65°的范围，完全确认不到无定形部分所特有的光晕。另一方面，如图2所示，在被验样品2的粉末Ｘ射线衍射图中，与图1的粉末Ｘ射线衍射图不同，虽然无定形部分所特有的光晕作为基线的膨起显著地出现，完全确认不到抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶所特有的衍射峰。

<实验1-3：被验样品1及2的由同步放射光的粉末Ｘ射线衍射>

本实验以再证实被验样品1及2各自作为用于确定解析值H₁₀₀及H₀的标准样品而适宜作为目的，将这些被验样品供于将同步放射光（以下，也称为“放射光”。）用于Ｘ射线源而可检测微弱的衍射或散射的信号的透射光方式的粉末Ｘ射线衍射。再有，测定条件如下。

<测定条件>

粉末Ｘ射线衍射装置：高速粉末Ｘ射线衍射装置（神津精机公司销售、

型番“PDS-16”）、Debye Scherrer模式、

照相机长：497.2mm

Ｘ射线源：从偏向电磁石的放射光（兵库县Beam Line（BL08B2））

测定波长：

（16.066keV）

测定强度：10⁹光子/秒

测定角：2～40°

曝光时间：600秒钟

图像摄影：成像板（富士胶卷公司制、商品名『成像板BAS-2040』）

图像读取装置：像分析仪（富士胶卷公司制、『生物图像分析仪BAS-2500』）

测定利用大型放射光设施“SPring-8”（兵库县佐用郡佐用町光都1-1-1）内设的“兵库县Beam Line（BL08B2）”实施。

粉末Ｘ射线衍射的测定之前，将被验样品1及2用研钵研碎之后，由53μm的筛筛分，将通过筛的粉末填充到Ｘ射线结晶衍射用的毛细管（株式会社Toho销售、商品名“Marktube”、No.14（直径0.6mm、Lindeman玻璃制））内而均一地填充至长大致30mm。接下来，将毛细管在样品的填充终端切断，将开口部用粘接剂封住之后，将毛细管用粘土固定到样品架，毛细管的纵向相对于粉末Ｘ射线衍射装置的光轴垂直，将样品架设置到粉末Ｘ射线衍射装置。

为了除去抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的取向对粉末Ｘ射线衍射特征的影响，测定中，向毛细管的纵向，以1次/60秒钟的周期，将样品架以±1.5mm的幅度等速往复振动，将毛细管的纵向作为旋转轴，使样品架以2次/秒的周期等速旋转。

对于被验样品1及2解析得到的粉末Ｘ射线衍射特征，在制成粉末Ｘ射线衍射图的过程中，为了升高测定精度，根据常规方法，从各粉末Ｘ射线衍射特征除去来源于粉末Ｘ射线衍射装置的背景信号。将如此得到的对于被验样品1及2的粉末Ｘ射线衍射图各自示于图3及图4。

如图3所示，在由使用放射光的粉末Ｘ射线衍射的对于被验样品1的粉末Ｘ射线衍射图中，抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶所特有的衍射峰在衍射角（2θ）2～40°的范围明显并且锐利地出现。将图3和图1比较，由于放射光的波长

和特性Ｘ射线的波长不同，虽然在图3中有各衍射峰以图1中的大致2分之1的衍射角（2θ）出现的差异，图1及图3中的衍射图极其良好地一致。另外，尽管图3中的各衍射峰的强度相比在图1中的衍射峰的强度强近100倍，各衍射峰的半值幅相比在图1中的明显更窄，分离度也高。另外，在图3的粉末Ｘ射线衍射图中，如同后述的图4中所示，完全确认不到无定形部分所特有的光晕。这表明，被验样品1中的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶性极其高，被验样品1基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶组成。

另一方面，和图4所示，在由使用放射光的粉末Ｘ射线衍射的对于被验样品2的粉末Ｘ射线衍射图中，无定形部分所特有的光晕作为基线的膨起显著地出现，完全确认不到抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶所特有的衍射峰。这表明，被验样品2基本上由无定形部分组成。

将放射光作为Ｘ射线源使用而得到的上述的结果证实，被验样品1及被验样品2作为用于确定式［1］中的解析值H₁₀₀及解析值H₀的标准样品适宜。

<实验1-4：固结性试验>

对于各被验样品1～4，以研究其固结性的目的，进行以下的实验。即，秤取各1g在实验1-1中制备的被验样品1～4，各自个别地填充到内底部是半球状的14ml容积的带盖的聚丙烯制圆筒管（Becton-Dickinson公司销售、商品名“Falcon管2059”、直径1.7cm、高度10cm）之内部，在将管在试管架上直立的状态下收容到50℃的温育器（Advantec东洋株式会社销售、商品名“CI-410”）之内部，经24小时静置之后，将管取出到温育器外，从管解下盖，通过将管缓慢倒转，将被验样品取出到黑色塑料制平板上，肉眼观察取出的被验样品的状态。

固结的有无是，被验样品在平板上也明显保持管内底部的半球状时判断为“有固结”（+）、被验样品虽然稍微有管内底部的形状但可识别时判断为“略有固结”（±）、被验样品崩解，不保持管内底部的形状时判断为“无固结”（-）。结果如表1中的“固结性”的栏所示。

【表1】

被验样品1	2	3	4
				抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度（%）99.9	99.1	99.1	99.1
结晶化度（%）100.0	0.0	88.3	93.1
				固结性-	+	+	-

如表1所示，作为用于确定解析值H₁₀₀的标准样品的被验样品1（结晶化度100.0%）只要取出到平板上就崩解，不保持管内底部的形状，被判断为“无固结”（-）。对此，作为用于确定解析值H₀的标准样品的被验样品2（结晶化度0.0%）即使从管取出到平板上，尚明确地保持管内底部的半球状，被判断为明显“有固结”（+）。取出到平板上的被验样品2所保持的管内底部的半球状的形态在给平板轻振动的程度下不崩解的程度。

结晶化度是88.3%的被验样品3与被验样品2同样地，即使从管取出到平板上，尚明确地保持管内底部的半球状，被判断为明显“有固结”（+），结晶化度是93.1%的被验样品4与被验样品1同样地，一取出到平板上就崩解，被判断为“无固结”（-）。

再有，被验样品2～4，如上所述，基于抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度是99.9%的被验样品1制备的，但根据上述的HPLC分析，它们的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度均止于99.1%。此理由虽无定论，但推测是制备途中以任何理由，抗坏血酸2-葡萄糖苷，虽然极其微量，分解等而流失。

上述的结果表明，在以无水物换算含有99.1%以上的抗坏血酸2-葡萄糖苷粉末的情况中，有结晶化度越高，固结性越低的倾向，结晶化度是88.3%的被验样品3被判断为“有固结”（+），结晶化度是93.1%的被验样品4被判断为“无固结”（-）的事实表明，在上述固结性试验中，从“有固结”（+）变化为“无固结”（-）的临界点在结晶化度88.3%和93.1%之间。

<实验2：含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的固结性和结晶化度的关系>

在本实验中，基于实验1的结果，为了再详细地研究固结性和结晶化度的关系，使用结晶化度在0～100%的范围，抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度是99.1～99.9%的7种含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，与实验1中同样地测试固结性。

<实验2-1：被验样品的制备>

分别适量取实验1-1中制备的被验样品1和被验样品2，通过均一地混合，制备表2所示的被验样品5～9的粉末。通过实验1-2中记载的方求出的被验样品5～9的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度和结晶化度如表2所示。再有，对于表2中的被验样品1及2的结果转记于表1。

<实验2-2：固结性试验>

将被验样品5～9供于实验1-4的固结性试验。结果示于表2的“固结性”的栏。再有，表2中的对于被验样品1及2的“固结性”转记于表1中记载的对于被验样品1及2的固结性试验结果。

【表2】

被验样品	1	2	5	6	7	8	9
								抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度（%）	99.9	99.1	99.8	99.7	99.6	99.5	99.4
结晶化度（%）	100.0	0.0	99.8	92.6	91.5	89.2	29.9
								固结性	-	+	-	-	-	±	+

如表2的结果所示，结晶化度是29.9%的被验样品9被判断为“有固结”（+），结晶化度是89.2%的被验样品8被判断为“略有固结”（±）。对此，结晶化度是91.5%是被验样品7、结晶化度是92.6%的被验样品6、及结晶化度是99.8%的被验样品5均与被验样品1同样地，被判断为“无固结”（-）。这些的结果表明，在以无水物换算含有99.1%以上但不足99.9%的抗坏血酸2-葡萄糖苷的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中，结晶化度在90%以上的情况中，在本实验的条件下不固结。

<实验3：抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度给含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的结晶化度带来的影响>

通过先前的实验，在抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度是99.1%以上的高纯度的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中，不同的结晶化度的粉末的存在变得明显，所以在本实验中，对于含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的结晶化度和抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度的关系进行检查。再者，检查抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度和固结性的关系。

<实验3-1：被验样品的制备>

如以下一样，从含有L-抗坏血酸和，糊精的水溶液，制备表3所示的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度互相不同的被验样品10～15。

即，将糊精（松谷化学工业株式会社销售、商品名“Pinedex＃100”）4质量份加热溶解于水15质量份，加L-抗坏血酸3质量份，保持pH5.5、液温55℃，每1g糊精加100单位嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus）Tc-62株来源的CGT酶，每1g糊精加250单位异淀粉酶（株式会社林原生物化学研究所销售），反应50小时，生成抗坏血酸2-葡萄糖苷。再有，推测在反应液中，当然生成2-O-α-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽三糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽四糖基-L-抗坏血酸等的α-糖基-L-抗坏血酸类。

通过加热反应液使酶失活之后，调节到pH4.5，每1g糊精加50单位葡萄糖淀粉酶（商品名“GluczymeAF6”天野酶株式会社销售），通过反应24小时，如上述的α-糖基-L-抗坏血酸类分解为抗坏血酸2-葡萄糖苷，另外，将混在的寡糖分解为D-葡萄糖。在此时间点，对于反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是39%。

通过加热反应液来使葡萄糖淀粉酶失活，用活性炭脱色过滤之后，使滤液通过阳离子交换树脂（H⁺型）的柱而脱盐之后，使L-抗坏血酸及抗坏血酸2-葡萄糖苷吸附于阴离子交换树脂（OH^-型），水洗除去D-葡萄糖之后，用0.5N盐酸溶液溶出。再者，将此溶出液浓缩至固体分约50%，接下来，供于使用强酸性阳离子交换树脂（Dow Chemical公司制造、商品名“Dowex50W×4”、Ca²⁺型）的柱层析。向柱负荷其湿润树脂容积的约1/50量，以线速度1m/时间通液负荷量的50倍的纯化水，将溶出液以柱容积的各0.05容积量分级分离。其后，将各级分的组成由在实验1-2所述的HPLC法测定，对于以无水物换算抗坏血酸2-葡萄糖苷含量是80%以上的6级分，将它们减压浓缩至浓度约76%，将得到的浓缩液取于结晶罐，作为种晶，加各2%实验1-1中的被验样品1，缓慢搅拌着浓缩液，经2天将液温从40℃自然冷却至15℃，经约2天自然冷却，使抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析。

其后，根据常规方法，通过由篮型离心机从糖膏采集结晶，用少量的蒸馏水清洗之后，成熟、干燥，将25℃的空气吹30分钟而冷却，粉碎，得到表3所示的被验样品10～15。另外，作为被验样品16，使用作为以往的准药品级的粉末的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末（商品名“AA2G”株式会社林原生物化学研究所销售）。

【表3】

被验样品	1	2	10	11	12	13	14	15	16
										抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度（%）	99.9	99.1	97.4	98.0	98.6	99.1	99.5	99.7	98.9
结晶化度（%）	100.0	0.0	88.7	89.0	91.6	94.8	99.4	99.5	88.9
										固结性	-	+	+	±	-	-	-	-	±
保存性	-	/	+	+	-	-	-	-	+

再有，表3所示的被验样品1及2与实验1-1中同样，它们的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度、结晶化度直接转记于在先前的实验得到的结果。将被验样品10～16的固结性以与实验1-4中同样的方法试验。结果示于表3。再有，表3所示的对于被验样品1及2的固结性试验的结果直接转记于表1。

<实验3-2：保存性试验>

为确认在实验1-4等中进行的固结性试验作为评价含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的实际的保存时的固结性的试验是否妥当，对于以实验1-1的方法得到的被验样品1、在实验3-1得到的被验样品10～15、及被验样品16，进行推定含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末实际上保存的状态、环境、期间等的保存性试验。

即，各取10kg被验样品1及被验样品10～16，分别放入双层的聚乙烯袋（纵800mm×横600mm），将各被验样品制备各1袋。接下来使各聚乙烯袋开口部向上，开着口不闭口而收纳到钢罐（18L容积）、不盖钢罐的盖地静置，避免高温多湿，在室内保存45天。保存45天后，从钢罐取出放了各被验样品的聚乙烯袋，从袋将被验样品取出到黑色塑料制平板上，肉眼观察那时的被验样品的流动性和固结的状态。

固结的有无是，被验样品中确认块状物，相比保存开始时流动性降低时判断为“有固结”（+）；确认不到块状物，相比保存开始时流动性无变化时判断为“无固结”（-）。再有，本保存试验中的各被验样品的保存形态，除了将开口部不用橡胶条带闭口的点、不放入干燥剂的点、及不盖钢罐的盖的点，与准药品级的粉末的商品形态相同，与实际上在市场上流通，保存时的形态相同。再有，上述3个的差异点是，如早期得到试验结果，为使保存试验的保存环境相比实际的保存环境略更严酷而设定的差异点。结果示于表3。

如表3所示，除基本上由无定形部分组成的被验样品2、及作为准药品级的粉末的被验样品16外，在其余的被验样品1及被验样品10～15中，随着抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度升高，有结晶化度变高的倾向。再者，在固结性试验中，抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度分别是97.4%及98.0%的被验样品10及11被判断为“有固结”（+）或“略有固结”（±），与此相比，抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度是98.6～99.7%的被验样品12～15被判断为“无固结”（-）。这些的结果表明，对于被认为左右固结性的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度的阈值在98.0%附近，可得到为了得到被评价“无固结”（-）的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，超98.0%的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度是必要的结论。

另外，被验样品12～15的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度是98.6～99.7%，是与作为准药品级的粉末的被验样品16的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度98.9%大致相同的水平，尽管相比是试剂级的粉末而基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶组成的被验样品1的纯度显著地更低，与被验样品1同样地完全确认不到固结。顺便而言，被验样品12～15的结晶化度是91.6～99.5%，是90%以上，准药品级的粉末的被验样品16的结晶化度是88.9%，低于90%。从这些的结果判断，想要得到相比作为准药品级的粉末的被验样品16更显著地难固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，结晶化度有必要为90%以上。

再有，如表3的最下段所示，在将各被验样品仿实际的商品形态，在放10kg的袋装的状态下保存45天的保存性试验中，抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度是各自97.4%及98.0%的被验样品10及11被判断为“有固结”（+），与此相比，抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度是98.6～99.7%的被验样品12～15被判断为“无固结”（-），得到与固结性试验同样的结果。此事实表明，实验1-4等中的固结性试验作为评价在含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的实际的保存环境下的固结性的试验妥当。

<实验4：含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的还原力和着色的关系>

在先前的实验中使用的被验样品均为从经使CGT酶作用于含L-抗坏血酸和淀粉质的溶液的步骤而得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液制备的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。通过这样的制法时，在得到的粉末中，姑且不论量的多寡，含制造方法所特有的作为杂质的L-抗坏血酸及D-葡萄糖。L-抗坏血酸或D-葡萄糖均有还原性，虽也随含的量，但在含蛋白质或氨基酸等的有氨基的化合物的制品中使用时，有给制品带来不适合的变色的担忧。在其中也是，L-抗坏血酸被认为，与氧的反应性高，不仅给使用其的制品带来不适合的变色，在长期间保存以往的准药品级的粉末时，往往成为确认的粉末自体的着色的原因。

从而，在本实验中，对于在先前的实验中使用的被验样品1及被验样品12～16，对于它们的粉末中的L-抗坏血酸和D-葡萄糖的合计量、L-抗坏血酸量、还有，粉末全体的还原力和着色性的关系，通过以下述的顺序进行由加热处理的加速试验来检查。

在10ml容积的带螺盖试管内以无水物换算秤取各150mg各被验样品，在塞住试管的开口部的状态下收容到烘箱（增田理化株式会社销售、商品名“DRYING-OVENSA310”）内，于80℃加温3天。接下来，从试管解下螺盖，向各被验样品各加3ml脱离子水，溶解之后，由分光光度计（株式会社岛津制作所销售、商品名“UV-2400PC”）测定波长400nm中的吸光度。伴随加温的着色的程度是，在波长400nm处的吸光度的数值不足0.50时，判断为“不着色，或者，实质上不着色”（-）、上述吸光度的数值是0.50以上时，判断为“着色的”（+）、的2阶段。结果示于表4。

再有，各被验样品中的L-抗坏血酸和D-葡萄糖的合计量由实验1-1中所述的HPLC法确定。另外，对于粉末全体的还原力而言，将D-葡萄糖作为标准物质使用，由本领域广泛使用的Somongyi-Nelson法及蒽酮硫酸法，分别测定，还原糖量及全糖量，将它们代入上述的式［3］，通过计算求出。各被验样品中的L-抗坏血酸和D-葡萄糖的合计量、L-抗坏血酸量、及，粉末全体的还原力如表4所示。

【表4】

如表4所示，在含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中，在作为基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶组成的试剂级的粉末的被验样品1中，L-抗坏血酸及D-葡萄糖量均在检测限界以下。对此，在作为本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的被验样品12～15、及，作为以往的准药品级的粉末的被验样品16中，在全部粉末中均检测到L-抗坏血酸及/或D-葡萄糖。再者，在这样的粉末中，如被验样品12～15一样，在L-抗坏血酸和D-葡萄糖的合计量以无水物换算是0.2%以下时，被判断为“不着色，或者，实质上不着色”（-），与此相比，如被验样品16一样，L-抗坏血酸和D-葡萄糖的合计量以无水物换算达0.3%，则被判断为“着色”（+）。再者，对于被认为与这样的粉末的着色性最强相关的L-抗坏血酸而言，如被验样品12～15一样，在其含量以无水物换算在0.1%以下时，被判断为“不着色，或者，实质上不着色”（-），与此相比，如被验样品16一样，L-抗坏血酸量以无水物换算达0.2%，则被判断为“着色的”（+）。顺便而言，如已所述，L-抗坏血酸与氧的反应性高，被认为与含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的着色相关，所以在L-抗坏血酸量超0%但0.1%以下的情况下，被判断的将这样的粉末以以往的准药品级的粉末的商品形态长期保存时，不实质着色的担忧而好。

另一方面，从还原力来看，如被验样品12～15一样，粉末全体的还原力超0%而不足1%时，被判断为“不着色，或者，实质上不着色”（-），与此相比，如被验样品16一样，粉末全体的还原力超1%，则被判断为“着色的”（+）。结果与以上述的L-抗坏血酸和D-葡萄糖的合计量作为指标判断的结果良好一致。

以上的结果来明，由制造方法所致，不可避免地，即使以可检测的水平含L-抗坏血酸及/或D-葡萄糖，在使粉末全体的还原力超0%而不足1%时，可得无着色的悬念的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。另外，不仅使用的制品的着色，还包括粉末自体的着色的观点，则表明L-抗坏血酸的含量是以无水物换算超0%而0.1%以下是优选的。

<实验5：晶析时的冷却方法给含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的结晶化度带来的影响>

为了研究晶析时的冷却方法给含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的结晶化度带来的影响，由下述所示的方法，制备表5所示的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末（被验样品17～22）。再有，酶反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率由实验1-2的方法测定。

<被验样品的制备方法>

（1）被验样品17

在后述的参考例1的方法中，除了将CGT酶及异淀粉酶的作用时间在作为参考例1之一半的第25小时停止，纯化至抗坏血酸2-葡萄糖苷含量86%以上之后，将含抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液减压浓缩至浓度约76%的点、及，将得到的浓缩液移到在周围配套箱的结晶罐，通过调节套箱内的水温，由经1.5天从40℃缓慢地冷却至30℃之后，经0.5天从30℃急速冷却至15℃的拟似控制冷却法将结晶晶析的点以外，与后述的参考例1中同样制备作为含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的被验样品17。再有，酶反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是25.3%。

（2）被验样品18

在后述的实施例1的方法中，除了将作为原料使用的液化马铃薯淀粉用糊精（松谷化学工业株式会社销售、商品名“Pinedex＃100”）代替的点、及，将酶反应后的溶液纯化、减压浓缩后，经约2天从40℃自然冷却至15℃而将结晶析出的点以外，与实施例1中同样制备作为含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的被验样品18。再有，酶反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是27.0%。

（3）被验样品19

除了将酶反应后的溶液纯化、减压浓缩后，移到在周围配套箱的结晶罐，通过调节套箱内的水温，由经1.5天从40℃缓慢地冷却至30℃后，经0.5天从30℃急速冷却至15℃的拟似控制冷却法将结晶晶析的点以外与被验样品18同样制备作为含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的被验样品19。再有，酶反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是27.0%。

（4）被验样品20

在后述的实施例4的方法中，除了在将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析之时、将含抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液减压浓缩至浓度约76%，将得到的40℃的溶液移到结晶罐，经约2天从40℃自然冷却至15℃而将结晶晶析出以外，与实施例4中同样制备作为含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的被验样品20。再有，酶反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是32.5%。

（5）被验样品21

将酶反应后的溶液纯化、减压浓缩后，移到在周围配套箱的结晶罐，通过调节套箱内的水温，由经1.5天从40℃缓慢地冷却至30℃后，经0.5天从30℃急速冷却至15℃的拟似控制冷却法将结晶晶析的点以外，与被验样品20同样制备作为含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的被验样品21。再有，酶反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是32.5%。

（6）被验样品22

在实验3-1中的被验样品的制备方法中，将由CGT酶和异淀粉酶的酶反应在反应30小时停止，纯化而将抗坏血酸2-葡萄糖苷含量提高至86.2%的溶液减压浓缩至浓度约76%，将得到的40℃的溶液移到结晶罐，由经约2天从40℃冷却至15℃的自然冷却法将结晶晶析出以外，与实验3-1中同样制备作为含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的被验样品22。再有，酶反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是35.3%。

<抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度及结晶化度的测定>

通过与实验1-2中同样的方法，测定被验样品17～22的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度、及对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度。

<平均微晶径>

被验样品17～22的平均微晶径由以下的方法测定。为了由既述的式［2］算出，在各被验样品的结晶化度的测定中使用的基于粉末Ｘ射线衍射特征制成的衍射图中，对于对应于图1的符号a～e所示的衍射峰的，对于衍射角（2θ）10.4°（米勒指数（hkl）：120）、13.2°（米勒指数：130）、18.3°（米勒指数：230）、21.9°（米勒指数：060）及22.6°（米勒指数：131）中检测的5个衍射峰的半值幅和衍射角（2θ），使用附属于粉末Ｘ射线衍射装置（Spectris株式会社制、商品名“X’PertPROMPD”）的解析处理用计算机软件“X’pertHighscorePlus”处理，接下来，利用由同软件中的“Scherrer的式”的程序，算出这些被验样品中的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的平均微晶径。

以上的结果示于表5。

【表5】

所表5所示，将抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是27.0%或32.5%的酶反应液纯化、浓缩后，从含有L-抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液，由拟似控制冷却法将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析而制备的被验样品19及21是，结晶化度超90%，平均微晶径分别是

及对此，将抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是25.3%的酶反应液纯化、浓缩后，从含有L-抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液，虽然由相同的拟似控制冷却法将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析而制备的被验样品17的平均微晶径是

比较大，结晶化度不满90%。另外，将抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率与被验样品19及21相同是27.0%或32.5%的酶反应液纯化、浓缩后，从含有L-抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液，由自然冷却法将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析而制备的被验样品18及20的结晶化度不满90%，平均微晶径分别是

及

而均低。另一方面，将抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是35.3%的酶反应液纯化、浓缩后，从含有L-抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液，由自然冷却法将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析而制备的被验样品22的结晶化度是98.9%而高，平均微晶径也是

而高。

实验5的结果表明，就算是从抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率相同的反应液制备的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，由拟似控制冷却法将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析时，相比由自然冷却晶析时结晶化度更高，并且，平均微晶径也变大。另外，在由自然冷却将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析时，如果酶反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率不超35%，就得不到结晶化度超90%的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，与此相比，在晶析时适用拟似控制冷却法时，酶反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率不满35%，就算是32.5%（被验样品21）或27.0%（被验样品19），也得到结晶化度超90%的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。这些的结果表明，拟似控制冷却法对于结晶化度的升高或，微晶径的增大有效，只要酶反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是27.0%以上，纯化、浓缩后，通过使用拟似控制冷却法或控制冷却法，可得对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度超90%的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。再有，被验样品19及21的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度在超98.0%不足99.9%的范围内，并且，结晶化度超90%，所以是相比以往的准药品级的粉末显著地难固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。

<实验6：平均微晶径给对亲水性溶剂的溶解性带来的影响>

作为被验样品，使用在上述实验中使用的被验样品17～22、由后述的实施例1～4的方法制造的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末、由实验1-1制备的被验样品1及实验3-1中使用的被验样品16（准药品级的粉末），研究对在化妆品或准药品中广泛使用的亲水性溶剂的溶解性。

即，秤量各0.25g上述被验样品或实施例1～4的粉末之任何，放入内底部是半球状的14ml容积的带盖的聚丙烯制圆筒管（Becton-Dickinson公司销售、商品名“Falcon管2059”。向放入各样品的管加5ml将1,3-丁二醇（和光纯药工业株式会社制、试剂特级）用脱离子水稀释30%浓度的溶液，在50℃的恒温水槽中加温30分钟之后，颠倒2次，再者于50℃保持15分钟，由目测，看到粉末完全地溶解时判断为“溶解性良”（-）、确认不溶物的残留时判断为“溶解性不良”（+）。确认此不溶物的残留时，再者于50℃保持15分钟，看到该时粉末完全地溶解时判断为“溶解性略不良”（±）。结果示于表6。

再者，使用上述被验样品或实施例1～4的粉末，由实验1-4及实验3-2的方法，实施固结性试验及保存性试验。结果一并示于表6。再有，对于被验样品1及16的平均微晶径由实验5的方法测定，一并示于表6。另外，对于被验样品1及16的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度、结晶化度、固结性及保存性的结果转记于表3中记载的对于被验样品1及16的结果。

【表6】

如表6所示，作为平均微晶径是

以下的被验样品16～21及后述的实施例1～4的粉末判断为“溶解性良”（-）。对此，平均微晶径是

的被验样品22判断为“溶解性略不良”（±）。平均微晶径是的被验样品1（试剂级的粉末）判断为“溶解性不良”（+）。再者，被验样品1、19、21、22、及实施例1～4的粉末，在固结性试验及保存性试验中，被判断为“不固结”（-），与此相比，被验样品16～18及20被判断为“固结”（+）。从结果推测，给对含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的亲水性溶剂的溶解性带来影响的平均微晶径的阈值小于判断平均微晶径不足

更具体而言

以下的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末相比试剂级的粉末，对亲水性溶剂的溶解性更优良。再者，在溶解性、固结性、及保存性之任何中得到好的评价的被验样品19、21、及，实施例1～4的粉末之中，最小的平均微晶径是（被验样品19），所以判断优选的平均微晶径的范围是

以上但不足

更优选为

以上

以下。

<实验7：由各种微生物来源的CGT酶的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率>

在使CGT酶作用于含有液化淀粉和L-抗坏血酸的溶液，接下来，向其作用葡萄糖淀粉酶的由酶反应生成抗坏血酸2-葡萄糖苷的酶反应系统中，为研究CGT酶的来源的差异给酶反应中得到的酶反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率带来何影响，进行以下的实验。

<市售CGT酶>

各种微生物来源的CGT酶之中，作为市售的CGT酶，使用以下的CGT酶。即，作为胶质芽胞杆菌（Bacillus macerans）来源的CGT酶，使用市售的CGT酶（商品名“Contizyme”、天野酶株式会社销售），作为嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）来源的CGT酶，使用嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）Tc-91株来源的CGT酶（株式会社林原生物化学研究所制），作为嗜热产硫嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter thermosulfurigenes）来源的CGT酶，使用作为重组型酶而销售的市售的CGT酶（商品名“Toruzyme3.0L”、Novozymes·日本株式会社销售）。

<实验7-1：各种微生物来源的CGT酶的制备>

<实验7-1-1：伊利诺斯类芽孢杆菌（Paenibacillus illinoisensis）NBRC15379株来源的CGT酶的制备>

将伊利诺斯类芽孢杆菌（Paenibacillus illinoisensis）NBRC15379株在含糊精2%、氯化铵0.5%、磷酸氢钾0.05%、硫酸镁0.025%及碳酸钙0.5%的液体培养基中，于27℃培养3天，通过将培养液离心分离而得到的各自的离心上清根据常规方法硫酸铵盐析、透析而得到CGT酶的粗酶液。将得到的CGT酶粗酶液各自供于使用DEAE-TOYOPEARL650S凝胶（Tosoh株式会社制）的阴离子交换柱层析及使用丁基-TOYOPEARL650M凝胶（Tosoh株式会社制）的疏水柱层析而纯化，制备部分纯化CGT酶。

<实验7-1-2：嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus）Tc-91株CGT酶变体的制备>

嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）Tc-91株起源的CGT酶，如上述其基因已被克隆，从基因的碱基序列（序列表中的SEQ ID NO:2所示的碱基序列）确定成熟型CGT酶的氨基酸序列（序列表中的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列）。向所述CGT酶的基因DNA以下述的顺序导入变异，取得相比野生型CGT酶，抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成能力更优良的CGT酶变体。

即，使用本发明人保有的嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus）Tc-91株（独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERMBP-11273）来源的CGT酶基因，不改变其编码的氨基酸序列而变异而导入或缺失限制酶切断部位等，将其重组到质粒载体，制备含编码野生型CGT酶的基因的重组DNA。所述重组DNA“pRSET-iBTC12”的结构示于图5。接下来，切出得到的重组DNA中的编码含野生型CGT酶的活性残基的区域的基因片段（NdeI-EcoT22I片段），使用PCR变异试剂盒（商品名“GeneMorphPCRMutagenesisKit”、Stratagene公司销售）在试管内随机地加变异，通过返回原来的重组DNA而制备编码发生各种各样的氨基酸取代的CGT酶变体的基因混合物。将该变异基因整合到表达质粒载体中，制备重组DNA。使用所述重组DNA转化大肠杆菌，制备CGT酶变体基因库。

接下来，从得到的基因库单离超13,000株的转化体，从培养得到的菌体制备含CGT酶变体的溶菌液作为粗酶液。使得到的粗酶液作用于含L-抗坏血酸和淀粉部分分解物的水溶液，对生成的α-糖基L-抗坏血酸进行葡萄糖淀粉酶处理而生成抗坏血酸2-葡萄糖苷，通过将其生成量与野生型CGT酶比较，筛选产生抗坏血酸2-葡萄糖苷高生产型CGT酶变体的转化体。在该筛选的过程中，得到保持目的变异CGT酶基因的转化体2株、即，＃129株及＃268株。解读所述转化体各自保持的变异CGT酶基因的碱基序列时判明，转化体＃129株产生的CGT酶变体是，在序列表中的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中2个位置的氨基酸残基被取代，第176甘氨酸残基（G）被精氨酸残基（R）取代，及，第452酪氨酸残基（Y）被组氨酸残基（H）取代的氨基酸序列、即有序列表中的SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。另外判明，转化体＃268株产生的CGT酶变体是，在序列表中的SEQID NO:1所示的氨基酸序列中1个位置的氨基酸残基被取代，第228赖氨酸残基（K）被异亮氨酸残基（I）取代的氨基酸序列、即，有序列表中的SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。将这些CGT酶变体，在序列表中的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中氨基酸残基基于取代的位置和氨基酸取代，各自命名为G176R/Y452H、及，K228I。

将保持编码上述CGT酶变体的基因DNA的转化体2株，分别使用含氨苄西林Na盐100μl/ml的T培养基（每1L培养基，含有细菌-胰蛋白胨12g、细菌-酵母提取物24g、甘油5ml、17mM磷酸一钾、72mM磷酸二钾）于37℃好氧地培养24小时。将培养液离心分离而将得到的菌体使用超声波破碎器（商品名“UltraSonicHomogenizerUH-600”、MST株式会社制）破碎处理，将破碎液上清于60℃热处理30分钟，将宿主来源的非耐热性蛋白质变性、失活。将热处理液再离心分离而各自制备CGT酶变体的部分纯化标品。

再有，上述的各CGT酶的酶活性根据上述的方法测定，使用式［4］算出。

<实验7-2：抗坏血酸2-葡萄糖苷生成反应>

将糊精（商品名“Pinedex＃1”、松谷化学工业株式会社销售）5质量份加到水20质量份而加热溶解，加L-抗坏血酸3质量份，pH调节为5.5而作为底物溶液。通过向其中，每1g糊精固体分加100单位上述的市售的CGT酶、及，实验7-1中制备的CGT酶之任何，于55℃反应40小时，通过加热反应液使酶失活，与抗坏血酸2-葡萄糖苷一同，生成2-O-α-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽三糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽四糖基-L-抗坏血酸等的α-糖基-L-抗坏血酸。接下来，将得到的反应液加热而使酶失活之后，调节到pH4.5，向其中每1g糊精固体分加50单位葡萄糖淀粉酶剂（天野酶株式会社销售、商品名“GluczymeAF6”、6，000单位/g），于55℃处理24小时，将α-糖基-L-抗坏血酸分解为抗坏血酸2-葡萄糖苷，另外，将混在的糖质分解为D-葡萄糖之后，通过加热反应液而使葡萄糖淀粉酶失活而得到酶反应液1～6。

<实验7-3：抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率的测定>

如以下一样求出实验7-2中得到的酶反应液1～6中的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率。即，将酶反应液1～6各自用纯化水作为2%溶液，由0.45μm膜滤器过滤之后，供于实验1-2记载的HPLC分析，由从示差折射计的层析谱中出现的峰的面积计算反应液的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量，无水物换算。结果示于表7。再有，表7所示的各酶反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率是，对各CGT酶在相同的条件下将抗坏血酸2-葡萄糖苷生成反应及葡萄糖淀粉酶处理重复5次时，仍在若干的偏差的范围内再现性良好地得到的值。

【表7】

*葡萄糖淀粉酶处理后

如表7所示，在使用胶质芽胞杆菌（Bacillus macerans）来源的CGT酶时（反应液1），葡萄糖淀粉酶处理后的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率止于16%，使用伊利诺斯类芽孢杆菌（Paenibacillusillinoisensis）来源的CGT酶时（反应液2），抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率也是18%而低。另一方面，在使用嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）Tc-91株来源的CGT酶时（反应液3），抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率达28%，在使用嗜热产硫嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter thermosulfurigenes）来源的CGT酶时（反应液4），抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率达30%。再者，在各自使用作为嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）Tc-91株CGT酶变体的G176R/Y452H及K228I时（反应液5及6），抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率各自达32%及31%。

结果明显表明，在胶质芽胞杆菌（Bacillus macerans）来源、及，伊利诺斯类芽孢杆菌（Paenibacillus illinoisensis）来源的CGT酶中，无法收率良好地制造抗坏血酸2-葡萄糖苷，这些微生物来源的CGT酶不适宜于制造抗坏血酸2-葡萄糖苷。

<实验8：晶析方法给含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度及诸性质带来的影响>

作为析出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶析方法，使用一直以来使用的自然冷却法和，拟似控制冷却法，从实验7中得到的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率不同的酶反应液3～6，制备含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，研究给粉末的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度及诸性质带来的晶析方法的影响。再有，在酶反应液的阶段，对于使抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率显著地低的酶反应液1及2、即胶质芽胞杆菌（Bacillus macerans）来源的CGT酶及伊利诺斯类芽孢杆菌（Paenibacillus illinoisensis）来源的CGT酶作用而得到的酶反应液，判断为见不到效率好的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造，不进行粉末的制备。

<实验8-1：被验样品的制备>

<被验样品23～26>

将实验7中得到的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率不同的酶反应液3～6分别用活性炭脱色过滤，将滤液用阳离子交换树脂（H⁺型）脱盐，接下来，使L-抗坏血酸及抗坏血酸2-葡萄糖苷吸附于阴离子交换树脂（OH^-型），水洗除去含D-葡萄糖的糖质之后，用0.5N盐酸水溶液溶出。再者，将此溶出液浓缩至固体分约50%，供于填充强酸性阳离子交换树脂（商品名“DIAIONUBK550”Na⁺型、三菱化学株式会社制）的柱层析。采集高含抗坏血酸2-葡萄糖苷的级分至抗坏血酸2-葡萄糖苷含量成为86%以上。合并采集的级分而浓缩至固体物浓度约75%，得到分别对应于酶反应液3～6的，含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液3～6（以无水物换算含有86.3～87.1%的抗坏血酸2-葡萄糖苷）。

通过将含有上述抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液3～6各自取到结晶罐，相对于各糖液的容量加约2%（w/v）的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶作为种晶而搅拌着约48小时从40℃自然冷却到15℃经而结晶，制备晶析抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的糖膏。从上述糖膏，由常规方法，由篮型离心机采集抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶，将采集的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶相对于糖膏重量，使用8%的脱离子水清洗，于40℃成熟、干燥3小时之后，吹25℃的清洁的空气30分钟而强制冷却，通过粉碎，作为含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。将从含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液3～6的各自通过自然冷却法得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末各自作为被验样品23～26。

<被验样品23c～26c>

将在上述制备的无水物换算的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量不同的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液3～6的各自，在减压下浓缩至固体物浓度约75%，取到结晶罐，相对于溶液的容量加约2%（w/v）的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶作为种晶，搅拌着，经约48小时由拟似控制冷却法从40℃冷却至15℃而结晶以外，与上述同样，制备将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析的糖膏。再有，拟似控制冷却法通过将全48小时的晶析时间分为24小时、12小时、12小时的3个区间，在最初的区间经24小时将液温从40℃冷却到35℃，在接下来的区间经12小时从35℃冷却到27.5℃，再者，在最后的区间经12小时将液温从27.5℃冷却到15℃来进行。从得到的糖膏，由常规方法，由篮型离心机采集抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶，将采集的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶使用相对于糖膏重量8%的脱离子水清洗，于40℃成熟、干燥3小时之后，吹25℃的清洁的空气30分钟而强制冷却，通过粉碎，作为含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。将从含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液3～6的各自由拟似控制冷却法得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末各自作为被验样品23c～26c。

<实验8-2：被验样品23～26、及，被验样品23c～26c的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度及诸性质>

对于在上述得到的被验样品23～26及被验样品23c～26c，与实验6同样地研究抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度、结晶化度、平均微晶径、固结性、及，向作为亲水性溶剂的1,3-丁二醇的溶解性。结果示于表8。再有，为了比较，对于作为准药品级的粉末的被验样品16的结果也从表6转记并示于表8。

【表8】

如表8所示，在被验样品23～26、被验样品23c～26c的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的无水物换算的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量、即抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度均超98%，这些被验样品是与作为以往的准药品级的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的被验样品16同等的高纯度的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。

另一方面，关于结晶化度，在抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶析步骤中适用以往的自然冷却法而制备的被验样品23～26与以往的准药品级的粉末的被验样品16止于同等的不足90%，与此相比，在晶析步骤中适用拟似控制冷却法制备的被验样品23c～26c均示90%以上的值，确认是因为拟似控制冷却法有提高得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的结晶化度的效果。另外，与结晶化度同样地，粉末的平均微晶径也是，被验样品23～26止于

的范围，与此相比，被验样品23c～26c是

得到高的值。

另外，对于粉末的固结性，结晶化度不足90%、平均微晶径不足

的被验样品23～26被判断为“固结”（+），与此相比，结晶化度是90%以上、平均微晶径是以上的被验样品23c～26c被判断为“不固结”（-）。再有，向1,3-丁二醇的溶解性是任何的被验样品都被判断为“溶解性良”（-）。

上述实验7及8的结果表明，在含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造中，使用嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus）来源的CGT酶及其变体酶、或者，嗜热产硫嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter thermosulfurigenes）来源的CGT酶得到抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率27%以上的酶反应液、纯化至抗坏血酸2-葡萄糖苷含量86%以上，在晶析步骤中适用拟似控制冷却法或控制冷却法，则可制造结晶化度90%以上的难固结的粉末。

<实验9：淀粉脱支酶的联用给由各种微生物来源的CGT酶的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率带来的影响>

使CGT酶作用于含有液化淀粉和L-抗坏血酸的溶液，接下来，在使葡萄糖淀粉酶作用的由酶反应生成抗坏血酸2-葡萄糖苷的酶反应系统中，为研究淀粉脱支酶的联用给由使用各种微生物来源的CGT酶的酶反应得到的反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率带来何影响，进行以下的实验。

<实验9-1：抗坏血酸2-葡萄糖苷生成反应>

除了与实验7中使用的各种CGT酶一同，作为淀粉脱支酶，每1g糊精固体分作用1,000单位的异淀粉酶剂（介支淀粉假单胞菌（Pseudomonas amyloderamosa）来源、株式会社林原制）以外，与实验7同样地进行抗坏血酸2-葡萄糖苷生成反应，进行葡萄糖淀粉酶处理而各自得到后述的表9所示的酶反应液7～12之后，用实验1-2的方法测定酶反应液7～12中的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率。结果示于表9。

【表9】

*葡萄糖淀粉酶处理后

如表9所示，在联用淀粉脱支酶时，在胶质芽胞杆菌（Bacillusmacerans）来源的CGT酶的情况（反应液7）及，伊利诺斯类芽孢杆菌（Paenibacillus illinoisensis）来源的CGT酶的情况（反应液8）中，葡萄糖淀粉酶处理后的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率分别是21%或25%。另一方面，用嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus）来源的CGT酶（反应液9）时，抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率是37%、用嗜热产硫嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter thermosulfurigenes）来源的CGT酶（反应液10）时，抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率是33%。再者，使用作为嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）Tc-91株来源的CGT酶的变体的G176R/Y452H及K228I时（反应液11及12）分别是37%及36%。

虽然随CGT酶的来源而有偏差，通过向由CGT酶的酶反应联用淀粉脱支酶（异淀粉酶），酶反应液7～12之任何全部，其葡萄糖淀粉酶处理后的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率，相比单独使用CGT酶时（参照表7的反应液1～6）分别更显著地增加3～9%。但是，在胶质芽胞杆菌（Bacillus macerans）来源的CGT酶的情况（反应液7）及，伊利诺斯类芽孢杆菌（Paenibacillus illinoisensis）来源的CGT酶的情况（反应液8）中，即使联用淀粉脱支酶时，葡萄糖淀粉酶处理后的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率止于各自21%或25%，是相比单独使用其以外的CGT酶时（参照表7的反应液3～6）更显著地低的生成率。

上述结果表明，用嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus）Tc-91株来源的CGT酶、嗜热产硫嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter thermosulfurigenes）来源的CGT酶、及，作为嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）Tc-91株来源的CGT酶的变体的G176R/Y452H及K228I时，通过联用淀粉脱支酶，相比不使用淀粉脱支酶而CGT酶单独作用时得到的高约3～9%左右的生成率，可制造更有效抗坏血酸2-葡萄糖苷。

另外，从上述结果确认，胶质芽胞杆菌（Bacillus macerans）来源及伊利诺斯类芽孢杆菌（Paenibacillus illinoisensis）来源的CGT酶的情况，即使联用淀粉脱支酶，无法生成率良好地制造抗坏血酸2-葡萄糖苷，这些的CGT酶有不适宜于抗坏血酸2-葡萄糖苷的制造的。

<实验10：晶析方法给从CGT酶和淀粉脱支酶联用得到的反应液的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造带来的的影响>

在本实验中，与实验8同样地检查在从CGT酶和淀粉脱支酶联用得到的反应液的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造中，晶析方法给粉末的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度及诸性质带来的影响。再有，对于抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率低的酶反应液7及8而言，以与实验8同样的理由不进行粉末的制备。

<实验10-1：被验样品的制备>

<被验样品27～30>

将实验9中得到的酶反应液9～12各自与实验8同样地纯化，作为抗坏血酸2-葡萄糖苷含量86%以上的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液9～12之后，适用与实验8-1同样的自然冷却法而将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析，将各自制备的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末作为被验样品27～30。

<被验样品27c～30c>

除了在抗坏血酸2-葡萄糖苷的晶析步骤中，适用与实验8相同的拟似控制冷却法以外，与被验样品27～30的情况同样从抗坏血酸2-葡萄糖苷含量86%以上的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液9～12制备含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，各自作为被验样品27c～30c。

<实验10-2：被验样品27～30及被验样品27c～30c的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度及诸性质>

与实验8同样地各自研究被验样品27～30、及，被验样品27c～30c的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度、结晶化度、平均微晶径、固结性及向作为亲水性溶剂的1,3-丁二醇的溶解性。将结果示于表10。另外，为了比较，对于作为准药品级的粉末的被验样品16的结果也从表6转记而并示于表10。

【表10】

从表10可知，除去被验样品28的情况，则被验样品27、29、30、及，被验样品27c～30c之任何均抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度成为99.2%以上，另外，结晶化度是92.6%以上、平均微晶径成

以上，是在试验的条件下不示固结性的粉末。在酶反应的阶段的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率止于33%的从酶反应液晶析步骤中适用自然冷却法制备的被验样品28，虽然抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度是99.2%，结晶化度是88.0%、平均微晶径成

另外，在固结性试验中被判断为“固结”（+）。另一方面，从被验样品28c的结果可知，在酶反应的阶段的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率即便止于33%时，在晶析步骤中适用拟似控制冷却法，则可得到结晶化度成90%以上、平均微晶径成以上，不示固结性的粉末。

上述结果表明，从在抗坏血酸2-葡萄糖苷生成反应中联用淀粉脱支酶，抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率提高至35%以上的酶反应液，无关于晶析步骤中的冷却方法，可制造结晶化度90%以上的难固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，及，在抗坏血酸2-葡萄糖苷生成反应中，即便抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率止于33%左右而不足35%时，在晶析步骤中适用拟似控制冷却法或控制冷却法，则结晶化度是90%以上而高，可制造有难固结的优良的性质的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。

<实验11：适宜于抗坏血酸2-葡萄糖苷的制造的CGT酶中共通的部分氨基酸序列>

以适宜于抗坏血酸2-葡萄糖苷的制造的CGT酶作为特征的目的，将适宜于抗坏血酸2-葡萄糖苷的制造的上述嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）Tc-91株来源的CGT酶和其变体酶的氨基酸序列（序列表中的SEQ ID NO:1、4及5），和嗜热产硫嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter thermosulfurigenes）来源的CGT酶的氨基酸序列（序列表中的SEQ ID NO:3）、及，不适宜于抗坏血酸2-葡萄糖苷的制造的上述胶质芽胞杆菌（Bacillus macerans）来源的CGT酶的氨基酸序列（序列表中的SEQ ID NO:6）和伊利诺斯类芽孢杆菌（Paenibacillus illinoisensis）来源的CGT酶的氨基酸序列（序列表中的SEQ ID NO:7）进行比较。再有，在氨基酸序列的比较中，作为嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）Tc-91株来源的CGT酶和胶质芽胞杆菌（Bacillus macerans）来源的CGT酶的氨基酸序列由申请人独自确定，使用由与本申请相同的申请人的特开昭61-135581号公报中各自公开的序列。另外，作为嗜热产硫嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter thermosulfurigenes）来源的CGT酶的氨基酸序列，使用在基因数据库“GenBank”中以登录No.35484登录的。再者，作为伊利诺斯类芽孢杆菌（Paenibacillus illinoisensis）来源的CGT酶的氨基酸序列，使用由申请人独自克隆确定的伊利诺斯类芽孢杆菌（Paenibacillus illinoisensis）NBRC15379株的CGT酶基因的碱基序列所编码的氨基酸序列。

在上述的氨基酸序列的比较中，作为适宜于抗坏血酸2-葡萄糖苷的制造的CGT酶、即，在嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus）Tc-91株来源的CGT酶及其变体酶、及，嗜热产硫嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter thermosulfurigenes）来源的CGT酶中共存在，并且，不适宜于抗坏血酸2-葡萄糖苷的制造的CGT酶、即，胶质芽胞杆菌（Bacillus macerans）来源的CGT酶和伊利诺斯类芽孢杆菌（Paenibacillus illinoisensis）来源的CGT酶中不存在的部分氨基酸序列，确认下述（a）乃至（d）的部分氨基酸序列。

（a）Asn-Glu-Val-Asp-X₁-Asn-Asn；

（b）Met-Ile-Gln-X₂-Thr-Ala；

（c）Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn-Ile；及

（d）Val-X₃-Ser-Asn-Gly-Ser-Val

从以上的结果判明，适宜于由本发明的制造方法的抗坏血酸2-葡萄糖苷的制造的CGT酶、即，抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率成27%以上的CGT酶可以有上述（a）乃至（d）的部分氨基酸序列作为特征。

以下，基于实施例、比较例及参考例更详细地说明本发明。但是，本发明不限于这些。

【实施例】

【实施例1】

<含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>

将液化马铃薯淀粉4质量份加水20质量份而加热溶解，加L-抗坏血酸3质量份，pH调节为5.5而作为底物溶液。向其，每1g液化马铃薯淀粉的固体分加100单位嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus）Tc-91株（独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERMBP-11273）来源的CGT酶的粗酶液（株式会社林原生物化学研究所制造），于55℃反应40小时，与抗坏血酸2-葡萄糖苷一同，生成2-O-α-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽三糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽四糖基-L-抗坏血酸等的α-糖基-L-抗坏血酸。

加热本反应液而使酶失活之后，调节为pH4.5，向其每1g液化马铃薯淀粉的固体分加50单位葡萄糖淀粉酶剂（天野酶株式会社销售、商品名“GluczymeAF6”、6，000单位/g），于55℃处理24小时，将α-糖基-L-抗坏血酸分解为抗坏血酸2-葡萄糖苷，另外，将混在的糖质分解为D-葡萄糖。本反应液中的L-抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是约28%。

加热本反应液而使酶失活，用活性炭脱色过滤，将滤液用阳离子交换树脂（H⁺型）脱盐，接下来，使L-抗坏血酸及抗坏血酸2-葡萄糖苷吸附于阴离子交换树脂（OH^-型），水洗除去D-葡萄糖之后，用0.5N盐酸水溶液溶出。再者，将此溶出液浓缩至固体分约50%，供于使用填充强酸性阳离子交换树脂（商品名“DIAIONUBK550”Na⁺型、三菱化学株式会社制）的10条的柱的拟似移动床式的柱层析。向柱负荷其湿润树脂容积的约40分之1量，将负荷量的约5倍的洗脱液连续地供给于柱，连续地采集L-抗坏血酸含量少的，高含抗坏血酸2-葡萄糖苷的级分。采集的级分中的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算是87.2%。

将此级分减压浓缩，使浓度为约76%。将其取到结晶罐，加2%作为分析用的标准试剂销售的含有L-抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末（株式会社林原生物化学研究所销售、商品名“抗坏血酸2-葡萄糖苷999”（编码编号：AG124、抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度99.9%以上））作为种晶，通过于40℃稳稳搅拌着经1.5天从40℃冷却至30℃之后，经0.5天从30℃冷却至15℃的拟似控制冷却法，析出抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶。

将析出的结晶用篮型离心机回收，用少量的冷纯化水喷雾清洗之后，于38℃成熟、干燥3小时之后，将25℃的空气吹45分钟而冷却，粉碎而得到抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度99.3%、L-抗坏血酸和D-葡萄糖的合计含量0.1%、L-抗坏血酸含量不足0.1%、粉末全体的还原力0.27%、对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度90.3%、其平均微晶径是

的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。顺便而言，上述结晶化度的测定根据Hermans法进行，使用实验1-2中求出的解析值H₁₀₀及H₀进行。当测定本粉末的粒度分布时，粒径不足150μm的粒子含91.0%、粒径53μm以上但不足150μm的粒子含50.7%。

本粉末相比面向准药品而作为美白成分等市售的以往的准药品级的粉末，难以固结，化妆品及准药品中广泛使用的向亲水性溶剂的溶解性优良而容易处理。本粉末在含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的点与以往的准药品级的粉末无任何变化，所以与以往的准药品级的粉末同样地，可单独，或者与其他成分混合，作为粉末状的食品原料、食品添加物原料、化妆品原料、准药品原料、药品原料等适宜地使用。

【实施例2】

<含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>

使CGT酶作用于含液化淀粉和L-抗坏血酸的溶液之时，除了液化淀粉的每固体分作用5单位的支链淀粉酶（株式会社林原生物化学研究所销售、商品编码（EN201）、肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）（产气气杆菌（Aerobacter aerogenes））来源，及，将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析之时、适用将溶液的温度经1.5天从40℃冷却至35℃之后，经0.5天从35℃冷却至15℃的拟似控制冷却法以外，与实施例1同样，制造含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。再有，葡萄糖淀粉酶处理后的反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是约29.5%。供于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶析的溶液的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算是91.8%。

本品是抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度99.5%、L-抗坏血酸和D-葡萄糖的合计含量0.1%、L-抗坏血酸含量不足0.1%、粉末全体的还原力0.21%、对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度91.0%、其平均微晶径是

的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。顺便而言，上述结晶化度的测定根据Hermans法进行，使用实验1-2中求出的解析值H₁₀₀及H₀进行。当测定本粉末的粒度分布时，粒径不足150μm的粒子含93.0%、粒径53μm以上但不足150μm的粒子含53.7%。

【实施例3】

<含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>

将玉米淀粉5质量份加水15质量份，加市售的液化酶而加热溶解，加L-抗坏血酸3质量份，pH调节为5.5而作为底物溶液。向其，每1g玉米淀粉的固体分加100单位重组了嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter）属来源的CGT酶基因而由芽孢杆菌（Bacillus）属的菌株表达的市售的CGT酶（Novozyme（NOVOZYME）公司销售、商品名“Toruzyme3.0L”）（参照例如，专利文献30及31），于55℃反应50小时生成抗坏血酸2-葡萄糖苷、及其他α-糖基-L-抗坏血酸。

将此反应液加热而使酶失活之后，pH调节为4.5，向其每1g玉米淀粉的固体分加50单位葡萄糖淀粉酶剂（Nagase ChemteX株式会社销售、商品名“Glucozyme＃20000”、20，000单位/g），于55℃反应24小时，将2-O-α-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽三糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽四糖基-L-抗坏血酸等的α-糖基-L-抗坏血酸分解为抗坏血酸2-葡萄糖苷，另外，将混在的糖质分解为D-葡萄糖。本反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是约31%。

加热本反应液而使酶失活之后，用活性炭脱色过滤，将滤液用阳离子交换树脂（H⁺型）脱盐，接下来，使L-抗坏血酸及抗坏血酸2-葡萄糖苷吸附于阴离子交换树脂（OH^-型），水洗除去D-葡萄糖之后，用0.5N盐酸溶液溶出，再者供于使用多孔性树脂（商品名“TOYOPEARLHW-40”、Tosoh株式会社制）的柱层析，采集高含抗坏血酸2-葡萄糖苷，L-抗坏血酸量少的级分。采集的级分中的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算是88.6%。

将此级分减压浓缩为浓度约76%，将其取到结晶罐，加2%实施例1中制造的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末作为种晶，通过于40℃稳稳搅拌着经1.5天从40℃冷却至33℃之后，经0.5天从33℃冷却至15℃的拟似控制冷却法，使抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶晶析。

通过用篮型离心机回收结晶，将结晶用少量的蒸馏水喷雾清洗之后，于35℃成熟、干燥8小时之后，将25℃的空气吹15分钟冷却，粉碎而得到抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度99.2%、L-抗坏血酸和D-葡萄糖的合计含量0.1%、L-抗坏血酸含量不足0.1%、粉末全体的还原力0.17%、对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度91.5%、其平均微晶径

的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。顺便而言，上述结晶化度的测定根据Hermans法进行，使用实验1-2中求出的解析值H₁₀₀及H₀进行。当测定本粉末的粒度分布时，粒径不足150μm的粒子含83.2%、粒径53μm以上但不足150μm的粒子含57.1%。

【实施例4】

<含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>

除了对玉米淀粉6质量份加水15质量份，加市售的液化酶而加热溶解，使市售的CGT酶（Novozyme（NOVOZYME）公司销售、商品名“Toruzyme3.0L”）作用于加L-抗坏血酸3质量份的溶液，那时，每固体分玉米淀粉作用500单位的异淀粉酶（株式会社林原生物化学研究所制造、介支淀粉假单胞菌（Pseudomonas amyloderamosa）（ATCC21262）来源，及，将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析之时、适用将溶液的温度经24小时从40℃冷却至35℃之后，经12小时从35℃冷却至30℃，再者，经12小时从30℃冷却至15℃的拟似控制冷却法以外，使用与实施例1相同的方法，制造含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。再有，葡萄糖淀粉酶处理后的反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是约32.5%。供于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶析的溶液的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算是89.6%。

本品得到抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度99.7%、L-抗坏血酸和D-葡萄糖的合计含量0.1%、L-抗坏血酸含量不足0.1%、粉末全体的还原力0.10%、对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度92.4%、其平均微晶径的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。顺便而言，上述结晶化度的测定根据Hermans法进行，使用实验1-2中求出的解析值H₁₀₀及H₀进行。当测定本粉末的粒度分布时，粒径不足150μm的粒子含94.5%、粒径53μm以上但不足150μm的粒子含55.3%。

【实施例5】

<含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>

将玉米淀粉5质量份加水15质量份，加市售的液化酶而加热溶解，加L-抗坏血酸3质量份，pH调节为5.5而作为底物溶液。向其，每1g玉米淀粉的固体分加100单位实验7及9中使用的嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）Tc-91株来源的CGT酶的变体G176R/Y452H，于55℃反应50小时生成抗坏血酸2-葡萄糖苷及其其他α-糖基-L-抗坏血酸。

将此反应液加热而使酶失活之后，pH调节为4.5，向其每1g玉米淀粉的固体分加50单位葡萄糖淀粉酶剂（Nagase ChemteX株式会社销售、商品名“Glucozyme＃20000”、20，000单位/g），于55℃反应24小时，将2-O-α-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽三糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽四糖基-L-抗坏血酸等的α-糖基-L-抗坏血酸分解为抗坏血酸2-葡萄糖苷，另外，将混在的糖质分解为D-葡萄糖。本反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是31.5%。

加热本反应液而使酶失活之后，用活性炭脱色过滤，将滤液用阳离子交换树脂（H⁺型）脱盐，接下来，使L-抗坏血酸及抗坏血酸2-葡萄糖苷吸附于阴离子交换树脂（OH^-型），水洗除去D-葡萄糖之后，用0.5N盐酸溶液溶出，再者供于使用多孔性树脂（商品名“TOYOPEARLHW-40”、Tosoh株式会社制）的柱层析，采集高含抗坏血酸2-葡萄糖苷，L-抗坏血酸量少的级分。采集的级分中的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算是87.6%。

将其取到结晶罐，加2%标准试剂级的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末（商品名“抗坏血酸2-葡萄糖苷999”、编码编号：AG124、抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度99.9%以上、株式会社林原生物化学研究所销售）作为种晶，之后适用于40℃稳稳搅拌着，将溶液的温度经24小时从40℃冷却至35℃之后，经12小时从35℃冷却至30℃，再者，经12小时从30℃冷却至15℃的拟似控制冷却法，将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析。用篮型离心机回收结晶，将结晶相对于糖膏重量用约5%的纯化水喷雾清洗之后，于35℃成熟、干燥8小时，吹20℃的空气10分钟而冷却，粉碎而得到以无水物换算含有抗坏血酸2-葡萄糖苷99.2%、含有L-抗坏血酸和D-葡萄糖合计0.4%、含有L-抗坏血酸不足0.1%，粉末全体的还原力0.50%的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。

本含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度是90.4%、平均微晶径是顺便而言，上述结晶化度的测定根据Hermans法进行，使用实验1-2中求出的解析值H₁₀₀及H₀进行。在测定本品的粒度分布时，粒径不足150μm的粒子含85.2%、粒径53μm以上但不足150μm的粒子含69.3%。使用本品，由与实验1-4相同的方法进行固结性试验时，被判断为“无固结”（-）。另外，由与实验6相同的方法试验向1,3-丁二醇的溶解性时，被判断溶解性“良”。

由本制造方法制造的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，相比市售的以往的准药品级的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末（商品名“AA2G”、株式会社林原商事销售），尽管抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度无何差异，是显著地难固结的粉末，保存或处理容易。本品在含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶的粉末的点与以往的准药品级的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末同样，保存或处理容易，所以可作为食品原料、食品添加物原料、化妆品原料、准药品原料、及药品原料等更适宜地使用。

【实施例6】

<含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>

将液化马铃薯淀粉4质量份加水20质量份而加热溶解，加L-抗坏血酸3质量份，pH调节为5.5而作为底物溶液。向其，每1g淀粉的固体分加100单位嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus）Tc-91株来源的CGT、每1g淀粉的固体分加500单位芳香黄杆菌（Flavobacterium odoratum）来源异淀粉酶（制品名“GODO-FIA”、合同酒精株式会社制），于55℃反应40小时，与抗坏血酸2-葡萄糖苷一同，生成2-O-α-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽三糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽四糖基-L-抗坏血酸等的α-糖基-L-抗坏血酸。

加热本反应液而使酶失活之后，调节为pH4.5，向其每1g淀粉的固体分加50单位葡萄糖淀粉酶剂（天野酶株式会社销售、商品名“GluczymeAF6”、6,000单位/g），于55℃处理24小时，将α-糖基-L-抗坏血酸分解为抗坏血酸2-葡萄糖苷，另外，将混在的糖质分解为D-葡萄糖。本反应液中的L-抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是约36%。

加热本反应液而使酶失活，用活性炭脱色过滤，将滤液用阳离子交换树脂（H⁺型）脱盐，接下来，使L-抗坏血酸及抗坏血酸2-葡萄糖苷吸附于阴离子交换树脂（OH^-型），水洗除去D-葡萄糖之后，用0.5N盐酸水溶液溶出。再者，将此溶出液浓缩至固体分约50%，供于使用填充强酸性阳离子交换树脂（商品名“DIAIONUBK550”Na⁺型、三菱化学株式会社制）的10条的柱的拟似移动床式的柱层析。将溶出液浓缩至固体分浓度约50%，向柱负荷其树脂容积的约1/40量，通过向柱供给负荷量的约15倍的洗脱液来将抗坏血酸2-葡萄糖苷溶出，采集L-抗坏血酸含量少的，高含抗坏血酸2-葡萄糖苷的级分。采集的级分中的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算是约86.6%。

将此级分减压浓缩，使浓度为约76%。将其取到结晶罐，加2%试剂级的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末（商品名“抗坏血酸2-葡萄糖苷999”、编码编号：AG124、抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度99.9%以上、株式会社林原生物化学研究所销售）作为种晶，通过适用于40℃稳稳搅拌着将溶液的温度经20小时从40℃冷却至35℃之后，经16小时从35℃冷却至30℃，再者，经12小时从30℃冷却至15℃的拟似控制冷却法经48小时冷却，将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析。用篮型离心机回收结晶，将结晶相对于糖膏重量用约5%的纯化水喷雾清洗之后，于38℃成熟、干燥3小时，将20℃的空气吹45分钟而冷却，粉碎而，得到以无水物换算含有抗坏血酸2-葡萄糖苷99.5%、含有L-抗坏血酸和D-葡萄糖合计0.1%、含有L-抗坏血酸不足0.1%，粉末全体的还原力0.21%的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。

由本制造方法制造的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度是93.9%、平均微晶径是

顺便而言，上述结晶化度的测定根据Hermans法进行，使用实验1-2中求出的解析值H₁₀₀及H₀进行。在测定本品的粒度分布时，粒径不足150μm的粒子含91.2%、粒径53μm以上但不足150m的粒子含57.3%。使用本品，由与实验1-4相同的方法进行固结性试验时，被判断为“无固结”（-）。另外，由与实验6相同的方法试验向1,3-丁二醇的溶解性时，被判断溶解性“良”。

本品是相比以往的准药品级的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末显著地难固结的粉末，可作为食品原料、食品添加物原料、化妆品原料、准药品原料、及药品原料等有利地利用。

【实施例7】

<含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>

在抗坏血酸2-葡萄糖苷生成反应中，每1g淀粉的固体分使用50单位作为CGT酶，嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter）属来源的重组型CGT酶（商品名“Toruzyme3.0L”、Novozyme（NOVOZYME）公司销售），另外，作为与CGT酶联用的淀粉脱支酶，每1g淀粉的固体分使用50单位嗜酸普鲁兰芽孢杆菌（Bacillus acidopullulyticas）来源的支链淀粉酶（商品名“Promozyme”、Novozyme·日本公司销售），另外，除了在晶析步骤中，适用以5个阶段经48小时从40℃冷却至15℃的拟似控制冷却法、即，经12小时从40℃冷却至38℃、经12小时从38℃冷却至35℃、经8小时从35℃冷却至30℃、经8小时从30℃冷却至23℃、再者，经8小时从23℃冷却至15℃的拟似控制冷却法以外，与实施例6同样，制造含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，得到以无水物换算含有抗坏血酸2-葡萄糖苷99.3%、含有L-抗坏血酸和D-葡萄糖合计0.1%、含有L-抗坏血酸不足0.1%，粉末全体的还原力是0.28%的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。再有，在本制造中，葡萄糖淀粉酶处理后的反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是32.9%。供于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶析的溶液的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算是86.4%。

本含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度是96.4%、平均微晶径是

顺便而言，上述结晶化度的测定根据Hermans法进行，使用实验1-2中求出的解析值H₁₀₀及H₀进行。在测定本品的粒度分布时，粒径不足150μm的粒子含92.2%、粒径53μm以上但不足150m的粒子含54.8%。使用本品，由与实验1-4相同的方法进行固结性试验时，被判断为“无固结”（-）。另外，由与实验6相同的方法试验向1,3-丁二醇的溶解性时，被判断溶解性“良”。

由本制造方法制造的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末相比市售的以往的准药品级的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末（商品名“AA2G”、株式会社林原商事销售），尽管抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度无何差异，是显著地难固结的粉末，保存或处理容易。

本品在含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶的粉末的点与以往的准药品级的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末同样，保存或处理容易，所以可作为食品原料、食品添加物原料、化妆品原料、准药品原料、及药品原料等更适宜地使用。

【实施例8】

<含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>

除了在抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶析步骤中，使用广泛使用的晶析系统用程序恒温循环装置，使温度控制的热介质在结晶罐的套内流动，将温度从40℃冷却至15℃，适用通过用近似于上述式［7］的20阶段的冷却表征经48小时冷却的控制冷却法，将抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶晶析以外，由与实施例3同样的方法制造含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。得到的粉末，以无水物换算含有抗坏血酸2-葡萄糖苷99.6%、含有L-抗坏血酸和D-葡萄糖合计0.1%、含有L-抗坏血酸不足0.1%，粉末全体的还原力是0.17%的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。再有，在本制造中，葡萄糖淀粉酶处理后的反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是约31%。供于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶析的溶液的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算是88.7%。

本含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度是93.0%、平均微晶径是

顺便而言，上述结晶化度的测定根据Hermans法进行，使用实验1-2中求出的解析值H₁₀₀及H₀进行。在测定本品的粒度分布时，粒径不足150μm的粒子含90.4%、粒径53μm以上但不足150m的粒子含65.3%。使用本品，由与实验1-4相同的方法进行固结性试验时，被判断为“无固结”（-）。另外，由与实验6相同的方法试验向1,3-丁二醇的溶解性时，被判断溶解性“良”。

<比较例1：含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>

除了在抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶析步骤中不适用拟似控制冷却法，使用以往的自然冷却法的以外，与实施例1中同样制造含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，得到以无水物换算含有抗坏血酸2-葡萄糖苷98.6%、含有L-抗坏血酸和D-葡萄糖合计0.5%、含有L-抗坏血酸0.3%，粉末全体的还原力0.72%的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。再有，在本制造中，葡萄糖淀粉酶处理后的反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是28.4%、供于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶析的溶液的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算是86.5%。

本含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度是87.5%、平均微晶径是

顺便而言，上述结晶化度的测定根据Hermans法进行，使用实验1-2中求出的解析值H₁₀₀及H₀进行。在测定本品的粒度分布时，粒径不足150μm的粒子含74.8%、粒径53μm以上但不足150μm的粒子含68.6%。使用本品，由与实验1-4相同的方法进行固结性试验时，被判断为“有固结”（+）。另外，由与实验6相同的方法试验向1,3-丁二醇的溶解性时，被判断溶解性“良”。

<比较例2：含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>

除了在抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶析步骤中不适用拟似控制冷却法使用以往的自然冷却法的以外，与实施例3中的同样制造含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，得到以无水物换算含有抗坏血酸2-葡萄糖苷98.3%、含有L-抗坏血酸和D-葡萄糖合计0.6%、含有L-抗坏血酸0.4%，粉末全体的还原力0.85%的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。再有，在本制造中，葡萄糖淀粉酶处理后的反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是30.5%、供于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶析的溶液的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算是87.8%。

本含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度是86.6%、平均微晶径是

顺便而言，上述结晶化度的测定根据Hermans法进行，使用实验1-2中求出的解析值H₁₀₀及H₀进行。在测定本品的粒度分布时，粒径不足150μm的粒子含76.5%、粒径53μm以上但不足150μm的粒子含68.4%。使用本品，由与实验1-4相同的方法进行固结性试验时，被判断为“有固结”（+）。另外，由与实验6相同的方法试验向1,3-丁二醇的溶解性时，被判断溶解性“良”。

<参考例1：含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>

对马铃薯淀粉5质量份加水15质量份，加市售的液化酶而加热溶解，加L-抗坏血酸3质量份，pH调节为5.5而作为底物溶液。向其，分别以每1g马铃薯淀粉100单位及1,000单位加CGT酶（株式会社林原生物化学研究所制造、嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus）Tc-91株（独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERMBP-11273）来源）和异淀粉酶（株式会社林原生物化学研究所制造），于55℃反应50小时生成抗坏血酸2-葡萄糖苷及其其他α-糖基-L-抗坏血酸。将此反应液加热而使酶失活之后，pH调节为4.5，向其每1g马铃薯淀粉加50单位葡萄糖淀粉酶剂（Nagase ChemteX株式会社销售、商品名“Glucozyme＃20000”、20，000单位/g），于55℃反应24小时，将α-糖基-L-抗坏血酸分解为抗坏血酸2-葡萄糖苷，另外，将混在的糖质分解为D-葡萄糖。本反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是约38%。

加热本反应液而使酶失活之后，用活性炭脱色过滤，将滤液用阳离子交换树脂（H⁺型）脱盐，接下来，使L-抗坏血酸及抗坏血酸2-葡萄糖苷吸附于阴离子交换树脂（OH^-型），水洗除去D-葡萄糖之后，用0.5N盐酸溶液溶出，再者，供于使用多孔性树脂（商品名“TOYOPEARLHW-40”、Tosoh株式会社制）的柱层析，采集高含抗坏血酸2-葡萄糖苷，L-抗坏血酸量少的级分。采集的级分中的抗坏血酸2-葡萄糖苷含量以无水物换算是87.6%。

将此级分减压浓缩为浓度约76%，将其取到结晶罐，加2%实施例1中制造的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末作为种晶，于40℃稳稳搅拌着用自然冷却法经2天冷却至15℃，使抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶晶析。用篮型离心机回收结晶，通过将结晶用少量的蒸馏水喷雾清洗之后，于35℃成熟、干燥8小时，将20℃的空气吹10分钟而冷却，粉碎而得到抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度98.5%、L-抗坏血酸和D-葡萄糖的合计的不足含量0.1%、L-抗坏血酸含量不足0.1%、粉末全体的还原力0.15%、对于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化度91.8%、其平均微晶径是

的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。顺便而言，上述结晶化度的测定根据Hermans法进行，使用实验1-2中求出的解析值H₁₀₀及H₀进行。当测定本粉末的粒度分布时，粒径不足150μm的粒子含83.0%、粒径53μm以上但不足150μm的粒子含57.7%。使用本粉末，通过与实验1-4、实验3-2及实验6分别相同的方法进行固结性试验、保存性试验及溶解性试验时，本粉末在固结性试验及保存性试验中被判断为“无固结”（-），在溶解性试验中，被判断为“溶解性不良”（-）。

【工业实用性】

如上所述，根据本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造方法，以淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸作为原料，在酶反应液中的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率不满35%时，也能通过在晶析步骤中适用控制冷却法或拟似控制冷却法，制造相比以往的准药品级的粉末更显著地难固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。如此本发明的制造方法，对于使用的酶，其选择的范围广，同时以作为有限的资源的淀粉或糊精和L-抗坏血酸作为原料，能以工业的规模更有效制造含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，有对于其产业上的有用性特别的方面。

【符号的说明】

在图1中，

a：微晶径的计算中使用的衍射角（2θ）10.4°（米勒指数（hkl）：120）的衍射峰

b：微晶径的计算中使用的衍射角（2θ）13.2°（米勒指数：130）的衍射峰

c：微晶径的计算中使用的衍射角（2θ）18.3°（米勒指数：230）的衍射峰

d：微晶径的计算中使用的衍射角（2θ）21.9°（米勒指数：060）的衍射峰

e：微晶径的计算中使用的衍射角（2θ）22.6°（米勒指数：131）的衍射峰

在图5中，

pUCori：质粒pUC的复制起始点

T7：T7启动子

白箭头（Amp）：氨苄西林抗性基因

黑箭头：CGT酶基因

在图6中，

a：控制冷却曲线

b：直线冷却

c：自然冷却曲线

Claims

1.含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末的制造方法，其包括下述（A）～（E）的步骤：

（A）使环麦芽糖糊精－葡聚糖转移酶作用于作为原料的含液化淀粉或糊精之任何和L-抗坏血酸的溶液，接下来向其作用葡萄糖淀粉酶而得到2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的生成率是27质量%以上的含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的溶液的步骤；

（B）将得到的含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的溶液纯化，使2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸含量以无水物换算超86质量%的步骤；

（C）从含有以无水物换算超86质量%的2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的溶液通过控制冷却法或拟似控制冷却法将2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的无水结晶析出的步骤；

（D）采集析出的2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的无水结晶的步骤；

（E）通过对采集的2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的无水结晶不进行溶解、再结晶化而进行成熟、干燥，根据需要粉碎而得到含有以无水物换算超98.0质量%但不足99.9质量%的2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸，基于粉末Ｘ射线衍射特征算出的对于2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的结晶化度是90%以上的含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末的步骤。

2.权利要求1所述的含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末的制造方法，其特征在于，在上述（A）的步骤中，使淀粉脱支酶与环麦芽糖糊精－葡聚糖转移酶一同作用。

3.权利要求1或2所述的含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末的制造方法，其中上述（B）的步骤包括进行将阴离子交换树脂作为填充剂使用的柱层析和将强酸性阳离子交换树脂作为填充剂使用的拟似移动床式的柱层析的步骤。

4.权利要求1～3之任一项所述的含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末的制造方法，其中上述环麦芽糖糊精－葡聚糖转移酶是有下述（a）～（d）所示的部分氨基酸序列的环麦芽糖糊精－葡聚糖转移酶：

（a）Asn-Glu-Val-Asp-X₁-Asn-Asn；

（b）Met-Ile-Gln-X₂-Thr-Ala；

（c）Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn-Ile；

（d）Val-X₃-Ser-Asn-Gly-Ser-Val，

但是，X₁表示Pro或Ala，X₂表示Ser或Asp，X₃表示Ser或Gly。

5.权利要求1～4之任一项所述的含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末的制造方法，其中上述环麦芽糖糊精－葡聚糖转移酶是嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）或嗜热产硫嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter thermosulfurigenes）来源的天然型或重组型酶。

6.权利要求1～5之任一项所述的含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末的制造方法，其中上述环麦芽糖糊精－葡聚糖转移酶是有序列表中的SEQ ID NO:1、3、4或5之任何所示的氨基酸序列的环麦芽糖糊精－葡聚糖转移酶。

7.权利要求1～6之任一项所述的含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末的制造方法，其特征在于，得到的含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末含有原料来源的L-抗坏血酸及/或D-葡萄糖，L-抗坏血酸量是以无水物换算0.1质量%以下，粉末全体的还原力是不足1质量%。