BR112013022939B1

BR112013022939B1 - Processo para produzir uma composição particulada

Info

Publication number: BR112013022939B1
Application number: BR112013022939-0A
Authority: BR
Inventors: Takashi Shibuya; Seisuke Izawa; Tomoyuki Nishimoto; Shigeharu Fukuda; Toshio Miyake
Original assignee: Hayashibara Co., Ltd
Priority date: 2011-03-07
Filing date: 2012-03-07
Publication date: 2022-01-11
Also published as: WO2012121297A1; JP5308590B2; JP5553899B2; JP2013151556A; EP2653475A1; CA2828516C; EP2653475B1; ZA201307116B; CA2828516A1; KR20140039177A; US20140178943A9; JP2013055932A; JP5242832B2; US20170360819A9; US9265781B2; AU2012226907A1; JP2013151555A; KR101957665B1; JP5308591B2; JP2016166235A

Abstract

processo para produzir uma composição particulada. [problema] fornecer um método para produzir um pó contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro com o qual é possível produzir um pó que não apresenta solidificação significante, mesmo quando a porcentagem de ácido 2-glicosídeo ascórbico for menor que 35 % em peso. [solução] um método para produzir um pó contendo cristais anidros de ácido 2-glicosídeo ascórbico compreendendo uma etapa na qual uma solução contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido l-ascórbico é exposta a cgtase e então a glicoamilase a fim de obter uma solução, em que a porcentagem de ácido 2-glicosídeo ascórbico produzido é 27 % em massa ou mais; uma etapa para purificar a solução resultante, de maneira tal o teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico exceda 86 % em massa; uma etapa para precipitar os cristais anidros de ácido 2-glicosídeo ascórbico pelo resfriamento controlado ou resfriamento semicontrolado; e uma etapa de recuperar, envelhecer e secar os cristais anidros de ácido 2-glicosídeo ascórbico precipitados.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito a um processo para produzir uma composição particulada contendo ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico cristalino anidro e, mais particularmente, a um processo para produzir uma composição particulada contendo ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico cristalino anidro que é significativamente menos propensa à formação de torta, comparada com as convencionais.

Fundamentos da Invenção

Devido a suas atividades fisiológicas e ação antioxidante vantajosas, ácido L-ascórbico tem sido usado com vários propósitos, incluindo aqueles para produtos alimentícios e cosméticos. Ácido L- ascórbico, entretanto, tem uma séria desvantagem de que é instável em virtude de sua redutibilidade e é suscetível a degradação oxidante que faz perder facilmente suas atividades fisiológicas. Para superar a desvantagem, o mesmo requerente da presente invenção, como um dos corequerentes da Literatura de Patente 1, revelaram ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico que é composto de uma molécula de D-glicose ligada no grupo hidroxila na posição C-2 de ácido L-ascórbico (a seguir, abreviado como “ácido 2-glicosídeo ascórbico”, por toda a especificação). Como características notáveis, ácido 2- glicosídeo ascórbico não apresenta redutibilidade, tem uma estabilidade satisfatória, e exerce as atividades fisiológicas inerentes ao ácido L-ascórbico após ser hidrolisado em corpos vivos em ácido L-ascórbico e D-glicose por uma enzima in vivo inerentemente existente nos corpos vivos. De acordo com o processo revelado na Literatura de Patente 1, ácido 2-glicosídeo ascórbico é formado deixando que uma enzima de transferência de sacarídeo tal como ciclomaltodextrina glucanotransferase (abreviada como “CGTase”, a seguir) ou a-glucosidase aja em uma solução contendo ácido L-ascórbico e um composto de sacarídeo a-glucosila.

Na Literatura de Patente 2, o mesmo requerente da presente invenção teve êxito na cristalização de ácido 2-glicosídeo ascórbico a partir de uma solução supersaturada de ácido 2-glicosídeo ascórbico e revelou ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino e uma composição particulada contendo o 5 mesmo. Na Literatura Não patente 1, o mesmo requerente da presente invenção revelou um processo para produzir um produto de alto teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico em grande escala. Até agora, sabe-se que ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino existe somente em uma forma cristalina anidra. Para referência, Literaturas Não patente 2 e 3 reportam os resultados de 10 análise da estrutura de raios-X para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino.

Nas Literaturas de Patente 3 e 4, o mesmo requerente da presente invenção revelou adicionalmente um processo para produzir um produto de alto teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, que compreende as etapas de submeter uma solução com ácido 2-glicosídeo ascórbico formado 15 por reações enzimáticas a uma cromatografia de coluna com uma resina de troca catiônica de ácido forte, e coletar uma fração rica em ácido 2-glicosídeo ascórbico. Na Literatura de Patente 5, o mesmo requerente da presente invenção revelou um processo para produzir um produto de alto teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, compreendendo submeter uma solução contendo 20 ácido 2-glicosídeo ascórbico formado por reações enzimáticas a eletrodiálise com uma membrana de troca aniônica para remover impurezas tais como ácido L-ascórbico e sacarídeos da solução; e, na Literatura de Patente 6, o mesmo requerente da presente invenção revelou um processo para produzir um produto de alto teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, que compreende as 25 etapas de submeter uma solução com ácido 2-glicosídeo ascórbico a uma resina de troca aniônica, e seletivamente dessorver os ingredientes adsorvidos na resina para obter uma fração rica em ácido 2-glicosídeo ascórbico.

Além do mais, Literaturas de Patente 7 a 11 revelam uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Bacillus stearothermophilus, que é agora classificada em um microrganismo da espécie Geobacillus stearothermophilus} uma sequência de nucleotídeo de um gene que codifica tal proteína CGTase; uma sequência de aminoácido determinada a partir da sequência de nucleotídeo; uma CGTase mutante 5 preparada introduzindo artificialmente uma mutação na sequência de aminoácido; e um processo para produzir sacarídeos usando a mesma. Literaturas Não patente 4 e 5 revelam a formação de ácido 2-glicosídeo ascórbico deixando que uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Bacillus stearothermophilus aja em uma solução contendo substância 10 amilácea e ácido L-ascórbico, e então deixando que glucoamilase aja na solução resultante para formar ácido 2-glicosídeo ascórbico.

Na Literatura de Patente 12, o mesmo requerente da presente invenção revelou um processo para produzir ácido 2-glicosídeo ascórbico compreendendo deixar que tanto uma enzima de formação de a-isomaltosil- 15 glucosacarídeo quanto uma enzima de formação de a-isomaltosil- glucosacarídeo e CGTase aja em uma solução contendo composto do ácido L- ascórbico e a-glucosil sacarídeo para formar ácido 2-glicosídeo ascórbico. Literaturas de Patente 13 e 14 pelo mesmo requerente da presente invenção respectivamente revelam que uma enzima de formação de a-isomaltosil- 20 glucosacarídeo e uma enzima de transferência de a-isomaltosila formam ácido 2-glicosídeo ascórbico catalisando a transferência de sacarídeos em ácido L- ascórbico.

Como para o uso de ácido 2-glicosídeo ascórbico, muitas propostas foram feitas conforme mostrado nas Literaturas de Patente 15 a 34.

Devido a suas propriedades vantajosas, ácido 2-glicosídeo ascórbico têm sido extensivamente usado como um material alimentício, material aditivo de alimentos, material cosmético, material quase medicamento, ou material farmacêutico para uso como em ácido L-ascórbico convencional e para outros usos onde ácido L-ascórbico não poderia ser usado em virtude de sua 4 instabilidade.

Conforme descrito anteriormente, no momento, sabe-se que ácido 2-glicosídeo ascórbico foi produzido usando várias enzimas de transferência de sacarídeo do ácido L-ascórbico e uma substância amilácea 5 como materiais. Entre eles, até o ponto do conhecimento até agora do presente requerente, o método compreendendo deixar que CGTase como uma enzima de transferência de sacarídeo aja em uma solução contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico é um método industrial mente vantajoso em virtude do rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo 10 ascórbico ser o maior. Com base na descoberta, o presente requerente produziu uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro por um processo compreendendo deixar que CGTase aja em uma solução contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L- ascórbico, e tem comercializado-a como um material para cosméticos/quase 15 medicamentos e para produtos alimentícios e aditivos de alimento com os respectivos nomes do produto de “AA2G” (comercializado por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão) e “ASCOFRESH” (comercializado por Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Japão), onde todas essas composições particuladas convencionais contendo ácido 2- 20 glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que foram comercializadas como um material como esse para cosméticos/quase medicamentos e para produtos alimentícios e aditivos de alimento, são abreviados como “pós de grau quase medicamento”, a seguir.

Embora pós de grau quase medicamento tenham 25 especificações do produto de pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico relativamente altas de 98,0 % em peso ou mais e tenham uma fluidez satisfatória como pós imediatamente após suas produções, eles têm uma desvantagem de que eles induzem formação de torta devido a seus próprios pesos e absorções de umidade quando deixados ficar em condições de temperatura e umidade relativamente altas. Em vista de uma desvantagem como essa, pós de grau quase medicamento têm sido comercializados em uma forma de produto, fechado em uma lata de aço com uma tampa depois embalados em um saco de polietileno por peso de 10-kg cada qual junto com um dessecante, entretanto, a última descoberta dos presentes inventores revelou que pós de grau quase medicamento mesmo em uma forma de produto como essa têm a desvantagem de que eles podem frequentemente causar formação de torta e perder suas propriedades adequadas como pós, quando armazenados por um período de tempo relativamente longo. Quando uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro para uso como um material cosmético ou material quase medicamento ou como um material alimentício ou material aditivo de alimentos é uma vez transformada em torta, ela pode causar qualquer problema nas etapas de transportar, peneirar, misturar matérias-primas, etc., se usinas de produção forem projetadas com a premissa de que matérias-primas são pós que retêm fluidez.

Uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro (nome de produto “Acido 2-glicosídeo ascórbico 999”, Código No.: AG 124, comercializado por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão) (a seguir abreviado como “um pó de grau reagente”)(vide, por exemplo, Literatura Não Patente 6), que tem sido comercializada como um reagente padrão analítico pelo mesmo requerente da presente invenção, não forma torta mesmo nas condições que permitem que um pó de grau quase medicamento forma torta, e ainda retém suas propriedades como um pó. Similarmente, como em um pó de grau quase medicamento, um pó de grau reagente como esse é um pó preparado deixando que CGTase aja em uma solução contendo ácido L-ascórbico e uma substância amilácea, purificando e concentrando a solução obtida contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico para precipitar ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, e coletando os cristais precipitados. Um pó de grau reagente como esse é diferente de um pó de grau quase medicamento em que, além das etapas convencionais, o primeiro precisa de etapas adicionais tal como uma etapa de recristalização de dissolver os cristais uma vez obtidos e então recristalizar os cristais, e uma etapa de lavagem de lavar repetidamente os cristais, obtidos através de uma etapa de recristalização, com água purificada, etc., para aumentar a pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico para uma pureza distintamente alta de 99,9 % ou mais em peso. Dessa maneira, mesmo em um pó de grau quase medicamento, pode-se especular fazê-lo em uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro que é significativamente menos propensa à formação de torta, aumentando a pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico para um nível de pelo menos 99,9 % em peso.

Entretanto, conforme descrito anteriormente, para aumentar a pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico para um nível de pelo menos 99,9 % em peso, uma etapa de recristalização e uma etapa de lavagem repetida com água purificada, etc., poderia ser adicionada além da etapa de produção usual, resultando em desvantagens não somente de um aumento de tempo e mão de obra exigidos para sua produção, mas uma perda de ácido 2-glicosídeo ascórbico nas etapas de recristalização e lavagem, bem como uma redução do rendimento de produção e um aumento do custo da produção por uma grande margem. Em virtude disso, não é uma opção realística simplesmente aumentar a pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico para um nível de pelo menos 99,9 % em peso com o propósito de obter uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro que é significativamente menos propensa à formação de torta, comparada com um pó de grau quase medicamento. Além do mais de acordo com o conhecimento dos presentes inventores, um pó de grau reagente tem uma desvantagem que é inferior em solubilidade quando misturado com um solvente hidrofílico, tal como uma solução de 1,3-butileno glicol aquosa, que é frequentemente usada em cosméticos e quase medicamentos.

Nessas circunstâncias, o presente requerente tem feito esforços de tentativa e erro, revelando que, em um método de produção de deixar que CGTase aja em uma solução contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico e então deixando que glucoamilase aja na solução resultante, no caso de aumentar o rendimento de produção de ácido 2- glicosídeo ascórbico na solução obtida pelas reações enzimáticas para um nível de pelo menos 35 % em peso, um pó que é significativamente menos propenso à formação de torta, comparado com um pó de grau quase medicamento convencional pode ser produzido substancialmente através das mesmas etapas do processo para produzir um pó de grau quase medicamento convencional como esse, sem dissolver e recristalizar o ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro uma vez obtido; e revelou a descoberta anterior na Literatura de Patente 35. No processo anterior, entretanto, existe uma inconveniência de que uma CGTase específica limitada poderia ser usada sozinha ou em combinação com uma enzima de desramificação de amido tal como isoamilase para aumentar o rendimento de produção de ácido 2- glicosídeo ascórbico para um nível de pelo menos 35 % em peso na mistura da reação obtido pelas reações enzimáticas, e tal processo não tem versatilidade geral como um método de produção.

Literaturas da Tecnologia Anterior Literaturas de Patente

[Literatura de Patente 1] Patente Japonesa Kokai No.139288/91 [Literatura de Patente 2] Patente Japonesa Kokai No. 135992/91 [Literatura de Patente 3] Patente Japonesa Kokai No. 183492/91 [Literatura de Patente 4] Patente Japonesa Kokai No. 117290/93 [Literatura de Patente 5] Patente Japonesa Kokai No. 208991/93 [Literatura de Patente 6] Patente Japonesa Kokai No. 2002- 088095 [Literatura de Patente 7] Patente Japonesa Kokai No. 63189/75 [Literatura de Patente 8] Patente Japonesa Kokai No. 39597/88 [Literatura de Patente 9] Patente Japonesa Kokai No.244945/93 [Literatura de Patente internacional No. WO 96033267 10] Relatório descritivo de patente [Literatura de Patente internacional No. WO 99015633 11] Relatório descritivo de patente [Literatura de Patente 12] Patente Japonesa Kokai No. 2004- 065098 [Literatura de Patente internacional No. WO 02010361 13] Relatório descritivo de patente [Literatura de Patente internacional No. WO 01090338 14] Relatório descritivo de patente [Literatura de Patente internacional No. WO 05087182 15] Relatório descritivo de patente [Literatura de Patente 16] Patente Japonesa Kokai No. 046112/92 [Literatura de Patente 17] Patente Japonesa Kokai No. 182412/92 [Literatura de Patente 18] Patente Japonesa Kokai No. 182413/92 [Literatura de Patente 19] Patente Japonesa Kokai No. 182419/92 [Literatura de Patente 20] Patente Japonesa Kokai No. 182415/92 [Literatura de Patente 21] Patente Japonesa Kokai No. 182414/92 [Literatura de Patente 22] Patente Japonesa Kokai No. 333260/96 [Literatura de Patente 23] Patente Japonesa Kokai No. 2005- 239653 [Literatura de Patente 24] Relatório descritivo de patente internacional No. WO 06033412 [Literatura de Patente 25] Patente Japonesa Kokai No. 2002- 326924 [Literatura de Patente 26] Patente Japonesa Kokai No. 2003- 171290 [Literatura de Patente 27] Patente Japonesa Kokai No. 2004- 217597 [Literatura de Patente 28] Relatório descritivo de patente internacional No. WO 05034938 225327 [Literatura de Patente 29] Patente Japonesa Kokai No. 2006- [Literatura de Patente 30] Relatório descritivo de patente internacional No. WO 06137129 [Literatura de Patente 31] Relatório descritivo de patente internacional No. WO 06022174 063177 [Literatura de Patente 32] Patente Japonesa Kokai No. 2007- [Literatura de Patente 33] Relatório descritivo de patente internacional No. WO 06132310 [Literatura de Patente 34] Relatório descritivo de patente internacional No. WO 07086327 [Literatura de Patente 35] Relatório descritivo de patente internacional No. WO 2011/027790 Literaturas Não Patente [Literatura Não Patente 1] Sanyo-Gijyutsu-Zasshi, Vol. 45, No. Lpágs. 63-69, 1997 [Literatura Não Patente 2] Carbohydrate Research, Takahiko MANDAI et al„ Vol. 232, págs. 197-205, 1992 [Literatura Não Patente 3] International Journal de Pharmaceutics, Yutaka INOUE et al., Vol. 331, págs. 38-45, 2007 [Literatura Não Patente 4] Applied Biochemistry e Microbiology, Vol. 143, No. 1, págs. 36-40, 2007 [Literatura Não Patente 5] Agricultural Biological Chemistry, Vol. 7, págs. 1751-1756, 1991 [Literatura Não Patente 6] Wako Analytical Circle, No. 29, pág. 6, 2003

Revelação da Invenção Objetivo da Invenção

A presente invenção, que foi feita para resolver a desvantagem anterior, visa prover um processo para produzir uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro que permite a produção de uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro que é significativamente menos propensa à formação de torta, comparada com um pó de grau quase medicamento, mesmo no caso em que o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico em uma solução da reação obtida por reações enzimáticas, seja abaixo de 35 % em peso.

Meios para Alcançar o Objetivo

A fim de superar o objetivo exposto, os presentes inventores continuaram estudando ainda mais e repetiram esforços de tentativa e erro em um processo para produzir uma composição particulada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro, e observaram que, aplicando o método de resfriamento controlado ou método de resfriamento pseudocontrolado descrito posteriormente durante a precipitação do ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de uma solução contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico, um ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro que é significativamente menos propensa à formação de torta, comparada com um pó de grau quase medicamento convencional pode ser produzido substancialmente através das mesmas etapas de um processo convencional para produzir um pó de grau quase medicamento como esse, mesmo quando o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico em uma solução da reação obtida por reações enzimáticas for abaixo de 35 % em peso.

Em outras palavras, a presente invenção resolve o objetivo anterior fornecendo um processo para produzir ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que contém as seguintes etapas (a) a (e); (a) uma etapa de deixar que CGTase aja em uma solução contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico como materiais, e então deixar que glucoamilase aja na solução resultante para obter uma solução contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico com um rendimento de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de pelo menos 27 % em peso; (b) uma etapa de purificar a solução resultante contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico para dar um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico acima de 86 % em peso, com base em material sólido e seco (pode ser abreviada como “d.s.b.”, a seguir); (c) uma etapa de precipitar ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro da solução purificada com um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico acima de 86 % em peso, d.s.b., por um método de resfriamento controlado ou método de resfriamento pseudocontrolado; (d) uma etapa de coletar o ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro precipitado; e (e) uma etapa de envelhecer, secar, e opcionalmente pulverizar o ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro coletado sem dissolver e recristalizá-lo para obter uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que contém um ácido 2-glicosídeo ascórbico em um nível, com base em material sólido e seco, acima de 98,0 % em peso, mas abaixo de 99,9 % em peso, e tem um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de pelo menos 90 %, quando calculado com base no perfil de difração de raios-X em pó da composição particulada.

De acordo com o processo da presente invenção, pode ser obtida uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que tem um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, com base em material sólido e seco, acima de 98,0 % em peso, mas abaixo de 99,9 % em peso e tem um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de pelo menos 90 % quando calculado com base no perfil de difração de raios-X em pó da composição particulada, precipitando ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro de uma solução do ácido 2-glicosídeo ascórbico, que é obtida por reações enzimáticas e apropriadamente purificando a solução da reação resultante, pelo método de resfriamento controlado ou método de resfriamento pseudocontrolado descrito posteriormente, desde que o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico seja pelo menos 27 % em peso na solução da reação, mesmo quando o nível de rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico não atingir 35 % em peso.

A composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, obtida pelo processo anterior tem uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico acima de 98,0 % em peso, mas abaixo de 99,9 % em peso, em que o nível de pureza é quase igual ou menor que aquele de um 5 pó de grau quase medicamento convencional; tem um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro (por toda a especificação, simplesmente abreviado como “grau de cristalinidade”, a seguir) tão alto quanto pelo menos 90 %; é um pó que é significativamente menos propenso à formação de torta, comparado com um pó de grau quase medicamento; e tem 10 uma solubilidade vantajosa em solventes hidrofílicos usados amplamente em cosméticos e quase medicamentos comparados com um pó de grau reagente devido a sua pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico menor que 99,9 % em peso. Tal composição particulada pode ser facilmente manipulável e adequadamente usada como um material alimentício, material aditivo de 15 alimentos, material cosmético, material quase medicamento, e material farmacêutico.

No processo de acordo com a presente invenção, o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico em uma solução da reação obtida por reações enzimáticas será preferivelmente pelo menos 27 % em peso, e, em 20 alguns casos, ele pode ser pelo menos 35 % em peso. O processo é particularmente vantajoso uma vez que ele fornece uma composição particulada, que é um pó que é significativamente menos propenso à formação de torta, comparado com um pó de grau quase medicamento, quase na mesma etapa de um pó de grau quase medicamento convencional, exceto pela 25 aplicação de um método de resfriamento controlado ou método de resfriamento pseudocontrolado, mesmo quando o nível do rendimento de produção identificado anteriormente é menos que 35 % em peso, isto é, pelo menos 27 % em peso mas menos que 35 % em peso. Quando o rendimento de produção anterior é pelo menos 35 % em peso, o processo de acordo com a presente invenção tem o mérito de que ele pode produzir uma composição particulada, que é um pó que é significativamente menos propenso à formação de torta, comparado com um pó de grau quase medicamento, usando praticamente a mesma etapa de um processo convencionalmente empregado para produzir um pó de grau quase medicamento, exceto pela aplicação de um método de resfriamento controlado ou método de resfriamento pseudocontrolado. No processo de acordo com a presente invenção, em que, na etapa (a) de obter uma solução contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico com seu rendimento de produção de pelo menos 27 % em peso, uma enzima de desramificação de amido tal como isoamilase e pululanase pode ser usada em combinação com CGTase para aumentar mais o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico na solução da reação.

Além disso, no processo de acordo com a presente invenção, em que, na etapa (b) de purificar a solução resultante contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico para dar um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico acima de 86 % em peso, d.s.b., pode ser também empregada uma cromatografía de coluna usando uma resina de troca aniônica como um material de empacotamento da coluna e uma cromatografía de coluna de leito móvel simulado usando uma resina de troca catiônica de ácido forte como um material de empacotamento da coluna. Na etapa (b), quando a cromatografía de coluna usando a resina de troca aniônica anterior como um material de empacotamento da coluna e a cromatografía de coluna de leito móvel simulado usando a resina de troca catiônica de ácido forte anterior como um material de empacotamento da coluna são empregadas em combinação, uma solução contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico com um teor de ácido 2- glicosídeo ascórbico acima de 86 % em peso, d.s.b., pode ser mais efícientemente obtida como um mérito.

Adicionalmente, os estudos continuados dos presentes inventores revelaram que CGTases, capazes de produzir pelo menos 27 % em peso de ácido 2-glicosídeo ascórbico em soluções de reação obtidas pelas reações enzimáticas na etapa (a), têm um recurso característico comum no nível de aminoácido.

Mais especificamente, a presente invenção também resolve o objetivo anterior fornecendo um processo para produzir ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro usando, como as CGTases anteriores, qualquer CGTases com as seguintes sequências de aminoácido parciais de (a) a (d): (a) Asn-Glu-Val-Asp-X]-Asn-Asn; (b) Met-Ile-Gln-X2-Thr-Ala; (c) Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn-Ile; e (d) Val-X3-Ser-Asn-Gly-Ser-Val. (Em que Xi significa Pro ou Ala, X2 significa Ser ou Asp, e X3 significa Ser ou Gly, respectivamente).

Exemplos das CGTases com as sequências de aminoácido parciais anteriores de (a) a (d) incluem enzimas naturais e recombinantes derivadas de microrganismos da espécie Geobacillus stearothermophilus ou Thermoanaerobacter thermosulfurigenes, mais especificamente, CGTases com qualquer das sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 1, 3, 4 e 5, que podem ser preferivelmente usadas na presente invenção.

A composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, obtida pelo processo da presente invenção, preferivelmente contém ácido 2-glicosídeo ascórbico em um teor, com base em material sólido e seco, acima de 98,0 % em peso, mas abaixo de 99,9 % em peso; tem um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de pelo menos 90 %, quando calculado com base no perfil de difração de raios-X em pó da composição particulada; contém ácido L- ascórbico e/ou D-glicose derivado dos materiais; contém ácido L-ascórbico em um teor de não mais que 0,1 % em peso, d.s.b.; e tem um poder redutor de toda a composição particulada menor que um por cento em peso.

Efeito da Invenção

Uma vez que o processo da presente invenção permite produzir uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que é significativamente menos propensa à formação de torta, comparada com um pó de grau quase medicamento, mesmo no caso em que o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico em uma solução da reação obtida por reações enzimáticas é abaixo de 35 % em peso, ele fornece um grande benefício de que a faixa de enzimas de seleção, particularmente, CGTases, usada para reações enzimáticas, é expandida amplamente. O processo da presente invenção fornece uma informação a respeito das sequências de aminoácido parciais comuns em CGTases que realizam o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico a um nível de pelo menos 27 % em peso nas reações enzimáticas e, portanto, ele fornece um mérito de que a classificação de CGTases viáveis para o processo da presente invenção toma-se viável com base nas sequências de aminoácido parciais. Adicionalmente de acordo com o processo da presente invenção, uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que é significativamente menos propensa à formação de torta, comparada com um pó de grau quase medicamento convencional, pode ser produzida por um processo que, em termos de etapas, não é diferente do processo para produzir um pó de grau quase medicamento convencional que usa tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico como materiais, exceto pelo uso de um método de resfriamento controlado ou método de resfriamento pseudocontrolado na etapa de cristalização para precipitar ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de uma solução da reação obtida por reações enzimáticas; e, portanto, uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que é significativamente menos propensa à formação de torta, comparada com um pó de grau quase medicamento, pode ser produzida com um tempo, mão de obra, instalação de produção, e custo que são bem próximos daqueles convencionalmente exigidos para produzir um pó de grau quase medicamento como esse como um mérito.

Para referência, quando usado como um material alimentício pulverizado, material aditivo de alimentos, material cosmético, material quase medicamento, e material farmacêutico, a composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro produzida pelo processo da presente invenção exerce o mérito de que ela pode ser facilmente preservada, armazenada, e manipulada, bem como sendo substancialmente livre de causar problema em processos tais como materiais de transporte, peneiramento e mistura, mesmo quando usados em uma usina de produção construída na premissa de que os materiais usado neles deverá ter fluidez, em virtude de a composição particulada, como um constituinte dos materiais pulverizados, ser significativamente menos propensa à formação de torta.

Uma vez que a composição particulada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro produzida pelo processo da presente invenção pode ter facilmente controlada sua distribuição de tamanho de partícula naquela exigida para materiais alimentícios, etc., isto é, ela pode ser controlada por aquelas com um tamanho de partícula menor que 150 μm em um teor de pelo menos 70 % em peso para toda a composição particulada e aquelas com um tamanho de partícula de pelo menos 53 μm mas menos que 150 μm em um teor de 40 a 60 % em peso para toda a composição particulada, a composição particulada tem o mérito de que ela pode ser usada como antes sem alterar etapas de produção e padrões de material anteriores, mesmo quando usada como um material alimentício, material aditivo de alimentos, material cosmético, material quase medicamento, ou material farmacêutico. Uma vez que a composição particulada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro, produzida pelo processo de acordo com a presente invenção, contém ácido L-ascórbico e/ou D-glicose e tem um poder redutor de todo o pó acima de 0 % em peso mas menos que 1 % em peso e, a despeito do fato de que é uma composição particulada produzida tanto de amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico como materiais, ela tem o mérito de que ela não apresenta nenhum risco de causar deterioração das qualidades tal como mudança de cor mesmo quando misturada com outras substâncias com grupos amino intramolecularmente tais como aminoácidos e proteínas. Adicionalmente, uma vez que a composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro produzida pelo processo da presente invenção contém ácido L-ascórbico em um teor acima de 0 % em peso mas abaixo de 0,1 % em peso, ela per se mesma não apresenta nenhum risco de tomar a cor em marrom descorado, mesmo quando armazenada sozinha por um período de tempo relativamente longo, e ela pode ser usada como um material alimentício, material aditivo de alimentos, material cosmético, material quase medicamento, e material farmacêutico como um pó branco substancialmente incolor.

Breve Descrição dos Desenhos

A FIG. 1 é um exemplo de padrão de difração de raios-X em pó com raios-X característicos para uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, consistindo substancialmente em ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro.

A FIG. 2 é um exemplo de padrão de difração de raios-X em pó com raios-X característicos para uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico, consistindo substancialmente em ácido 2- glicosídeo ascórbico amorfo.

A FIG. 3 é um exemplo de padrão de difração de raios-X em pó com uma radiação síncroton para uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, consistindo substancialmente em ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro.

A FIG. 4 é um exemplo de padrão de difração de raios-X em pó com uma radiação síncroton para uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico, consistindo substancialmente em ácido 2- glicosídeo ascórbico amorfo.

A FIG. 5 é uma FIG. da estrutura e os sítios de reconhecimento de enzima de restrição de um DNA recombinante “pRSET- ÍBTC12”, que contém um gene CGTase derivado da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus usada na presente invenção.

A FIG. 5 é uma FIG. de padrões de resfriamento. Melhor Modo para Realizar a Invenção

1. Definição dos termos

Por toda a especificação, os termos seguintes têm o significado apresentado a seguir:

Os termos “um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro” conforme referidos na especificação significam um valor definido pela seguinte fórmula [1]. Fórmula [1]:

Hioo: Um valor analítico para um grau de cristalinidade, determinado com base no perfil de difração de raios-X em pó para uma amostra padrão pulverizada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, onde a amostra padrão pulverizada consiste substancialmente em ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro. Ho: Um valor analítico para um grau de cristalinidade, determinado com base no perfil de difração de raios-X em pó para uma amostra padrão pulverizada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico, onde a amostra padrão pulverizada consiste substancialmente em uma forma amorfa de ácido 2-glicosídeo ascórbico. Hs: Um valor analítico para um grau de cristalinidade, determinado com base no perfil de difração de raios-X em pó para, como uma amostra de teste, um pó contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico.

Na Fórmula [1], os perfis de difração de raios-X em pó para a base de valores analíticos determinantes Hioo, Ho e Hs podem ser normalmente determinados por um difratômetro de raios-X em pó equipado com um sistema ótico refletivo ou transmissivo. Os perfis de difração de raios-X em pó contêm dados para ângulos de difração e intensidades de difração de ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro contidos em uma amostra teste ou de padrão. Exemplos de um método para determinar os dados analíticos para os graus de cristalinidade de tais amostras com base em seus perfis de difração de raios-X em pó incluem, por exemplo, método de Hermans, método de Vonk, etc. Entre estes, o método de Hermans é preferível em virtude de sua facilidade e precisão. Uma vez que qualquer desses métodos analíticos tem sido atualmente provido como um software de computador, qualquer difratômetro de raios-X em pó equipado com um aparelho analítico instalado com qualquer um dos softwares de computador anteriores pode ser favoravelmente usado.

Como “uma amostra padrão pulverizada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro, onde a amostra padrão pulverizada consiste substancialmente em ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro”, para determinar o valor analítico Hioo, deve ser usado um ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro na forma de um pó ou cristal simples, que tem uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de pelo menos 99,9 % em peso (por toda a especificação, “% em peso” é abreviado como “%”, a menos que de outra forma especificada, mas “%” relacionada ao grau de cristalinidade não deverá ser limitado a isto), exibe picos de difração característicos inerentes ao ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, e consiste substancialmente em ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro. Exemplos desses na forma de um pó ou cristal simples incluem o pó de grau reagente identificado anteriormente, uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro obtida recristalizando o pó de grau reagente, e ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro na forma de um cristal simples. Para referência, quando analisado com um software de computador para os métodos de Herman, um perfil de difração de raios-X em pó da amostra padrão pulverizada da composição particulada identificada anteriormente contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, consistindo substancialmente em ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, dá um valor analítico Hioo, normalmente, variando de cerca de 70,2 % a cerca de 70,5 %.

Como “uma amostra padrão pulverizada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico, onde a amostra padrão pulverizada consiste substancialmente em uma forma amorfa de ácido 2-glicosídeo ascórbico” para determinar o valor analítico Ho, deve ser usado um ácido 2-glicosídeo ascórbico na forma de um pó, que tem uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de pelo menos 99,1 %, exibe um padrão de difração de raios-X em pó consistindo somente em halo inerentes a sua forma amorfa, e não exibe substancialmente nenhum pico de difração característico inerente a ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro. Exemplos de um pó como esse incluem aqueles que são obtidos dissolvendo a amostra padrão pulverizada identificada anteriormente para determinar o valor analítico Hioo supracitado em uma quantidade apropriada de água purificada, concentrando a solução, liofilizando o concentrado, e secando in vacuo o resultante para dar um teor de umidade de 2,0 % ou menos, quando determinado pelo método Karl Fischer. Com esses tratamentos, sabe-se por experiência que é obtido um pó consistindo substancialmente em uma forma amorfa de ácido 2-glicosídeo ascórbico. Para referência, quando analisado com um software de computador para os métodos de Herman, um perfil de difração de raios-X em pó da amostra padrão pulverizada identificada anteriormente contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico, consistindo substancialmente em uma forma amorfa de ácido 2-glicosídeo ascórbico, dá um valor analítico Ho, normalmente, variando de cerca de 7,3 % a cerca de 7,6 %.

Como uma amostra padrão para determinar o valor analítico Ho, sem precisar dizer que um ácido 2-glicosídeo ascórbico com uma maior pureza é preferível, entretanto, a pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de uma amostra padrão usada para determinar o valor analítico HQ, preparada a partir da amostra padrão usada para determinar o valor analítico H]00 conforme mencionado anteriormente, é limitada até 99,1 %, mesmo que a pureza da amostra padrão usada para determinar o valor analítico H100 seja distintamente tão alta quanto 99,9 % ou mais, conforme mostrado no Experimento 1-1 descrito posteriormente. Assim, a pureza de “uma amostra padrão pulverizada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico, onde a amostra padrão pulverizada consiste substancialmente em uma forma amorfa de ácido 2-glicosídeo ascórbico” é ajustada a 99,1 % ou mais conforme mencionado anteriormente.

<Diâmetro de cristalito médio>

Em geral, uma partícula de pó em um pó contendo cristal foi reconhecido como constituído por cristais simples, isto é, cristalitos. Especula-se que o tamanho do cristalito (diâmetro de cristalito) em um pó cristalino seja refletido em sua propriedade. Os termos “um diâmetro de cristalito médio para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro” conforme referido na especificação significam uma média dos diâmetros de cristalitos calculada respectivamente submetendo uma composição particulada contendo anidro cristalino 2-glicosídeo a uma análise de difração de raios-X em pó; selecionando cinco picos de difração entre picos de difração detectados nos padrões de difração de raios-X em pó obtidos, isto é, aqueles de picos de difração (vide os símbolos “a” a “e” na FIG. 1) nos ângulos de difração (20) de 10,4 ° (índice de Miller (hkl): 120), 13,2 ° (índice de Miller (hkl): 130), 18,3 ° (índice de Miller (hkl):230), 21,9 0 (índice de Miller (hkl):060), e 22,6 ° (índice de Miller (hkl): 131), que localizado em uma região de ângulo relativamente baixo que deve ser menos rompedora para largura do pico de difração devido a cepa heterogênea de cristalito, e que foram bem separados dos outros picos de difração; calibrando as respectivas meias larguras (larguras totais na metade máxima) e os ângulos de difração com base nos valores medidos determinados quando silício (“SÍ640C”, provido por NIST: National Institute of Standards and Technology, como uma amostra padrão para difração de raios-X) é usado como uma amostra padrão; e calculando as respectivas médias dos diâmetros de cristalitos com a equação de Scherrer mostrada na seguinte fórmula [2]: Fórmula [2]: [Equação 2]

D : Tamanho do cristalito (Â) 2 : Comprimento de onda de raios-X (Â) β : Largura de linha de Difração (rad) θ : Difração ângulo (°) K : Constante (0,9 quando uma meia largura (uma largura total na metade máxima) é usada para β)

Uma vez que um difratômetro de raios-X em pó usado comumente foi sido instalado com um software de computador para calcular tais diâmetros de cristalito, um diâmetro de cristalito médio de ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro é determinado de forma relativamente fácil, desde que uma composição particulada contenha ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro seja disponível. Antes da medição para padrão de difração de raios-X em pó, cada amostra de teste é pulverizada em um almofariz e peneirada com uma peneira de 53 μm para obter um pó passado através da peneira para uso.

Os termos “um poder redutor de toda a composição particulada” conforme referido na especificação significam uma porcentagem (%) do teor de sacarídeo redutor para o teor de açúcar total em uma amostra de teste, calculada pela seguinte fórmula [3] com base no teor de açúcar redutor e no teor de açúcar total em termos de D-glicose determinado pelo método Somogyi-Nelson e pelo método antrona-ácido sulfúrico amplamente usados na técnica, onde D-glicose é usada como uma substância padrão. Fórmula [3]:

<Distribuição de tamanho de partícula>

Na especificação, a distribuição de tamanho de partícula de uma composição particulada é determinada como a seguir: peneiras metálicas com tamanhos de abertura de 425, 300, 212, 150, 106, 75 e 53 μm, produzidas por Kabushiki Gaisha lida Seisaku-sho, Tóquio, Japão, que são de conformidade com Padrões Industriais Japoneses (JIS Z 8801-1), são corretamente pesadas, empilhadas na ordem identificada anteriormente, e montadas em “R-l”, um nome de produto de um agitador de peneira ro-tap, produzido pela Kabushiki Gaisha Tanaka Kagaku Kikai Seisaku-sho, Osaka, Japão. Uma quantidade prescrita da amostra pesada é colocada na peneira mais alta (com um tamanho de abertura de 425 μm) nas peneiras empilhadas, seguido por agitação das peneiras por 15 minutos mantendo ao mesmo tempo o estado empilhado. Em seguida, cada qual das peneiras empilhadas foi corretamente pesada novamente, e o peso da amostra coletada em cada qual das peneiras foi determinado subtraindo o peso de cada qual das peneiras antes do carregando da amostra do peso da peneira correspondente depois da agitação. Em seguida, distribuições do tamanho de partícula são expressas calculando a porcentagem em peso (%) de cada qual dos pesos das composições particuladas com respectivos tamanhos de partículas coletados em cada qual das peneiras para o peso da amostra carregada na peneira mais alta.

Os termos “um rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico” conforme referido na especificação significam um teor (%) de ácido 2-glicosídeo ascórbico, d.s.b., em uma solução da reação enzimática obtida deixando enzimas tal como CGTase agir em uma solução contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico.

Os termos “um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, d.s.b.” significam uma porcentagem (%) em peso de ácido 2-glicosídeo ascórbico para o peso total de uma amostra contendo o mesmo quando calculado excluindo umidade. Por exemplo, o significado de um teor de ácido 2- glicosídeo ascórbico, d.s.b., em uma solução é uma porcentagem em peso de ácido 2-glicosídeo ascórbico para os teores de sólidos totais restantes, excluindo a água contida na solução. Embora o significado de um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, d.s.b., em uma composição particulada seja uma porcentagem em peso do peso de ácido 2-glicosídeo ascórbico para o peso total da composição particulada, quando calculado com relação ao resíduo da composição particulada excluindo umidade contida nele como o peso total da composição particulada.

Os termos “atividade de CGTase” conforme referidos na especificação são definidos como a seguir: a cinco mililitros de uma solução de substrato aquosa contendo 0,3 % (p/v) de um amido solúvel, tampão de acetato 20 mM (pH 5,5) e cloreto de cálcio 1 mM, é adicionado 0,2 mL de uma solução de enzima devidamente diluída, e a solução de substrato resultante é mantida a 40°C, e amostrada a 0 minuto e 10 minutos depois de iniciar a reação enzimática nas respectivas quantidades de 0,5 mL, seguido pela adição imediata de 15 mL de solução de ácido sulfúrico 0,02 N para cada amostra para suspender a reação enzimática. Cada qual das soluções de ácido sulfurico resultante é misturada com 0,2 mL de solução de iodo 0,1 N para revelar cores, e, depois de 10 minutos, as soluções coloridas são respectivamente medidas para absorbância a um comprimento de onda de 660 nm por um medidor de absorção, seguido pelo cálculo da atividade de CGTase usando a seguinte fórmula [4] como uma atividade de hídrolisação de amido. Uma atividade da unidade de CGTase é definida como a quantidade de enzima que diminui completamente a cor do iodo de 15 mg de amido em uma solução. Fórmula [4]: [Equação 4]

Nota : “Aa” significa absorbância a um comprimento de onda de 660 nm de uma solução da reação a 0 minuto depois de iniciar a reação enzimática.“Ab” significa a absorbância a um comprimento de onda de 660 nm de uma solução da reação a 10 minutos depois de iniciar a reação enzimática.

<AtÍvidade de isoamilase>

Os termos “atividade de isoamilase” conforme referidos na especificação são definidos como a seguir: a três mililitros de uma solução de substrato aquosa contendo 0,83 % (p/v) de amido de milho ceroso solúvel em Lintner e tampão de acetato 0,1 M (pH 3,5) é adicionada 0,5 mL de uma solução de enzima devidamente diluída, e a solução de substrato resultante é mantida a 40°C e amostrada a 0,5 minuto e 30,5 minutos depois de iniciar a reação enzimática nas respectivas quantidades de 0,5 mL, seguido pela adição imediata de 15 mL de solução de ácido sulfúrico 0,02 N em cada amostra para suspender a reação enzimática. Cada qual das soluções de ácido sulfúrico resultante é misturada com 0,5 mL de solução de iodo 0,01 N para revelar cores a 25°C por 15 minutos, e então as soluções coloridas são respectivamente medidas com relação à absorbância a um comprimento de onda de 610 nm por um medidor de absorção, seguido pelo cálculo da atividade de isoamilase usando a seguinte fórmula [5] como uma atividade de hidrolisação de amido. Uma atividade da unidade de isoamilase é definida como uma quantidade de enzima que aumenta a absorbância em 0,004 a um comprimento de onda de 610 nm nas condições de medição anteriores. Fórmula [5]: [Equação 5]

Nota: “Aa” significa a absorbância de uma solução da reação a um comprimento de onda de 610 nm. “Ab” significa a absorbância de uma solução controle a um comprimento de onda de 610 nm.

Os termos “atividade de pululanase” conforme referidos na especificação são definidos como a seguir: Uma solução de pululano aquosa 1,25 % (p/v) (um reagente para atividade pululanase, comercializado por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão) é provida como uma solução de substrato aquosa. Quatro mililitros da solução de substrato aquosa e 0,5 mL de salina tamponada com fosfato-ácido cítrico 0,05 M (pH 5,8) foram colocados em um tubo de teste e pré-aquecidos a 30°C. Ao tubo de teste foi adicionado 0,5 mL de uma solução de enzima, que foi devidamente diluída com tampão de acetato 0,01 M (pH 6,0) e a solução de substrato resultante foi incubada a 30°C e amostrada nas respectivas quantidades de 0,5 mL a 0,5 minuto (uma solução controle) e 30,5 minutos (uma solução da reação), seguido adicionando prontamente cada qual das soluções amostradas em dois mililitros da solução de cobre Somogyi para suspender a reação, submetendo cada solução resultante ao método Somogyi-Nelson, determinando a absorbância de cada solução a um comprimento de onda de 520 nm por um medidor de absorção para medir o poder redutor formado, e calculando o valor como uma atividade de decomposição de pululano pela seguinte fórmula [6], Uma atividade da unidade de pululanase é definida como uma quantidade de enzima que libera um poder redutor correspondente a um micromol de maltotriose por minuto. Fórmula [6]: [Equação 6]

Nota: “Aa” significa a absorbância de uma solução da reação a um comprimento de onda de 520 nm. “Ab” significa a absorbância de uma solução controle a um comprimento de onda de 520 nm. “Ac” significa a absorbância de uma solução padrão a um comprimento de onda de 520 nm. D-Glicose (100 μg/mL) é usado para uma solução padrão.

<Método de resfriamento controlado>

Os termos “um método de resfriamento controlado” conforme referidos na especificação significam um método para precipitar cristais por “um resfriamento controlado” e significam um método de resfriamento onde a temperatura do líquido “T” no tempo “t” é basicamente expressa pela seguinte fórmula [7], em que “T” é o tempo de operação estabelecido para uma etapa de cristalização, “To” é a temperatura do líquido no início de cristalização, e “Tf” é a temperatura do líquido alvejada no término de cristalização.Fórmula [7]: [Equação 7]

Quando um método de resfriamento controlado é expresso mais concretamente (esquematicamente) com um gráfico, ele é expresso com “a” na FIG. 6, em que o eixo da abscissa corresponde ao tempo de operação estabelecido como uma etapa de cristalização e o eixo longitudinal corresponde à temperatura do líquido na cristalização. Conforme mostrado no símbolo “a” na FIG. 6 de acordo com um método de resfriamento controlado, a temperatura do líquido diminui gradualmente na fase inicial de cristalização na qual a temperatura é relativamente alta, mas ela prontamente diminui na última fase na qual a temperatura do líquido diminuiu até certo ponto. Dessa maneira, a temperatura do líquido “Tm” no tempo de t=r/2, isto é, no ponto médio da etapa de cristalização é mantida pelo menos na conexão de Tm > [(To -Tf)/2 + Tf] (ou a mudança de temperatura no ponto médio da etapa de cristalização fica menos que 50 % da mudança de temperatura total). No padrão de mudança da temperatura do líquido em função do tempo, o método de resfriamento controlado é claramente distinto tanto de um método de resfriamento linear (o símbolo “b” na FIG. 6) onde a temperatura do líquido diminui linearmente com o tempo “T” da temperatura do líquido To aTf, e um método de resfriamento não forçado usual (o símbolo “c” na FIG. 6) onde a temperatura do líquido diminui exponencialmente e prontamente na fase inicial de cristalização na qual a temperatura do líquido é relativamente alta, mas diminui gradualmente na última fase da etapa de cristalização na qual a temperatura do líquido foi abaixada. Para alterar a temperatura do líquido “T” em função do tempo “t” representado na Fórmula anterior [7], por exemplo, um circulador constante programado de uso geral comercializado para sistema de cristalização, etc., pode ser usado.

Quando um método de resfriamento controlado como esse é aplicado para etapa de cristalização, depois da adição dos cristais sementes de ácido 2-glicosídeo ascórbico, a redução da temperatura do líquido é gradualmente realizada na fase inicial de cristalização, e, portanto, um aumento pronto do grau de supersaturação de ácido 2-glicosídeo ascórbico e a formação de uma nucleação de cristal secundária por resfriamento são ambos inibidos e o crescimento dos cristais a partir dos cristais sementes adicionados como núcleos de cristal pode ser predominantemente continuado. Entretanto, na última fase da etapa de cristalização na qual cristais foram completamente gerados a partir dos cristais sementes adicionados como núcleos de cristal, os cristais homogeneamente formados são deixados crescer todos juntos diminuindo prontamente a temperatura do líquido, e, portanto, ela dá o mérito de que um método de resfriamento controlado fornece uma massa cozida contendo cristais com um tamanho de partícula homogêneo e uma quantidade menor de microcristais. Para referência, “método de resfriamento controlado” é descrito com detalhes em “Wakariyasui-Batch-Shosekí” (Accessible Batch Cristalization), págs. 32-47, editado por Noriaki KUBOTA, publicado pela Society of Separation Process Engineers, Japão, publicado em 30 de abril de 2010.

<Método de resfriamento pseudocontrolado>

O termo “um método de resfriamento pseudocontrolado” conforme referido na especificação significa literalmente um método de resfriamento que é artificial mente parecido com o método de resfriamento controlado identificado anteriormente, em que a temperatura do líquido “T” não é estritamente alterada em função do tempo “t” de acordo com a Fórmula anterior [7], e mais especificamente ele significa um método de resfriamento em que a temperatura do líquido “T” é diminuída linearmente ou escalonadamente em função do tempo “t” a fim de manter a variação (T0-Tm) da temperatura do líquido “T” no ponto “t=x/2” para ter pelo menos 5 %, mas menos que 50 % da mudança de temperatura total (T0-Tf), preferivelmente, pelo menos 10 %, mas menos que 30 %, em virtude, variando dependendo do teor dos cristais sementes, a pureza, concentração, e grau de supersaturação de as0-Tm) da temperatura do líquido “T” no ponto “t=r/2” para ter pelo menos 5 %, mas menos que 50 % da mudança de temperatura total (T0-Tf), a temperatura do líquido “T” diminui gradualmente ácido 2-glicosídeo ascórbico em uma solução contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico usado na cristalização, é preferível que núcleos de cristal sejam quase completamente gerados no momento da operação “t=r/2” (no ponto médio na etapa de cristalização). No caso de deixar que a temperatura do líquido “T” diminua linearmente ou escalonadamente em função do tempo “t” de maneira a ajustar a variação (teste o tempo “t” na fase inicial de cristalização na qual a temperatura do líquido é relativamente alta, enquanto a temperatura do líquido “T” prontamente diminui em função do tempo “t” na última fase da etapa de cristalização na qual a temperatura do líquido diminuiu até certo ponto. Em decorrência disso, ela pode ser um pouco inferior ao método de resfriamento controlado supracitado, entretanto, um método de resfriamento pseudocontrolado proporciona substancialmente o mesmo mérito do método de resfriamento controlado, em que o método de resfriamento pseudocontrolado permite fornecer uma massa cozida contendo cristais com uma quantidade menor de microcristais e um tamanho de partícula homogêneo.

Falando concretamente, por exemplo, a temperatura do líquido “T” é deixada diminuir linearmente ou escalonadamente em função do tempo “t” de tal maneira de dividir o tempo de operação “T” em pelo menos duas, preferivelmente, pelo menos três zonas e então, em uma zona da fase inicial da etapa de cristalização, deixando que o gradiente térmico em resfriamento diminua gradualmente (para abaixar a taxa de resfriamento); e, à medida que ele muda da fase inicial ou da fase intermediária para a última fase, deixando que o gradiente térmico aumente (para aumentar a taxa de resfriamento) para fazer com que a variação (T0-Tm) da temperatura do líquido “T” no ponto “t=r/2” seja pelo menos 5 %, mas menos que 50 % da mudança de temperatura total (T0-Tf), preferivelmente, pelo menos 10 %, mas menos que 30 %. No caso em que a variação (T0-Tm) da temperatura do líquido “T” no ponto “t=r/2” é pelo menos 50 % da mudança de temperatura total (To-Tf), a taxa de resfriamento na fase inicial da etapa de cristalização é tão rápida a ponto de possivelmente aumentar prontamente o grau de supersaturação por resfriamento para formar os núcleos de cristais secundários; enquanto no caso menor que 5 %, a taxa de resfriamento na fase inicial da etapa de cristalização é tão baixa quanto para entrar na última fase da etapa de cristalização, onde um pronto resfriamento iniciará antes do término de formar suficientemente cristais a partir dos cristais sementes adicionados como núcleos de cristal. De qualquer maneira, fica impossível obter uma massa cozida contendo cristais com uma quantidade menor de microcristais e um tamanho de partícula homogêneo.

Para conduzir o método de resfriamento controlado conforme descrito anteriormente, a temperatura do líquido “T” deveria ser mudada em função do tempo “t” representado na Fórmula [7], e um aparelho ou um cristalizador, que pode controlar a temperatura do líquido por um programa prefixado, é essencial; entretanto de acordo com um método de resfriamento pseudocontrolado, a temperatura do líquido “T” pode ser diminuída linearmente ou escalonadamente em função do tempo “t” de maneira a ajustar a variação (T0-Tm) da temperatura do líquido “T” no ponto “t=x/2” a um nível de pelo menos 5 %, mas menos que 50 % da mudança de temperatura total (T0-Tf), preferivelmente, pelo menos 10 %, mas menos que 30 % de forma que um método de resfriamento pseudocontrolado como esse tem o mérito de que ele pode ser conduzido de forma relativamente fácil, mesmo no caso em que não existe nenhuma instalação que controle a temperatura do líquido corretamente.

2. Composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro obtida pelo processo da presente invenção

A seguir é explicada a composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro obtida pelo processo da presente invenção.

Conforme descrito anteriormente, a composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro obtida pelo processo da presente invenção é aquela que contém ácido 2-glicosídeo ascórbico em um teor, com base em material sólido e seco, acima de 98,0 %, mas abaixo de 99,9 %. Em uma modalidade preferida, a composição particulada anterior contém ácido L-ascórbico e/ou D-glicose derivado dos materiais e tem um poder redutor acima de 0 %, mas abaixo de 1 %. Igualmente conhecido, uma vez que ácido L-ascórbico e D-glicose têm um poder redutor e eles induzem coloração marrom quando aquecidos na presença de um composto com um grupo amino intramolecularmente tal como aminoácidos e proteínas, estas substâncias não são preferivelmente incorporadas no ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro como um produto. Entretanto, por exemplo, no caso de produzir uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro através de uma etapa de deixar que uma enzima tal como CGTase aja em uma solução contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico, em uma quantidade maior ou menor, tanto ácido L-ascórbico intacto quanto D-glicose derivado do material amido liquefeito ou dextrina são inevitavelmente incorporados como concomitantes da reação em uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro como um produto. Por exemplo, uma vez que, em um pó de grau quase medicamento convencional, o teor total do ácido L-ascórbico e D- glicose contido nele poderia ainda atingir cerca de um porcento, d.s.b., uma coloração marrom inesperada poderia ser induzida quando o pó é usado como um material alimentício.

No processo de acordo com a presente invenção, uma incorporação inevitavelmente inescapável de ácido L-ascórbico e/ou D- glicose é aceita e, em uma composição particulada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro, a poder redutor de toda a composição particulada é regulada baixo de 1 %, e particularmente, acima de 0 %, mas abaixo de 1 %. Conforme mostrado no experimento descrito posteriormente, no caso de produzir uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro pelo processo de acordo com a presente invenção, a poder redutor de toda a composição particulada pode ser facilmente ajustada acima de 0 %, mas abaixo de 1 %. Embora a composição particulada contenha ácido L-ascórbico e/ou D-glicose, ela não induz substancialmente coloração marrom, mesmo quando aquecida na presença de um composto com um grupo amino intramolecularmente tais como aminoácidos e proteínas, sempre a poder redutor de toda a composição particulada é acima de 0 %, mas abaixo de 1 %. Assim, uma composição particulada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que contém ácido L-ascórbico e/ou D- glicose e tem um poder redutor de toda a composição particulada acima de 0 %, mas abaixo de 1 %, tem o mérito de que ela pode ser misturada com produtos alimentícios, cosméticos, quase medicamentos, e produtos farmacêuticos em geral sem receio de causar mudança de coloração ou cor. Adicionalmente, no caso de o poder redutor de toda a composição particulada ser abaixo de 1 %, o teor de ácido L-ascórbico contido nela não é mais que 0,1 %, d.s.b.

A composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, obtida pelo processo da presente invenção, contém ácido L-ascórbico em um teor de não mais que 0,1 %, d.s.b., particularmente, acima de 0 %, mas não mais que 0,1 %. Como ácido L- ascórbico foi usado em produtos alimentícios, etc. como um antioxidante ou desoxidante, ele é altamente suscetível a reagir com oxigênio. Assim, considera-se que, quando aquecido na coexistência de um composto com um grupo amino(s) intramolecularmente, ácido L-ascórbico não somente induz coloração marrom, mas, é profundamente relacionado à coloração da composição particulada contendo ácido L-ascórbico per se. Realmente, conforme mostrado no experimento descrito posteriormente, um pó de grau quase medicamento contém cerca de 0,2 % de ácido L-ascórbico, e, com base na descoberta dos presentes inventores, um pó de grau quase medicamento como esse frequentemente causa um fenômeno que ele per se mesma assume cores marrom descorado quando armazenado por um período de tempo relativamente longo na forma de produto supramencionado. Ao contrário, no caso de o teor de ácido L-ascórbico na composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro ser acima de 0 %, mas não mais que 0,1 %, a composição particulada per se não apresenta nenhum risco de ser colorida de marrom descorado, mesmo quando armazenada por um período de tempo relativamente longo em uma forma de produto similar à de um pó de grau quase medicamento. De acordo com o processo da presente invenção, pode ser de forma relativamente fácil produzir o teor de ácido L-ascórbico em uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro a um nível acima de 0 %, mas não mais que 0,1 % sem aumentar o custo da produção empregando sequencialmente uma cromatografía de coluna usando uma resina de troca aniônica para remover sacarídeos tal como D- glicose e uma cromatografía de coluna usando uma resina de troca catiônica ou uma resina de troca porosa na etapa de purificação, particularmente, no caso de usar uma cromatografía de coluna de leito móvel simulado como uma cromatografía de coluna usando uma resina de troca catiônica.

A composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro obtida pelo processo da presente invenção tem um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de pelo menos 90 %, quando calculado com base no perfil de difração de raios-X em pó da composição particulada, e tem um diâmetro de cristalito médio de pelo menos 1.400 Â mas menos que 1.710 À. Conforme mostrado pelos experimentos seguintes, a composição particulada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro da presente invenção, que tem os níveis acima do grau de cristalinidade e diâmetro de cristalito médio, tem substancialmente o mesmo nível de pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico, isto é, o teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, d.s.b, ou não atinge a pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico como em um pó de grau reagente, entretanto, ela tem características de que ela significativamente, mais dificilmente forma tortas comparada com um pó de grau quase medicamento e, comparada com um pó de grau reagente, ela tem uma solubilidade superior em solventes hidrofílicos amplamente usados em cosméticos e quase medicamentos.

<Distribuição de tamanho de partícula>

Em uma modalidade preferida da composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro obtida pelo processo da presente invenção, ela contém partículas com um tamanho de partícula menor que 150 μm em um teor de 70 % ou mais de toda a composição particulada, e contém aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou mais, mas menos que 150 μm em um teor de 40 a 60 % de toda a composição particulada. Uma vez que a composição particulada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro da presente invenção pode ser, por exemplo, facilmente controlada dentro da distribuição de tamanho de partícula identificada anteriormente exigida para materiais para produtos alimentícios, etc., ela tem o mérito de que ela pode ser usada como um material para produtos alimentícios, aditivos de alimento, cosméticos, quase medicamentos, ou produtos farmacêuticos similarmente como a convencional sem alterar nenhuma etapa de produção convencional ou regulamentos do material.

3. Processo para produzir a composição particulada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro da presente invenção

A seguir é explicado o processo para produzir a composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro da presente invenção.

O processo para produzir a composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro da presente invenção basicamente contém as seguintes etapas (a) a (e): (a) uma etapa de deixar que CGTase aja em uma solução contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico, e então deixar que glucoamilase aja na mistura resultante para formar ácido 2-glicosídeo ascórbico e obter uma solução contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico como uma mistura da reação depois do tratamento com glucoamilase em um rendimento de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de pelo menos TI %, (b) uma etapa de purificar a solução contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico para dar um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico acima de 86 % em peso, d.s.b.; (c) uma etapa de precipitar ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro a partir da solução purificada com um teor de ácido 2- glicosídeo ascórbico acima de 86 % em peso, d.s.b., por um método de resfriamento controlado ou método de resfriamento p seudocontrolado; (d) uma etapa de coletar o ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro precipitado; e (e) uma etapa de envelhecer, secar, e opcionalmente pulverizar o ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro coletado sem dissolver e recristalizá-lo para obter uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que contém ácido 2- glicosídeo ascórbico em um teor, com base em material sólido e seco, acima de 98,0 % em peso, mas abaixo de 99,9 % em peso, e tem um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de pelo menos 90 %, quando calculado com base no perfil de análise de difração de raios-X em pó da composição particulada.

A seguir é explicada cada etapa: <Etapa (a)>

Etapa (a) é para aumentar o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico em uma solução da reação para um nível de pelo menos 27 % deixando que CGTase aja em uma solução contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico e então deixar que glucoamilase aja na mistura resultante. Os materiais e enzimas usados são explicados primeiro e em seguida as reações enzimáticas empregadas são explicadas.

A. Materiais e enzimas usados (Acido L-ascórbico)

Exemplos do ácido L-ascórbico usado na presente invenção incluem qualquer forma de um ácido hidroxi ou um sal metálico deste tal como sais de metal alcalino e sais de metal alcalino terroso deste, e mesmo misturas destes podem ser usadas sem dificuldade.

(Amido liquefeito ou dextrina)

Exemplos do amido liquefeito ou dextrina usado na presente invenção incluem aqueles que são obtidos liquefazendo amido de batata, amido de batata doce, amido de tapioca, amido de milho, amido de trigo, etc., com uma a-amilase termoestável. Mediante condução de tal reação enzimática, CGTase pode ser usada em combinação, por exemplo, com enzima(s) de desramificação de amido tal como isoamilase (EC 3,2.1.68) e pululanase (EC 3.3.1.41) para desramificar os sítios de desramificação de amido. Tais amido liquefeito e dextrina são materiais adequados para uma produção em escala industrial comparada com ciclodextrinas e amiloses. (CGTase)

Exemplos da CGTase (EC 2.4.1.19) usada na presente invenção incluem qualquer daquelas que são de origens naturais, aquelas que são obtidas por tecnologia recombinante, e enzimas mutantes obtidas introduzindo uma modificação de substituição, adição, ou deleção de um aminoácido(s) nas enzimas naturais ou recombinantes, sem restrição particular à suas origens e fontes, desde que elas formem ácido 2-glicosídeo ascórbico em um rendimento de produção de pelo menos 27 % quando deixadas sozinhas ou em combinação com uma enzima de desramificação de amido para agir em uma solução contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico e então glucoamilase pode agir naturalmente na mistura resultante.

De acordo com a descoberta dos presentes inventores, CGTases, que formam ácido 2-glicosídeo ascórbico em um rendimento de produção de pelo menos 27 % quando deixadas sozinhas ou em combinação com uma enzima de desramificação de amido para agir em uma solução contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico e então glucoamilase pode agir naturalmente na mistura resultante, normalmente tem as seguintes sequências de aminoácido parciais comuns representadas por (a) a (d): (a) Asn-Glu-Val-Asp-Xi-Asn-Asn; (b) Met-Ile-Gln-X2-Thr-Ala; (c) Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn-Ile; e (d) Val-X3-Ser-Asn-Gly-Ser-Val. (Em que X] significa Pro ou Ala, X2 significa Ser ou Asp, e X3 significa Ser ou Gly, respectivamente).

Exemplos de tais CGTases incluem, por exemplo, aquelas que são enzimas naturais ou recombinantes derivadas de microrganismos da espécie Geobacillus stearothermophilus e Thermoanaerobacter thermosulfurigenes, e exemplos concretos de tais incluem uma CGTase derivada da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus, isto é, uma CGTase com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, mutantes da CGTase preparados introduzindo uma modificação de substituição, adição, ou deleção de um aminoácido(s) por tecnologia recombinante na sequência de aminoácido de SEQ ID NO:1, isto é, uma CGTase mutante com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 ou 5, uma CGTase com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 derivada de um microrganismo da espécie Thermoanaerobacter thermosulfurigenes, e CGTase mutantes destes.

A cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus identificada anteriormente é o microrganismo revelado na Patente Japonesa Kokai No. 63189/75 (Relatório descritivo de patente Japonesa No. 27791/78) aplicado pelo mesmo requerente da presente invenção, e ela foi uma vez depositada domesticamente em 30 de julho de 1973, com o número de acesso de FERM- P 2225 e no momento ela foi depositada no International Patent Organism Depositary in National Institute of Advanced Industrial Science and Tecnology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, 305-8566 Japão, com o número de acesso de FERM BP-11273. Para referência, sabe-se que a CGTase derivada da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus tern um peso molecular de cerca de 68.000 daltons e tern uma ação de transferência de sacarídeo mais forte que CGTases derivadas de outros microrganismos. O gene da CGTase identificada anteriormente foi clonado e a sequência de aminoácido de uma CGTase maturada (a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:1) foi determinada com base na sequência de nucleotideo (a sequência de nucleotideo de SEQ ID NO:2) do gene, e soube- se que existem quatro regiões conservadas, reconhecidas como existentes comumente em enzimas classificadas como família a-amilase, na sequência de aminoácido da CGTase. A conformação tridimensional da CGTase já foi revelada por análise estrutural cristalina de raios-X. Os três resíduos catalíticos da CGTase, isto é, o 225° ácido aspártico (D225), o 253° ácido glutâmico (E253), e o 324° ácido aspártico (D324) na sequência de aminoácido de SEQ ID NO:1 foram também revelados (vide, por exemplo, “Kogyoyo-Toshitsu-Koso-HandboolG (Handbook of Industrial Enzymes for Saccharides), editado por Kodansha Scientific Ltd., Tóquio, Japão, publicado por Kodansha Ltd., Tóquio, Japão, págs. 56-63, 1999).

Exemplos concretos de uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Thermoanaerobacter thermosulfurigenes incluem “TORUZYME 3.0L”, um nome de produto de uma enzima produzida como uma enzima recombinante da CGTase derivada do microrganismo citado, comercializado por Novozymes Japan Ltd., Tóquio, Japão. As propriedades fisicoquímicas e sequência de aminoácido de uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Thermoanaerobacter thermosulfurigenes foram também reveladas.

(Enzima de desramificação de amido)

Quando CGTase pode agir natural mente em uma solução contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico, uma enzima de desramificação de amido pode ser usada em combinação para aumentar o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico. Como uma enzima de desramificação de amido preferida, isoamilase é particularmente preferível, em virtude ela ser facilmente manipulada em termos de sua atividade enzimática, especificidade do substrato, etc. Exemplos de tal isoamilase incluem, por exemplo, aquelas que são derivadas de microrganismos da espécie Pseudomonas amyloderamosa, Bacillus sp., Flavobacterium sp., e isoamilases mutantes obtidas modificando geneticamente os genes dos microrganismos anteriormente identificados. “GODO-FIA”, um nome de produto de uma espécime de isoamilase produzida por Godo Shusei Co., Ltd., Tóquio, Japão, pode ser usado como uma isoamilase derivada de um microrganismo da espécie Flavobacterium odor atum.

Exemplos de pululanase incluem aqueles que são derivados de microrganismos da espécie Bacillus sp., Bacillus acidopullulyticas, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes, Flavobacterium pennivorans, e Enterobacter aerogenes.

Qualquer glucoamilase (EC 3.2.1.3) pode ser usada sem restrição específica independentemente de sua origem e fonte e incluem aquelas na forma de uma enzima natural e aquelas obtidas por tecnologia de DNA recombinante, desde que ácido 2-glicosídeo ascórbico seja formado quando CGTase age naturalmente em uma solução contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico e então glucoamilase age naturalmente na mistura resultante.

Uma vez que glucoamilase é normalmente adicionada a uma solução da reação enzimática depois que a solução é aquecida para suspender a reação de transferência de sacarídeo por CGTase, são desejados aqueles que podem exercer um atividade enzimática suficiente para uso real a uma temperatura relativamente alta, por exemplo, cerca de 40°C para cerca de 60°C, de maneira a economizar a energia e tempo necessários para resfriar a solução da reação enzimática depois do aquecimento. Quando glucoamilase a ser usada contém a-glucosidase, o ácido 2-glicosídeo ascórbico resultante formado será hidrolisado e, portanto, glucoamilases substancialmente livre de a-glucosidase são desejavelmente usadas. Qualquer glucoamilase pode ser usada independentemente de sua fonte e pureza, desde que elas preencham as exigências citadas, por exemplo, uma preparação de glucoamilase comercializada derivada de um microrganismo do gênero Rhizopus (“GLUCOZYME #20000”, um nome de produto de uma enzima comercializada por Nagase ChemteX Corp., Osaka, Japão); e uma preparação de enzima derivada de um microrganismo do gênero Aspergillus (“GLUCZYME AF6”, um nome de produto de uma enzima comercializada por Amano Enzyme Inc., Aichi, Japão), pode ser preferivelmente usada.

B. Reações enzimáticas

A seguir, é explicada a reação de transferência de sacarídeo para ácido L-ascórbico. CGTase pode agir naturalmente em uma solução, normalmente, uma solução aquosa contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico. Quando CGTase pode agir naturalmente em uma solução aquosa contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico, um ou mais resíduos de D-glicose são transferidos para o grupo hidroxila na posição C-2 de ácido L-ascórbico, resultando na formação de ácido 2-glicosídeo ascórbico com um resíduo de D-glicose ligado no grupo hidroxila na posição C-2 citada, e outros ácidos a-glicosil-L-ascórbicos, tais como ácido 2-O-a-maltosil-L-ascórbico, ácido 2-O-a-maltotriosil-L- ascórbico, e ácido 2-O-a-maltotetraosil-L-ascórbico, que têm pelo menos dois resíduos de D-glicose ligados no grupo hidroxila na posição C-2 citada.

CGTase é normalmente adicionada a uma solução aquosa, que foi normalmente preparada dissolvendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico em água para dar uma concentração de substrato de 1 a 40 %, em um teor de 1 a 500 unidades/g substrato, seguida por uma reação enzimática a um pH de cerca de 3 a cerca de 10 e uma temperatura de 30 a 70°C por pelo menos seis horas, preferivelmente, cerca de 12 a cerca de 96 horas. Uma vez que ácido L-ascórbico é suscetível a oxidação, a solução preferivelmente deve ser mantida em condições anaeróbicas ou redutoras durante a reação enzimática, ainda protegendo da luz e opcionalmente coexistindo, por exemplo, com um agente redutor tal como toureia ou sulfeto de hidrogênio na solução da reação.

A razão em peso, d.s.b., tanto de amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico na solução deve preferivelmente ser estabelecida em 8:2 a 3:7. Quando a razão de ácido L-ascórbico para amido liquefeito ou dextrina excede a faixa citada, transferência de sacarídeo para ácido L- ascórbico se dá efetivamente; entretanto, o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico é restrito pela concentração inicial de ácido L- ascórbico para permanecer em um nível relativamente baixo. Entretanto, quando a razão de ácido L-ascórbico excede a faixa citada, ácido L-ascórbico intacto permanecerá em uma quantidade considerável, e isto não é preferível para uma produção em escala industrial. Dessa maneira, a faixa de razão anteriormente identificada é considerada a melhor.

Além de CGTase, no caso de usar isoamilase como uma enzima de desramificação de amido, tal isoamilase deveria preferivelmente ser deixada agir tanto no amido liquefeito quanto na dextrina na coexistência com CGTase em uma solução contendo tanto amido liquefeito quanto dextrina e ácido L-ascórbico, em que a quantidade de isoamilase a ser adicionada é normalmente 200 a 2.500 unidades/g substrato e é reagida enzimaticamente a uma temperatura de 55°C ou menos, variando dependendo do tipo, temperatura ideal, e pH ideal da isoamilase usada. Quando pululanase é usada como uma enzima de desramifícação de amido, ela pode ser usada, normalmente, em uma quantidade de 1 a 500 unidades/g substrato de acordo com o caso de isoamilase.

Depois que a reação enzimática com CGTase sozinha ou junto com uma enzima de desramifícação de amido é completada como um todo, a solução da reação enzimática resultante é instantaneamente aquecida para inativar a CGTase sozinha ou junto com a enzima de desramifícação de amido para suspender a(s) reação(s) enzimática(s), a seguir deixando que glucoamilase aja na solução da reação enzimática resultante. Pela ação de glucoamilase, uma cadeia de dois ou mais resíduos de D-glicose ligados no grupo hidroxila na posição C-2 de ácido L-ascórbico é clivada para transformar ácidos a-glicosil-L-ascórbicos tais como ácido 2-O-a-maltosil- ascórbico e ácido 2-O-a-maltotriosil-L-ascórbico em ácido 2-glicosídeo ascórbico.

A etapa (b) é para purificar a solução contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico obtido etapa (a) anterior para aumentar o teor de ácido 2- glicosídeo ascórbico acima de 86 %, d.s.b.; a solução contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico obtido na etapa (a) é descolorida com um carvão ativado, etc., filtrada, seguido por dessalinização do filtrado resultante com uma resina de troca catiônica e aplicação da solução dessalgada na cromatografia de coluna para purificar a solução para dar um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, com base em material sólido e seco, acima de 86 %, preferivelmente, até 88% ou mais. Como uma cromatografia de coluna usada para tal purificação, basicamente, qualquer cromatografia de coluna pode ser usada, desde que ela aumente o ácido 2-glicosídeo ascórbico em uma solução acima de 86 %, d.s.b., entretanto, exemplos preferidos de tais é uma cromatografia de coluna usando uma resina de troca catiônica ou resina porosa, que segue depois uma cromatografia de coluna usando uma resina de troca aniônica para remover sacarídeos, tal como D-glicose. Exemplos das resinas de troca aniônica desejadas para remover sacarídeos, tal como D- glicose incluem tais como “AMBERLITE IRA411S” e “AMBERLITE IRA478RF” (ambas as quais são comercializadas por Rohm & Hass Company, Philadelphia, USA); e “DIAION WA30” (comercializada por Mitsubishi Chemical Corp., Tóquio, Japão). Exemplos das resinas de troca catiônica desejadas para separar ácido 2-glicosídeo ascórbico de ácido L- ascórbico incluem “DOWEX 50WX8” (comercializada por Dow Chemical Co., Midland, USA); “AMBERLITE CG120” (comercializada por Rohm & Hass Company, Philadelphia, USA); “XT-1022E” (comercializada por Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tóquio, Japão); e “DIAION SK104” e “DIAION UBK 550” (ambas as quais são comercializadas por Mitsubishi Chemical Corp., Tóquio, Japão). Exemplos das resinas porosas desejadas incluem tal como “TOYOPEARL HW-40” (comercializadas por Tosoh Corp., Tóquio, Japão); e “CELLFINE GH-25” (comercializadas por Chisso Corp., Tóquio, Japão). No caso de conduzir uma cromatografia de coluna usando uma resina de troca catiônica ou resina porosa, condições preferíveis são como a seguir: a concentração de sólidos de uma solução de material a ser alimentada em uma coluna é cerca de 10 a cerca de 50 %, d.s.b., o volume de carga para uma resina é cerca de 1/1.000 a cerca de 1/20 vezes o volume de resina úmida, e água purificada em uma quantidade grosseiramente igual ao volume de resina úmida é alimentada na coluna a uma velocidade linear de 0,5 a 5 m/hora. Entre estes, no caso de usar uma cromatografía de coluna de leito móvel simulado como uma cromatografía de coluna usando uma resina de troca catiônica, uma cromatografía de coluna como essa é preferível em virtude de aumentar a pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico no produto purificado resultante e reduzir concomitantes tal como ácido L-ascórbico e D- glicose, particularmente, reduzir o teor de ácido L-ascórbico e fornecer uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro com um teor de ácido L-ascórbico tão baixo quanto 0,1 % ou menos, d.s.b. Para referência, variando dependendo da temperatura da operação e vazão predeterminada, condições de eluição preferíveis para uma cromatografía de coluna de leito móvel simulado, onde uma resina de troca catiônica é usada como um material de empacotamento, são como a seguir: a concentração de uma solução, contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico, alimentada na cromatografía de coluna anterior é 60 % ou menos; o volume de carga de uma solução contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico é 1/20 vezes em volume ou abaixo do volume de resina úmida; e o volume de água purificada usada como um eluente é até 30 vezes em volume, normalmente, cerca de 3 a cerca de 20 vezes em volume do volume de carga anterior.

Quando o teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, d.s.b., na solução é 86 % ou menos, é difícil obter uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro com um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de pelo menos 90 %, mesmo quando passado através das etapas de acompanhamento (c) a (e). Conjectura-se que o motivo é que, quando o teor de ácido 2- glicosídeo ascórbico, d.s.b., na solução é 86 % ou menos, a pureza de ácido 2- glicosídeo ascórbico na composição particulada resultante contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro, obtida nas etapas subsequentes, é relativamente baixa e isto impede a sua cristalização suave.

A solução que foi purificada para dar um teor de ácido 2- glicosídeo ascórbico, com base em material sólido e seco, acima de 86 %, preferivelmente, 88 % ou mais é concentrada para dar uma concentração prescrita, normalmente, uma concentração de cerca de 65 a cerca de 85 % de ácido 2-glicosídeo ascórbico, antes da etapa de cristalização para ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro. A temperatura do concentrado é normalmente controlada em cerca de 30 a cerca de 45°C. O concentrado com essa concentração e temperatura corresponde a um ácido 2-glicosídeo ascórbico contendo a solução com um grau de supersaturação de 1,05 a 1,50.

Etapa (c) é para precipitar ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de uma solução contendo acima de 86 %, preferivelmente, 88 % ou mais, d.s.b., de ácido 2-glicosídeo ascórbico por um método de resfriamento controlado ou método de resfriamento pseudocontrolado; a solução contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico, que foi previamente purificada e concentrada para dar uma pureza e concentração prescritas e controlada para uma temperatura prescrita na etapa (b), é transferida para um cristalizador, misturada com 0,1 a 5 % (p/v), preferivelmente, 0,5 a 2 % (p/v) dos cristais sementes de ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, e agitada suavemente, seguido por diminuição gradual da temperatura do líquido na fase inicial da etapa de cristalização e diminuição pronta da temperatura do líquido na última fase da etapa de cristalização por um método de resfriamento controlado ou método de resfriamento pseudocontrolado para realizar a cristalização. Embora o tempo exigido para cristalização varie dependendo do teor dos cristais sementes de ácido 2-glicosídeo ascórbico a ser adicionados, por exemplo, no caso de um método de resfriamento pseudocontrolado, o tempo total exigido para cristalização pode ser dividido pelo menos em duas zonas, preferivelmente, pelo menos três zonas, em que em cada zona a temperatura do líquido diminui grosseiramente de um modo linear em função do tempo, a temperatura do líquido “T” preferivelmente diminuirá linear ou gradualmente em função do tempo “t” de tal maneira a deixar que a variação (T0-Tm) da temperatura do líquido “T” no ponto do tempo de operação “t=r/2” (no ponto médio da etapa de cristalização) seja pelo menos 5 %, mas menos que 50 %, preferivelmente, pelo menos 10 %, mas menos que 30 % da mudança de temperatura total (T0-Tf). Por exemplo, quando cristais são precipitados por resfriamento a solução contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico de 40°C para 15°C por 48 horas, o tempo de resfriamento pode ser dividido em duas zonas de 36 e 12 horas, onde a solução é preferivelmente resfriada de 40°C para 30°C em 36 horas e então resfriada de 30°C para 15°C em 12 horas, ou a solução é também preferivelmente resfriada de 40°C para 35°C em 30 horas e então resfriada de 35°C para 15°C por 18 horas. Mais preferivelmente, o tempo de resfriamento pode ser dividido em três zonas de 24, 12 e 12 horas, onde a solução é preferivelmente, de forma sucessiva resfriada de 40°C para 3 5°C em 24 horas na primeira zona, resfriada de 35°C para 27,5°C em 12 horas na zona seguinte, e então resfriada de 27,5°C para 15°C em 12 horas na última zona.

Deste modo de acordo com um método de resfriamento controlado ou método de resfriamento pseudocontrolado, pode ser obtida uma massa cozida, que dificilmente gera microcristais de ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro e contém cristais com um diâmetro cristalino substancialmente homogêneo, comparada com um método de cristalização que resfria não forçadamente a solução sem controlar a temperatura. Conforme descrito posteriormente, a composição particulada obtida contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro tem os recursos característicos de ter tanto uma maior pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico quanto um maior grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro que deve ser um importante índice para formação de torta comparado com um pó obtido por um método de resfriamento não forçado. No caso de um método de resfriamento controlado ou método de resfriamento pseudocontrolado, ela tem um mérito de obter uma composição particulada com uma distribuição de tamanho de partícula mais homogênea do que um pó obtido por um método de cristalização de resfriamento não forçado.

Esta etapa é para coletar o ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro cristalizado da massa cozida obtido na etapa de cristalização (c) de acordo com uma separação sólido-líquido convencional. O ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro coletado é lavado jateando (aspergindo) nele uma pequena quantidade de água purificada para impurezas um xarope amorfo adsorvido na superfície do ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro. A quantidade de água purificada preferível usada para tal aspersão é normalmente pelo menos 3 %, mas, até 10 % em peso da massa cozida antes da centrifugação. Mais especificamente, quando a quantidade de água purificada usada para lavagem é menos que 3 %, lavagem suficiente pode não ser feita e um xarope amorfo ainda continua, resultando em um receio de não obter ácido 2-glicosídeo ascórbico com uma pureza desejada. Ao contrário, quando a quantidade de água purificada usada para lavagem excede 10 %, a quantidade de ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro a ser dissolvido e removido por lavagem aumenta e isto resulta em um receio de diminuir o rendimento dos cristais.

Etapa (e) é para envelhecer, secar, e opcionalmente pulverizar o ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro coletado sem dissolver e recristalizá-lo; o ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro coletado por centrifugação é lavado com uma pequena quantidade de água purificada tal como água deionizada e água destilada para lavar as impurezas adsorvidas nas superfícies dos cristais. O teor de água usado para lavagem não deve especifícamente ser restrito, entretanto, um teor excessivo de água dissolverá os cristais per se, bem como as impurezas, resultando em uma redução do rendimento e um aumento do custo de água para lavagem. Portanto, as superfícies dos cristais normalmente são preferivelmente lavadas com água para lavar uma quantidade de até 30 %, preferivelmente, 15 a 25 % em peso dos cristais. Os cristais assim lavados são envelhecidos e secos mantendo-os em uma atmosfera com uma temperatura e umidade predeterminadas por um período de tempo prescrito para produzir em uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro. Embora a temperatura do produto da composição particulada contendo cristais, a umidade relativa da atmosfera e o tempo para envelhecer e secar nas etapas de envelhecimento e secagem não devam especifícamente ser restritos, desde que uma composição particulada com um grau de cristalinidade desejado seja obtido, a temperatura do produto e a umidade relativa da atmosfera serão preferivelmente mantidas a uma temperatura de 20 a 55°C e uma umidade relativa de 60 a 90 %, respectivamente, nas etapas de envelhecimento e secagem. O tempo total para as etapas de envelhecimento e secagem é preferivelmente cerca de 5 a cerca de 24 horas. A composição particulada contendo cristais, obtida através das etapas de envelhecimento e secagem, não é forçadamente resfriada a uma temperatura ambiente, ou ela pode ser também vantajosamente resfriada forçadamente soprando nela um ar puro com uma temperatura em tomo da temperatura ambiente para dar uma temperatura do produto em tomo da temperatura ambiente. O pó cristalino assim obtido é produzido em um produto final com ou sem pulverização opcional.

As etapas anteriores (a) a (e), excluindo a etapa de cristalização por um método de resfriamento controlado ou método de resfriamento pseudocontrolado na etapa anterior (d), são basicamente as mesmas das etapas de produção para pós de grau quase medicamento e elas são livre de quaisquer etapas para recristalização e lavagem repetida dos cristais, que são ambas indispensáveis nas etapas de produção para pós de grau reagente.

O pó assim obtido é uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro que contém ácido 2-glicosídeo ascórbico em um teor, com base em material sólido e seco, acima de 98,0 %, mas abaixo de 99,9 %, tem um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de pelo menos 90 %, quando calculado com base no perfil de difração de raios-X em pó da composição particulada, mais preferivelmente, ela contém ácido 2-glicosídeo ascórbico em um teor, com base em material sólido e seco, acima de 98,0 %, mas abaixo de 99,9 %, tem um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de pelo menos 90 %, quando calculado com base no perfil de difração de raios-X em pó da composição particulada, contém ácido L-ascórbico e/ou D- glicose derivado dos materiais, contém ácido L-ascórbico em um teor de 0,1 % ou menos, d.s.b., e tem um poder redutor de toda a composição particulada menor que um porcento. Uma vez que uma composição particulada como essa dificilmente forma tortas, mesmo nas condições onde pós de grau quase medicamento convencionais formam torta, ela é uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro que é significativamente menos propensa à formação de torta, comparada com pós de grau quase medicamento convencionais. Adicionalmente, comparada com pós de grau reagente, a composição particulada tem o mérito de que ela tem uma solubilidade vantajosa em solventes hidrofílicos usados amplamente em cosméticos e quase medicamentos.

Uma vez que a composição particulada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro, produzida pelo processo da presente invenção, significativamente, mais dificilmente forma tortas comparada com pós de quase medicamento convencionais, ela tem o mérito vantajoso de que ela pode ser incorporada com segurança em materiais pulverizados simples ou diversos outros materiais pulverizados para produtos alimentícios, aditivos de alimento, cosméticos, quase medicamentos, e produtos farmacêuticos no campo de fabricações de produtos alimentícios incluindo bebidas, bem como de cosméticos, quase medicamentos, e produtos farmacêuticos, que são produzidos por usinas de produção que são projetadas onde materiais pulverizados devem ser usados na premissa.

Os experimentos seguintes explicam concretamente a presente invenção:

Composições particuladas, que contêm ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro com diferentes graus de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro na faixa de 0 a 100 %, foram preparadas e testadas quanto a formação de torta para examinar o relacionamento entre um grau de cristalinidade e formação de torta. Os detalhes são como a seguir:

“ASCORBIC ACID 2-GLUCOSIDE 999” (Código No.: AG 124, Pureza: pelo menos 99,9 %), um nome de produto de uma composição particulada de grau reagente contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, consistindo substancialmente em ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro, como um espécime padrão, foi usado como Amostra de teste 1.

Uma composição particulada consistindo substancialmente em uma forma amorfa de ácido 2-glicosídeo ascórbico, preparada dissolvendo Amostra de teste 1 em um teor adequado de água purificada, liofilizando a solução resultante por três dias, e secando o resultante in vacuo a uma temperatura de 40°C ou menos por toda a noite, foi usada como uma amostra padrão consistindo substancialmente em uma forma amorfa de ácido 2- glicosídeo ascórbico para uso como “Amostra de teste 2”. Amostra de teste 2 teve um teor de umidade de 2,0 % quando medido pelo método Karl Fischer,

As Amostras de teste 3 e 4, aquelas que têm um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro ficando entre aquelas das amostras de teste 1 e 2 foram preparadas pelo seguinte procedimento: Uma composição particulada consistindo em uma forma amorfa de ácido 2-glicosídeo ascórbico, que foi preparado similar à amostra de teste 2, foi espalhada sobre bandejas metálicas e parcialmente cristalizada mantendo-a em uma câmara a uma temperatura constante e umidade controlada a uma temperatura de 25°C e uma umidade relativa de 90 % por 24 ou 72 horas para acelerar a cristalização. De forma sucessiva, as bandejas metálicas foram tiradas da câmara e secas in vacuo a 38°C por toda a noite para obter dois tipos de composições particuladas, em que uma com o tempo de encharque de 24 horas na temperatura constante e câmara controlada pela umidade foi denominada “Amostra de teste 3” e a outra com o tempo de encharque de 72 horas foi denominada “Amostra de teste 4”. Além do mais, as Amostras de teste 3 e 4 foram respectivamente fechadas em frascos, seladas com tampas, e preservadas junto com um dessecante em um dessecador em condições herméticas até imediatamente antes de seus testes analíticos.

Experimento 1-2: Purezas de ácido 2-glicosídeo ascórbico e graus de cristalinidade das amostras de teste 1 a 4 <Purezas do ácido 2-glicosídeo ascórbico>

As purezas do ácido 2-glicosídeo ascórbico das amostras de teste 1 a 4 foram determinadas como a seguir: usando água purificada, cada qual das amostras de teste 1 a 4 foi preparada em uma solução 2 %, que foi então filtrada com um filtro de membrana de 0,45-μm. Cada qual dos filtrados foi submetido à cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) nas condições seguintes, seguido pelo cálculo da pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico, d.s.b., para cada amostra de teste com base em uma área de pico mostrada em uma cromatografia por um refratômetro diferencial. Os resultados estão na tabela 1.

Condições analíticas

Sistema HPLC: “LC-10AD”, comercializado por Shimadzu Corp., Kyoto, Japão; Desgaseificador: “DGU-12AM”, comercializado por Shimadzu Corp., Kyoto, Japão; Coluna: “WAKOPAK WAKOBEADS T-330”, fT-form, comercializada por Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japão; Volume de injeção da amostra: 10 μL; Eluente: Solução aquosa de ácido nítrico 0,01 % (v/v); Vazão: 0,5 mL/minutos; Temperatura: 25°C; Refratômetro diferencial: “RID-10A”, comercializado por Shimadzu Corp., Kyoto, Japão; Aparelho de processamento de dados: “CHROMATOPAK C-R7A”, comercializado por Shimadzu Corp., Kyoto, Japão;

Os graus de cristalinidade das amostras de teste 1 a 4 foram determinados como a seguir: valores analíticos para os graus de cristalinidade das respectivas Amostras de teste 1 a 4 pelo método de Herman foram determinados usando “X’ Pert PRO MPD”, um nome de produto de um difratômetro de raios-X em pó de luz refletida comercialmente disponível comercializado por Spectris Co., Ltd., Tóquio, Japão, e usando um software de computador analítico exclusivamente instalado no difratômetro, com base em um perfil de difração de raios-X em pó por um raio CuKa (corrente elétrica de raios-X: 40 mA, tensão do tubo de raios-X: 45 kV, comprimento de onda: 1.5405 Â), como um raio X característico irradiado de um Cu alvo. Antes da análise de grau de cristalinidade anterior pelo método de Herman, a granulosidade e o fator de dobramento pré-estabelecido no software foram respectivamente ajustados a níveis apropriados para obter uma linha de base considerada a mais preferível, considerando ainda picos sobrepostos mútuos, intensidade de difração, e intensidade de dispersão nos respectivos padrões de difração de raios-X em pó. O método de Herman é descrito com detalhes tanto em P. H. Hermans quanto em A. Weidinger, "Journal of Applied Physics, Vol. 19, págs. 491-506 (1948), e P. H. Hermans e A. Weidinger, "Journal ofPolimer Science”, Vol. 4, págs. 135-144, 1949.

O grau de cristalinidade de cada amostra de teste foi calculado substituindo os seguintes dados na Fórmula anterior [1]: Hs como o valor de grau de cristalinidade de cada amostra de teste; H100, o valor analítico daquele da Amostra de teste 1; e Ho, o valor analítico daquele da Amostra de teste 2. Quando analisado pelo método de Herman, o valor analítico do grau de cristalinidade da amostra de teste 1 (valor analítico Hioo) e aquele da Amostra de teste 2 (valor analítico Ho) foram respectivamente 70,23 % e 7,57 %. Os resultados estão na tabela 1 em paralelo. Os padrões de difração de raios-X em pó das amostras de teste 1 e 2, como amostras padrões, são respectivamente mostrados nas FIGS. 1 e 2.

Conforme mostrado na FIG. 1, picos de difração claros e acentuados específicos para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foram observados na faixa de ângulos de difração (20) de 4 a 65 ° no padrão de difração de raios-X em pó da amostra de teste 1, mas não foi observado nenhum halo específico para uma forma amorfa de ácido 2-glicosídeo ascórbico. Entretanto, conforme mostrado na FIG. 2, diferente do padrão de difração de raios-X em pó da FIG. 1, halo específico para uma forma amorfa de ácido 2-glicosídeo ascórbico foi claramente observado como um agrupamento de linha de base no padrão de difração de raios-X em pó da amostra de teste 2, mas não foi observado nenhum pico de difração específica do ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro.

Este experimento foi realizado para confirmar adicionalmente que as amostras de teste 1 e 2 são respectivamente amostras padrões adequadas para determinar os valores analíticos H1Oo e Ho: Essas amostras foram submetidas a uma difração de raios-X em pó de luz transmitida, que detecta um sinal de difração e dispersão fraco, usando uma radiação síncroton (denominada “radiação”, a seguir), como uma fonte de raios-X. A condição de medição foi como a seguir:

<Condição de medição>

Difratômetro de raios-X em pó: Modelo “PDS-16”, um difratômetro de raios-X em pó de alta velocidade (Debye Scherrer mode, comprimento da câmara: 497,2 mm) comercializado por Kohzu Precision Co., Ltd., Kanagawa, Japão; Fonte de raios-X : “Beam line de Hyogo Prefecture (BL08B2)”, uma luz de radiação de dobramento eletromagnético; Comprimento de onda : 0,7717 Â (16,066 keV); Intensidade Angulo de medição Tempo de exposição Registro de imagem : 109 fotons/s; : 2 a 40 °; : 600 s; : “IMAGING PLATE BAS-2040”, uma chapa de formação de imagem comercializada da Fujifilm Corp., Tóquio, Japão; e Analisador de imagem : “BIO-IMAGE ANALYZER BAS-2500”, comercializado por Fujifilm Corp., Tóquio, Japão.

A medição foi conduzida usando “Beam line of Hyogo Prefecture (BL08B2)” colocada em “SPring-8”, uma grande instalação de radiação síncroton, 1-1-1, Kouto, Sayo-cho, Sayo-gun, Hyogo, Japão.

Antes da medição de difração de raios-X em pó, as amostras de teste 1 e 2 foram respectivamente trituradas em um almofariz e peneiradas com uma peneira de malha 53 μm. Então, cada qual das composições particuladas resultantes passadas através da peneira foi homogeneamente injetada em “MARKTUBE No. 14”, um nome de produto de um capilar para difração de raios-X em pó (diâmetro: 0,6 mm, vidro Lindeman), comercializado por Toho KK, Tóquio, Japão, para dar um comprimento da amostra injetada de cerca de 30 mm. De forma sucessiva, o capilar foi cortado na extremidade terminal da amostra injetada e a extremidade aberta foi selada com um adesivo. Então, o capilar foi fixado em um suporte da amostra com uma argila, e o suporte da amostra foi montado no difratômetro de raios-X em pó para dar a direção longitudinal do capilar perpendicularmente ao eixo ótico do difratômetro.

Para remover o efeito adverso de impurezas da orientação de ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro no perfil de difração de raios-X em pó, a medição da difração de raios-X em pó foi realizada deixando o suporte da amostra alternar a uma velocidade uniforme na direção longitudinal do capilar em uma largura de ± 1,5 mm e a um ciclo de tempo de uma vez/60 s, e deixando simultaneamente que a quantidade de amostra gire a uma velocidade uniforme em tomo do eixo rotacional na direção longitudinal do capilar a um ciclo de duas vezes/s.

Nos processos de analisar os perfis de difração de raios-X em pó e preparar os padrões de difração de raios-X em pó das amostras de teste 1 e 2, sinais de fundo inerentes ao difratômetro de raios-X em pó foram eliminados de cada perfil de difração de raios-X em pó de acordo com uma maneira convencional para melhorar a precisão da medição. Os padrões resultantes de difração de raios-X em pó das amostras de teste 1 e 2 são 10 respectivamente mostrados nas FIGS. 3 e 4.

Conforme mostrado na FIG. 3, picos de difração de raios-X em pó específicos para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro apareceram claros e nítidos na faixa de ângulos de difração (20) de 2 a 40 0 para o padrão de difração de raios-X em pó da amostra de teste 1, medido 15 usando a radiação síncroton. Comparando a FIG. 3 com a FIG. 1, uma vez que o comprimento de onda de radiação síncroton (0.7717 Â) foi diferente daquele de raios-X característicos (1.5405 Â), cada pico de difração na FIG. 3 apareceu em cerca de meio ângulo de difração (20) de cada qual dos picos correspondentes na FIG. 1. Os padrões de difração de raios-X em pó nas 20 FIGS. 1 e 3, entretanto, coincidiram extremamente bem uns com os outros.

Entretanto, a largura de pico na meia altura de cada pico de difração na FIG. 3 foi evidentemente mais estreita do que o da FIG. 1, e cada pico de difração na FIG. 3 mostrou uma resolução maior do que a da FIG. 1, embora a intensidade de cada pico de difração na FIG. 3 fosse maior do que o da FIG. 1 25 em quase 100 vezes. O padrão de difração de raios-X em pó na FIG. 3 não mostrou nenhum halo específico para uma forma amorfa de ácido 2- glicosídeo ascórbico, conforme mostrado na FIG. 4 seguinte. O resultado indica que o grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro da amostra de teste 1 é extremamente alto, e a amostra de teste 1 consiste substancialmente em ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro.

Conforme mostrado na FIG. 4, o padrão de difração de raios-X em pó da amostra de teste 2, obtido por difração de raios-X em pó usando a radiação síncroton, mostrou um halo específico notável para uma forma amorfa de ácido 2-glicosídeo ascórbico como um agrupamento da linha de base, mas não foi observado nenhum pico de difração específica para ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro. Este resultado indica que a amostra de teste 2 consiste substancialmente em uma forma amorfa de ácido 2-glicosídeo ascórbico.

Os resultados anteriores, obtidos usando a radiação síncroton como uma fonte de raios-X, suportam que as amostras de teste 1 e 2 são amostras padrões adequadas para definir os valores analíticos H1Oo e Ho, respectivamente, para uso na Fórmula 1.

O experimento seguinte foi realizado para investigar a formação de torta das respectivas amostras de teste 1 a 4: alíquotas de um grama de cada qual das amostras de teste 1 a 4, preparadas no experimento 11, foram separadamente cheias em “FALCON TUBE 2059”, um nome de produto de um tubo cilíndrico de polipropileno de 14 mL (1,7 cm de diâmetro, 10 cm de altura) com uma forma de base semiesférica e uma tampa, comercializado por Becton Dickinson e Company, Nova Jérsei, USA. Os tubos foram estabelecidos perpendicularmente em uma prateleira de tubo e deixados ficar em 24 horas, depois a prateleira de tubo foi colocada em “IC410”, um nome de produto de um incubador comercializado Advantec Toyo Kaisha, Ltd., Tóquio, Japão, controlado a 50°C. Depois da incubação, os tubos foram tirados do incubador, seguido por remoção de cada tampa, tirando cada amostra de teste de cada tubo para colocá-la em uma placa plana de plástico preto virando os tubos de cabeça para baixo lentamente, e observando macroscopicamente as condições das amostras de teste resultantes.

O grau de formação de torta de cada amostra de teste foi considerado com base no seguinte critério: “transformada em torta”, (+): a amostra mantém claramente a forma semiesférica da base do tubo, mesmo quando colocada na placa; “levemente transformada em torta”, (±): a amostra mostra levemente, mas distintamente, a forma semiesférica da base do tubo; “não transformada em torta” (-): a amostra não mantém a forma semiesférica da base do tubo. Os resultados foram mostrados na coluna de “formação de torta” na tabela 1.Tabela 1

Conforme mostrado na tabela 1, a amostra de teste 1, como uma amostra padrão para definir o valor analítico H1Oo (grau de cristalinidade: 100,0 %), foi considerada “não transformada em torta” (-) em virtude de ela ter colapsado e não ter mantido a forma semiesférica da base do tubo, quando tirada do tubo e colocada na placa plana. Ao contrário, a amostra de teste 2, como uma outra amostra padrão para definir o valor analítico Ho (grau de cristalinidade: 0,0 %), foi claramente considerada “transformada em torta” (+) em virtude de ela ainda aparentemente ter mantido a forma semiesférica da base do tubo, mesmo quando tirada do tubo e colocada na placa. A forma semiesférica da amostra de teste 2 não colapsou quando uma leve vibração foi meramente dada na placa.

A amostra de teste 3 com um grau de cristalinidade de 88,3 % ainda claramente manteve a forma semiesférica da base do tubo similar à amostra de teste 2, mesmo quando tirada do tubo e colocada na placa plana, e ela foi aparentemente considerada “transformada em torta” (+). A amostra de teste 4 com um grau de cristalinidade de 93,1 % colapsou instantaneamente similar à amostra de teste 1 quando tirada do tubo e colocada na placa, e ela foi considerada “não transformada em torta” (-).

Conforme descrito anteriormente, embora as amostras de teste 2 a 4 tenham sido preparadas a partir da amostra de teste 1 com uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 99,9 %, a análise HPLC supramencionada mostrou que suas purezas de ácido 2-glicosídeo ascórbico foram até 99,1 %. O motivo disto não é certo, mas, pode-se conjeturar que um leve teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico pode ser perdido por degradação ou similares durante sua preparação por algum motivo.

Os resultados anteriores indicam que, no caso de composições particuladas contendo pelo menos 99,1 %, d.s.b., de ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, aquelas com um maior grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro tendem ter uma propriedade de formação de torta menor; e o fato de que a amostra de teste 3 com um grau de cristalinidade de 88,3 % foi considerada “transformada em torta” (+) e a amostra de teste 4 com um grau de cristalinidade de 93,1 % foi considerada “não transformada em torta” (-) indica que o patamar de mudança do julgamento de “transformada em torta” (+) para aquela de “não transformada em torta” (-) no teste de formação de torta anterior fica entre os graus de cristalinidade de 88,3 % e 93,1 %.

Neste experimento, com base nos resultados do experimento 1, sete tipos de composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, com um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro na faixa de 0 a 100 % e uma pureza de ácido 2- glicosídeo ascórbico na faixa de 99,1 a 99,9 %, foram usados e testados para formação de torta similarmente ao experimento 1 para investigar o relacionamento entre a formação de torta e o grau de cristalinidade com mais detalhes.

Composições particuladas das amostras de teste 5 a 9 na tabela 2 foram preparadas pesando as amostras de teste 1 e 2, que foram preparadas no experimento 1-1, em teores apropriados, respectivamente, e misturando-as para homogeneidade. A tabela 2 mostra as purezas de ácido 2-glicosídeo ascórbico e os graus de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro das amostras de teste 5 a 9, determinados pelo método revelado no experimento 1-2. Os resultados das amostras de teste 1 e 2 na tabela 2 foram transcritos da tabela 1.

As amostras de teste 5 a 9 foram submetidas ao teste de formação de torta no experimento 1-4. Os resultados são mostrados na coluna de “formação de torta” na tabela 2. Os resultados de “formação de torta” das amostras de teste 1 e 2 na tabela 2 foram transcritos daqueles descritos na tabela 1.Tabela 2

Conforme observado nos resultados da tabela 2, a amostra de teste 9 com um grau de cristalinidade de 29,9 % foi considerada “transformada em torta” (+) e a amostra de teste 8 com um grau de cristalinidade de 89,2 % foi considerada “levemente transformada em torta” (±). Ao contrário, as amostras de teste 7, 6 e 5 com respectivos graus de cristalinidade de 91,5 %, 92,6 % e 99,8 % foram todas consideradas “não transformada em torta” (-) similares à amostra de teste 1. Esses resultados indicam que, entre as composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro em um teor de pelo menos 99,1 %, mas menos que 99,9 %, d.s.b., aquelas com um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de pelo menos 90 % não transformam em torta nas condições deste experimento.

Os experimentos antecedentes revelaram que, nas composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro com uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico tão alto quanto 99,1 % ou mais, existem aqueles com diferentes graus de cristalinidade de forma que, neste experimento, o relacionamento entre o grau de cristalinidade de uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro e a pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico foi adicionalmente investigada. Adicionalmente, o relacionamento entre a pureza e a formação de torta de ácido 2-glicosídeo ascórbico foi investigado.

As amostras de teste 10 a 15, com purezas de ácido 2- glicosídeo ascórbico mutuamente diferentes conforme mostrado na tabela 3, foram preparada a partir de uma solução aquosa contendo ácido L-ascórbico e dextrina.

Quatro partes em peso de “PINEDEX #100”, um nome de produto de uma dextrina comercializada por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japão, foram dissolvidas em 15 partes em peso de água por aquecimento. Então, três partes em peso de ácido L-ascórbico foram misturadas com a solução. De forma sucessiva, a solução foi misturada com 100 unidades/g de dextrina, d.s.b., de uma CGTase derivada da cepa Tc-62 de Geobacillus stearothermophilus e 250 unidades/g de dextrina, d.s.b., de uma espécime de isoamilase, comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, e submetidas a uma reação enzimática mantendo ao mesmo tempo a solução a um pH de 5,5 e uma temperatura de 55°C por 50 horas para formar ácido 2-glicosídeo ascórbico. Além do mais, pode-se conjeturar que ácidos a-glicosil-L-ascórbico tais como ácido 2-O-a- maltosil-ascórbico, ácido 2-O-a-maltotriosil-L-ascórbico, ácido 2-O-a- maltotetraosil-L-ascórbico, etc., teriam sido naturalmente formados na solução da reação.

Depois de inativar as enzimas remanescentes por aquecimento, a solução da reação foi ajustada a pH 4,5, misturada com 50 unidades/g de dextrina, d.s.b., de “GLUCZYME AF6”, um nome de produto de uma espécime de glucoamilase comercializada por Amano Enzimas Inc., Aichi, Japão, e submetida a uma reação enzimática em 24 horas para hidrolisar o ácidos a-glicosil-L-ascórbico anteriores em ácido 2-glicosídeo ascórbico e hidrolisar os oligossacarídeos concomitantes remanescentes em D-glicose. Neste estágio, a solução da reação conteve ácido 2-glicosídeo ascórbico em um rendimento de produção de 39 %.

A solução da reação foi aquecida para inativar glucoamilase, descolorida com um carvão ativado, filtrada, submetida a uma coluna de uma resina de troca catiônica (forma H+) para dessalgar, e então submetida a uma resina de troca aniônica (forma OH') para absorver ácido L-ascórbico e ácido 2-glicosídeo ascórbico, seguido por lavagem da resina com água para remover D-glicose e alimentação de solução de ácido clorídrico 0,5 N para realizar a eluição. O eluado foi concentrado para dar um teor de sólidos de cerca de 50 % e então submetido a uma cromatografia de coluna usando “DOWEX 50WX4” (forma Ca“ ), um nome de produto de uma resina de troca catiônica de ácido forte comercializada pela Dow Chemical Company. O concentrado foi carregado na coluna em um volume de cerca de 1/50 vezes do volume de resina úmida, seguido por alimentação na água purificada da coluna em um volume de 50 vezes do volume de carga do concentrado a uma velocidade linear de 1 m/hora e fracionando o eluado resultante por alíquotas de 0,05 em volume do volume da coluna. Em seguida, a composição de cada fração foi medida em HPLC descrito no experimento 1 -2, e seis frações com um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico de pelo menos 80 %, d.s.b., foram concentradas in vacuo para dar respectivas concentrações sólidas de cerca de 76 %. Os concentrados resultantes foram respectivamente colocados em um cristalizador, misturados com a amostra de teste 1 no experimento 1-1, como um cristal semente, em um teor de dois porcento de cada qual dos teores de sólidos, d.s.b., seguido por resfriamento não forçado de cada concentrado de 40°C para 15°C por cerca de dois dias agitando ao mesmo tempo suavemente para precipitar ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro.

Em seguida de acordo com uma maneira convencional, as amostras de teste 10 a 15, mostradas na tabela 3, foram obtidas coletando cristais de cada massa cozida por uma centrífuga tipo cesta, lavando os cristais com um pequeno teor de água destilada, envelhecendo e secando os cristais lavados, soprando ar 25°C por 30 minutos nos cristais envelhecidos e secos para resfriamento, e pulverizando os resultantes. “AA2G”, um nome de produto de uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, como um pó de grau quase medicamento convencional, comercializado por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, foi usado como a amostra de teste 16.Tabela 3

As amostras de teste 1 e 2 conforme observado na tabela 3 foram similares às do experimento 1-1, e suas purezas e graus de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foram transcritos dos resultados experimentais antecedentes. As amostras de teste 10 a 16 foram testadas quanto a formação de torta pelo método similarmente ao experimento 1-4. Os resultados estão na tabela 3. Os resultados do teste de formação de tortas para as amostras de teste 1 e 2 conforme observado na tabela 3 foram transcritos da tabela 1 sem nenhuma mudança.

Para confirmar que o teste de formação de torta conduzido no experimento 1-4, etc., é um teste adequado para avaliar a formação de torta de uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro quando realmente armazenada, a amostra de teste 1 obtida no experimento 1-1, as amostras de teste 10 a 15 obtidas no experimento 3-1, e a amostra de teste 16 foram submetidas a um teste de estabilidade de armazenamento que foi projetado levando em conta as condições, ambiente, e período de tempo para armazenamento real de uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro.

Alíquotas de dez quilogramas de qualquer uma das amostras de teste 1 e 10 a 16 foram respectivamente pesadas e colocadas em um saco duplo de polietileno (800 mm por 600 mm) para cada amostra de teste. Então, cada saco foi colocado em uma lata de aço de 18 litros de uma maneira tal a deixar que a parte da abertura de cada saco abra e fique perpendicular sem fechar a parte da abertura, deixando que os sacos fiquem sem tampar as latas de aço, e armazenar por 45 dias em um ambiente longe de uma temperatura relativamente alta e umidade. Depois de 45 dias de armazenamento, cada saco duplo de polietileno fechando qualquer das amostras de teste foi tirado das latas, e as amostras foram tiradas dos sacos e colocadas em uma placa plana de plástico preto para observação macroscópica de sua fluidez e estados transformados em torta.

As amostras de teste foram julgadas pela sua formação de torta pelo seguinte critério: “transformadas em torta” (+), agrupamento(s) é/são detectadas em uma amostra de teste e a fluidez da amostra de teste foi abaixada em comparação com aquela no início do teste; e “não transformada em torta” (-), no agrupamento é detectado em uma amostra de teste e a fluidez da amostra de teste não foi mudada em comparação com aquela no início do teste. A forma de armazenamento de cada amostra de teste no teste de estabilidade de armazenamento é a mesma daquela de um pó de grau quase medicamento que é comercialmente distribuído e armazenado, exceto por não abrir a parte da abertura do saco com uma fita de borracha, não colocar em qualquer dessecante, e ser armazenado em uma lata de aço sem fechá-la com uma tampa. As três diferenças anteriores foram daquelas, que foram ajustadas como um ambiente de armazenamento para um teste de armazenamento que foi levemente mais rigoroso do que um ambiente de armazenamento real, para expedir os resultados de teste. Os resultados estão na tabela 3 em paralelo.

Conforme mostrado na tabela 3, exceto pela amostra de teste 2 consistindo substancialmente em uma forma amorfa de ácido 2-glicosídeo ascórbico e a amostra de teste 16 como um pó de grau quase medicamento, as demais amostras de teste 1 e 10 a 15 tendem aumentar seus graus de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro como o aumento de suas purezas de ácido 2-glicosídeo ascórbico. No teste de formação de torta, as amostras de teste 10 e 11 com respectivas purezas do ácido 2-glicosídeo ascórbico de 97,4 % e 98,0 % foram considerada “transformadas em torta” (+) ou “ligeiramente transformadas em torta” (±). Ao contrário, as amostras de teste 12 a 15 com purezas do ácido 2-glicosídeo ascórbico de 98,6 a 99,7 % foram consideradas “não transformadas em torta” (-). Esses resultados indicam que o valor do patamar da pureza de ácido 2- glicosídeo ascórbico que influencia na formação de torta fica em tomo de 98,0 % e conclui-se que uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico acima de 98,0 % deve ser necessária para obter uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro que é considerada “não transformada em torta” (-).

Não foi observada nenhuma formação de torta nas amostras de teste 12 a 15 similarmente à amostra de teste 1, embora as purezas de ácido 2- glicosídeo ascórbico das amostras de teste 12 a 15 tenham sido 98,6 % a 99,7 %, que tiveram praticamente os mesmos níveis da amostra de teste 16, um pó de grau quase medicamento, com uma pureza de 98,9 %, e foram significativamente mais baixos que os da amostra de teste 1, um pó de grau reagente consistindo substancialmente em ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro. Os graus de cristalinidade das amostras de teste 12 a 15 foram 91,6 % a 99,5 % sendo tão alto quanto 90 % ou mais, e a amostra de teste 16, um pó de grau quase medicamento, teve um grau de cristalinidade de 88,9 % sendo tão baixo quanto menos que 90 %. A partir desses resultados, pode-se concluir que o grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro poderia ser feito 90 % ou mais para obter uma composição particulada desejada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que é significativamente menos propensa à formação de torta, comparada com a amostra de teste 16 como um pó de grau quase medicamento.

Conforme mostrado na coluna da base da tabela 3, as amostras de teste 10 e 11 com respectivas purezas do ácido 2-glicosídeo ascórbico de 97,4 % e 98,0 % foram consideradas “transformadas em torta” (+) mesmo em um teste de estabilidade de armazenamento, onde elas foram armazenadas por 45 dias em sacos em respectivos teores de 10 kg/saco ao longo das linhas de sua forma de produto comercializado real. Ao contrário, as amostras de teste 12 a 15 com uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 98,6 % a 99,7 % foram consideradas “não transformadas em torta” (-) similares aos resultados em seu teste de formação de tortas. Estes fatos indicam que o teste de formação de torta como no experimento 1-4, etc., é um teste adequado para avaliar a formação de torta de uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro em um ambiente de armazenamento real.

As amostras de teste usadas nos experimentos precedentes foram todas composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro preparadas a partir de soluções contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico obtidas através de uma etapa de deixar que CGTase aja em uma solução contendo ácido L-ascórbico e uma substância amilácea. Quando se emprega tal processo de produção, as composições particuladas resultantes conterão ácido L-ascórbico e D-glicose como concomitantes específicos para o processo de produção independente do teor de tais concomitantes. Uma vez que tanto ácido L-ascórbico quanto D-glicose têm redutibilidade, composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, variando dependendo do teor de ácido L-ascórbico e D-glicose, podem possivelmente causar mudança de cor desfavorável nos produtos finais quando usadas em produtos contendo compostos com um grupo amino, tais como proteínas e aminoácidos. Entre estes, uma vez que ácido L-ascórbico tem uma reatividade relativamente alta com oxigênio, conjetura-se que ácido L-ascórbico deve ser um causativo de induzir não somente mudança de cor desfavorável em produtos usando o mesmo, mas escurecimento indesejado de um pó de grau quase medicamento convencional per se que foi ocasionalmente observado quando armazenado por um período de tempo relativamente longo.

Dessa maneira, neste experimento, as amostras de teste 1 e 12 a 16, que foram usadas nos experimentos antecedentes, foram examinadas com relação ao relacionamento entre a coloração e o teor total de ácido L- ascórbico mais D-glicose, o teor de ácido L-ascórbico, ou o poder redutor de toda a composição particulada conduzindo um teste acelerado no tratamento térmico de acordo com os seguintes procedimentos:

Cento e cinquenta miligramas de cada qual das amostras de teste foram pesados e colocados em um tubo de teste de 10 mL com uma tampa de rosca, e os tubos de teste em uma condição fechada de sua parte das aberturas com a tampas de rosca foram colocados em “DRYING-OVEN SA310”, um nome de produto de um forno comercializado por Masuda Corp., Osaka, Japão, e aquecidos a 80°C por três dias. Subsequentemente, depois de remover as tampas de rosca dos tubos de teste, três mililitros de água deionizada foram adicionados a cada qual dos tubos para dissolver cada amostra. As soluções resultantes foram medidas quanto a absorbância a um comprimento de onda de 400 nm usando “UV-2400PC”, um nome de produto de um espectrofotômetro comercializado por Shimadzu Corp., Kyoto, Japão. O grau de coloração causado por aquecimento foi considerado com base nos dois seguintes critérios: quando a absorbância a um comprimento de onda de 400 nm é menor que 0,50, é considerada “não amarronzada ou substancialmente não amarronzada” (-); e quando a absorbância a um comprimento de onda de 400 nm é 0,50 ou maior, ela é considerada “amarronzada” (+). Os resultados estão na tabela 4.

O teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose em cada amostra de teste foi determinado por HPLC descrito no experimento 1-1. O poder redutor de toda a composição particulada de cada amostra de teste foi determinado por medição dos teores de açúcar de redução e açúcares totais pelo método Somogyi-Nelson e o método de antrona-ácido sulfúrico geralmente usados na técnica, respectivamente, usando D-glicose como uma substância padrão; e calculando o poder redutor substituindo os dados na fórmula [3] supracitada. O teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose, o teor de ácido L-ascórbico, e o poder redutor de toda a composição particulada para cada amostra foram conforme mostrado na tabela 4.Tabela 4

Conforme mostrado na tabela 4, em composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, os teores tanto de ácido L-ascórbico quanto de D-glicose na amostra de teste 1, que é um pó de grau reagente consistindo substancialmente em ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, foram mais baixos que seus limites de detecção. Ao contrário, ácido L-ascórbico e/ou D-glicose foram detectados em qualquer das amostras de teste 12 a 15, como as composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro da presente invenção, e a amostra de teste 16 como um pó de grau quase medicamento convencional. Nesses pós, como fica evidente pelas amostras de teste 12 a 15, quando o teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose foi não mais que 0,2 %, d.s.b., ele foi considerado “não amarronzado ou substancialmente não amarronzado” (-); enquanto, como fica evidente pela amostra de teste 16, quando o teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose atingiu 0,3 %, d.s.b., ele foi considerado “amarronzado” (+). Como para ácido L-ascórbico que é considerado mais profundamente relacionado com a coloração de pós, aqueles como as amostras de teste 12 a 15, que contêm ácido L-ascórbico em um teor de 0,1 % ou menos, d.s.b., foram considerados “não amarronzados ou substancialmente não amarronzados” (-); enquanto aqueles como a amostra de teste 16, que tem um teor de ácido L-ascórbico atingindo 0,2 %, d.s.b., foram considerados “amarronzados” (+). Conforme já mencionado, uma vez que ácido L- ascórbico tem uma reatividade relativamente alta com oxigênio e está relacionado ao escurecimento de composições particuladas contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro, aqueles com um teor de ácido L- ascórbico acima de 0 %, mas não mais que 0,1 %, d.s.b., não precisam ter receio de causar escurecimento substancial, mesmo quando armazenados por um período de tempo relativamente longo na forma de produto de um pó de grau quase medicamento convencional.

Do ponto de vista da poder redutor, como evidente a partir das amostras de teste 12 a 15, aqueles com um poder redutor de toda a composição particulada acima de 0 %, mas abaixo de 1 % foram considerados “não bronzeados ou substancialmente não bronzeados” (-). Ao contrário, como evidente a partir da amostra de teste 16, as amostras de teste com um poder redutor de toda a composição particulada acima de 1 % foram consideradas “amarronzadas” (+). Esses resultados foram bem coincidentes com os resultados anteriores obtidos pelo julgamento com um índice do teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose.

Os resultados anteriores indicam que composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro sem nenhum receio de causar escurecimento podem ser obtidas controlando as forças redutoras das composições particuladas totais a um nível acima de 0 %, mas abaixo de 1 % embora elas inevitavelmente contenham ácido L-ascórbico e/ou D-glicose em um nível detectável devido a seus processos de produção. Considerando ambos os aspectos do escurecimento não somente dos produtos finais preparados com as composições particuladas, mas as composições particuladas per se, os resultados anteriores mostram que os teores de ácido L-ascórbico em composições particuladas devem preferivelmente ser acima de 0 %, mas não mais que 0,1 %, d.s.b.

Para examinar o efeito do método de resfriamento na cristalização nos graus de cristalinidade das composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, as composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro na tabela 5 (amostras de teste 17 a 22) foram preparadas pelo método seguinte. O rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico em cada solução da reação enzimática foi determinado pelo método no experimento 1-2.

(1) Amostra de teste 17

Similarmente ao exemplo descrito posteriormente para a referência 1, a amostra de teste 17 como uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foi preparada, exceto que, no método do exemplo descrito posteriormente para a referência 1, as durações de ações de CGTase e isoamilase foram suspensas a 25 horas como uma metade do tempo como no exemplo para a referência 1, seguido pela purificação da solução da reação enzimática para dar um teor de ácido 2- glicosídeo ascórbico de pelo menos 86 % e então concentrando in vacuo a solução contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico para dar uma concentração de cerca de 76 %, transferindo o concentrado resultante para um cristalizador com um tanque encamisado equipado em tomo do cristalizador, precipitando cristais por um método de resfriamento pseudocontrolado de resfriar gradualmente o concentrado de 40°C para 30°C em 1,5 dia, e então resfriá-lo prontamente de 30°C para 15°C em 0,5 dia controlando a temperatura da água no tanque encamisado. O rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico na solução da reação enzimática foi 25,3 %.

(2) Amostra de teste 18

Similarmente ao exemplo 1, a amostra de teste 18 como uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foi preparada, exceto que, no método do exemplo descrito posteriormente 1, o amido de batata liquefeito usado como um material foi substituído com “PINEDEX #100”, um nome de produto de uma dextrina comercializada por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japão; e cristais foram obtidos purificando a solução depois das reações enzimáticas, concentrando a solução purificada sob uma baixa pressão, e resfriando não forçadamente o concentrado de 40°C para 15°C em cerca de dois dias. O rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico na solução da reação enzimática foi 27,0 %.

(3) Amostra de teste 19

A amostra de teste 19 como uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foi preparada similarmente à amostra de teste 18, exceto que uma solução depois das reações enzimáticas foi transferida para um cristalizador com um tanque encamisado equipado em tomo do cristalizador e cristalizado por um método de resfriamento pseudocontrolado de resfriar gradualmente a solução de 40°C para 30°C em 1,5 dia e então resfriá-lo prontamente de 30°C para 15°C em 0,5 dia controlando a temperatura da água em o tanque encamisado. O rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico na solução da reação enzimática foi 27,0 %.

(4) Amostra de teste 20

Similarmente ao exemplo 4, a amostra de teste 20 como uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foi preparada, exceto que, no método do exemplo descrito posteriormente 4, uma solução contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico foi concentrada para dar uma concentração de cerca de 76 % sob uma baixa pressão e a solução obtida com uma temperatura de 40°C foi transferida para um cristalizador e resfriada não forçadamente de uma tal maneira a resfriar a solução de 40°C para 15°C por cerca de dois dias para precipitar os cristais. O rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico na solução da reação enzimática foi 32,5 %.

(5) Amostra de teste 21

A amostra de teste 21 como uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foi preparada similarmente à amostra de teste 20, exceto que uma solução depois das reações enzimáticas foi transferida para um cristalizador com um tanque encamisado equipado em torno do cristalizador, seguido por precipitação dos cristais por um método de resfriamento pseudocontrolado de resfriar gradualmente a solução de 40°C para 30°C em 1,5 dia e então resfriá-lo prontamente de 30°C para 15°C em 0,5 dia controlando a temperatura da água no tanque encamisado. O rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico na solução da reação enzimática foi 32,5 %.

(6) Amostra de teste 22

Similarmente ao experimento 3-1, a amostra de teste 22 como uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foi preparada, exceto que, no método de preparação para amostras de teste do experimento 3-1, as reações enzimáticas por CGTase e isoamilase foram suspensas a 30 horas depois de iniciar as reações enzimáticas, e a solução, que foi purificada para dar um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 86,2 %, foi concentrada para dar uma concentração de cerca de 76 % sob uma baixa pressão, seguido por transferência da solução resultante com uma temperatura de 40°C para um cristalizador e resfriamento da solução por um método de resfriamento não forçado de 40°C para 15°C por cerca de dois dias para precipitar os cristais. O rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico na solução da reação enzimática foi 35,3 %.

<Medição da pureza e do grau de cristalinidade de ácido 2-glicosídeo ascórbico>

De acordo com um método similar como no experimento 1 -2, as purezas e os graus de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro das amostras de teste 17 a 22 foram determinados.

<DÍâmetro de cristalito médio>

Os diâmetros de cristalito médio das amostras de teste 17 a 22 foram medidos pelo método seguinte. Para o cálculo pela fórmula [2] supradescrita, nos padrões de difração, que foram preparados com base nos perfis de difração de raios-X em pó que foi usado para determinar o grau de cristalinidade de cada amostra de teste, as meias alturas e os ângulos de difração (29) de cinco picos de difração detectados nos ângulos de difração (20) de 10,4 ° (índice de Miller (hkl): 120), 13,2 ° (índice de Miller (hkl): 130), 18,3 0 (índice de Miller (hkl):230), 21,9 0 (índice de Miller (hkl):060), e 22,6 ° (índice de Miller (hkl): 131), que correspondem ao símbolos “a” até “e” na FIG. 1, respectivamente, foram tratados com “X’ pert Highscore Plus”, um software de computador de processamento analítico provido com “X’ Pert PRO MPD”, um nome de produto de um difratômetro de raios-X em pó comercialmente disponível, e submetido ao cálculo de diâmetro de cristalito médio de ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro em cada amostra de teste com o programa de “Fórmula de Scherrer” no software de computador anterior.

Os resultados anteriores estão na tabela 5.Tabela 5

Conforme mostrado na tabela 5, as amostras de teste 19 e 21,que foram preparadas purificando e concentrando uma solução da reação enzimática com um rendimento de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de 27,0 % ou 32,5 % e cristalização do ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro por um método de resfriamento pseudocontrolado, teve um grau de cristalinidade acima de 90 % e respectivos diâmetros de cristalito médio de 1.450 Â e 1.650 Á. Enquanto a amostra de teste 17 que foi preparada purificando e concentrando uma solução da reação enzimática com um rendimento de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de 25,3 % e precipitando ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro a partir da solução resultante contendo ácido L-ascórbico 2-glicosídeo também por um método de resfriamento pseudocontrolado similarmente conforme anteriormente, teve um diâmetro de cristalito médio relativamente tão alto quanto 1.410 A, mas teve um grau de cristalinidade menor que 90 %. As amostras de teste 18 e 20, que foram preparadas purificando e concentrando uma solução da reação enzimática com um rendimento de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de 27,0 % ou 32,5 % similarmente às amostras de teste 19 e 21 e precipitando ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro a partir da solução contendo ácido L-ascórbico 2-glicosídeo por um método de resfriamento pseudocontrolado, teve um grau de cristalinidade menor que 90 % e respectivos diâmetros de cristalito médio tão baixos quanto 1.220 Â e 1.250 Â. A amostra de teste 22, que foi preparada purificando e concentrando uma solução da reação enzimática com um rendimento de produção do ácido 2- glicosídeo ascórbico de 35,3 % e precipitando ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro a partir da solução contendo ácido L-ascórbico 2-glicosídeo por um método de resfriamento não forçado, teve um grau de cristalinidade tão alto quanto 98,9 % e um diâmetro de cristalito médio tão alto quanto 1.705 Â.

Os resultados na tabela 5 indicam que, mesmo uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro preparado a partir de uma solução da reação com o mesmo rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico, o grau de cristalinidade e o diâmetro de cristalito médio de ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que foi cristalizado por um método de resfriamento pseudocontrolado, são maiores que aqueles do obtido por cristalização por um método de resfriamento não forçado. No caso de precipitar 2-glicosídeo cristalino anidro por um método de resfriamento não forçado, uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro com um grau de cristalinidade acima de 90 % não poderia ser obtida, a menos que o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico fosse acima de 35 %, enquanto, no caso de aplicar um método de resfriamento pseudocontrolado na cristalização, mesmo uma solução da reação enzimática com um rendimento de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de 32,5 % (amostra de teste 21) ou 27,0 % (amostra de teste 19) como menos que 35 %, uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro com um grau de cristalinidade acima de 90 % foi obtida. Esses resultados indicam que um método de resfriamento pseudocontrolado aumenta efetivamente o grau de cristalinidade e o diâmetro de cristalito médio, e uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro com um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro acima de 90 % pode ser obtida aplicando tanto um método de resfriamento pseudocontrolado quanto método de resfriamento controlado depois da purificação e concentração, desde que o rendimento de produção de ácido 2- glicosídeo ascórbico em uma solução da reação enzimática seja acima de 27,0 %. Uma vez que as amostras de teste 19 e 21 têm uma pureza de ácido 2- glicosídeo ascórbico na faixa acima de 98,0 %, mas abaixo de 99,9 % e um grau de cristalinidade acima de 90 %, elas são composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro que são significativamente menos propensas à formação de torta, comparadas com um pó de grau quase medicamento convencional.

Como amostras de teste, as amostras de teste 17 a 22 usadas no experimento anterior, composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro preparadas pelo método no exemplo descrito posteriormente 1 a 4, a amostra de teste 1 preparada no experimento 1-1, e a amostra de teste 16 (um pó de grau quase medicamento) usadas no experimento 3-1 foram usadas para examinar suas solubilidades em solventes hidrofílicos amplamente usados em cosméticos e quase medicamentos.

Qualquer uma das amostras de teste anteriores e das composições particuladas dos exemplos 1 a 4 foi pesada 0,25 g e colocada em “FALCON TUBO 2059”, um nome de produto de um tubo cilíndrico de polipropileno de 14 mL com uma forma de base semiesférica e uma tampa, comercializado por Becton, Dickinson e Company, Nova Jérsei, USA. A cada tubo com cada amostra foram adicionados cinco mililitros de uma solução, que foi preparada diluindo 1,3-butileno glicol (um reagente de grau especial comercializado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tóquio, Japão) com água deionizada para dar uma concentração de 30 %, e a mistura resultante foi aquecida por 30 minutos em um banho de água a temperatura constante a 50°C, em seguida deixando que o tubo vire duas vezes, que o mantém a 50°C por 15 minutos, e julgando macroscopicamente a aparência da seguinte maneira: “solubilidade aprovável” (-), quando um pó foi considerado completamente dissolvido; “solubilidade reprovável” (+), quando foram observada(s) substância(s) insolúvel(s). Quando uma substância(s) insolúvel como essa(s) foi/foram observada(s), ela foi adicionalmente mantida a 50°C por 15 minutos e ela foi considerada “solubilidade ligeiramente reprovável” (±), quando um pó foi considerado completamente dissolvido. Os resultados estão na tabela 6.

Usando as amostras de teste anteriores ou as composições particuladas dos exemplos 1 a 4, elas foram submetidas ao teste de formação de torta e o teste de estabilidade de armazenamento pelos métodos nos experimentos 1-4 e 3-2. Os resultados estão na tabela 6 em paralelo. As amostras de teste 1 e 16 foram medidas quanto ao diâmetro de cristalito médio pelo método no experimento 5, e os resultados estão na tabela 6 em paralelo. Os resultados de pureza do ácido 2-glicosídeo ascórbico, grau de cristalinidade, formação de torta e estabilidade de armazenamento para as amostras de teste 1 e 16 foram transcritos dos resultados na tabela 3 para as amostras de teste 1 e 16. Tabela 6

Conforme mostrado na tabela 6, as amostras de teste 16 a 21 e as composições particuladas descritas posteriormente dos exemplos 1 a 4 com um diâmetro de cristalito médio de 1.670 Â ou menor foram consideradas “solubilidade aprovável” (-). Ao contrário, a amostra de teste 22 com um diâmetro de cristalito médio de 1.705 Â foi considerada “solubilidade ligeiramente reprovável” (±). A amostra de teste 1 (um pó de grau reagente) com um diâmetro de cristalito médio de 1.770 Â foi considerada “solubilidade reprovável” (+). Os pós das amostras de teste 1, 19, 21, e 22 e as composições particuladas dos exemplos 1 a 4 foram consideradas “não transformadas em torta” (-) no teste de formação de torta e o teste de estabilidade de armazenamento, enquanto as amostras de teste 16 a 18 e 20 foram consideradas “transformadas em torta” (+). Com base nesses resultados, conjetura-se que o patamar de diâmetro de cristalito médio que influencia na solubilidade em solventes hidrofílicos seja mais baixo que 1.705 Â, e uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro com um diâmetro de cristalito médio menor que 1.700 Â, mais particularmente 1.670 Â ou menos foi considerada superior a um pó de grau reagente em solubilidade contra solventes hidrofílicos. Entre as amostras de teste 19 e 21 e as composições particuladas dos exemplos 1 a 4, que foram avaliadas como satisfatórias em qualquer item de solubilidade, formação de torta, e estabilidade de armazenamento, o diâmetro de cristalito médio mais baixo é 1.450 Â (amostra de teste 19) de forma que um diâmetro de cristalito médio preferível foi considerado na faixa de 1.400 Â ou mais, mas menos que 1.700 Â, mais preferivelmente, 1.450 Â ou mais, mas não mais que 1.670 À. <Experimento 7: Rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico por CGTases derivadas de vários microrganismos>

Em um sistema de reação enzimática onde CGTase pode agir naturalmente em uma solução contendo amido liquefeito e ácido L-ascórbico e então glucoamilase pode agir naturalmente na solução resultante para formar ácido 2-glicosídeo ascórbico, o experimento seguinte foi conduzido para examinar como a diferença de origem de CGTase influencia no rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico em uma solução da reação enzimática obtida através das reações enzimáticas anteriores. <CGTase comercializada>

Entre CGTases derivadas de vários microrganismos, as CGTases seguintes são usadas como CGTase comercializadas: “CONTIZYME”, um nome de produto de uma espécime de CGTase comercializada vendida por Amano enzyme Inc., Tóquio, Japão, foi usada como uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Bacillus macerans; uma CGTase derivada da cepa TC-91 de Geobacillus stearothermophilus, produzida por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, foi usada como uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Geobacillus stearothermophilus', e “TORUZYME 3.0L”, um nome de produto de uma CGTase comercializada recombinante vendida por Novozymes Japão Ltd., Tóquio, Japão, foi usada como uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Thermoanaerobacter thermos ulfurigenes.

Cepa NBRC 15379 de Paenibacillus illinoisensis foi cultivada em um meio de cultura líquido contendo dextrina 2 %, de cloreto amónio 0,5 %, hidrogeno fosfato de potássio 0,05 %, sulfato de magnésio 0,025 %, e carbonato de cálcio 0,5 % a 27°C por três dias. A cultura resultante foi centrifugada e o sobrenadante resultante dessalgado com sulfato de amónio de maneira usual e dialisada para obter uma solução de enzima bruta de CGTase. A solução de enzima bruta assim obtida foi alimentada em DEAE- TPYOPEAL 650S comercializado por Tosoh Corp., Tóquio, Japão, uma cromatografia de coluna de troca catiônica, e uma cromatografia de coluna hidrofóbica usando gel BUTIL-TOYOPEARL 650 M comercializado por Tosoh Corp., Tóquio, Japão, para obter uma CGTase parcialmente purificada. <Experimento 7-1-2: Preparação de mutante de CGTase derivado da cepa Tc- 91 de Geobacillus stearothermophilus>

Conforme descrito anteriormente, um gene de uma CGTase derivada da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus foi clonado e a sequência de aminoácido de uma CGTase madura (sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO:1) foi determinada com base na sequência de nucleotideo (sequência de nucleotideo representada por SEQ ID NO:2) do gene. Introduzindo uma mutação no DNA genético da CGTase pelo procedimento seguinte para obter uma CGTase mutante com uma maior produtividade de ácido 2-glicosídeo ascórbico do que a CGTase tipo selvagem.

Usando um gene CGTase derivado da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus (depositado com International Patent Organism Depositary in National Institute de Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japão, com o número de acesso de FERM BP-11273), que foi concedida aos inventores da presente invenção, o gene foi mutado para introduzir ou desencorajar um sítio(s) de clivagem de restrição de enzima sem alterar a sequência de aminoácido codificada pelo gene CGTase, e introduzido em um vetor de plasmídeo para obter um DNA recombinante contendo um gene que codifica a CGTase tipo selvagem. A FIG. 5 mostra a estrutura do DNA recombinante “pRSET-iBTC12”. Em seguida, um fragmento do gene (fragmento Nde I-EcoT221) que codifica uma região contendo um resíduo ativo da CGTase tipo selvagem no DNA recombinante obtido anteriormente foi clivado e mutado aleatoriamente em um tubo de teste usando “GeneMorph PCR Mutagenesis Kit”, um nome de produto de um estojo de mutação de PCR comercializado por Stratagene Company, CA, USA, e os resultantes retomaram para o DNA original para obter uma mistura de gene que codifica mutantes da CGTase com várias substituições de aminoácido. Introduzindo os genes mutados nos vetores de plasmídeo de expressão, DNAs recombinantes foram obtidos. Uma biblioteca do gene CGTase mutante foi obtida transformando E. coli com os DNAs recombinantes.

Mais de 1.300 cepas transformantes foram isoladas da biblioteca de gene obtida e cultivada respectivamente, seguido por preparação de um lisado celular como uma solução de enzima bruta contendo uma CGTase mutante da células obtidas por cada cultura. A solução de enzima bruta resultante foi deixada para agir em uma solução aquosa contendo ácido L-ascórbico e hidrolisado de amido parcial, seguido por tratamento dos ácidos a-glicosil L-ascórbico formados com glucoamilase para formar ácido 2- glicosídeo ascórbico, e classificando transformantes capazes de produzir mutantes da CGTase com um produtividade relativamente alta de ácido 2- glicosídeo ascórbico comparando a produtividade com a da CGTase tipo selvagem. Durante o processo de classificação, duas cepas transformantes possuindo o mutante visado dos genes CGTase, isto é, cepas #129 e #268 foram obtidas. As sequências de nucleotídeos de dos genes CGTase mutante que são possuídos pelo transformantes foram decodificados e revelaram que uma CGTase mutante produzida pela cepa #129 transformante tem uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO:1, em que dois resíduos de aminoácido foram substituídos; os 176° resíduos de glicina (G) foram substituídos com resíduo de arginina (R) e o 452e resíduo de tirosina (Y) foi substituído com resíduo de histidina (H), isto é, ele tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:4. Enquanto o CGTase mutante produzido a partir da cepa #268 transformante tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:1, em que um único resíduo de aminoácido foi substituído; o 228th resíduo de lisina (K) foi substituído com resíduo de isoleucina (I), isto é, ele tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5. Esses mutantes da CGTase foram respectivamente denominados G176R/Y452H e K228I com base nos sítios de aminoácidos substituídos na sequência de aminoácido da SEQ 1D NO:1 e a substituições de aminoácido.

Os dois transformantes anteriores, que possuem DNAs genéticos que codificam as mutantes da CGTase anteriores, foram respectivamente cultivada de forma aeróbica a 37°C em 24 horas usando meio de cultura T (contendo 12 g de bacto-triptona por litro, 24 g de extrato bacto- levedura, 5 mL de glicerol, 17 mM de fosfato de potássio, e 72 mM de fosfato de dipotássio) contendo 100 μL/mL de ampicilina de sódio. As células, obtidas centrifugando cada cultura, foram respectivamente submetidas a tratamento de ruptura com “Ultra Sonic Homogenizer UH-600”, um nome de produto de um rompedor ultrassónico comercializado por MST Corporation, Aichi, Japão, e o sobrenadante das células rompidas foi aquecido a 60°C por 30 minutos para desnaturar e inativar as proteínas não termoestáveis derivadas do hospedeiro. As soluções com tratamento térmico foram respectivamente centrifugadas ainda mais para obter espécimes parcialmente purificadas dos mutantes de CGTase.

A atividade enzimática para cada qual das CGTases anteriores foi determinada pelo método identificado anteriormente e calculada usando a fórmula [4].

Cinco partes em peso de “PINEDEX #1”, um nome de produto de uma dextrina comercializada por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japão, foram adicionadas a 20 partes em peso de água, dissolvidas por aquecimento, misturadas com três partes em peso de ácido L-ascórbico, e ajustadas a pH 5,5 para uso como uma solução de substrato. A solução de substrato foi adicionada qualquer uma das CGTases comercializadas supradescritas e as CGTases preparadas no experimento 7-1 em uma quantidade de 100 unidades/g de dextrina, d.s.b., e deixadas reagir enzimaticamente a 55°C por 40 horas, seguido por aquecimento das soluções de reação enzimática para inativar as enzima remanescentes para formar ácido 2-glicosídeo ascórbico junto com ácidos a-glicosil-L-ascórbico tais como ácido 2-O-a-maltosil-ascórbico, ácido 2-O-a-maltotriosil-L-ascórbico, e ácido 2-O-a-maltotetraosil-L-ascórbico. As soluções de reação assim obtidas foram aquecidas para inativar a enzima remanescente, ajustadas a pH 4,5, misturadas com “GLUCZYME AF6”, um nome de produto de uma espécime de glucoamilase (6.000 unidades/g), comercializada por Amano Enzima, Inc., Aichi, Japão, em uma quantidade de 50 unidades/g de dextrina, d.s.b., reagida a 55°C em 24 horas para hidrolisar ácidos a-glicosil-L-ascórbico em ácido 2- glicosídeo ascórbico e para hidrolisar os sacarídeos concomitantes em D- glicose, e aquecida para inativar a glucoamilase remanescente para obter soluções de reação enzimática 1 a 6.

Os rendimentos de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico nas soluções de reação enzimática 1 a 6, obtidos no experimento 7-2, foram determinados da seguinte maneira: as soluções de reação enzimática 1 a 6 foram respectivamente preparadas em uma solução 2 % com água purificada, filtradas com um filtro de membrana de 0,45 μm e submetidas a análise HPLC descrita no experimento 1-2, seguido pelo cálculo do teor de ácido 2- glicosídeo ascórbico de cada qual das soluções de reação enzimática resultantes com base na área de pico que apareceu em uma cromatografia por um refratômetro diferencial para cada solução, e convertendo os dados calculado naqueles expressas com base em material sólido e seco. Os resultados estão na tabela 7. O rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico em cada solução da reação enzimática na tabela 7 é aquele que pode ser reprodutivelmente obtido em uma dispersão considerável, mesmo quando a reação de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico e o tratamento com glucoamilase são repetidos cinco vezes nas mesmas condições para cada CGTase.Tabela 7

Nota *: Depois tratamento com glucoamilase

Conforme mostrado na tabela 7, no caso de usar a CGTase derivada de um microrganismo da espécie Bacillus macerans (solução da reação 1), o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico depois do tratamento com glucoamilase foi até 16 % e, no caso de usar a CGTase derivada de um microrganismo da espécie Paenibacillus illinoisensis (solução da reação 2), o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico foi tão baixo quanto 18 %. Ao contrário, no caso de usar a CGTase derivada da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus (solução da reação 3), o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico atingiu 28 % e, no caso de usar a CGTase derivada de um microrganismo da espécie Thermoanaerobacter thermosulfurigenes (solução da reação 4), o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico atingiu 30 %. Adicionalmente, no caso de usar G176R/Y452H e K228I, mutantes de uma CGTase derivados da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus, os rendimentos da produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico atingiram 32 % e 31 %, respectivamente.

Os resultados indicam claramente que as CGTases derivadas de microrganismos da espécie Bacillus macerans e Paenibacillus illinoisensis não podem produzir ácido 2-glicosídeo ascórbico em um rendimento da produção eficiente, e elas não são adequadas para produzir ácido 2-glicosídeo ascórbico.

Usando um método de resfriamento não forçado convencional e método de resfriamento pseudocontrolado como métodos de cristalização para precipitar ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foram preparadas a partir das soluções de reação enzimática 3 a 6 com diferentes rendimentos de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico obtidos no experimento 7, seguido por exame dos efeitos de tais métodos de cristalização nas purezas e nas propriedades de ácido 2-glicosídeo ascórbico pulverizado. As soluções de reação enzimática 1 e 2 com um rendimento de produção distintamente baixo de ácido 2-glicosídeo ascórbico nos seus estágios de soluções de reação enzimática, isto é, as soluções de reação enzimática, que foram preparadas deixando que uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Bacillus macerans ou Paenibacillus illinoisensis aja em cada qual de seus substratos, não foram usadas para preparar pós em virtude de elas terem sido consideradas instáveis para produzir eficientemente qualquer composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro.

As soluções de reação enzimática 3 a 6 com diferentes rendimentos de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico obtidas no experimento 7 foram respectivamente descoloridas com um carvão ativado, filtradas, dessalgadas com uma resina de troca catiônica (forma H), e submetidas a uma resina de troca aniônica (forma OH ) para adsorver por isso ácido L-ascórbico e ácido 2-glicosídeo ascórbico, seguido por lavagem da resina com água para remover sacarídeos contendo D-glicose e alimentação de solução aquosa 0,5 N de ácido clorídrico para realizar a eluição. Cada qual dos eluados foi concentrado para dar uma concentração de sólidos de cerca de 50 %, d.s.b., e submetido a uma cromatografia de coluna usando um coluna empacotada com “DIAION UBK 550” (forma NaT), um nome de produto de uma resina de troca catiônica de ácido forte comercializado por Mitsubishi Chemical Corp., Tóquio, Japão, a fim de obter alto teor de frações do ácido 2- glicosídeo ascórbico com um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 86 % ou mais. As frações coletadas foram agrupadas e concentradas para dar um teor de sólido de cerca de 75 %, d.s.b., para obter ácido 2-glicosídeo ascórbico contendo soluções 3 a 6 (contendo 86,3 a 87,1 %, d.s.b., de ácido 2-glicosídeo ascórbico), que corresponderam às soluções de reação enzimática 3 a 6, respectivamente.

Cada das soluções contendo ácido-2-glucosídeo ascórbico anterior 3 a 6 foi colocada em um cristalizador, misturado com ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro como um cristal semente em um teor de cerca de dois porcento (p/v) do volume de cada solução de sacarídeo, e cristalizado resfriando não forçadamente cada solução de 40°C para 15°C por cerca de 48 horas em condições de agitação para obter uma massa cozida com ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro precipitado. Um ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro foi coletado da massa cozida por uma centrífuga tipo cesta convencional, lavado com água deionizada em um teor de oito porcento do peso de cada massa cozida, envelhecido e seco a 40°C por três horas, resfriado forçadamente soprando nele 25°C ar puro por 30 minutos, e pulverizado nas composições particuladas contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro. Essas composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, obtidas do ácido 2-glicosídeo ascórbico contendo soluções 3 a 6 por um método de resfriamento não forçado, foram respectivamente denominadas amostras de teste 23 a 26.

Similarmente ao exposto, uma massa cozida com ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro precipitado foi obtida, exceto que cada qual das soluções contendo ácido 2-glicosídeo-ascórbÍco 3 a 6 com diferentes teores de ácido 2-glicosídeo ascórbico, d.s.b., preparada anteriormente, foi concentrada in vacuo para dar uma concentração de sólidos de cerca de 75 %, d.s.b., colocada em um cristalizador, misturada com ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro como um cristal semente em um teor de cerca de dois porcento (p/v) do volume do concentrado, e submetida a cristalização por um método de resfriamento pseudocontrolado de resfriamento de 40°C para 15°C em cerca de 48 horas em condições de agitação. No método de resfriamento pseudocontrolado, o tempo de cristalização de 48 horas no total foi dividido em três zonas de 24 horas, 12 horas, e 12 horas, em que, na primeira zona, a temperatura do líquido foi abaixada de 40°C para 35°C em 24 horas; na zona intermediária, a temperatura do líquido foi abaixada de 35°C para 27,5°C em 12 horas; e na última zona, a temperatura do líquido foi abaixada de 27,5°C para 15°C em 12 horas. A partir de cada massa cozida obtida, ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foi coletado por uma centrífuga tipo cesta convencional, lavado com água deionizado em um teor de oito porcento do peso da massa cozida, envelhecido e seco a 40°C por três horas, forçadamente resfriado soprando nele 25°C de ar puro por 30 minutos, e pulverizado nas composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro. Essas composições particuladas, contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro obtidas das soluções 3 a 6 contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico pelo método de resfriamento pseudocontrolado, foram respectivamente denominadas amostras de teste 23c a 26c.

Para as amostras de teste 23 a 26 e amostras de teste 23c a 26c obtidas anteriormente, elas foram examinadas, similarmente ao experimento 6, quanto a suas purezas, graus de cristalinidade, diâmetros de cristalito médio, formações de torta, e solubilidades em 1,3-butÍleno glícol como um solvente hidrofilico. Os resultados estão na tabela 8. O resultado para a 10 amostra de teste 16 como um pó de grau quase medicamento foi transcrito da tabela 6 e mostrado na tabela 8 em paralelo.Tabela 8

Conforme mostrado na tabela 8, o teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, d.s.b., ou a pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico nas 15 composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro das amostras de teste 23 a 26 e amostras de teste 23c a 26c foram todos acima de 98 %, e essas amostras de teste foram composições particuladas contendo um ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de pureza relativamente alta similar à amostra de teste 16 que é uma composição 20 particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro como um pó de grau quase medicamento convencional.

Como para os graus de cristalinidade, as amostras de teste 23 a 26, que foram preparadas aplicando um método de resfriamento não forçado convencional na etapa de cristalização para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, permaneceram nos graus de cristalinidade menores que 90 % similares ao da amostra de teste 16 como um pó de grau quase medicamento convencional; enquanto todas as amostras de teste 23c a 26c, que foram preparadas aplicando um método de resfriamento pseudocontrolado na etapa de cristalização, mostraram um grau de cristalinidade de 90 % ou mais, reconfirmando que um método de resfriamento pseudocontrolado como esse tem um efeito de aumentar o grau de cristalinidade de uma composição particulada resultante contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro. Similarmente aos graus de cristalinidade dos pós, os diâmetros de cristalito médio das amostras de teste 23 a 26 permaneceram na faixa de 1.220 a 1.280 Â, enquanto as amostras de teste 23c a 26c tiveram diâmetros de cristalito médio tão alto quanto 1.480 a 1.540 À.

Também com relação à formação de torta de pós, as amostras de teste 23 a 26, que tiveram graus de cristalinidade menores que 90 % e diâmetros de cristalito médio menores que 1.400 Â, foram consideradas “transformadas em torta” (+), enquanto as amostras de teste 23 c a 26c, que tiveram graus de cristalinidade de pelo menos 90 % e diâmetros de cristalito médio de 1.400 Â ou mais, foram consideradas “não transformadas em torta” (-). Quanto a solubilidade em 1,3-butileno glicol, cada amostra de teste foi considerada “solubilidade aprovável” (-).

Os resultados nos experimentos 7 e 8 indicam que uma composição particulada, que tem um grau de cristalinidade de pelo menos 90 % e que é significativamente menos propensa à formação de torta, é produzida preparando uma solução da reação enzimática com um rendimento de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de 27 % ou mais usando, em um processo para produzir ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, qualquer de uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Geobacillus stearothermophilus, suas enzimas mutantes, e uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Thermoanaerobacter thermosulfurigenes} purificando a solução da reação enzimática para dar um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 86 % ou mais; e aplicando um método de resfriamento pseudocontrolado ou método de resfriamento controlado na etapa de cristalização.

O experimento seguinte foi conduzido para examinar como o uso da combinação de uma enzima de desramificação de amido afeta no rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico em uma solução da reação enzimática, obtida através de uma reação enzimática usando qualquer das CGTases derivadas de vários microrganismos em um sistema da reação enzimática, onde qualquer de tais CGTases pode agir naturalmente em uma solução contendo amido liquefeito e ácido L-ascórbico e então glucoamilase pode agir naturalmente na solução resultante para formar ácido 2-glicosídeo ascórbico.

Uma reação de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico foi conduzida similarmente ao experimento 7, exceto para deixar 1.000 unidades/g de dextrina, d.s.b., de uma preparação de enzima de isoamilase (derivado de um microrganismo da espécie Pseudomonas amyloder arnosa, comercializado por Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japão) como uma enzima de desramificação de amido junto com qualquer das CGTases usadas no experimento 7. O ácido 2-glicosídeo ascórbico resultante foi tratado com glucoamilase para obter qualquer das soluções de reação enzimática 7 a 12, conforme mostrado na tabela 9 descrita posteriormente, seguido por medição do rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico em cada qual das soluções de reação enzimática 7 a 12 pelo método no experimento 1-2. Os resultados estão na tabela 9.Tabela 9

Note *: Depois do tratamento com glucoamilase

Conforme observado na tabela 9, quando usada em combinação com uma enzima de desramificação de amido, a CGTase derivada de um microrganismo da espécie Bacillus macerans (solução da reação 7) e a CGTase derivada de um microrganismo da espécie Paenibacillus illinoisensis (solução da reação 8) exibiram rendimentos de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de 21 % e 25 %, respectivamente, depois do tratamento com glucoamilase. Entretanto, a CGTase derivada da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus (solução da reação 9) exibiu um rendimento de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de 37 %, e a CGTase derivada de um microrganismo da espécie Thermoanaerobacter thermosulfurigenes (solução da reação 10) exibiu um rendimento de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de 33 %. No caso de usar G176R/Y452H e K228I, mutantes de uma CGTase derivada da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus exibiram 37 % e 36 %, respectivamente.

Variando dependendo das origens da CGTases, o uso da combinação de uma enzima de desramificação de amido (isoamilase) com a reação enzimática por CGTase aumentou mais significativamente o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico depois do tratamento com glucoamilase em qualquer das soluções de reação enzimática 7 a 12 em 3 % a 9 %, comparado ao obtido com um único uso das respectivas CGTases (vide soluções de reação 1 a 6 na tabela 7). No caso da CGTase derivada de um microrganismo da espécie Bacillus macerans (solução da reação 7) e da

CGTase derivada de um microrganismo da espécie Paenibacillus illinoisensis (solução da reação 8), mesmo quando uma enzima de desramifícação de amido foi usada em combinação, os rendimentos da produção de ácido 2- glicosídeo ascórbico depois do tratamento com glucoamilase permaneceram em 21 % e 25 %, respectivamente, que foram significativamente mais baixos que os obtidos com um único uso de qualquer das CGTases sem ser as CGTases identificadas anteriormente (vide soluções de reação 3 a 6 na tabela 7).

Os resultados anteriores indicam que, quando uma enzima de desramifícação de amido é usada em combinação, a CGTase derivada da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus, a CGTase derivada de um microrganismo da espécie Thermoanaerobacter thermosulfurigenes, e G176R/Y452H e K228I como mutantes da CGTase derivada da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus produzem mais efícientemente ácido 2- glicosídeo ascórbico em virtude de elas alcançarem um maior rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico em cerca de 3 % a cerca de 9 % do que aquele alcançado com um único uso de qualquer das CGTases sem usar uma enzima de desramifícação de amido.

Os resultados anteriores reconfirmaram que as CGTases derivadas de microrganismos da espécie Bacillus macerans e Paenibacillus illinoisensis não são adequadas para produzir ácido 2-glicosídeo ascórbico em virtude de elas não poderem produzir efícientemente ácido 2-glicosídeo ascórbico mesmo quando usadas em combinação com uma enzima de desramifícação de amido.

Neste experimento, o efeito do método de cristalização na pureza e nas propriedades de um ácido 2-glicosídeo ascórbico pulverizado foi examinado similarmente ao experimento 8, durante a produção de uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro a partir de uma solução da reação enzimática obtida usando uma CGTase e uma enzima de desramificação de amido em combinação. Para as soluções de reação enzimática 7 e 8 com um rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico relativamente baixo, nenhum destes pós não foi preparado com o mesmo motivo do experimento 8.

As soluções de reação enzimática 9 a 12, obtidas no experimento 9, foram respectivamente purificadas similarmente ao experimento 8 nas soluções 9 a 12 contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico com um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 86 % ou mais, seguido por precipitação de ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro aplicando nelas um método de resfriamento não forçado similarmente ao experimento 8-1 para preparar composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro para uso como amostras de teste 27 a 30.

Similarmente às amostras de teste 27 a 30, exceto pela aplicação do mesmo método de resfriamento pseudocontrolado como no experimento 8 na etapa de cristalização para ácido 2-glicosídeo ascórbico, composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foram preparadas a partir das soluções contendo ácido 2-glicosídeo- ascórbico 9 a 12 com um teor de ácido ascórbico de 86 % ou mais para uso como amostras de teste 27c e 30c.

Similarmente ao experimento 8, as amostras de teste 27 a 30 e amostras de teste 27c a 30c foram respectivamente examinadas quanto a suas purezas de ácido 2-glicosídeo ascórbico, graus de cristalinidade, diâmetros de cristalito médio, formações de torta, e solubilidades em 1,3-butileno glicol como um solvente hidrofílico. Os resultados estão na tabela 10. O resultado da amostra de teste 16 como um pó de grau quase medicamento foi transcrito da tabela 6 e mostrado na tabela 10 em paralelo. Tabela 10

Como fica evidente pela tabela 10, qualquer das amostras de teste 27 a 30 excluindo a amostra de teste 28 e amostras de teste 27c a 30c teve uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de pelo menos 99,2 %, um grau de cristalinidade de pelo menos 92,6 %, e um diâmetro de cristalito médio de 1.440 Â ou mais, e elas foram pós que não exibiram nenhuma formação de torta nas condições testadas. A amostra de teste 28, que foi preparada a partir de uma solução da reação enzimática com um rendimento de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de até 33 % no estágio de uma reação enzimática preparada aplicando um método de resfriamento não forçado na etapa de cristalização, teve uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 99,2 %, um grau de cristalinidade de 88,0 %, e um diâmetro de cristalito médio de 1.280 Â, e ela foi considerada “transformada em torta” (+) no teste de formação de torta. Ao contrário, como fica evidente pelos resultados da amostra de teste 28c, mesmo quando o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico permanece no máximo 33 % no estágio de uma reação enzimática, um pó que não apresenta formação de torta pode ser obtido aplicando um método de resfriamento pseudocontrolado na etapa de cristalização para fazer com que ele tenha um grau de cristalinidade de pelo menos 90 % e um diâmetro de cristalito médio de 1.400 Â ou mais.

Os resultados anteriores indicam que uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que é significativamente menos propensa à formação de torta e tem um grau de cristalinidade de pelo menos 90 %, pode ser produzida a partir de uma solução da reação enzimática com um maior rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico a 35 % ou mais usando combinatoriamente uma enzima de desramificação de amido em uma reação para produzir ácido 2- glicosídeo ascórbico, independentemente do método de resfriamento usado na etapa de cristalização; e uma composição particulada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que é significativamente menos propensa à formação de torta e tem um grau de cristalinidade de pelo menos 90 %, pode ser produzida mesmo a partir de uma solução da reação enzimática com um maior rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico a cerca de 33 % como abaixo de 35 % aplicando um método de resfriamento pseudocontrolado ou método de resfriamento controlado na etapa de cristalização.

Para caracterizar CGTases adequadas para produzir ácido 2- glicosídeo ascórbico, sequências de aminoácido (SEQ ID NOs: 1, 4 e 5) de uma CGTase derivada da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus e suas enzimas mutantes, e uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 3) de uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Thermoanaerobacter thermosulfurigenes, que são adequadas para produzir ácido 2-glicosídeo ascórbico, foram comparadas com uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO:6) de uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Bacillus macerans e a (SEQ ID NO:7) de uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Paenibacillus illinoisensis, que não são adequadas para produzir ácido 2-glicosídeo ascórbico. Comparando essas sequências de aminoácido, foram usadas aquelas das CGTases derivadas da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus e um microrganismo da espécie Bacillus macerans, que foi determinado exclusivamente pelo mesmo requerente da presente invenção, revelado respectivamente na Patente Japonesa Kokai No. 135581/86, requerida pelo mesmo requerente da presente invenção. Uma sequência de aminoácido registrada em “GenBank”, uma base de dados de gene, com o número de acesso de 35484 foi usada como aquela para uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Thermoanaerobacter thermosulfurigenes. Adicionalmente, ela foi usada como a sequência de aminoácido de uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Paenibacillus illinoisensis, aquela codificada pela sequência de nucleotídeo, determinada exclusivamente pelo mesmo requerente da presente invenção depois de clonagem do gene CGTase da cepa NBRC15379 de Paenibacillus illinoisensis.

Em comparação com as sequências de aminoácido anteriores, as seguintes sequências de aminoácido parciais de (a) a (d) foram determinadas como aquelas que existem comumente em CGTases adequadas para produzir ácido 2-glicosídeo ascórbico, isto é, uma CGTase derivada da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus, suas enzimas mutantes, e uma CGTase derivada de um microrganismo da espécie Thermoanaerobacter thermosulfurigenes, mas não existem em CGTases não adequadas para produzir ácido 2-glicosídeo ascórbico, isto é, CGTases derivadas de microrganismos da espécie Bacillus macerans e Paenibacillus illinoisensis: (a) Asn-Glu-Val-Asp-X]-Asn-Asn; (b) Met-Ile-Gln-XrThr-Ala; (c) Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn-Ile; e (d) Val-Xj-Ser-Asn-Gly-Ser-Val. (Em que Xi significa Pro ou Ala, X2 significa Ser ou Asp, e X3 significa Ser ou Gly).

Com base nos resultados anteriores, revelou-se que a CGTase adequada para produzir ácido 2-glicosídeo ascórbico pelo processo de acordo com a presente invenção, isto é, CGTases, que alcançam um rendimento de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de 27 % ou mais, são caracterizadas pelo sequências de aminoácido parciais de (a) a (d) identificadas anteriormente.

Os exemplos seguintes, exemplos comparativos, e exemplos para referência explicam a presente invenção com mais detalhes, mas a presente invenção não deverá nunca ser restrita por meio disso.

Exemplo 1 <Produção da composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro>

Quatro partes em peso de amido de batata liquefeito foram adicionadas a 20 partes em peso de água, dissolvidas nelas por aquecimento, e misturadas com três partes em peso de ácido L-ascórbico, seguido por ajuste da solução resultante ao pH 5,5 para uso como uma solução de substrato. A solução de substrato foi adicionada uma solução de enzima bruta (produzida por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão) de uma CGTase derivada da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus (depositada no International Patent Organism Depositary in National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japão, com o número de acesso de FERM BP-11273) em uma quantidade de 100 unidades/g de sólido do amido de batata liquefeito, d.s.b., e reagida enzimaticamente a 55°C por 40 horas para formar ácido 2-glicosídeo ascórbico e ácidos a-glicosil-L- ascórbicos tais como ácido 2-O-a-maltosil-ascórbico, ácido 2-O-a- maltotriosil-L-ascórbico, e ácido 2-O-a-maltotetraosil-L-ascórbico.

Depois do aquecimento a solução da reação enzimática para inativar as enzima remanescentes, a solução resultante foi ajustada ao pH 4,5, misturada com “GLUCZYME AF6”, um nome de produto de uma espécime de glucoamilase (6.000 unidades/g), comercializado por Amano Enzima, Inc., Aichi, Japão, em uma quantidade de 50 unidades/g de sólido, d.s.b., do amido de batata liquefeito e tratada a 55°C em 24 horas para hidrolisar ácidos a- glicosil-L-ascórbicos em ácido 2-glicosídeo ascórbico e para hidrolisar os sacarídeos concomitantes em D-glicose. O rendimento de produção de ácido L-ascórbico 2-glicosídeo foi cerca de 28 %.

Depois de inativar a enzima remanescente por aquecimento, a solução da reação enzimática foi descolorida com um carvão ativado e filtrada, e o filtrado foi dessalgado com uma resina de troca catiônica (forma H*). Então, ácido L-ascórbico e ácido 2-glicosídeo ascórbico na solução dessalgada foram deixados adsorver em uma resina de troca aniônica (forma OH'), seguido por lavagem da resina com água para remover impurezas D- glicose antes da eluição com solução aquosa de ácido clorídrico 0,5 N. O concentrado foi concentrado para dar uma concentração de sólidos de cerca de 50 % e submetido a uma cromatografia de coluna de leito móvel simulado usando 10 colunas empacotadas com “DIAION UBK 550” (forma Na+), um nome de produto de uma resina de troca catiônica de ácido forte comercializado por Mitsubishi Chemical Corp., Tóquio, Japão. O eluado resultante foi carregado nas colunas em um nível de cerca de 1/40 vezes o volume do volume de resina úmida, seguido por alimentação nas colunas de um eluente em um nível de cerca de 5 vezes os volumes do volume carregado e sequencialmente coletando frações ricas em ácido 2-glicosídeo ascórbico, mas, pobres em ácido L-ascórbico. As frações foram agrupadas, revelando que elas contiveram 87,2 %, d.s.b., de ácido 2-glicosídeo ascórbico.

Depois que as frações agrupadas foram concentradas sob uma baixa pressão em um concentrado cerca de 76 %, que foi então colocado em um cristalizador e misturado com “ASCORBIC ACID 2-GLUCOSIDE 999” (Código No.: AG 124, uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de pelo menos 99,9 %), um nome de produto de uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, comercializado como um reagente padrão analítico por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, como um cristal semente, em um teor de dois porcento dos teores de sólidos. Então, a solução da mistura foi ajustada a 40°C e submetida a um método de resfriamento pseudocontrolado de resfriar a solução de 40°C para 30°C em 1,5 dia e então resfriá-la de 30°C para 15°C em 0,5 dia em condições de agitação suaves para precipitar ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro.

Os cristais precipitados foram coletados por uma centrífuga tipo cesta, lavados jateando neles um pequeno teor de água purificada fria, envelhecidos e secos a 38°C por três horas, resfriada soprando neles 25°C ar por 45 minutos, e pulverizado para obter uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que teve uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 99,3 %, um total ácido L-ascórbico e D- glicose teor de 0,1 %, um teor de ácido L-ascórbico menor que 0,1 %, um poder redutor de toda a composição particulada de 0,27 %, um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de 90,3 %, e um diâmetro de cristalito médio de 1.460 Â. Incidentalmente, o grau de cristalinidade anterior foi determinado pelo método de Herman usando os valores analíticos H1Oo e Ho obtidos no experimento 1-2. Quando medida quanto a distribuição de tamanho de partícula, a composição particulada conteve partículas com um tamanho de partícula menor que 150 μm em um teor de 91,0 % e aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou mais, mas menos que 150 μm em um teor de 50,7 %.

A composição particulada é facilmente manipulável em virtude de ela ser significativamente menos propensa à formação de torta e tem uma solubilidade superior em solventes hidrofílicos amplamente usados em cosméticos e quase medicamentos, comparados com um pó de grau quase medicamento convencional comercializado como um ingrediente branqueador de pele para quase medicamentos. Uma vez que a composição particulada não difere de um pó de grau quase medicamento convencional como esse em que é uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro similarmente ao pó de grau quase medicamento convencional anterior, ela pode ser usada sozinha ou em combinação com outros ingredientes como um material pulverizado para produtos alimentícios, aditivos de alimento, cosméticos, quase medicamentos, produtos farmacêuticos, etc.

Exemplo 2 <Produção da composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro>

Uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foi preparada similarmente ao exemplo 1, exceto por deixar que uma pululanase (código do produto de “EN201”, comercializado por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão) derivada de um microrganismo da espécie Klebsiella pneumoniae (Aerobacter aerogenes} aja em uma solução contendo amido liquefeito e ácido L-ascórbico em uma quantidade de cinco unidades por sólido do amido liquefeito, quando deixa CGTase agir na solução contendo amido liquefeito e ácido L-ascórbico; e empregando um método de resfriamento pseudocontrolado de resfriar a solução de 40°C para 35°C em 1,5 dia e então resfriando-a de 35°C para 15°C em 0,5 dia, quando se precipita ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro. Além disso, o rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico na solução da reação enzimática depois do tratamento com glucoamilase foi cerca de 29,5 %. O teor de ácido 2- glicosídeo ascórbico, d.s.b, na solução, que foi submetida a cristalização de ácido 2-glicosídeo ascórbico, foi 9’1,8 %.

O produto teve uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 99,5 %, um teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose de 0,1 %, um teor de ácido L-ascórbico menor que 0,1 %, um poder redutor de toda a composição particulada de 0,21 %, um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de 91,0 %, e um diâmetro de cristalito médio de 1.540 Â. Incidentalmente, o grau de cristalinidade anterior foi determinado pelo método de Herman usando os valores analíticos Hioo e Ho obtidos no experimento 1-2. Quando medida quanto a distribuição de tamanho de partícula, a composição particulada conteve partículas com um tamanho de partícula menor que 150 μm em um teor de 93,0 % e aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou mais, mas menos que 150 μm em um teor de 53,7 %.

A composição particulada é facilmente manipulável em virtude de ela ser significativamente menos propensa à formação de torta e ter uma solubilidade superior em solventes hidrofílicos amplamente usados em cosméticos e quase medicamentos, comparados com um pó de grau quase medicamento convencional comercializado como um ingrediente branqueador de pele para quase medicamentos. Uma vez que a composição particulada não difere de um pó de grau quase medicamento convencional como esse em que é uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro similarmente ao pó de grau quase medicamento convencional anterior, ela pode ser usada sozinha ou em combinação com outros ingredientes como um material pulverizado para produtos alimentícios, aditivos de alimento, cosméticos, quase medicamentos, produtos farmacêuticos, etc.

Exemplo 3 <Produção da composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro>

Cinco partes em peso de amido de milho foram adicionadas a 15 partes em peso de água e então dissolvidas por aquecimento depois da adição de uma enzima de liquefação comercializada. A solução resultante foi misturada com três partes em peso de ácido L-ascórbico e ajustada a pH 5,5 para uso como uma solução de substrato. A solução de substrato foi adicionado ‘TORUZYME 3,0L” (vide, por exemplo, Literaturas de Patente 30 e 31), um nome de produto de uma espécime de CGTase comercialmente disponível, comercializado por Novozymes Japão Ltd., Tóquio, Japão, que foi preparado recombinando um gene CGTase derivado de um microrganismo do gênero Thermoanaerobacter e deixando que o CGTase recombinante resultante expresse em um microrganismo do gênero Bacillus, em uma quantidade de 100 unidades/g de sólido do amido de milho, d.s.b., e reagida enzimaticamente a 55°C por 50 horas para formar ácido 2-glicosídeo ascórbico e outros ácidos a-glycosil-L-ascórbico.

Depois de inativar as enzimas remanescentes por aquecimento, a solução da reação enzimática foi ajustada ao pH 4,5, misturada com “GLUCOZYME #20000”, um nome de produto de uma espécime de glucoamilase com uma atividade de 20.000 unidades/g, comercializado por Nagase ChemteX Corp., Osaka, Japão, em uma quantidade de 50 unidades/g de sólido do amido de milho, d.s.b., e reagida enzimaticamente a 55°C em 24 horas para hidrolisar ácidos a-glicosil-L-ascórbico tais como ácido 2-O-a- maltosil-ascórbico, ácido 2-O-a-maltotriosil-L-ascórbico, e ácido 2-O-a- maltotetraosil-L-ascórbico em ácido 2-glicosídeo ascórbico e para hidrolisar os sacarídeos concomitantes em D-glicose. O rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico na solução da reação resultante foí cerca de 31 %.

Depois de inativar a enzima remanescente por aquecimento, a solução da reação foí descolorida com um carvão ativado e filtrada. O filtrado foi dessalgado com uma resina de troca catiônica (forma fT) e alimentado com uma resina de troca aniônica (forma OH') para adsorver por isso ácido L- ascórbico e ácido 2-glicosídeo ascórbico, seguido por lavagem da resina de troca aniônica com água para remover D-glicose e alimentação da solução de ácido clorídrico 0,5 N na resina para eluição. O eluado foi submetido a uma cromatografia de coluna usando “TOYOPEARL HW-40”, um nome de produto de uma resina porosa de Tosoh Corp., Tóquio, Japão, para coletar frações ricas em ácido 2-glicosídeo ascórbico, mas pobres em ácido L- ascórbico. As frações coletadas foram agrupadas, revelando que elas continham 88,6 %, d.s.b., de ácido 2-glicosídeo ascórbico.

As frações agrupadas foram concentradas sob uma baixa pressão em um concentrado cerca de 76 %, que foi então colocado em um cristalizador e misturado com a composição particulada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro preparada no exemplo 1, como um cristal semente, em um teor de dois porcento dos teores de sólidos. Em seguida, o concentrado foi aquecido a 40°C e submetido a um método de resfriamento pseudocontrolado de resfriar o concentrado em condições de agitação suave de 40°C para 33°C em 1,5 dia e então de 33°C para 15°C em 0,5 dia para precipitar ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro.

Os cristais foram coletados usando uma centrífuga tipo cesta, lavados jateando neles uma pequena quantidade de água destilada, envelhecendo e secando o resultante a 35°C por oito horas, resfriando o produto resultante soprando nele 25°C ar por 15 minutos, e pulverizando o produto resfriado para obter uma composição particulada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que teve uma pureza de ácido 2- glicosídeo ascórbico de 99,2 %, um teor total do ácido L-ascórbico e D- glicose menor que 0,1 %, um teor de ácido L-ascórbico menor que 0,1 %, um poder redutor de toda a composição particulada de 0,17 %, um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de 91,5 %, e um diâmetro de cristalito médio de 1.610 Â. Incidentalmente, o grau de cristalinidade anterior foi determinado pelo método de Herman usando os valores analíticos H]00 e Ho obtidos no experimento 1-2. Quando medida quanto a distribuição de tamanho de partícula, a composição particulada conteve partículas com um tamanho de partícula menor que 150 μm em um teor de 83,2 % e aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou mais, mas menos que 150 μm em um teor de 57,1 %.

Exemplo 4 <Produção da composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro>

Uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foi preparada usando o mesmo método do exemplo I, exceto pela adição de seis partes em peso de amido de milho a 15 partes em peso de água, dissolvendo o amido de milho por aquecimento depois da adição de uma enzima de liquefação comercializada, adicionando três partes em peso de ácido L-ascórbico à solução resultante, deixando que “TORUZYME 3,0L”, um nome de produto de uma CGTase comercialmente disponível, comercializado por Novozymes Japão Ltd., Tóquio, Japão, aja na solução, na qual uma espécime de isoamilase derivada de um microrganismo da espécie Pseudomonas amyloderamosa (ATCC 21262), comercializado por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, foi deixado agir na solução em uma quantidade de 500 unidades/g de sólido do amido de milho, d.s.b., e empregando um método de resfriamento pseudocontrolado de resfriar a solução de 40°C para 35°C em 24 horas e então resfriando-a de 35°C para 15°C em 12 horas, durante a precipitação do ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro. O rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico na solução da reação depois do tratamento com glucoamilase foi cerca de 32,5 %. O teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, d.s.b., na solução, que foi submetida a precipitação de ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, foi 89,6 %.

O produto teve uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 99,7 %, um teor total do ácido L-ascórbico e D-glicose menor que 0,1 %, um teor de ácido L-ascórbico menor que 0,1 %, um poder redutor de toda a composição particulada de 0,10 %, um grau de cristalinidade para ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro de 92,4 %, e um diâmetro de cristalito médio de 1.670 Â. Incídentalmente, o grau de cristalinidade anterior foi determinado pelo método de Herman usando os valores analíticos Hioo e Ho obtidos no experimento 1-2. Quando medida para distribuição de tamanho de partícula, a composição particulada conteve partículas com um tamanho de partícula menor que 150 μm em um teor de 94,5 % e aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou mais, mas menos que 150 μm em um teor de 55,3 %.

Exemplo 5 <Produção da composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro>

Cinco partes em peso de amido de milho foram adicionadas a 15 partes em peso de água e então dissolvidas nela por aquecimento depois da adição de uma enzima de liquefação comercializada. A solução resultante foi misturada com três partes em peso de ácido L-ascórbico e ajustada ao pH 5,5 para uso como uma solução de substrato. A solução de substrato foi adicionado G176R/Y452H como um mutante de uma CGTase derivado da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus usado nos experimentos 7 e 9 em uma quantidade de 100 unidades/g de sólido do amido de milho, d.s.b., e reagida enzimaticamente a 55°C por 50 horas para formar ácido 2-glicosídeo ascórbico e outros ácidos a-glicosil-L-ascórbico.

Depois de inativar as enzimas remanescentes por aquecimento, a solução da reação foi ajustada ao pH 4,5, misturada com “GLUCOZYME #20000”, um nome de produto de uma espécime de glucoamilase (20.000 unidades/g), comercializado por Nagase ChemteX Corp., Osaka, Japão, em uma quantidade de 50 unidades/g de sólido do amido de milho, d.s.b., e reagida enzimaticamente a 55°C em 24 horas para hidrolisar ácidos a-glicosil- L-ascórbico tais como ácido 2-O-a-maltosil-ascórbico, ácido 2-O-a- maltotriosil-L-ascórbico, e ácido 2-O-a-maltotetraosil-L-ascórbico em ácido 2-glicosídeo ascórbico e para hidrolisar os sacarídeos concomitantes em D- glicose. O rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico na solução da reação resultante foi cerca de 31,5 %.

Depois de inativar a enzima remanescente por aquecimento, a solução da reação foi descolorida com um carvão ativado e filtrada. O filtrado foi dessalgado com uma resina de troca catiônica (forma H+) e alimentada em uma resina de troca aniônica (forma OH’) para adsorver ácido L-ascórbico e ácido 2-glicosídeo ascórbico por isso, seguido por lavagem da resina de troca aniônica com água para remover D-glicose e alimentação da solução de ácido clorídrico 0,5 N na resina para eluição. O eluado foi alimentado em uma cromatografia de coluna usando “TOYOPEARL HW-40”, um nome de produto de uma resina porosa de Tosoh Corp., Tóquio, Japão, para coletar frações ricas em ácido 2-glicosídeo ascórbico, mas, pobres em ácido L- ascórbico. As frações coletadas foram agrupadas, revelando que elas continham 87,6 %, d.s.b., de ácido 2-glicosídeo ascórbico.

As frações agrupadas foram então colocadas em um cristalizador e misturadas com “ASCORBIC ACID 2-GLUCOSIDE 999” (Código No.: AG 124, uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de pelo menos 99,9 %), um nome de produto de uma composição particulada de grau reagente padrão contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, comercializado por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, como um cristal semente, em um teor de dois porcento dos teores de sólidos. Então, a solução da mistura foi ajustada a 40°C e submetida a um método de resfriamento pseudocontrolado de resfriar sucessivamente a solução de 40°C para 3 5°C em 24 horas, de 3 5°C para 30°C em 12 horas, e de 30°C para 15°C em 12 horas em condições de agitação suave para precipitar ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro. Os cristais foram coletados usando uma centrífuga tipo cesta, lavados jateando neles uma água purificada em um teor de cerca de cinco porcento do peso de uma massa cozida, envelhecendo e secando o resultante a 35°C por oito horas, resfriando o produto seco soprando nele 20°C de ar por 10 minutos, e pulverizando o produto resfriado para obter uma composição particulada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que teve uma pureza de ácido 2- glicosídeo ascórbico de 99,2 %, um teor total do ácido L-ascórbico e D- glicose de 0,4 %, um teor de ácido L-ascórbico menor que 0,1 %, e um poder redutor de toda a composição particulada de 0,50 %.

A composição particulada contendo produto ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro assim obtido teve um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de 90,4 %, e um diâmetro de cristalito médio de l .480 Â. O grau de cristalinidade anterior foi determinado pelo método de Herman usando os valores analíticos H|Oo e Ho obtidos no experimento 1-2. Quando a composição particulada foi medida para distribuição de tamanho de partícula, ela conteve partículas com um tamanho de partícula menor que 150 μm em um teor de 85,2 % e aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou mais, mas menos que 150 μm em um teor de 69,3 %. Quando a composição foi submetida ao mesmo teste de formação de torta do experimento 1-4, ela foi considerada “não transformada em torta” (-). Também, o produto foi considerado com “solubilidade aprovável”, quando submetido ao mesmo teste de solubilidade em 1,3- butileno glicol no experimento 6.

A composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro produzida pelo processo identificado anteriormente é pó que é significativamente menos propenso à formação de torta e é facilmente armazenável e manipulável, mesmo que a composição particulada não tenha nenhuma diferença maior comparada com “AA2G”, um nome de produto de uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, como um pó de grau quase medicamento convencional comercializado, vendido por Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Japão. Uma vez que a composição particulada é similar a um pó de grau quase medicamento convencional como esse em que é uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro e uma vez que é facilmente armazenada e manipulada, ela pode ser mais adequadamente usada como um material para produtos alimentícios, aditivos de alimento, cosméticos, quase medicamentos, produtos farmacêuticos, etc.

Exemplo 6 <Produção da composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro>

Quatro partes em peso de amido de batata liquefeito foram adicionadas a 20 partes em peso de água e então dissolvidas nela por aquecimento. A solução resultante foi misturada com três partes em peso de ácido L-ascórbico e ajustada ao pH 5,5 para uso como uma solução de substrato. A solução de substrato foi adicionada uma CGTase derivada da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus em uma quantidade de 100 unidades/g de sólido do amido, d.s.b., e “GODO-FIA”, um nome de produto de uma espécime de isoamilase derivado de um microrganismo da espécie Flavobacterium odoratus produzido por Godo Shusei Co., Ltd., Tóquio, Japão, em uma quantidade de 500 unidades/g de sólido do amido, d.s.b., e reagida enzimaticamente a 55°C por 40 horas para formar ácido 2-glicosídeo ascórbico e ácidos a-glicosil-L-ascórbico tais como ácido 2-O-a-maltosil-L- ascórbico, ácido 2-O-a-maltotriosil-L-ascórbico, e ácido maltotetraosil-L- ascórbico.

Depois de aquecida para inativar as enzimas remanescentes, a solução da reação enzimática foi ajustada ao pH 4,5, misturada com “GLUCZYME AF6”, um nome de produto de uma espécime de glucoamilase (6.000 unidades/g), comercializado por Amano Enzyme Inc., Aichi, Japão, em uma quantidade de 50 unidades/g de sólido do amido, d.s.b., e tratada por aquecimento a 55°C em 24 horas para hidrolisar ácidos a-glicosil-L-ascórbico em ácido 2-glicosídeo ascórbico e os sacarídeos concomitantes em D-glicose. O rendimento de produção de ácido L-ascórbico 2-glicosídeo na solução da reação foi cerca de 36 %.

A solução da reação foi aquecida para inativar a enzima remanescente, descolorida com um carvão ativado, filtrada, dessalgada com uma resina de troca catiônica (forma H4"), e submetida a uma resina de troca aniônica (forma OH') para adsorver por isso ácido L-ascórbico e ácido 2- glicosídeo ascórbico, seguido por lavagem da resina de troca aniônica com água para remover sacarídeos contendo D-glicose e alimentação da solução aquosa de ácido clorídrico 0,5 N para realizar a eluição. O eluado foi concentrado para dar um concentração de sólidos de cerca de 50 %, d.s.b., e submetido a uma cromatografia de coluna de leito móvel simulado usando 10 colunas empacotadas com “DIAION UBK 550” (forma Na+), um nome de produto de uma resina de troca catiônica de ácido forte comercializada pela Mitsubishi Chemical Corp., Tóquio, Japão. O eluado, que foi concentrado para dar uma concentração de sólidos de cerca de 50 %, foi carregado para as colunas em um nível de cerca de 1/40 vezes o volume do volume de resina úmida, e alimentado com um eluente em um nível de cerca de 15 vezes o volumes do volume carregado para eluir ácido 2-glicosídeo ascórbico, seguido por coleta das frações ricas em ácido 2-glicosídeo ascórbico, mas, pobres em ácido L-ascórbico. As frações foram agrupadas, revelando que elas contiveram cerca de 86,6 %, d.s.b., de ácido 2-glicosídeo ascórbico.

As frações agrupadas foram concentrada in vacuo em um concentrado cerca de 76 %, que foram então colocadas em um cristalizador e misturadas com “ASCORBIC ACID 2-GLUCOSIDE 999” (Código No.: AG 124, uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de pelo menos 99,9 %), um nome de produto de uma composição particulada de grau reagente contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, comercializado por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, como um cristal semente, em um nível de dois porcento dos teores de sólidos. Então, a solução da mistura foi ajustada a 40°C e resfriada em 48 horas, resfriando sucessivamente a solução de 40°C para 35°C em 20 horas, de 35°C para 30°C em 16 horas, e de 30°C para 15°C em 12 horas em condições de agitação suave por um método de resfriamento pseudocontrolado para cristalizar ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro. Os cristais foram coletados usando uma centrífuga tipo cesta, lavados jateando neles uma água purificada em um teor de cerca de cinco porcento do peso da massa cozida, envelhecendo e secando o resultante a 38°C por três horas, resfriando o produto resultante soprando neles 20°C ar por 45 minutos, e pulverizando o produto resfriado para obter uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que teve uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 99,5 %, d.s.b., um teor total do ácido L-ascórbico e D-glicose de 0,1 %, um teor de ácido L-ascórbico menor que 0,1 %, e um poder redutor de toda a composição particulada de 0,21 %.

A composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro obtida pelo processo identificado anteriormente teve um grau de cristalinidade para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro de 93,9 %, e um diâmetro de cristalito médio de 1.630 Â. Incidentalmente, o grau de cristalinidade anterior foi determinado pelo método de Herman usando os valores analíticos H1Oo e Ho obtidos no experimento 1-2. Quando a composição particulada foi medida para distribuição de tamanho de partícula, ela conteve partículas com um tamanho de partícula menor que 150 μm em um teor de 91,2 % e aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou mais, mas menos que 150 μm em um teor de 57,3 %. Quando a composição foi submetida ao mesmo teste de formação de torta do experimento 1-4, ela foi considerada “não transformada em torta” (-). Também, quando o produto foi submetido ao mesmo teste de solubilidade em 1,3-butileno glicol no experimento 6, ele foi considerado “solubilidade aprovável”.

A composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro é um pó que é significativamente menos propenso à formação de torta, comparado com um pó de grau quase medicamento convencional, e ele pode ser vantajosamente usado como um material para produtos alimentícios, aditivos de alimento, cosméticos, quase medicamentos, produtos farmacêuticos, etc.

Exemplo 7 <Produção da composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro>

Uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foi produzida similarmente ao exemplo 6, exceto pelo uso, na reação de produção para ácido 2-glicosídeo ascórbico, de “TORUZYME 3,0L”, um nome de produto de uma CGTase recombinante, comercializada pela Novozymes Japan Ltd., Tóquio, Japão, preparada de uma CGTase derivada de um microrganismo do gênero Thermoanaerobacter, e “PROMOZYME”, um nome de produto de uma espécime de pululanase derivada de um microrganismo da espécie Bacillus acidopullulyticus, comercializado por Novozymes Japão Ltd., Tóquio, Japão, como uma enzima de desramifícação de amido para ser usada em combinação com a CGTase, em uma quantidade de 50 unidades/g de sólido do amido, d.s.b.; e, na etapa de cristalização, aplicando um método de resfriamento pseudocontrolado de resfriar a solução da reação enzimática de 40°C para 15°C em 48 horas por cinco etapas, isto é, resfriar sequencialmente a solução de 40°C para 38°C em 12 horas, de 38°C para 35°C em 12 horas, de 35°C para 30°C em oito horas, de 30°C para 23°C em oito horas, e então de 23°C para 15°C em oito horas. A composição particulada teve, com base em material sólido e seco, um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 99,3 %, um teor total do ácido L-ascórbico e D-glicose de 0,1 %, um teor de ácido L-ascórbico menor que 0,1 %, e um poder redutor de toda a composição particulada de 0,28 %. Este processo proporcionou um rendimento de produção de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 32.9 % na solução da reação depois do tratamento com glucoamilase. O teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, d.s.b, na solução, que foi submetida a cristalização de ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, foi 86,4 %.

A composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro teve um grau de cristalinidade para ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro de 96,4 %, e teve um diâmetro de cristalito médio de 1.570 Â. Incidentalmente, o grau de cristalinidade anterior foi determinado pelo método de Herman usando os valores analíticos H1Oo e Ho obtidos no experimento 1-2. Quando a composição particulada foi medida para distribuição de tamanho de partícula, ela conteve partículas com um tamanho de partícula menor que 150 μm em um teor de 92,2 % e aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou mais, mas menos que 150 μm em um teor de 54,8 %. Quando a composição foi submetida ao mesmo teste de formação de torta do experimento 1-4, ela foi considerada “não transformada em torta” (-). Também, o produto foi considerado com “solubilidade aprovável”, quando submetido ao mesmo teste de solubilidade em 1,3- butileno glicol do experimento 6.

A composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro produzida pelo processo identificado anteriormente é um pó que é signifícativamente menos propenso à formação de torta e é facilmente armazenável e manipulável ainda embora a composição particulada não tem nenhuma diferença maior comparada com “AA2G”, um nome de produto de uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, como um pó de grau quase medicamento convencional comercializado, vendido por Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Japão.

Uma vez que a composição particulada é similar a um pó de grau quase medicamento convencional como esse em que é uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro e uma vez que é facilmente armazenada e manipulada, ela pode ser mais adequadamente usada como um material para produtos alimentícios, aditivos de alimento, cosméticos, quase medicamentos, produtos farmacêuticos, etc.

Exemplo 8 <Produção da composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro>

Uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foi produzida similarmente ao exemplo 3, exceto pelo uso de um circulador constante programado com propósito geral para sistema de cristalização na etapa de cristalização para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, e aplicando um método de resfriamento controlado de resfriar a solução da reação de 40°C para 15°C por 48 horas por um perfil resfriamento de 20 etapas próximo ou idêntico à fórmula [7] de tal maneira a alimentar um carreador de calor controlado pela temperatura na camisa de um cristalizador. A composição particulada assim obtida teve, com base em material sólido e seco, um teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 99,6 %, um teor total do ácido L-ascórbico e D-glicose de 0,1 %, um teor de ácido L-ascórbico menor que 0,1 %, e um poder redutor de toda a composição particulada de 0,17 %. Esta produção proporcionou um rendimento de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de cerca de 31 % na solução da reação depois do tratamento com glucoamilase. O teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, d.s.b., na solução, que foi submetida a cristalização de ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro, foi 88,7 %.

A composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro teve um grau de cristalinidade para ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro de 93,0 %, e teve um diâmetro de cristalito médio de 1.650 Â. Incidentalmente, o grau de cristalinidade anterior foi determinado pelo método de Herman usando os valores analíticos Hioo e Ho obtidos no experimento 1-2. Quando a composição particulada foi medida quanto à distribuição de tamanho de partícula, ela conteve partículas com um tamanho de partícula menor que 150 μm em um teor de 90,4 % e aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou mais, mas menos que 150 μm em um teor de 65,3 %. Quando a composição foi submetida ao mesmo teste de formação de torta do experimento 1-4, ela foi considerada “não transformada em torta” (-). Também, o produto foi considerado com “solubilidade aprovável”, quando submetido ao mesmo teste de solubilidade em 1,3- butileno glicol do experimento 6.

A composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro produzida pelo processo identificado anteriormente é um pó que é significativamente menos propenso à formação de torta e é facilmente armazenável e manipulável, embora a composição particulada não tem nenhuma diferença maior comparada com “AA2G”, um nome de produto de uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, como um pó de grau quase medicamento convencional comercializado, vendido por Hayashibara Shojí, Co., Ltd., Okayama, Japão.

Uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foi preparada similarmente ao exemplo 1, exceto pelo uso de um método de resfriamento não forçado convencional sem aplicar um método de resfriamento pseudocontrolado na etapa de cristalização para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro. A composição particulada assim obtida teve, com base em material sólido e seco, um teor de ácido 2- glicosídeo ascórbico de 98,6 %, um teor total do ácido L-ascórbico e D- glicose de 0,5 %, um teor de ácido L-ascórbico menor que 0,3 %, e um poder redutor de toda a composição particulada de 0,72 %. Esta produção proporcionou um rendimento de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de cerca de 28,4 % na solução da reação depois do tratamento com glucoamilase, e o teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, d.s.b., na solução, que foi submetida a precipitação de ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, foi 86,5 %.

A composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro teve um grau de cristalinidade para ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro de 87,5 %, e teve um diâmetro de cristalito médio de 1.290 Â. Incidentalmente, o grau de cristalinidade anterior foi determinado pelo método de Herman usando os valores analíticos H]QO e Ho obtidos no experimento 1-2. Quando a composição particulada foi medida quanto a distribuição de tamanho de partícula, ela conteve partículas com um tamanho de partícula menor que 150 μm em um teor de 74.8 % e aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou mais, mas menos que 150 μm em um teor de 68,6 %. Quando a composição foi submetida ao mesmo teste de formação de torta do experimento 1 -4, ela foi considerada “transformada em torta” (+). Também, quando o produto foi submetido ao mesmo teste de solubilidade em 1,3-butileno glicol do experimento 6, ele foi considerado “solubilidade aprovável”.

Uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro foi preparada similarmente ao exemplo 3, exceto pelo uso de um método de resfriamento não forçado convencional sem aplicar um método de resfriamento pseudocontrolado na etapa de cristalização para ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro. A composição particulada assim obtida teve, com base em material sólido e seco, um teor de ácido 2- glicosídeo ascórbico de 98,3 %, um teor total do ácido L-ascórbico e D- glicose de 0,6 %, um teor de ácido L-ascórbico menor que 0,4 %, e um poder redutor de toda a composição particulada de 0,85 %. Esta produção proporcionou um rendimento de produção do ácido 2-glicosídeo ascórbico de cerca de 30,5 % na solução da reação depois do tratamento com glucoamilase, e o teor de ácido 2-glicosídeo ascórbico, d.s.b., na solução, que foi submetida a cristalização de ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, foi 87,8 %.

A composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro teve um grau de cristalinidade para ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro de 88,6 %, e teve um diâmetro de cristalito médio de 1,310 Â. Incidentalmente, o grau de cristalinidade anterior foí determinado pelo método de Herman usando os valores analíticos Hioo e HQ obtidos no experimento 1-2. Quando a composição particulada foi medida para distribuição de tamanho de partícula, ela conteve partículas com um tamanho de partícula menor que 150 μm em um teor de 76,5 % e aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou mais, mas menos que 150 μm em um teor de 68,4 %. Quando a composição foi submetida ao mesmo teste de formação de torta do experimento 1-4, ela foi considerada “transformada em torta” (+). Também, quando o produto foi submetido ao mesmo teste de solubilidade em 1,3-butileno glicol do experimento 6, ele foi considerado “solubilidade aprovável”.

Cinco partes em peso de amido de batata foram adicionadas a partes em peso de água e então dissolvidas nela por aquecimento depois da adição de uma enzima de liquefação comercializada. A solução resultante foi misturada com três partes em peso de ácido L-ascórbico e ajustada ao pH 5,5 para uso como uma solução de substrato. A solução de substrato foi adicionada uma CGTase derivada da cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus (depositada no International Patent Organism Depositary in National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 3058566 Japão, com o número de acesso de FERM BP-11273) e uma isoamilase, produzida por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, nas respectivas quantidades de 100 unidades e 1.000 unidades/g de sólido do amido de batata, d.s.b., e reagida a 55°C por 50 horas para formar ácido 2- glicosídeo ascórbico e outros ácidos a-glicosil-L-ascórbico. Depois de inativar as enzimas remanescentes por aquecimento, a solução da reação foi ajustada ao pH 4,5, misturada com “GLUCOZYME #20000”, um nome de produto de uma espécime de glucoamilase com uma atividade de 20.000 unidades/g, comercializado por Nagase ChemteX Corp., Osaka, Japão, em uma quantidade de 50 unidades/g de sólido do amido de batata, d.s.b., e reagida enzimaticamente a 55°C em 24 horas para hidrolisar ácidos a-glicosil- L-ascórbico em ácido 2-glicosídeo ascórbico e para hidrolisar os sacarídeos concomitantes em D-glicose. O rendimento de produção de 2-glicosídeo ascórbico na solução da reação resultante foi cerca de 38 %.

Depois de aquecida para inativar a enzima remanescente, a solução da reação foi descolorida com um carvão ativado e filtrada. O filtrado foi dessalgado com uma resina de troca catiônica (forma H+) e alimentada em uma resina de troca aniônica (forma OH') para adsorver ácido L-ascórbico e ácido 2-glicosídeo ascórbico, seguido por lavagem da resina de troca aniônica com água para remover D-glicose e alimentação da solução de ácido clorídrico 0,5 N na resina para realizar a eluição. O eluado foi alimentado em uma cromatografía de coluna usando “TOYOPEARL HW-40”, um nome de produto de uma resina porosa de Tosoh Corp., Tóquio, Japão, para coletar frações ricas em ácido 2-glicosídeo ascórbico, mas, pobres em ácido L- ascórbico. As frações coletadas foram agrupadas, revelando que elas contiveram 87,6 %, d.s.b., de ácido 2-glicosídeo ascórbico.

As frações agrupadas foram concentradas in vacuo em um concentrado cerca de 76 %, que foi então colocado em um cristalizador e misturado com a composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro preparada no exemplo 1, como um cristal semente, em um nível de dois porcento dos teores de sólidos. Em seguida, a mistura resultante foi aquecida a 40°C e submetida a um método de resfriamento não forçado de resfriar a mistura a 15°C por dois dias em condições de agitação suave para precipitar ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro. Os cristais foram coletados usando uma centrífuga tipo cesta, lavados jateando neles uma pequena quantidade de água destilada, envelhecendo e secando o resultante a 35°C por oito horas, resfriando o produto resultante soprando neles 20°C de ar por 10 minutos, e pulverizando o produto resfriado para obter uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que teve uma pureza de ácido 2-glicosídeo ascórbico de 98,5 %, um teor total do ácido L-ascórbico e D-glicose menor que 0,1 %, um teor de ácido L-ascórbico menor que 0,1 %, um poder redutor de toda a composição particulada de 0,15 %, um grau de cristalinidade para ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro de 91,8 %, e um diâmetro de cristalito médio de 1.320 Â. Incidentalmente, o grau de cristalinidade anterior foi determinado pelo método de Herman usando os valores analíticos Hioo e Ho obtidos no experimento 1-2. Quando a composição particulada foi medida quanto a distribuição de tamanho de partícula, ela conteve partículas com um tamanho de partícula menor que 150 μm em um teor de 83,0 % e aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou mais, mas menos que 150 μm em um teor de 57.7 %. Quando a composição foi submetida ao mesmo teste de formação de torta, teste de estabilidade de armazenamento, e teste de solubilidade como nos respectivos experimentos 1-4, 3-2, e 6, ela foi considerada “não transformada em torta” (-) no teste de formação de torta e no teste de estabilidade de armazenamento, mas considerada “solubilidade reprovável” (-) no teste de solubilidade.

Aplicabilidade Industrial

Conforme descrito anteriormente de acordo com o processo para produzir uma composição particulada contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro, uma composição particulada contendo ácido 2- glicosídeo ascórbico cristalino anidro, que é significativamente menos propensa à formação de torta, comparada com pós de grau quase medicamento convencionais, pode ser produzida usando tanto amido quanto dextrina e ácido L-ascórbico como materiais e aplicando um método de resfriamento controlado ou método de resfriamento pseudocontrolado na etapa de cristalização, mesmo quando o rendimento de produção de ácido 2- glicosídeo ascórbico em uma solução da reação enzimática não atinge 35 %. Conforme descrito anteriormente, o processo de acordo com a presente invenção expande a faixa de escolhas para enzimas usadas e permite produzir mais efetivamente composições particuladas contendo ácido 2-glicosídeo ascórbico cristalino anidro em uma escala industrial usando, como materiais, tanto amido quanto dextrina e ácido L-ascórbico que são recursos finitos; e assim, ele tem uma utilidade industrial particular.

Explicação dos Símbolos

Na FIG. 1, os símbolos “a” até “e” significam o seguinte: a: Um pico de difração a um ângulo de difração (20) de 10,4 ° (índice de Miller (hkl): 120) para uso no cálculo de diâmetro de cristalito; b: Um pico de difração a um ângulo de difração (20) de 13,2 ° (índice de Miller (hkl): 130) para uso no cálculo do diâmetro de cristalito; c: Um pico de difração a um ângulo de difração (2θ) de 18,3 ° (índice de Miller (hkl):230) para uso no cálculo do diâmetro de cristalito; d: Um pico de difração a um ângulo de difração (2θ) de 21,9 0 (índice de Miller (hkl):060) para uso no cálculo do diâmetro de cristalito; e e: Um pico de difração a um ângulo de difração (2θ) de 22,6 ° (índice de Miller (hkl): 131) para uso no cálculo do diâmetro de cristalito, Na FIG. 5, os símbolos seguintes significam o seguinte: pUC ori : Uma origem de replicação de plasmídeo pUC; T7 : Promotor T7; Seta branca (Amp) : Um gene resistente a ampicilina; e Seta preta: Um gene CGTase. Na FIG. 6, os símbolos “um” até “c” significam o seguinte: a : Curva de resfriamento controlado; b : Resfriamento linear; e c : Curva de resfriamento não forçado.

Claims

1. Processo para produzir uma composição particulada compreendendo ácido 2.O-a-D-glucosil-L-ascórbico cristalino anidro, caracterizado por o dito processo compreender as seguintes etapas (a) a (e): (a) incubar uma solução aquosa que compreende ciclomaltodextrina glucanotransferase, ácido L-ascórbico, amido liquefeito ou, dextrina para obter uma mistura de reação e, em seguida, incubar ainda mais a mistura de reação junto com glucoamilase para obter uma solução resultante com um teor de ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico de pelo menos 27 % em peso em uma base seca; (b) purificar a solução resultante compreendendo ácido 2-O-a-Dglucosil- L-ascórbico por meio de cromatografia de coluna usando uma resina de troca aniônica como um material de empacotamento da coluna e uma cromatografia de coluna de leito móvel simulado usando uma resina de troca catiônica de ácido forte como um material de empacotamento da coluna alcançando um teor de ácido 2-O-a-D-glucosil-L ascórbico acima de 86 % em peso, em uma base sólida seca; (c) cristalizar ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico da solução purificada com um teor de ácido 2-O-a-Dglucosil-L-ascórbico acima de 86% em peso, em base sólida seca na presença de cristais de sementes na quantidade de 0,1% a 5,0% por um método de resfriamento controlado ou método de resfriamento pseudocontrolado; (d) coletar os cristais do ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico por meio de centrifugação utilizando uma centrífuga do tipo cesta; (e) envelhecer e secar por um período entre 5 a 24 horas a uma temperatura de 20 a 55°C e uma umidade relativa de 60 a 90 %, os cristais de ácido 2-O-a-D glucosil-L-ascórbico sem dissolver e recristalizá-lo obtendo uma composição particulada compreendendo cristais de ácido 2-O-a-D-glucosil-L- ascórbico que compreende ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico em um teor, com base em material sólido e seco, acima de 98,0 % em peso, mas abaixo de 99,9 % em peso, e tem um grau de cristalinidade para ácido 2-O-a-D-glucosil-L- ascórbico cristalino anidro de pelo menos 90 %, quando calculado com base no perfil de difração de raios-X em pó da composição particulada; em que o método de resfriamento controlado é um método de resfriamento em que a temperatura T da solução no tempo t é expressa pela fórmula: T=To-(To-Tf) (t/T)3 em que T é o tempo de operação estabelecido para a etapa de cristalização, To é a temperatura da solução no início da cristalização, e Tf é a temperatura alvo do líquido no término da cristalização; e em que o método de resfriamento pseudocontrolado é um método de resfriamento em que a temperatura do líquido T é permitida para diminuir linearmente ou escalonadamente com tempo t tal que (TO - Tm) é pelo menos 5% e menor que 50% da mudança de temperatura total (TO-Tf), em que Tm é a temperatura do líquido no tempo t=T/2.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na etapa (a) uma enzima de desramificação de amido poder agir naturalmente nos ditos materiais junto com a dita ciclomaltodextrina glucanotransferase.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado por a dita ciclomaltodextrina glucanotransferase ser uma que compreende as seguintes sequências de aminoácido parciais de (a) a (d): (a) Asn-Glu-Val-Asp-X1 -Asn-Asn; (b) Met-Ile-Gln-Xz-Thr-Ala; (c) Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn--Ile; e (d) Val-X3-Ser-Asn-Gly-Ser-Val, em que X1 significa Pro ou Ala, X2 significa Ser ou Asp, e X3 significa Ser ou Gly, respectivamente.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a dita ciclomaltodextrina glucanotransferase ser uma enzima natural ou recombinante derivada de um microrganismo da espécie Geobacillus stearothermophilus ou Thermoanaerobacter thermosulfurigenes.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a dita ciclomaltodextrina glucanotransferase ser uma que compreende qualquer uma das sequências de aminoácido da SEQ ID NOs: 1, 3, 4 e 5.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a composição particulada obtida, compreendendo ácido 2-O- a-D-glucosil-L-ascórbico cristalino anidro, contém ácido L-ascórbico e/ou D- glicose derivado dos ditos materiais; contém o dito ácido L-ascórbico em um teor de 0,1 % em peso ou menos, com base no material sólido e seco; e tem um poder redutor de toda a composição particulada menor que 1 % em peso.