KR101957665B1 - 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 35질량%에 미치지 못하는 경우일지라도, 유의적으로 고결되기 어려운 분말을 제조하는 것을 가능하게 하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명은 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 포함하는 용액에 CGTase를 작용시키고, 그 다음 글루코아밀라아제를 작용시켜 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 27질량% 이상인 용액을 얻는 공정; 얻어진 용액을 정제하여 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 86질량% 초과로 하는 공정; 제어냉각법 또는 의사 제어냉각법에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 석출시키는 공정; 석출한 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 채취하여 숙성 건조시키는 공정을 포함하는, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조방법을 제공함으로써 해결한다.

Description

2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING 2-O-α-D-GLUCOSYL-L-ASCORBIC ACID ANHYDROUS CRYSTAL-CONTAINING POWDER}
본 발명은 2-0-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 종래품에 비해 유의적으로 고결(固結)되기 어려운 2-0-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말의 제조방법에 관한 것이다.
L-아스코르빈산은 그 뛰어난 생리활성이나 항산화작용 때문에, 종래부터 음식품, 화장품 등을 포함하여 여러 가지 용도로 사용되고 있다. 그러나, L-아스코르빈산은 직접 환원성 때문에 불안정하며, 쉽게 산화분해되고, 생리활성을 쉽게 잃어버린다는 큰 결점을 가지고 있다. 이 L-아스코르빈산의 결점을 해소하기 위하여, 본 출원인은 특허문헌 1에서 공동출원인 중 한 사람으로서, L-아스코르빈산의 2위치의 수산기에 1분자의 D-글루코오스가 결합한 2-0-α-D-글루코실-L-아스코르빈산(이하, 본 명세서에서는 '아스코르빈산 2-글루코시드'로 약칭함)을 개시하였다. 이 아스코르빈산 2-글루코시드는 직접 환원성을 나타내지 않고 안정적이며, 또한, 생체 내에서는 생체 내에 원래 존재하는 효소에 의해 L-아스코르빈산과 D-글루코오스로 분해되어 L-아스코르빈산 본래의 생리활성을 발휘한다는 획기적인 특성을 가지고 있다. 특허문헌 1에 개시된 제조방법에 따르면, 아스코르빈산 2-글루코시드는 L-아스코르빈산과 α-글루코실 당화합물을 함유하는 용액에 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제(이하 'CGTase'로 약칭함) 또는α-글루코시다아제 등의 당전이효소를 작용시킴으로써 생성된다.
또한, 본 출원인은 특허문헌 2에서, 아스코르빈산 2-글루코시드의 과포화 용액으로부터 아스코르빈산 2-글루코시드의 결정을 석출시키는 것에 성공하였고, 결정 아스코르빈산 2-글루코시드와 그것을 포함하는 아스코르빈산 2-글루코시드 결정 함유 분말을 개시하였다. 또한, 본 출원인은 비특허문헌 1에서, 대량 스케일의 아스코르빈산 2-글루코시드 고함유물의 제조방법을 개시하고 있다. 또한, 아스코르빈산 2-글루코시드 결정으로서는 현재 무수결정밖에 알려져 있지 않다. 그리고 비특허문헌 2 및 3에는 아스코르빈산 2-글루코시드 결정에 관해 X선에 의한 구조 해석의 결과가 보고되어 있다.
또한, 본 출원인은 특허문헌 3 및 4에서, 효소반응에 의해 생성된 아스코르빈산 2-글루코시드를 함유하는 용액을, 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 제공하여 아스코르빈산 2-글루코시드의 고함유 분획을 채취하는 아스코르빈산 2-글루코시드 고함유물의 제조방법을 개시하였다. 또, 본 출원인은 특허문헌 5에서는 효소반응에 의해 생성된 아스코르빈산 2-글루코시드를 함유하는 용액으로부터 음이온 교환막을 사용하는 전기투석에 의해 L-아스코르빈산이나 당류 등의 협잡물을 제거하는 아스코르빈산 2-글루코시드 고함유물의 제조방법을 개시하고, 특허문헌 6에서는 아스코르빈산 2-글루코시드를 함유하는 용액을 음이온 교환수지와 접촉시켜서, 음이온 교환수지에 흡착된 성분을 선택적으로 탈착시켜 아스코르빈산 2-글루코시드의 고함유 분획을 얻는 아스코르빈산 2-글루코시드 고함유물의 제조방법을 개시하였다.
또한, 특허문헌 7 내지 11에는 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus, 현재는 지오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus)로 분류된다) 유래의 CGTase와 그 CGTase 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열, 염기서열로부터 결정된 아미노산 서열, 그리고 인위적으로 변이를 도입하여 제작한 변이체 CGTase와 그를 이용한 당질의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 비특허문헌 4 및 5에는 전분질과 L-아스코르빈산을 포함하는 용액에 바실러스 스테아로써모필루스 유래 CGTase를 작용시키고, 그 다음 글루코아밀라아제를 작용시킴으로써 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성시킨 것이 개시되어 있다.
또한, 본 출원인은 특허문헌 12에서, L-아스코르빈산과 α-글루코실 당화합물을 함유하는 용액에 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소, 또는, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 CGTase를 작용시켜서 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성시키는 아스코르빈산 2-글루코시드의 제조방법을 개시하였다. 또, 본 출원인에 의한 특허문헌 13 및 14에는 각각 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소가 L-아스코르빈산으로의 당 전이를 촉매하여 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성하는 것이 개시되어 있다.
또한, 아스코르빈산 2-글루코시드의 용도에 관해서는, 예를 들면 특허문헌 15 내지 34에 나타낸 바와 같이 다수의 제안이 이루어지고 있다. 아스코르빈산 2-글루코시드는 그 뛰어난 특성 때문에 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재 혹은 의약품 소재로서, 종래부터의 L-아스코르빈산의 용도는 물론, L-아스코르빈산이 불안정하기 때문에 종래에는 L-아스코르빈산을 사용할 수가 없었던 그 이외의 용도에도 널리 사용되기에 이르렀다.
상술한 바와 같이, 아스코르빈산 2-글루코시드는 현재, L-아스코르빈산과 전분질을 원료로 하여 여러 가지의 당 전이 효소를 사용하여 제조할 수 있음이 알려져 있다. 그러나, 본 출원인이 지금까지 얻은 지견(知見)에 따르면, 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 함유하는 용액에 당 전이 효소로서 CGTase를 작용시키는 방법이, 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 가장 높고 공업적으로 우수한 방법이다. 이와 같은 지견에 기초하여, 본 출원인은 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 함유하는 용액에 CGTase를 작용시키는 방법에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조하고, 이것을 화장품·의약부외품 소재 및 식품 소재, 식품첨가물 소재로 사용하여, 각각 상품명 'AA2G'(주식회사 하야시바라생물화학연구소 판매) 및 상품명 '아스코프레쉬'(주식회사 하야시바라상사 판매)로 판매하고 있다(이하, 이들 화장품·의약부외품 소재, 식품 소재 및 식품첨가물 소재로서 판매되고 있는 종래의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 '의약부외품급의 분말'로 약칭함).
그러나 의약부외품급의 분말은 제품 규격상의 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도가 98.0질량% 이상으로 비교적 고순도이며, 제조 직후에는 분말로서의 양호한 유동성을 구비하고 있음에도 불구하고, 고온, 고습의 환경 하에 장기간 두면, 자중이나 흡습으로 인해 고결된다는 결점을 가지고 있다. 이와 같은 결점을 감안하여, 의약부외품급의 분말은 10kg씩 폴리에틸렌제 봉지에 담아 건조제와 함께 뚜껑 달린 스틸캔에 넣은 상품형태로 판매되고 있는데, 본 발명자들이 얻은 그 후의 지견에 따르면, 이와 같은 상품형태일지라도 의약부외품급의 분말은 보존기간이 장기간에 이르면, 때때로 고결되어 분말로서의 유용성이 손상된다는 문제점을 가지고 있다. 화장품 소재나 의약부외품 소재, 또는 식품 소재, 식품첨가물 소재로서 사용되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 고결되면, 본래 원료 소재가 유동성을 갖는 분말인 것을 전제로 제조 플랜트가 설계되어 있는 경우에는 원료 소재의 수송이나 체질, 혼합 등의 공정에 지장을 초래할 우려가 있다.
한편, 본 출원인이 분석용 표준시약으로서 판매하고 있는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말(상품명 '아스코르빈산 2-글루코시드 999', 코드 번호: AG124, 주식회사 하야시바라생물화학연구소 판매)(이하 '시약급의 분말'로 약칭한다)(비특허문헌 6 참조)은 의약부외품급의 분말이 고결되는 조건 하에서도 고결되지 않고, 분말로서의 성상을 유지하고 있다. 이 시약급의 분말은 의약부외품급의 분말과 마찬가지로, L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 CGTase를 작용시키는 공정을 거쳐, 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 정제, 농축하여, 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수 결정을 석출시키고, 이를 채취함으로써 제조되는 분말이지만, 통상의 공정에 더하여, 일단 얻어진 결정을 용해시켜 재차 결정을 석출시키는 재결정공정이나, 재결정공정에서 얻어진 결정을 순수 등을 이용하여 반복 세정하는 세정공정을 추가함으로써, 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도를 99.9질량% 이상이라는 매우 고순도의 레벨로까지 높인 점에서, 의약부외품급의 분말과는 달랐다. 따라서, 의약부외품급의 분말에서도, 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도를 99.9질량% 이상으로까지 높이면 고결되기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 얻어지는 것은 아닌가라고 추측된다.
그러나 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도를 99.9질량% 이상이라는 고순도로 하기 위해서는 상술한 바와 같이 통상의 제조공정에 더해 재결정공정이나 순수 등을 이용한 반복적인 세정공정을 추가할 필요가 있고, 제조에 필요한 시간과 노력이 늘어날 뿐만 아니라, 재결정 공정이나 세정공정에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 손실을 피할 수 없어 제품의 수율이 저하되며, 제품 비용이 대폭 상승한다는 단점이 있다. 이 때문에, 의약부외품급의 분말보다도 고결되기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻는 것을 목적으로 하여 단순히 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도를 99.9질량% 이상으로까지 높인다는 선택지는 현실적이지 못하다. 또한, 본 발명자들의 지견에 따르면, 시약급의 분말에는 1,3-부틸렌글리콜 수용액 등의 화장품 및 의약부외품에 일반적으로 사용되는 친수성 용매와 혼합한 경우에 용해성이 떨어진다는 결점이 있다.
이와 같은 상황 하에서, 본 출원인은 여러 가지 시행착오를 거듭한 결과, 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 함유하는 용액에 CGTase를 작용시키고, 그 다음 글루코아밀라아제를 작용시키는 제조방법에 있어서, 효소 반응에 의해 얻어지는 반응용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률을 35질량% 이상으로 높일 경우에는 일단 채취한 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 용해, 재결정하는 일 없이, 종래의 의약부외품급의 분말을 제조하는 것과 거의 동일한 공정에 의해, 종래의 의약부외품급의 분말보다도 유의적으로 고결되기 어려운 분말을 제조할 수 있음을 발견하여, 특허문헌 35에 개시하였다. 그러나 상기의 제조방법에서, 효소 반응에 의해 얻어지는 반응용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률을 35질량% 이상으로까지 높이기 위해서는 한정된 특정의 CGTase를 단독으로 또는 이소아밀라아제 등의 전분 절지 효소(starch debranching enzymes)와 병용하여 사용할 필요가 있어, 제조방법으로서의 범용성이 결여된다는 단점이 있다.
특허문헌 1: 일본특허공개 평3-139288호 공보 특허문헌 2: 일본특허공개 평3-135992호 공보 특허문헌 3: 일본특허공개 평3-183492호 공보 특허문헌 4: 일본특허공개 평5-117290호 공보 특허문헌 5: 일본특허공개 평5-208991호 공보 특허문헌 6: 일본특허공개 제2002-088095호 공보 특허문헌 7: 일본특허공개 소50-63189호 공보 특허문헌 8: 일본특허공개 소63-39597호 공보 특허문헌 9: 일본특허공개 평5-244945호 공보 특허문헌 10: 국제공개 WO96033267호 팜플렛 특허문헌 11: 국제공개 WO99015633호 팜플렛 특허문헌 12: 일본특허공개 제2004-065098호 공보 특허문헌 13: 국제공개 WO02010361호 팜플렛 특허문헌 14: 국제공개 WO01090338호 팜플렛 특허문헌 15: 국제공개 WO05087182호 팜플렛 특허문헌 16: 일본특허공개 평4-046112호 공보 특허문헌 17: 일본특허공개 평4-182412호 공보 특허문헌 18: 일본특허공개 평4-182413호 공보 특허문헌 19: 일본특허공개 평4-182419호 공보 특허문헌 20: 일본특허공개 평4-182415호 공보 특허문헌 21: 일본특허공개 평4-182414호 공보 특허문헌 22: 일본특허공개 평8-333260호 공보 특허문헌 23: 일본특허공개 제2005-239653호 공보 특허문헌 24: 국제공개 WO06033412호 팜플렛 특허문헌 25: 일본특허공개 제2002-326924호 공보 특허문헌 26: 일본특허공개 제2003-171290호 공보 특허문헌 27: 일본특허공개 제2004-217597호 공보 특허문헌 28: 국제공개 WO05034938호 팜플렛 특허문헌 29: 일본특허공개 제2006-225327호 공보 특허문헌 30: 국제공개 WO06137129호 팜플렛 특허문헌 31: 국제공개 WO06022174호 팜플렛 특허문헌 32: 일본특허공개 제2007-063177호 공보 특허문헌 33: 국제공개 WO06132310호 팜플렛 특허문헌 34: 국제공개 WO07086327호 팜플렛 특허문헌 35: 국제공개 WO2011/027790호 팜플렛
비특허문헌 1: 『산요기술잡지』, 제45권, 1호, 63-69페이지(1997년) 비특허문헌 2: 만다이 타카히코 등, 『Carbohydrate Research』, 제232권, 197~205 페이지(1992년) 비특허문헌 3: 이노우에 유타카 등, 『International Journal of Pharmaceutics』, 제331권, 38~45 페이지(2007년) 비특허문헌 4: 『Applied Biochemistry and Microbiology』, 제143권, 1호, 36~40페이지(2007년) 비특허문헌 5: 『Agricultural and Biological Chemistry』, 제7권, 1751~1756페이지(1991년) 비특허문헌 6: 『Wako Analytical Circle』, 29호, 6페이지(2003년)
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 이루어진 것으로, 효소 반응에 의해 얻어지는 반응용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 35질량%를 만족하지 못하는 경우이더라도, 의약부외품급의 분말에 비해 유의적으로 고결되기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조하는 것을 가능하게 하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
상기의 과제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조방법에 대해 더 연구를 거듭하여 여러 가지 시행착오를 반복한 결과, 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액으로부터 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시킬 때에 후술의 제어냉각법 또는 의사 제어냉각법을 적용함으로써, 효소 반응에 의해 얻어지는 반응용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 35질량%를 충족하지 못하는 레벨이더라도, 의약부외품급의 분말에 비해 유의적으로 고결되기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을, 종래부터 수행되고 있는 의약부외품급 분말의 제조방법과 거의 차이가 없는 공정으로 제조할 수 있음을 발견하였다.
즉, 본 발명은 하기 (가) 내지 (마)의 공정을 포함하는, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조방법을 제공함으로써 상기의 과제를 해결하는 것이다:
(가) 원료로서 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 포함하는 용액에 CGTase를 작용시키고, 그 다음 글루코아밀라아제를 작용시켜 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 27질량% 이상인 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 얻는 공정;
(나) 얻어진 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 정제하여 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 무수물 환산으로 86질량% 초과로 하는 공정;
(다) 아스코르빈산 2-글루코시드를 무수물 환산으로 86질량% 초과 함유하는 용액으로부터 제어냉각법 또는 의사 제어냉각법에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 석출시키는 공정;
(라) 석출한 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 채취하는 공정; 및
(마) 채취된 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 용해, 재결정화하지 않고, 숙성, 건조시키며, 필요에 따라 분쇄함으로써, 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.0질량% 초과, 99.9질량% 미만 함유하며, 분말 X선 회절 프로파일에 기초하여 산출되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90%이상인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻는 공정.
이와 같이 본 발명의 제조방법에 따르면, 효소 반응에 의해 얻어지는 반응용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 35질량%에 이르지 못하는 레벨일지라도, 적어도 27질량% 이상이면, 상기 반응용액을 적절히 정제하여 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 용액으로부터 후술의 제어냉각법 또는 의사 제어냉각법에 의해 아스코르빈산의 무수결정을 석출시킴으로써, 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.0질량% 초과, 99.9질량% 미만 함유하고, 분말 X선 회절 프로파일에 기초하여 산출되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻을 수 있다.
이러한 제조방법에 의해 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 분말 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도는 98.0질량% 초과, 99.9질량% 미만으로 종래의 의약부외품급의 분말과 동일한 정도이거나 그에 미치지 못하는 레벨이긴 하지만, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도(이하, 본 명세서에서는 단순히 '결정화도'라 한다.)가 90% 이상으로 높고, 의약부외품급의 분말에 비해 유의적으로 고결되기 어려운 분말임과 동시에, 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도가 99.9질량%에 미치지 못하는 만큼, 시약급의 분말보다도 화장품 및 의약부외품에 일반적으로 사용되는 친수성 용매에 대한 용해성이 뛰어난 분말이다. 이러한 분말은 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재 및 의약품 소재로서 취급이 용이하고 바람직하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법에서는 효소 반응에 의해 얻어지는 반응용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 27질량% 이상이면 좋고, 경우에 따라서는 35질량% 이상이어도 좋다. 본 발명의 제조방법은 상기 생성률이 35질량%에 미치지 못하는 27질량% 이상, 35질량% 미만의 레벨에 있어도, 제어냉각법 또는 의사 제어냉각법을 적용하는 점을 제외하면, 종래부터 행해지고 있는 의약부외품급 분말의 제조방법과 거의 차이가 없는 공정으로, 의약부외품급의 분말에 비해 유의적으로 고결되기 어려운 분말을 제조할 수 있는 점에서 특히 우수하다. 또한, 본 발명의 제조방법은 상기 생성률이 35질량% 이상인 경우에는 제어냉각법 또는 의사 제어냉각법을 적용하는 점을 제외하면 종래부터 행해지고 있는 의약부외품급 분말의 제조방법과 거의 차이가 없는 공정으로, 자연냉각법에 의한 것보다도 결정화도가 높고, 의약부외품급의 분말에 비해 유의적으로 고결되기 어려운 분말을 제조할 수 있다는 이점을 가지고 있다. 또한, 본 발명의 제조방법에서는 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 27질량% 이상인 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 얻는 상기 (가)의 공정에서, 필요하다면 이소아밀라아제, 풀룰라나아제 등의 전분 절지 효소를 CGTase와 병용하여, 반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률을 더욱 높이도록 하여도 좋다.
게다가, 본 발명의 제조방법에서는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 정제하여 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 무수물 환산으로 86질량% 초과로 하는 상기 (나) 공정에서, 음이온 교환수지를 충전제로서 사용하는 칼럼크로마토그래피와, 강산성 양이온 교환수지를 충전제로서 사용하는 의사이동상식(擬似移動床式)의 칼럼크로마토그래피를 실시하도록 하여도 좋다. 상기 (나)의 공정에 있어서, 상기 음이온 교환수지를 충전제로서 사용하는 칼럼크로마토그래피와, 강산성 양이온 교환수지를 충전제로서 사용하는 의사이동상식의 칼럼크로마토그래피를 조합하여 실시하는 경우에는 아스코르빈산 2-글루코시드 함량이 무수물 환산으로 86질량% 초과인 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 보다 효율적으로 얻을 수 있다는 이점이 얻어진다.
또한, 본 발명자들이 연구를 거듭한 결과, 상기 (가)의 공정에서, 효소 반응에 의해 얻어지는 반응용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 27질량% 이상이 되는 CGTase에는 아미노산 레벨에서 공통하는 특징이 있음이 판명되었다.
즉, 본 발명은 상기 CGTase로서, 하기 (a) 내지 (d)에 나타낸 부분 아미노산 서열을 갖는 CGTase를 사용하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조방법을 제공함으로써도, 상기의 과제를 해결하는 것이다;
(a) Asn-Glu-Val-Asp-X1-Asn-Asn;
(b) Met-Ile-Gln-X2-Thr-Ala;
(c) Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn-Ile;
(d) Val-X3-Ser-Asn-Gly-Ser-Val.
(단, X1은 Pro 또는 Ala을, X2는 Ser 또는 Asp를, X3은 Ser 또는 Gly를 각각 의미한다.)
상기 (a) 내지 (d)에 나타낸 부분 아미노산 서열을 갖는 CGTase로서는 지오바실러스 스테아로써모필루스 또는 써모아나에로박터 써모술푸리게네스(Thermoanaerobacter thermosulfurigenes) 유래의 천연형 또는 재조합형 효소를 예로 들 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열목록의 서열번호 1, 3, 4 및 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CGTase를 예로 들 수 있고, 이들 CGTase는 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 바람직하게는 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.0질량% 초과, 99.9질량% 미만을 함유하며, 분말 X선 회절 프로파일에 기초하여 산출되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상일 뿐만 아니라, 원료 유래의 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코오스를 함유하고, L-아스코르빈산의 양이 무수물 환산으로 0.1질량% 이하이며, 분말 전체의 환원력이 1질량% 미만이라는 특성을 구비하고 있다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 효소 반응에 의해 얻어지는 반응용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 35질량%를 충족하지 못하는 경우일지라도, 의약부외품급의 분말에 비해 유의적으로 고결되기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조할 수 있으므로, 효소 반응에 사용하는 효소, 특히 CGTase에 관해 선택의 폭이 크게 확장된다는 커다란 이점이 얻어진다. 또한, 본 발명의 제조방법에 따르면, 효소 반응에서 27질량% 이상이라는 생성률을 실현할 수 있는 CGTase가 공통적으로 가지고 있는 부분 아미노산 서열에 관한 정보가 제공되므로, 이 부분 아미노산 서열에 기초하여, 본 발명의 제조방법에서 사용할 수 있는 CGTase를 검색하는 것이 가능하게 된다는 이점이 얻어진다. 또한, 본 발명의 제조방법에 따르면, 효소 반응에 의해 얻어지는 반응용액으로부터 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시키는 결정석출공정에서 제어냉각법 또는 의사 제어냉각법을 사용하는 점을 제외하면, 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 원료로 하여, 종래의 의약부외품급 분말의 제조방법과 공정적으로 차이가 없는 제조방법에 의해, 의약부외품급의 분말보다도 유의적으로 고결되기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조할 수 있으므로, 의약부외품급의 분말의 제조에 종래부터 필요로 되었던 것과 큰 차이가 없는 시간, 노력, 제조설비 및 비용으로, 의약부외품급의 분말에 비해 유의적으로 고결되기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조할 수 있다는 뛰어난 이점이 얻어진다.
게다가, 본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 이를 분말형상의 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 및 의약품 소재 등으로서 사용하는 경우에는 분말형상 소재를 구성하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 유의적으로 고결되기 어려우므로, 보존, 보관은 물론, 취급이 용이함과 아울러, 원료가 유동성이 있는 분말인 것을 전제로 만들어진 제조 플랜트에 사용하여도, 원료의 수송이나 체질, 혼합 등의 프로세스에 지장을 초래할 우려가 없다는 이점이 얻어진다.
또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 식품 소재 등에 요구되는 입도 분포, 즉 입경 150μm 미만의 입자를 분말 전체의 70질량% 이상임과 함께 입경 53μm 이상, 150μm 미만의 입자를 분말 전체의 40~60질량% 함유하는 입도분포로 용이하게 조정할 수 있으므로, 이를 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 또는 의약품 소재로서 사용하여도, 종전으로부터의 제조공정이나 원료규격을 바꾸는 일 없이 종전대로 사용할 수 있다는 이점이 얻어진다. 또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코오스를 함유하고, 또한 분말 전체의 환원력이 0질량% 초과, 1질량% 미만이므로, 액화전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 원료로 하여 제조된 분말임에도 불구하고, 아미노산이나 단백질 등의 분자 내에 아미노기를 갖는 다른 성분과 혼합하여도 변색 등의 품질저하를 야기할 우려가 없다는 이점이 얻어진다. 게다가, 본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 L-아스코르빈산 함량이 무수물 환산으로 0질량% 초과, 0.1질량% 이하이므로, 분말 단독으로 장기간 보존한 경우에도, 분말 자체가 연한 갈색으로 착색될 우려가 없고, 실질적으로 무착색이며 백색인 분말로서, 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재 및 의약품 소재로서 이용할 수 있다.
도 1은 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어진 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 특성 X선에 의한 분말 X선 회절패턴의 일례이다.
도 2는 실질적으로 무정형 부분으로 이루어진 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 분말의 특성 X선에 의한 분말 X선 회절 패턴의 일례이다.
도 3은 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어진 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 싱크로트론 방사광에 의한 분말 X선 회절패턴의 일례이다.
도 4는 실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 분말의 싱크로트론 방사광에 의한 분말 X선 회절 패턴의 일례이다.
도 5는 본 발명에서 사용한 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91 유래의 CGTase 유전자를 포함하는 재조합 DNA 'pRSET-iBTC12'의 구조 및 제한효소 인식부위를 나타낸 도면이다.
도 6은 각종 냉각패턴을 나타낸 도면이다.
1. 용어의 정의
본 명세서에서 이하의 용어는 이하의 의미를 가지고 있다.
<결정화도>
본 명세서에서 언급하는 '아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도'란, 하기 식 [1]에 의해 정의되는 수치를 의미한다.
식 [1]:
Figure 112013090733505-pct00001
H100 : 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어진 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말 표준시료의 분말 X선 회절 프로파일로부터 구한 결정화도에 대한 해석값
H0 : 실질적으로 무정형 부분으로 이루어진 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말 표준시료의 분말 X선 회절 프로파일로부터 구한 결정화도에 대한 해석값
Hs : 피험시료가 되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 분말 X선 회절 프로파일로부터 구한 결정화도에 대한 해석값
식 [1]에서 해석값 H100, H0, Hs를 구하는 기초가 되는 분말 X선 회절 프로파일(profile)은 통상 반사식 또는 투과식의 광학계를 구비한 분말 X선 회절 장치에 의해 측정할 수 있다. 분말 X선 회절 프로파일은 피험시료 또는 표준시료에 포함되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 회절각 및 회절강도를 포함하고, 이와 같은 분말 X선 회절 프로파일로부터 결정화도에 대한 해석값을 결정하는 방법으로는 하만스법(Harmans method), 본크법(Vonk's Method) 등을 예로 들 수 있다. 이들 해석방법 중 하만스법을 사용하는 것이 간편함과 정확도(accuracy)의 측면에서 적합하다. 오늘날, 이들 해석방법은 모두 컴퓨터 소프트웨어화 되어 있으므로, 이러한 컴퓨터 소프트웨어 중 어느 하나가 탑재된 해석장치를 구비한 분말 X선 회절 장치를 사용하는 것이 바람직하다.
또, 해석값 H100를 구하는 '실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말 표준시료'로서는, 아스코르빈산 2-글루코시드에 대한 순도가 99.9질량% 이상(이하, 별도의 언급이 없는 한, 본 명세서에서는 질량%를 '%'로 간략히 기재한다. 단, 본 명세서에서 언급하는 결정화도에 붙여진 %는 예외로 한다.)인 분말 또는 단결정이며, 분말 X선 회절 패턴에 있어서 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 특유한 회절피크를 나타내고, 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 것을 사용한다. 이러한 분말 또는 단결정으로는 상술한 시약급의 분말, 또는 이것을 재결정화하여 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말 또는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 단결정을 예로 들 수 있다. 또한, 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 상기 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말 표준시료의 분말 X선 회절 프로파일을 하만스법에 의한 컴퓨터 소프트웨어로 해석한 경우의 해석값 H100는 통상 70.2~70.5% 정도가 된다.
한편, 해석값 H0를 구하는 '실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 분말 표준시료'로는, 아스코르빈산 2-글루코시드에 대한 순도가 99.1% 이상인 분말이며, 그 분말 X선 회절 패턴이 무정형부분으로부터 유래하는 할로(halo)만으로 이루어지고, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 특유한 회절피크를 실질적으로 나타내지 않는 것을 사용한다. 이러한 분말로서는 상기한 해석값 H100을 구하는 표준시료를 적정량의 정제수에 용해하고 농축한 후 동결건조시키고, 나아가 카알 피셔법(Karl Fischer method)에 의해 결정되는 수분함량이 2.0% 이하가 될 때까지 진공건조시킴으로써 얻어진 분말을 예로 들 수 있다. 이러한 처리를 실시한 경우에, 실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 분말이 얻어지는 것은 경험상 알려져 있다. 또한, 실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 상기 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 분말 표준시료의 분말 X선 회절 프로파일을 하만스법에 의한 컴퓨터 소프트웨어로 해석한 경우의 해석값 H0는 통상 7.3~7.6% 정도가 된다.
또한, 해석값 H0를 구하는 표준시료로서는 아스코르빈산 2-글루코시드에 대한 순도가 높은 것이 바람직하다는 것은 말할 것도 없으나, 해석값 H100를 구하는 표준시료로부터 상술한 바와 같이 하여 조제되는 해석값 H0를 구하는 표준시료에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도는 후술하는 실험 1-1에 나타낸 대로, 해석값 H100를 구하는 표준시료의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 99.9% 이상으로 매우 높음에도 불구하고, 99.1%에 그친다. 따라서, '실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 분말 표준시료'의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도는 상기한 바와 같이 99.1% 이상으로 하였다.
<평균 결정자 지름>
일반적으로, 결정 함유 분말에서의 1개의 분말 입자는 복수의 단결정, 즉 복수의 결정자에 의해 구성되는 것으로 생각되고 있다. 결정 분말에서의 결정자의 크기(결정자 지름)는 결정 분말의 특성에 반영되는 것으로 생각된다. 본 명세서에서 말하는 '아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 평균 결정자 지름'이란, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 분말 X선 회절 분석에 제공하고, 얻어진 분말 X선 회절패턴에서 검출되는 회절피크 중, 5개의 회절피크, 즉 결정자의 불균일 변형에 기인하는 회절피크폭에 대한 영향이 적다고 여겨지는 비교적 낮은 각의 영역에서, 다른 회절피크와 잘 분리한, 회절각(2θ) 10.4˚(미러지수(hkl): 120), 13.2˚(미러지수: 130), 18.3˚(미러지수: 230), 21.9˚(미러지수: 060) 및 22.6˚(미러지수: 131)의 회절피크(도 1의 부호 a 내지 e를 참조)를 선택하고, 각각의 반값폭(반가폭)과 회절각을 사용하여, 표준품으로서 규소(미국국립표준기술연구소(NIST) 공급, X선 회절용 표준시료(『Si640C』)를 사용한 경우의 측정값에 기초하여 보정한 후, 하기 식 [2]에 나타낸 '셰러(Scherrer)의 식'에 의해 각각 산출된 결정자 지름의 평균값을 의미한다.
식 [2]:
Figure 112013090733505-pct00002
D: 결정자의 크기(Å)
λ: X선의 파장(Å)
β: 회절선폭(rad)
θ: 회절각(°)
K: 상수(β에 반값폭(반가폭)을 사용할 경우 0.9)
일반적인 분말 X선 회절장치에는 이러한 결정자 지름 산출용 컴퓨터 소프트웨어가 탑재되어 있으므로, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말만 입수할 수 있으면, 해당 결정분말에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 평균 결정자 지름은 비교적 용이하게 측정할 수 있다. 또한, 피험시료는 분말 X선 회절의 측정에 앞서, 피험시료를 유발에 의해 갈은 후, 53μm의 체로 걸러서, 체를 통과한 분말을 사용한다.
<환원력>
본 명세서에서 언급하는 '분말 전체의 환원력'이란, D-글루코오스를 표준 물질로서 사용하고, 이 분야에서 일반적으로 사용되는 소모지-넬슨법(Somogyi Nelson's method) 및 안트론 황산법(anthrone-sulfuric acid method)에 의해 각각 D-글루코오스 환산에 기초하는 환원당량 및 전체당량을 구하고, 하기 식 [3]을 이용하여 구할 수 있는, 포함되는 전체당량에 대한 환원당량의 백분율(%)을 의미한다.
식 [3]:
Figure 112013090733505-pct00003
<입도분포>
본 명세서에서, 분말의 입도 분포는 이하와 같이 하여 결정한다. 즉, 일본공업규격(JIS Z 8801-1)에 준거하는, 오프닝 사이즈가 425, 300, 212, 150, 106, 75 및 53μm인 금속제 망체(주식회사 이이다제작소제)를 정확하게 칭량한 후, 그 순서대로 서로 포개어 로탑 체질 진탕기(ro-tap sieving shaker)(주식회사 타나카화학기계제작소제, 상품명 'R-1')에 장착한 다음, 칭량하여 채취한 일정량의 시료를 최상단의 체(오프닝 사이즈 425μm) 상에 올려놓고, 체를 서로 포갠 상태로 15분 동안 진탕한 후, 각 체를 다시 정확하게 칭량하여, 그 질량으로부터 시료를 올려놓기 전의 질량을 차감함으로써, 각 체에 의해 포집된 분말의 질량을 구한다. 그 후, 체 상에 올려놓은 시료의 질량에 대한, 각 체에 의해 포집된 각 입도를 가지는 분말의 질량의 백분율(%)을 계산하여, 입도 분포로 나타낸다.
<아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률>
본 명세서에서 말하는 '아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률'이란, 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 함유하는 용액에 CGTase 등의 효소를 작용시켜서 얻어지는 효소 반응액 중에서의 무수물 환산한 아스코르빈산 2-글루코시드의 함량(%)을 의미한다.
<아스코르빈산 2-글루코시드의 무수물 환산에서의 함량>
아스코르빈산 2-글루코시드의 무수물 환산에서의 함량이란, 수분을 포함하지 않고 계산한 경우의 전체질량에서 차지하는 아스코르빈산 2-글루코시드의 질량 백분율(%)을 의미한다. 예를 들면, 용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수물 환산에서의 함량이란, 용액에 포함되는 수분을 포함하지 않고, 나머지 전체 고형분에 대한 아스코르빈산 2-글루코시드의 질량 백분율을 의미한다. 또, 분말 중에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수물 환산에서의 함량이란, 분말중의 수분을 포함하지 않고 남은 부분을 분말 전체질량으로 계산한 경우의 분말 전체질량에 대한 아스코르빈산 2-글루코시드의 질량 백분율을 의미한다.
<CGTase의 활성>
본 명세서에서 'CGTase의 활성'은 이하와 같이 정의된다. 즉, 0.3%(w/v) 가용성 전분, 20mM 아세트산 완충액(pH 5.5), 1mM 염화칼슘을 포함하는 기질 수용액 5ml에 대하여, 적절히 희석한 효소액 0.2ml를 첨가하고, 기질용액을 40℃로 유지하면서, 반응 0분째 및 반응 10분째에 기질용액을 0.5ml씩 샘플링하고, 바로 0.02N 황산용액 15ml에 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 각 황산용액에 0.1N 요오드용액을 0.2ml씩 첨가하여 정색(呈色)시키고, 10분 후 흡광광도계에 의해 660nm 파장에서의 흡광도를 각각 측정하여, 식 [4]에 따라 전분 분해 활성으로 산출한다. CGTase의 활성 1단위란, 이와 같은 측정조건에서 용액 중의 전분 15mg의 요오드 정색(呈色)을 완전하게 소실시키는 효소의 양으로 정의한다.
식 [4]:
Figure 112013090733505-pct00004
<이소아밀라아제의 활성>
본 명세서에서 '이소아밀라아제의 활성'은 이하와 같이 정의된다. 즉, 0.83%(w/v) 린트너(Lintner) 가용화 왁시 옥수수 전분(waxy corn starch), 0.1M 아세트산 완충액(pH3.5)을 포함하는 기질 수용액 3ml에 대하여, 적절히 희석한 효소액 0.5ml를 첨가하고, 기질용액을 40℃로 유지하면서, 반응 30초째와 30분 30초째에 기질용액을 0.5ml씩 샘플링한 후, 바로 0.02N 황산용액을 15ml씩 첨가하여 반응을 정지시키고, 각 황산용액에 0.01N 요오드 용액을 0.5ml씩 첨가하여, 25℃에서 15분 동안 정색시킨 후, 흡광광도계에 의해 610nm 파장에서의 흡광도를 각각 측정하여 하기 식 [5]에 따라 전분 분해 활성으로 산출한다. 이소아밀라아제의 활성 1단위란, 이와 같은 측정 조건에서 610nm 파장의 흡광도를 0.004 증가시키는 효소의 양으로 정의한다.
식 [5]:
Figure 112013090733505-pct00005
<풀룰라나아제의 활성>
본 명세서에서 '풀룰라나아제의 활성'은 이하와 같이 정의된다. 즉, 1.25%(w/v) 풀룰란(주식회사 하야시바라생물화학연구소제, 풀룰라나아제 활성 측정용) 수용액을 기질용액으로 한다. 이 기질용액 4ml와 0.05M 구연산-인산 완충액(pH5.8) 0.5ml를 시험관에 덜어, 30℃로 예열하여 둔다. 0.01M 아세트산 완충액(pH6.0)을 사용하여, 적절히 희석한 효소액 0.5ml를 첨가하고, 기질용액을 30℃로 유지하면서, 반응 30초째(대조액)와 30분 30초째(반응액)에 기질용액을 0.5ml씩 샘플링한 후, 바로 소모기(Somogyi) 구리액 2ml에 주입하여 반응을 정지시키고, 소모기-넬슨법에 제공하여, 흡광광도계에 의해 520nm 파장에서의 흡광도를 각각 측정함으로써 생성된 환원력을 측정하고, 하기 식 [6]에 따라 풀룰란 분해활성으로서 산출한다. 풀룰라나아제의 활성 1단위란 이러한 측정조건에서 1분 동안 1마이크로 몰의 말토트리오스에 상당하는 환원력을 유리시키는 효소의 양으로 정의한다.
식 [6]:
Figure 112013090733505-pct00006
표준액에는 D-글루코오스(100μg/ml)를 사용
<제어냉각법>
본 명세서에서 말하는 '제어냉각법'이란 '제어된 냉각'에 의해 결정을 석출시키는 방법을 말하며, 결정석출공정으로서 설정한 작업시간을 'τ', 결정석출개시시의 액온(液溫)을 'T0', 결정석출종료시의 목표로 하는 액온을 'Tf', 시간 't'에서의 액온을 'T'로 하면, 시간(t)에서의 액온(T)이 원칙적으로 하기 식 [7]로 표시되는 냉각방법을 말한다.
식 [7]:
Figure 112013090733505-pct00007
제어냉각법을, 결정석출공정으로서 설정하는 작업시간을 가로축으로 하고, 결정석출시의 액온을 세로축으로 한 그래프를 사용하여 보다 구체적으로(모식적으로) 나타내면, 도 6의 부호 a에 나타낸 바와 같다. 도 6의 부호 a에 나타낸 바와 같이, 제어냉각법에 따르면, 액온이 높은 결정석출의 초기에는 액온이 완만하게 저하되며, 액온이 어느 정도 저하된 결정석출의 후기에는 액온이 급속도로 저하하게 되어, t=τ/2의 시점, 즉 결정석출공정의 중간점에서의 액온 'Tm'은 적어도 Tm> [(T0-Tf)/2+Tf]의 관계(즉, 결정석출공정의 중간점에서의 온도 변화가 총 온도변화의 50% 미만이 된다)가 유지된다. 이 액온의 시간에 대한 변화 패턴에 있어서, 제어냉각법은 액온이 T0로부터 Tf까지 시간 τ을 들여 직선적으로 저하되는 직선냉각(도 6에서의 부호 b)이나, 액온이 높은 결정석출의 초기에는 액온이 지수함수적으로 급속하게 저하되고, 액온이 저하된 결정석출의 후기가 될수록 액온이 완만하게 저하되는 통상의 자연냉각법(도 6에서의 부호 c)과는 분명히 구별된다. 또한, 액온(T)을 상기 식 [7]으로 표시되는 시간(t)의 함수로서 변화시키기 위해서는 예를 들면, 시판되고 있는 범용의 결정 석출 시스템용 프로그램 항온순환장치 등을 사용하면 좋다.
결정석출공정에서 이와 같은 제어냉각법을 적용할 경우에는 아스코르빈산 2-글루코시드의 종정(種晶)을 첨가한 후, 결정석출의 초기에는 액온의 냉각이 완만하게 이루어지므로, 냉각에 의한 급격한 과포화도의 상승과 이차적인 결정핵의 형성이 억제되어, 첨가한 종정을 결정핵으로 하는 결정을 우선적으로 성장시킬 수 있다. 한편, 첨가한 종정을 결정핵으로 하는 결정이 가지런한 결정석출의 후기에는 액온을 급속도로 냉각함으로써, 가지런한 결정을 일제히 성장시키게 되므로, 제어냉각법에 따르면, 미세결정이 적은 입경이 균일한 결정을 포함하는 마세큐트(Massecuite)가 얻어진다는 이점을 얻을 수 있다. 또한, '제어냉각법'에 대해서는 예를 들면 '쿠보타 노리아키 저, 『알기쉬운 배치(batch) 결정석출』, 분리기술회, 2010년 4월 30일 발행, 32~47페이지'에 상세히 기술되어 있다.
<의사(擬似) 제어냉각법>
본 명세서에서 말하는 '의사 제어냉각법'이란, 문자대로 상기 제어냉각법과 유사한 냉각법으로, 액온(T)을 시간(t)에 대해 엄밀하게 상기 [7]에 따라 변화시키는 것이 아니라, 결정석출에 사용하는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도, 농도, 과포화도, 종정의 양 등에 따라서도 다르지만, 작업시간 t=τ/2의 시점(결정석출공정의 중간점)에서 결정핵이 대략 가지런한 것이 바람직하기 때문에, t=τ/2의 시점에서 액온(T)의 변화량(T0-Tm)이 총온도변화량(T0-Tf)의 5% 이상 50% 미만, 바람직하게는 10% 이상 30% 미만의 범위를 유지하도록 액온(T)을 시간(t)에 대해 연속적 또는 단계적으로 저하시키는 냉각법을 의미한다. t=τ/2의 시점에서 액온(T)의 변화량(T0-Tm)이 총 온도변화량(T0-Tf)의 5% 이상 50% 미만이도록 액온(T)을 시간(t)에 대해 연속적 또는 단계적으로 저하시키는 경우에는 액온이 높은 결정석출의 초기에는 액온(T)이 시간(t)에 대해 완만하게 저하되며, 액온이 어느 정도 저하된 결정석출의 후기에는 액온(T)이 시간(t)에 대해 급속도로 저하하게 되어, 결과적으로, 상술한 제어냉각법에는 미치지 않는 경우가 있으나, 미세결정이 적은 입경이 균일한 결정을 포함하는 마세큐트가 얻어진다는, 제어냉각법과 거의 동일한 이점이 얻어진다.
구체적으로는, 예를 들면 작업시간(τ)을 적어도 2개, 바람직하게는 3개 이상의 구간으로 나누어, 결정석출공정의 초기 구간에서는 냉각시의 온도 구배를 완만하게(냉각속도를 느리게) 하고, 초기 내지는 중기부터 후기로 향함에 따라, 온도 구배를 크게(냉각속도를 빠르게) 하여, t=τ/2 시점에서의 액온(T)의 변화량(T0-Tm)이 총온도변화량(T0-Tf)의 5% 이상 50% 미만, 바람직하게는 10% 이상 30% 미만이 되도록 액온(T)을 시간(t)에 대해 연속적 또는 단계적으로 저하시키면 좋다. t=τ/2 시점에서의 액온(T)의 변화량(T0-Tm)이 총 온도변화량(T0-Tf)의 50% 이상인 경우에는결정석출 초기시의 냉각속도가 너무 빨라, 냉각에 의한 급격한 과포화도의 상승으로 인해 이차적인 결정핵이 형성될 우려가 있으며, 5% 미만인 경우에는 결정석출 초기의 냉각속도가 너무 느려, 첨가한 종정을 결정핵으로 하는 결정이 충분히 가지런하지 않은 채로, 급속한 냉각이 시작되는 결정석출 후기를 맞이하게 되어, 어느 쪽이든, 미세결정이 적은 입경이 균일한 결정을 포함하는 마세큐트(Massecuite)를 얻는 것이 곤란해진다.
상술한 제어냉각법을 수행하기 위해서는 액온(T)을 식 [7]에 표시되는 시간(t)의 함수로서 변화시킬 필요가 있으며, 설정한 프로그램으로 액온을 제어할 수 있는 장치나 결정관(crystallizer)이 필수인데, 의사 제어냉각법에 따르면, t=τ/2 시점에서의 액온(T)의 변화량(T0-Tm)이 총 온도변화량(T0-Tf)의 5% 이상 50% 미만, 바람직하게는 10% 이상 30% 미만이 되도록 액온(T)을 시간(t)에 대해 연속적 또는 단계적으로 저하시키면 되므로, 의사 제어냉각법에는 액온을 정밀하게 제어하는 설비가 없는 경우일지라도, 비교적 용이하게 실행할 수 있다는 이점이 있다.
2. 본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말
이하, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 대해 설명한다.
<아스코르빈산 2-글루코시드 함량 및 기타 협잡물 함량>
본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 상술한 대로, 무수물 환산으로, 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.0% 초과, 99.9% 미만인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이며, 바람직한 경우에 있어서, 상기 분말은 원료 유래의 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코오스를 함유하고, 분말 전체의 환원력이 0% 초과, 1% 미만이다. 잘 알려진 바와 같이, L-아스코르빈산이나 D-글루코오스는 직접 환원성을 가지며, 아미노산이나 단백질 등 분자 내에 아미노기를 갖는 화합물의 공존 하에서 가열하면 갈색의 착색을 일으키므로, 이들 물질이 제품으로서의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 포함되는 것은 바람직하지 않다. 그러나, 예를 들면, 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 함유하는 용액에 CGTase 등의 효소를 작용시키는 공정을 거쳐 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조할 경우에는 양의 많고 적음은 둘째치고, 미반응의 L-아스코르빈산이나, 원료인 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나로부터 유래하는 D-글루코오스 등이, 반응협잡물로서 제품인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 혼입되는 것은 피할 수 없다. 예를 들면, 종래의 의약부외품급 분말에서는, 포함되는 L-아스코르빈산과 D-글루코오스의 양이 무수물 환산한 양자의 합계로 약 1%에 달하는 일도 있었으며, 식품 소재 등으로서 사용한 경우에 예기치 못한 갈색의 착색을 일으키는 일이 있었다.
때문에, 본 발명의 제조방법에서는 불가피하게 피할 수 없는 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코오스의 혼입을 허용함과 함께, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에서의 분말 전체의 환원력을 1% 미만, 상세하게는 0% 초과, 1% 미만으로 규제하기로 하였다. 후술하는 실험에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 의해 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조할 경우에는 분말 전체의 환원력을 0% 초과, 1% 미만으로 하는 것은 용이하다. L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코오스를 함유하고 있어도, 분말 전체의 환원력이 0% 초과, 1% 미만이면, 아미노산이나 단백질 등의 분자 내에 아미노기를 갖는 화합물의 공존 하에서 가열하여도 갈색의 착색을 일으키는 일이 실질적으로 없다. 따라서, L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코오스를 함유하고, 또한 분말 전체의 환원력이 0% 초과, 1% 미만인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 착색이나 변색을 걱정하지 않고, 식품, 화장품, 의약부외품, 의약품 일반으로 배합사용할 수 있다는 이점을 가지고 있다. 게다가, 분말 전체의 환원력이 1% 미만인 경우, 포함되는 L-아스코르빈산의 양은 무수물 환산으로 0.1% 이하이다.
또한, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 L-아스코르빈산 함량이 무수물 환산으로 0.1% 이하, 상세하게는 0% 초과, 0.1% 이하이다. L-아스코르빈산은 산화방지제나 탈산소제로서 음식품 등에 사용되고 있는 바와 같이, 산소와의 반응성이 높다. 이 때문에, L-아스코르빈산은 분자 내에 아미노기를 갖는 화합물의 공존 하에서 가열하면 갈색의 착색을 일으킬 뿐만 아니라, L-아스코르빈산을 함유하는 분말 자체의 착색에도 깊이 관여하고 있다고 생각된다. 현재, 후술하는 실험에 나타낸 바와 같이, 의약부외품급의 분말에는 L-아스코르빈산이 0.2%정도 포함되어 있는데, 본 발명자들이 얻은 지견에 따르면, 의약부외품급의 분말은 이를 상술한 상품 형태로 비교적 장기간 보존하면, 때때로, 분말자체가 연한 갈색으로 착색되는 현상을 볼 수 있다. 이에 비해, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에서의 L-아스코르빈산 함량이 0% 초과, 0.1% 이하인 경우에는 이 분말을 의약부외품급의 분말과 마찬가지의 상품형태로 비교적 장기간 보존하여도, 분말 자체가 연한 갈색으로 착색될 우려가 없다. 또한, 본 발명의 제조방법에 따르면, 정제공정에 D-글루코오스 등의 당류를 제거하기 위한 음이온 교환수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피에 연속적으로, 양이온 교환수지 또는 다공성 수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피를 수행함으로써, 특히, 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피로서 의사이동상식을 사용할 경우에는 제조비용을 상승시키지 않고 비교적 용이하게, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에서의 L-아스코르빈산 함량을 0% 초과, 0.1% 이하로 할 수 있다.
<결정화도 및 평균 결정자 지름>
본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 분말 X선 회절 프로파일에 기초하여 산출되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이고, 또한 평균 결정자 지름이 1,400Å 이상 1,710Å 미만이다. 이하의 실험에 의해 나타낸 바와 같이, 결정화도 및 평균 결정자 지름이 상기 레벨에 있는 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도, 즉 무수물 환산에 의한 아스코르빈산 2-글루코시드의 함량이 의약부외품급의 분말과 거의 동일한 레벨이거나, 시약급 분말에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도를 만족하지 못함에도 불구하고, 의약부외품급의 분말에 비해 유의적으로 고결되기 어렵고, 또한, 시약급의 분말에 비해 화장품 및 의약부외품에 일반적으로 사용되는 친수성 매체에 대한 용해성이 뛰어나다는 특성을 구비하고 있다.
<입도 분포>
본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 그 바람직한 일 양태에서, 입경 150μm 미만의 입자를 분말 전체의 70% 이상임과 함께, 입경 53μm 이상 150μm 미만의 입자를 분말 전체의 40 내지 60% 함유한다. 본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은, 예를 들면, 식품 소재 등에 요구되는 상기의 입도 분포로 용이하게 조정할 수가 있으므로, 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 또는 의약품 소재로서 제조공정이나 원료규격을 바꾸지 않고 종전대로 사용할 수 있다는 이점을 가지고 있다.
3. 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조방법
이하, 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조방법에 관해 설명한다.
본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조방법은 기본적으로 하기의 (가) 내지 (마)의 공정을 포함하고 있다:
(가) 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 포함하는 용액에 CGTase를 작용시키고, 그 다음 글루코아밀라아제를 작용시켜 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성시킴으로써, 글루코아밀라아제 처리 후 반응액의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률이 27질량% 이상인 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 얻는 공정;
(나) 얻어진 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 정제하여, 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 무수물 환산으로 86% 초과로 하는 공정;
(다) 아스코르빈산 2-글루코시드를 무수물 환산으로 86% 초과 함유하는 용액으로부터 제어냉각법 또는 의사 제어냉각법에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 석출시키는 공정;
(라) 석출한 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 채취하는 공정; 및
(마) 채취된 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 용해, 재결정화하지 않고, 숙성, 건조시키며, 필요에 따라 분쇄함으로써, 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.0% 초과, 99.9% 미만 함유하며, 분말 X선 회절 프로파일에 기초하여 산출되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻는 공정.
이하, 각 공정에 대해 설명한다.
<(가)의 공정>
(가)의 공정은 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 포함하는 용액에 CGTase를 작용시키고, 그 다음 글루코아밀라아제를 작용시킴으로써, 글루코아밀라아제 처리 후 반응액의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률을 27%이상으로 하는 공정이다. 먼저, 사용하는 원료 및 효소에 대해 설명한 다음, 실시되는 효소반응에 대해 설명한다.
A. 사용원료 및 효소
(L-아스코르빈산)
사용하는 L-아스코르빈산으로서는 하이드록시산 형태의 것이어도, 알칼리 금속염, 알칼리 토류 금속염 등의 금속염 형태의 것이어도, 나아가 그들의 혼합물이어도 지장이 없다.
(액화 전분 또는 덱스트린)
또한, 사용하는 액화 전분 또는 덱스트린으로는 감자 전분, 고구마 전분, 타피오카 전분, 옥수수 전분, 밀 전분 등을 내열성 α-아밀라아제로 액화하여 얻어지는 액화 전분 또는 덱스트린을 예로 들 수 있다. 반응시에는 CGTase와 함께, 예를 들면 이소아밀라아제(EC 3. 2. 1. 68), 풀룰라나아제(EC 3. 3. 1. 41) 등의 전분 절지 효소를 병용하여, 전분의 분기 부분을 절단하는 것이 바람직하다. 액화 전분 또는 덱스트린은 시클로덱스트린이나 아밀로오스에 비해 공업적 규모의 대량 제조에 적합한 원료이다.
(CGTase)
사용하는 CGTase(EC 2. 4. 1. 19)로서는 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 함유하는 용액에 CGTase를 단독으로, 또는 전분 절지 효소와 함께 작용시킨 후, 글루코아밀라아제를 작용시켰을 때에, 27% 이상의 생성률로 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성시킬 수 있는 한, 그 기원이나 유래에 특별한 제한은 없으며, 천연의 효소이어도 좋고, 유전자 재조합에 의해 얻어지는 효소이어도 좋으며, 나아가 천연 또는 재조합형 효소에 아미노산의 치환, 부가, 결실을 도입한 변이체 효소이어도 좋다.
또한, 본 발명자들이 얻은 지견에 따르면, 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 함유하는 용액에 CGTase를 단독으로, 또는 전분 절지 효소와 함께 작용시킨 후, 글루코아밀라아제를 작용시켰을 때에, 27% 이상의 생성률로 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성시킬 수 있는 CGTase는 통상적으로 공통하는 부분 아미노산 서열로서, 하기 (a) 내지 (d)에 나타낸 부분 아미노산 서열을 가지고 있다:
(a) Asn-Glu-Val-Asp-X1-Asn-Asn;
(b) Met-Ile-Gln-X2-Thr-Ala;
(c) Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn-Ile;
(d) Val-X3-Ser-Asn-Gly-Ser-Val.
(단, X1은 Pro 또는 Ala을, X2는 Ser 또는 Asp를, X3은 Ser 또는 Gly를 각각 의미한다.)
이러한 CGTase로서는 지오바실러스 스테아로써모필루스 또는 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래의 천연형 또는 재조합형 효소를 예로 들 수 있으며, 구체적으로는 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 유래의 CGTase, 즉 서열목록의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CGTase나, 서열목록의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에, 유전자 공학적 수법으로 아미노산기의 치환, 결실, 부가를 도입함으로써 제작한 CGTase 변이체, 구체적으로는 서열목록의 서열번호 4 또는 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CGTase 변이체, 그리고 서열목록의 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래의 CGTase나 당해 CGTase의 변이체 등을 바람직한 예로서 들 수 있다.
또한, 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주는 동일한 출원인에 의한 일본 특허공개 소50-63189호 공보(일본 특허공고 소53-27791호 공보)에 개시된 미생물이며, 당초, FERM-P 2225로서 1973년 7월 30일자로 일본국내에 기탁되어, 현재는 수탁번호 FERM BP-11273으로 이바라기현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 중앙 제6소재의 독립행정법인 산업기술종합연구소, 특허생물기탁센터에 국제기탁되어 있다. 또한, 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 유래의 CGTase는 약 68,000 달톤의 분자량을 갖는 효소이며, 다른 미생물 유래의 CGTase에 비해 당전이작용이 강한 것이 알려져 있다. 또한, 해당 CGTase는 그 유전자가 복제되어, 유전자의 염기서열(서열목록의 서열번호 2로 표시되는 염기서열)로 이루어진 CGTase의 아미노산 서열(서열목록의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열)이 결정되어 있으며, 해당 CGTase의 아미노산 서열상에는 α-아밀라아제 패밀리로 분류되는 효소군에 공통적으로 존재한다고 여겨지는 4개의 보존영역이 존재하는 것이 알려져 있다. 또한, 해당 CGTase 단백질의 입체 구조는 X선 결정구조 해석에 의해 이미 명확히 밝혀져 있다. 게다가, 해당 CGTase의 3개의 촉매잔기, 즉 서열목록의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서의 225번째의 아스파라긴산(D225), 253번째의 글루타민산(E253), 324번째의 아스파라긴산(D324)도 판명되어 있다(『공업용 당질효소 핸드북』, 코단사 사이엔티픽사 편집, 코단사 발행, 56~63페이지(1999년) 참조).
또한, 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래의 CGTase로서는 구체적으로는 해당 미생물 유래의 CGTase가 재조합형 효소로서 제조된 효소제(상품명 『토루자임(Toruzyme) 3.0L』, 노보자임 재팬사제)가 시판되고 있다. 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래의 CGTase에 관해서도 그 이화학적 성질이나 아미노산 서열 등이 이미 밝혀져 있다.
(전분 절지 효소)
액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 포함하는 용액에 CGTase를 작용시킬 때에, 전분 절지 효소를 병용하여, 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률을 높일 수 있다. 전분 절지 효소로서는 이소아밀라아제가 효소 활성 및 기질 특이성 등의 측면에서 취급하기 쉬우므로 특히 바람직하다. 이소아밀라아제로서는 예를 들면 슈도모나스 아밀로데라모사(Pseudomonas amyloderamosa), 바실러스속(Bacillus Sp.), 플라보박테리움속(Flavobacterium sp.) 유래의 것이나, 동 미생물의 유전자를 재조합하여 얻어진 변이 이소아밀라아제를 들 수 있다. 또한, 플라보박테리움 오도라텀(Flavobacterium odoratum) 유래의 이소아밀라아제로서는 합동주정주식회사 제조의 이소아밀라아제 효소제(상품명 『GODO-FIA』)를 사용할 수 있다.
또한, 풀룰라나아제로서는 예를 들면 바실러스속(Bacillus sp.), 바실러스 애시도풀루리티카스(Bacillus acidopullulyticas), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 클렙시엘라 에어로게네스(Klebsiella aerogenes), ㅍ플라보박테리움 페니보란스(avobacterum pennivorans), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes) 유래의 것을 들 수 있다.
(글루코아밀라아제)
사용하는 글루코아밀라아제(EC 3. 2. 1. 3)에도 특별히 제한은 없으며, 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 함유하는 용액에 CGTase를 작용시키고, 그 다음 글루코아밀라아제를 작용시켰을 때에, 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성시킬 수 있는 한, 그 기원이나 유래에 특별한 제한은 없으며, 천연의 효소이어도 좋고, 유전자 재조합에 의해 얻어지는 효소이어도 좋다.
글루코아밀라아제는 통상, 효소반응액을 가열하여 CGTase에 의한 당전이반응을 정지시키고 나서 첨가되므로, 가열 후의 효소반응액의 냉각에 요구되는 에너지와 시간을 절약할 수 있도록, 비교적 높은 온도, 예를 들면 40~60℃ 정도의 온도에서 실용에 충분한 효소활성을 발휘할 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 사용하는 글루코아밀라아제가 α-글루코시다아제를 포함하고 있었던 경우, 생성된 아스코르빈산 2-글루코시드가 가수분해되어 버리므로, 글루코아밀라아제로서는 α-글루코시다아제를 실질적으로 포함하지 않는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 조건을 만족하는 것이면, 사용하는 글루코아밀라아제의 공급원, 순도에는 특별한 제한은 없으며, 예를 들면, 글루코아밀라아제제로서 시판되고 있는 리조푸스(Rhizopus)속에 속하는 미생물에서 유래하는 효소제(상품명 『글루코침 ＃20000』나가세켐텍스주식회사 판매)나 아스페르길루스(aspergillus)속의 미생물에서 유래하는 효소제(상품명 『글루쿠자임 AF6』아마노엔자임주식회사 판매)를 바람직하게 사용할 수 있다.
B. 효소반응
이어서, L-아스코르빈산에 대한 당전이반응에 대해 설명한다. 우선, 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 함유하는 용액(통상은 수용액)에 CGTase를 작용시킨다. 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 포함하는 수용액에 CGTase를 작용시키면, CGTase의 효소작용에 의해, L-아스코르빈산의 2위치의 수산기에 1개 또는 2개 이상의 D-글루코오스가 전이되고, 상기 2위치의 수산기에 1개의 D-글루코오스가 결합한 아스코르빈산 2-글루코시드가 생성됨과 동시에, 상기 2위치의 수산기에 2개 이상의 D-글루코오스가 결합한 2-O-α-말토실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토트리오실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토테트라오실-L-아스코르빈산 등의 α-글리코실-L-아스코르빈산이 생성된다.
CGTase는 통상, 기질 농도가 1 내지 40%가 되도록 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 용해시킨 수용액에 대하여, 기질 1g당 1 내지 500단위의 비율로 첨가되고, 해당 용액을 pH 약 3 내지 10, 온도 30 내지 70℃로 유지하면서 6시간 이상, 바람직하게는 약 12 내지 96시간 동안 반응시킨다. L-아스코르빈산은 산화에 의해 분해되기 쉽기 때문에, 반응 중, 용액을 혐기 또는 환원상태로 유지하는 한편, 빛을 차단하는 것이 바람직하고, 필요에 따라서 반응용액에 예를 들면 티오요소, 황화수소 등의 환원제를 공존시킨다.
용액 중의 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산의 질량비는 무수물 환산으로 8:2 내지 3:7의 범위로 설정하는 것이 바람직하다. 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와의 비율이 그 범위보다 커지면, L-아스코르빈산에 대한 당 전이는 효율적으로 진행되나, 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 L-아스코르빈산의 시발 농도에 의한 제약을 받아서 낮은 레벨에 그치게 된다. 반대로, L-아스코르빈산의 비율이 상기한 범위보다 커지면, 미반응의 L-아스코르빈산이 상당량 잔존하게 되어 공업적 생산에는 바람직하지 않다. 따라서, 상기한 비율의 범위를 가지고 최선으로 하였다.
또한, CGTase에 전분 절지 효소로서 이소아밀라아제를 병용하는 경우, 이소아밀라아제는 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 함유하는 용액 중에서 CGTase와 공존시킨 상태로 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나에 작용시키는 것이 바람직하고, 첨가량으로는 이소아밀라아제의 종류, 최적 온도, 최적 pH 등에 따라 다르나, 통상, 기질 1g당 200 내지 2,500단위로 하고, 55℃이하에서 반응시킨다. 또, 전분 절지 효소로서 풀룰라나아제를 사용하는 경우도 통상, 기질 1g당 1 내지 500단위로 하여, 이소아밀라아제에 준해 사용하면 된다.
CGTase, 또는 CGTase와 전분 절지 효소에 의한 효소반응이 대강 완료된 후, 효소반응액을 바로 가열하여 CGTase, 또는 CGTase와 전분 절지 효소를 실활시켜 효소반응을 정지시킨 다음, 이 효소반응액에 글루코아밀라아제를 작용시킨다. 글루코아밀라아제를 작용시키면, L-아스코르빈산의 2위치의 수산기에 결합하고 있는 2개 이상의 D-글루코오스 사슬은 절단되어서 2-O-α-말토실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토트리오실-L-아스코르빈산 등의 α-글리코실-L-아스코르빈산은 아스코르빈산 2-글루코시드로 변환되게 된다.
<(나)의 공정>
(나)의 공정은 상기 (가)의 공정에서 얻어진 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 정제하여, 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 무수물 환산으로 86% 초과로 하는 공정이다. 즉, (가)의 공정에서 얻어진 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 활성탄 등에 의해 탈색 여과하고, 여과액을 양이온 교환수지에 의해 탈염하며, 또한 칼럼크로마토그래피를 적용함으로써, 용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 무수물 환산으로 86% 초과, 바람직하게는 88% 이상으로까지 정제한다. 정제에 사용하는 칼럼크로마토그래피로서는 용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 무수물 환산으로 86% 초과로까지 높일 수 있는 한, 원칙적으로 어떠한 칼럼크로마토그래피를 사용하여도 좋지만, 바람직한 예로서는 D-글루코오스 등의 당류를 제거하기 위한 음이온 교환수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피에 연속하여, 양이온 교환수지 또는 다공성 수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피를 수행하는 것이 좋다. D-글루코오스 등의 당류를 제거하기 위한 바람직한 음이온 교환수지로서는 『앰버라이트 IRA411S』, 『앰버라이트 IRA478RF』(이상, 롬 앤드 하스사제), 『다이아이온 WA30』(미츠비시화학주식회사제) 등을 들 수 있다. 아스코르빈산 2-글루코시드와 L-아스코르빈산을 분리하기 위한 바람직한 양이온 교환수지로서는 『다웩스 50WX8』(다우케미컬사제), 『앰버라이트 CG120』(롬 앤드 하스사제), 『XT-1022E』(도쿄유기화학공업주식회사제), 『다이아이온SK104』, 『다이아이온 UBK 550』(이상, 미츠비시화학주식회사제) 등을 예로 들 수 있다. 다공성 수지로는 『토요펄 HW-40』(토소주식회사제), 『셀파인 GH-25』(칫소주식회사제) 등을 예로 들 수 있다. 양이온 교환수지 또는 다공성 수지를 사용하여 칼럼크로마토그래피를 행하는 경우, 칼럼에 부하하는 원료액의 농도는 고형분 약 10 내지 50%, 수지에 대한 부하량은 습윤 수지 용적의 약 1/1000 내지 1/20, 습윤 수지 용적과 거의 같은 양의 정제수를 0.5 내지 5m/시간의 선속도로 통액하는 것이 바람직하다. 그 중에서도 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피로서 의사이동상식을 사용하는 경우에는 정제하여 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도가 높아지고, L-아스코르빈산이나 D-글루코오스 등의 협잡물, 특히 L-아스코르빈산 함량이 저감되며, L-아스코르빈산 함량이 무수물 환산으로 0.1%이하로 적은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 얻어지므로 바람직하다. 또한, 양이온 교환수지를 충전제로 사용하는 의사이동상식의 칼럼크로마토그래피에서의 용리조건으로는 조작 온도, 설정 유속 등에 따라서도 다르지만, 의사이동상식의 칼럼크로마토그래피에 제공되는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액의 농도는 무수물 환산으로 60% 이하, 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액의 부하량은 습윤수지 용적에 대해 용적비로 1/20 이하, 용리액으로 사용하는 정제수량은 용적비로 상기 부하량의 30배까지, 통상 3~20배 정도로 하는 것이 바람직하다.
용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 함량이 무수물 환산으로 86% 이하인 경우에는 후속하는 (다) 내지 (마)의 공정을 거쳐도, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻는 것은 어렵다. 그 이유는 용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 함량이 무수물 환산으로 86% 이하인 경우에는 그 후의 공정을 거쳐서 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도가 낮고, 결정화가 원활하게 진행되지 않기 때문이라고 생각된다.
아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 무수물 환산으로 86% 초과, 바람직하게는 88% 이상으로까지 정제한 용액은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시키는 공정에 앞서, 소정의 농도, 통상은 아스코르빈산 2-글루코시드 농도 약 65 내지 85%까지 농축된다. 농축액의 온도는 통상 약 30 내지 45℃로 조절된다. 그 농도 및 온도는 아스코르빈산 2-글루코시드에 대한 과포화도로서는 1.05 내지 1.50에 상당한다.
<(다)의 공정>
(다)의 공정은 아스코르빈산 2-글루코시드를 무수물 환산으로 86% 초과, 바람직하게는 88% 이상 함유하는 용액으로부터 제어냉각법 또는 의사 제어냉각법에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 석출시키는 공정이다. 즉, 상기 (나)의 공정에서 소정의 순도 및 농도로까지 정제, 농축하여 소정의 온도로 조정한 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 결정관으로 옮기고, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 종정(種晶)을 0.1 내지 5%(w/v), 바람직하게는 0.5 내지 2%(w/v) 함유시켜 천천히 교반하면서, 제어냉각법 또는 의사 제어냉각법에 의해 결정석출공정의 초기에는 액온을 완만하게 저하시키고, 결정석출공정의 후기에는 액온을 급속도로 저하시켜 결정화시킨다. 결정석출에 필요한 시간은 아스코르빈산 2-글루코시드의 종정의 첨가량에 따라서도 다르지만, 예를 들면, 의사 제어냉각법에 의한 경우에는 전체 결정석출 시간을 적어도 2개, 바람직하게는 3개 이상의 구간으로 나누고, 각 구간 내에서는 시간에 대해 온도를 대략 직선적으로 저하시켜, 작업시간 t=τ/2의 시점(결정석출공정의 중간점)에서의 액온(T)의 변화량(T0-Tm)이 총 온도변화량(T0-Tf)의 5% 이상 50% 미만, 바람직하게는 10% 이상 30% 미만의 범위를 유지하도록 액온(T)을 시간(t)에 대해 연속적 또는 단계적으로 저하시키는 것이 좋다. 예를 들면 48시간에 걸쳐 액온을 40℃에서 15℃까지 냉각하여 결정을 석출시키는 경우에는 냉각시간을 36시간과 12시간의 2개의 구간으로 나누어, 액온을 40℃에서부터 30℃까지 36시간에 걸쳐 냉각한 다음, 30℃에서 15℃까지 12시간에 걸쳐 냉각하거나, 또는, 액온을 40℃에서부터 35℃까지 30시간에 걸쳐 냉각한 다음, 35℃에서 15℃까지 18시간에 걸쳐 냉각하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 냉각시간을 24시간, 12시간, 12시간의 3개의 구간으로 나누어, 최초 구간에서는 24시간에 걸쳐 액온을 40℃에서부터 35℃까지 냉각하고, 다음 구간에서는 12시간에 걸쳐 35℃에서 27.5℃까지 냉각하며, 또한 마지막 구간에서는 12시간에 걸쳐 액온을 27.5℃에서부터 15℃까지 냉각하는 것이 바람직하다.
이와 같이, 제어냉각법 또는 의사 제어냉각법에 의한 경우에는 온도제어를 수행하는 일 없이 자연냉각하는 결정석출법에 비해, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 미세결정이 생기기 어렵고, 입경이 균일한 결정을 포함하는 마세큐트를 얻을 수 있다. 또한, 후술한 바와 같이, 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 분말은 자연냉각법으로 얻어지는 분말에 비해, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도, 및 고결성의 중요한 지표가 되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 관한 결정화도의 측면에서도 높다는 특징을 구비하고 있다. 또한, 제어냉각법 또는 의사 제어냉각법에 의한 경우에는 자연 냉각하는 결정석출법에 의해 얻어지는 분말에 비해, 보다 입도 분포가 가지런한 분말이 얻어진다는 이점이 있다.
<(라)의 공정>
이 공정은 (다)의 공정에서 얻어진 마세큐트로부터 통상적인 방법인 분밀(分蜜)방식에 따라 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 원심 분리에 의해 채취하는 공정이다. 채취된 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정은 표면에 부착되어 있는 비정질의 꿀을 제거하기 위해, 소량의 정제수를 스프레이(샤워)하여 세정된다. 또한, 결정의 세정에 사용하는 정제수의 양은 통상, 원심분리전의 마세큐트의 중량에 대해 3% 이상, 10%까지로 하는 것이 바람직하다. 즉, 세정에 사용되는 정제수의 양이 3% 미만에서는 세정이 충분히 이루어지지 않으며, 비정질의 꿀이 남고, 소기의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 얻어지지 않을 우려가 있다. 한편, 세정에 사용되는 정제수의 양이 10%를 초과하면, 세정에 의해 용해, 제거되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 양이 증가하여 결정의 수율이 저하될 우려가 잇다.
<(마)의 공정>
(마)의 공정은 채취된 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 용해, 재결정화하지 않고, 숙성, 건조시키며, 필요에 따라 분쇄하는 공정이다. 즉, 원심분리에 의해 채취한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 소량의 탈이온수나 증류수 등의 정제수 등으로 세정하여, 결정 표면에 부착된 불순물을 씻어낸다. 세정에 사용하는 물의 양에는 특별한 제한은 없지만, 너무 많으면 표면의 불순물 뿐만 아니라 결정 자체도 용해되므로 수율이 저하되고 또한 세정수의 비용도 증가하므로, 통상적으로는 결정 질량의 30%까지, 바람직하게는 15~25%의 양의 세정수를 사용하여 결정 표면을 세정하는 것이 바람직하다. 세정된 결정은 소정의 온도 및 습도 분위기 중에 일정시간 유지함으로써 숙성, 건조되어 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 된다. 숙성, 건조 공정에서의 결정 함유 분말의 품온이나 분위기의 상대습도, 그리고 숙성, 건조시간은 소기의 결정화도를 나타내는 분말이 얻어지는 한 특별한 제한은 없지만, 숙성, 건조 공정에서, 결정 함유 분말의 품온은 20 내지 55℃, 분위기의 상대습도는 60 내지 90%로 유지되는 것이 바람직하다. 또한, 숙성, 건조 시간은 양자 합계로 약 5 내지 24시간으로 하는 것이 바람직하다. 또한, 숙성, 건조 공정을 거친 결정 함유 분말은 이어서 실온까지 자연 방랭된다. 또한, 실온 정도의 청정한 공기를 내뿜어 실온 정도의 품온으로까지 강제적으로 냉각하는 것도 유리하게 실시될 수 있다. 얻어진 결정 분말은 그대로, 또는 필요에 따라 분쇄하여 제품화된다.
상기 (가) 내지 (마)의 공정은 상기 (라)의 제어냉각법 또는 의사 제어냉각법에 의한 결정석출공정을 제외하고, 의약부외품급 분말의 제조공정과 기본적으로 동일하며, 시약급 분말의 제조공정에서는 필수로 여겨지는, 재결정공정이나 결정을 반복세정하는 공정은 포함되어 있지 않다.
이렇게 하여 얻어지는 분말은 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.0% 초과, 99.9% 미만 함유하고, 분말 X선 회절 프로파일에 기초하여 산출되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이며, 보다 바람직하게는 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.0% 초과, 99.9% 미만 함유하고, 분말 X선 회절 프로파일에 기초하여 산출되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이며, 또한, 원료 유래의 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코오스를 함유하고, L-아스코르빈산 양이 무수물 환산으로 0.1% 이하이고 분말 전체의 환원력이 1% 미만인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이다. 이러한 분말은 종래의 의약부외품급 분말이 고결되는 조건 하에서도 고결되지 않고, 의약부외품급 분말에 비해 유의적으로 고결되기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이다. 또한, 해당 분말은 시약급 분말에 비해 화장품 및 의약부외품에 일반적으로 사용되는 친수성 용매에 대한 용해성이 우수하다는 이점도 가지고 있다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 종래의 의약부외품급 분말에 비해 유의적으로 고결되기 어려우므로, 분말 원료를 취급하는 것을 전제로 설계된 제조 플랜트를 사용하는 음료를 포함한 식품 제조, 화장품 제조, 의약부외품 제조, 나아가서 의약품 제조의 각 분야에서, 다른 단독 또는 복수의 분말형상의 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 의약품 소재 등에 안심하고 함유시킬 수 있는 뛰어난 이점을 구비하고 있다.
이하, 본 발명에 대하여 실험에 의해 구체적으로 설명한다.
<실험 1: 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 고결성(solidification)에 미치는 결정화도의 영향>
결정화도가 0 내지 100%의 범위에 있는 복수의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 조제하고, 이들의 고결성을 시험함으로써, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에서의 결정화도와 고결성의 관련성을 조사하였다. 세부사항은 이하와 같다.
<실험 1-1 : 피험시료의 조제>
<피험시료 1>
실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어진 표준시료로서, 시약급의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말(상품명 『아스코르빈산 2-글루코시드 999』, 코드 번호: AG124, 순도 99.9% 이상)을 사용하며, 이를 피험시료 1로 하였다.
<피험시료 2>
실질적으로 무정형 부분으로 이루어진 표준시료로서는 피험시료 1을 적량의 정제수에 용해하고, 3일간에 걸쳐 동결건조시킨 후, 40℃ 이하에서 하룻밤 진공건조시켜 얻어진, 실질적으로 무정형 부분으로 이루어진 분말을 사용하고, 이를 피험시료 2로 하였다. 또한, 피험시료 2의 수분 함량을 카알 피셔법(Karl Fischer method)에 의해 측정하였더니, 2.0%이었다.
<피험시료 3, 4>
피험시료 3, 4로서, 결정화도가 피험시료 1과 피험시료 2 사이에 들어가는 것을 이하의 순서로 조제하였다. 즉, 피험시료 2와 동일하게 하여 조제한 무정형 부분으로 이루어진 분말을 금속제 트레이 내에 스프래드하고, 온도 25℃, 상대습도 90%로 조정된 항온, 항습 챔버 내에 24시간 또는 72시간 동안 수용함으로써 결정화를 촉진시켜서, 분말을 부분적으로 결정화시켰다. 그 후, 금속제 트레이를 챔버로부터 꺼내어, 38℃에서 하룻밤 진공건조시킴으로써 2종류의 분말을 조제하였다. 항온, 항습 챔버 내의 수용시간이 24시간인 것을 피험시료 3으로, 72시간인 것을 피험시료 4로 하였다. 또한, 피험시료 3 및 4는 분석시험에 제공하기 직전까지 뚜껑 달린 바이알병(vial) 내에 밀봉하여, 건조제와 함께 데시케이터 내에 밀봉보존하였다.
<실험 1-2: 피험시료 1 내지 4의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도와 결정화도>
<아스코르빈산 2-글루코시드 순도>
피험시료 1 내지 4의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도를 다음과 같이 하여 구하였다. 즉, 피험시료 1 내지 4 중 어느 하나를 정제수에 의해 2% 용액으로 하고, 0.45μm 멤브레인 필터(membrane filter)에 의해 여과한 후, 하기 조건에 의한 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석에 제공하며, 시차굴절계(refractive index detector)에 의한 크로마토그램(chromatogram)에 출현한 피크의 면적으로부터 계산하여 무수물 환산하였다. 결과는 표 1에 나타내었다.
·분석 조건
HPLC 장치:『LC-10AD』(주식회사 시마즈제작소제)
디가서(Degasser):『DGU-12AM』(주식회사 시마즈제작소제)
칼럼:「Wakopak Wakobeads T-330」(와코쥰야쿠공업주식회사 판매 H+형)
샘플 주입량: 10μl
용리액: 0.01%(용적/용적) 질산수용액
유속: 0.5ml/분
온도: 25℃
시차굴절계:『RID-10A』(주식회사 시마즈제작소제)
데이터 처리장치: 『크로마토팩 C-R7A』(주식회사 시마즈제작소제)
<결정화도>
피험시료 1 내지 4에서의 결정화도를 이하와 같이 하여 구하였다. 즉, 시판의 반사광 방식에 의한 분말 X선 회절 장치(스펙트리스 주식회사제, 상품명 『X' Pert PRO MPD』)를 사용하고, Cu 대음극으로부터 방사되는 특성 X선인 CuKα선(X선관전류 40mA, X선관전압 45kV, 파장 1.5405Å)에 의한 분말 X선 회절 프로파일에 기초하며, 동 분말 X선 회절 장치에 탑재된 전용 해석 컴퓨터소프트웨어를 사용하여, 피험시료 1 내지 4의 각각에 대해 하만스법에 의한 결정화도의 해석값을 구하였다. 하만스법에 의한 결정화도의 해석에 앞서, 각 분말 X선 회절 패턴에서의 피크 간의 겹침, 회절 강도, 산란 강도 등을 감안하면서, 최적으로 판단되는 베이스 라인이 얻어지도록, 소프트웨어에 설정된 입상도 및 밴딩 팩터(bending factor)를 각각 적절한 레벨로 맞추었다. 또한, 하만스법에 대해서는 피 에이치 하만스(P. H. Harmans)와 A 바이딩거(A. Weidinger), 「저널 오브 어플라이드 피직스」(Journal of Applied Physics), 제19권, 491~506 페이지(1948년) 및 피 에이치 하만스(P. H. Harmans)와 A 바이딩거(A. Weidinger), 「저널 오브 폴리머 사이언스」(Journal of Polymer Science), 제4권 135~144 페이지(1949년)에 상세하게 서술되어 있다.
피험시료 1에 대한 결정화도의 해석값을 해석값 H100로, 피험시료 2에 대한 결정화도의 해석값을 해석값 H0로 하고, 각 피험시료에 대한 결정화도의 해석값을 Hs로 하여 상기한 식 [1]에 대입함으로써 결정화도를 구하였다. 또한, 피험시료 1에 대한 하만스법에 의한 결정화도의 해석값(해석값 H100) 및 피험시료 2에 대한 동 해석값(해석값 H0)은 각각 70.23% 및 7.57%였다. 결과는 표 1에 함께 나타내었다. 또한, 표준시료인 피험시료 1 및 2에 대해서는, 분말 X선 회절 패턴을 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 피험시료 1의 분말 X선 회절 패턴에서는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 특유한 회절피크가 회절각(2θ) 4 내지 65°의 범위에 명료하고 분명하게 출현하였고, 무정형 부분에 특유한 할로는 전혀 확인되지 않았다. 한편, 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 피험시료 2의 분말 X선 회절 패턴에서는 도 1의 분말 X선 회절 패턴과는 달리, 무정형 부분에 특유한 할로가 베이스 라인의 융기로서 분명하게 출현하였으나, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 특유한 회절피크는 전혀 확인되지 않았다.
<시험 1-3: 피험시료 1 및 2의 싱크로트론 방사광에 의한 분말 X선 회절>
본 실험에서는 피험시료 1 및 2가 각각 해석값 H100 및 H0를 결정하기 위한 표준시료로서 적절한 것임을 더 뒷받침할 목적으로, 이들 피험시료를 싱크로트론 방사광(이하,「방사광」이라고 함)을 X선원에 사용하고, 미약한 회절이나 산란의 시그널을 검출할 수 있는 투과광 방식의 분말 X선 회절에 제공하였다. 또한, 측정조건은 다음과 같았다.
<측정조건>
분말 X선 회절 장치: 고속 분말 X선 회절 장치(코즈정기사 판매, 모델번호 『PDS-16』), 데바이 세러 모드(Debye Scherrer mode), 카메라 길이: 497.2mm
X선원: 편향 전자석으로부터의 방사광(효고현 빔 라인(BL08B2))
측정파장: 0.7717Å(16.066keV)
측정강도: 109포톤/초
측정각: 2 내지 40°
노광시간: 600초간
화상촬영: 이메이징 플레이트(후지필름사제, 상품명 『이메이징 플레이트 BAS-2040』)
화상판독장치: 이미지 애널라이저(후지필름사제, 『바이오이미지 애널라이저 BAS-250』)
측정은 대형 방사광 시설 「SPring-8」(효고현 사요군 사요쵸 코토 1-1-1) 내에 설치된 「효고현 빔 라인(BL08B2)」을 이용하여 실시하였다.
분말 X선 회절의 측정에 앞서, 피험시료 1 및 2를 유발로 갈은 후, 53μm의 체로 걸러서, 체를 통과한 분말을 X선 결정 회절용의 캐필러리(주식회사토호 판매, 상품명 『마크 튜브』, No.14(직경 0.6mm, 린데만글래스(Lindemann glass)제)) 내에 충전길이가 대략 30mm가 되도록 균일하게 충전하였다. 이어서, 캐필러리를 시료의 충전 종단에서 절단하고, 개구부를 접착제로 봉한 후, 시료 마운트에 캐필러리를 점토로 고정하여, 캐필러리의 길이방향이 분말 X선 회절 장치의 광축에 대해서 수직이 되도록 시료 마운트를 분말 X선 회절 장치에 설치하였다.
아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 배향에 의한 분말 X선 회절 프로파일에 대한 영향을 제거하기 위해, 측정 중 캐필러리의 길이방향으로 1회/60초의 주기로 시료 마운트를 ±1.5mm의 폭으로 등속 왕복진동시키면서, 캐필러리의 길이방향을 회전축으로 하여 시료 마운트를 2회/초의 주기로 등속 회전시켰다.
피험시료 1 및 2에 대하여 얻어진 분말 X선 회절 프로파일을 해석하여 분말 X선 회절 패턴을 작성하는 과정에서는 측정 정확도를 높이기 위해서, 통상의 방법에 따라 각 분말 X선 회절 프로파일로부터 분말 X선 회절 장치에서 유래하는 백그라운드 시그널을 제거하였다. 이렇게 하여 얻어진 피험시료 1 및 2에 대한 분말 X선 회절 패턴을 각각 도 3 및 도 4에 나타낸다.
도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 방사광을 사용한 분말 X선 회절에 의한 피험시료 1에 대한 분말 X선 회절 패턴에서는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 특유한 회절피크가 회절각(2θ) 2 내지 40°의 범위에 명료하고 분명하게 출현하였다. 도 3과 도 1을 비교하면, 방사광의 파장(0.7717Å)과 특성 X선의 파장(1.5405Å)이 다르기 때문에, 도 3에서는 도 1의 거의 2분의 1의 회절각(2θ)으로 각 회절피크가 출현한다는 차이는 있으나, 도 1 및 도 3에서의 회절 패턴은 상당히 잘 일치하였다. 또, 도 3에서의 각 회절피크의 강도는 도 1에서의 회절피크의 강도보다 100배 가까이 강력함에도 불구하고, 각 회절피크의 반값폭은 도 1에서보다 분명히 좁고 분리도도 높았다. 또, 도 3의 분말 X선 회절 패턴에서는 후술하는 도 4에 도시한 바와 같이 무정형 부분에 특유한 할로는 전혀 확인되지 않았다. 이것은 피험시료 1 중의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 결정성이 상당히 높고, 피험시료 1이 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 것을 나타내고 있다.
한편, 도 4에 나타낸 바와 같이, 방사광을 사용한 분말 X선 회절에 의한 피험시료 2에 대한 분말 X선 회절 패턴에서는 무정형 부분에 특유한 할로가 베이스 라인의 융기로서 분명하게 출현하였고, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 특유한 회절피크는 전혀 확인되지 않았다. 이는 피험시료 2가 실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 것을 나타내고 있다.
방사광을 X선원으로 사용하여 얻어진 상기의 결과는 피험시료 1 및 피험시료 2가 식 [1]에서의 해석값 H100 및 해석값 H0를 결정하기 위한 표준시료로서 적절한 것임을 뒷받침하고 있다.
<실험 1-4: 고결성 시험>
피험시료 1 내지 4의 각각에 대해 그 고결성을 조사할 목적으로 이하의 실험을 실시하였다. 즉, 실험 1-1에서 조제한 피험시료 1 내지 4를 1g씩 칭량 채취하고, 각각 별개로 내부 바닥이 반구형상인 14ml의 뚜껑 달린 폴리프로필렌제 원통 튜브(벡톤 디킨슨사 판매, 상품명 『팔콘 튜브 2059』, 직경 1.7cm, 높이 10cm)의 내부에 충전하고, 튜브를 튜브랙(tube rack)에 직립시킨 상태로 50℃의 인큐베이터(어드번택토요주식회사 판매, 상품명 『CI-410』) 내부에 수용하여, 24시간에 걸쳐서 정치한 후, 튜브를 인큐베이터 밖으로 꺼내고, 튜브로부터 뚜껑을 제거하여 튜브를 완만하게 거꾸로 함으로써, 피험시료를 흑색 플라스틱제 평판 상에 꺼내고, 꺼낸 피험시료의 상태를 육안으로 관찰하였다.
고결의 유무는 피험시료가 평판 상에서도 여전히 튜브내 바닥부의 반구형상을 분명하게 유지하고 있는 경우를 「고결 있음」(+), 피험시료가 튜브내 바닥부의 형상을 근소하지만 식별할 수 있는 경우를 「다소 고결 있음」(±), 피험시료가 붕괴하여 튜브내 바닥부의 형상을 유지하고 있지 않은 경우를 「고결 없음」(-)로 판정하였다. 결과는 표 1에서의 「고결성」 란에 나타낸 바와 같다.
피험시료 1 2 3 4
아스코르빈산
2-글루코시드 순도(%)		 99.9 99.1 99.1 99.1
결정화도(%) 100.0 0.0 88.3 93.1
고결성 - + + -
표 1에 나타난 바와 같이, 해석값 H100을 결정하기 위한 표준시료로 한 피험시료 1(결정화도 100.0%)는 평판 상에 꺼내면 붕괴하고, 튜브내 바닥부의 형상을 유지하고 있지 않아 「고결 없음」(-)으로 판단되었다. 이에 대해, 해석값 H0를 결정하기 위한 표준시료로 한 피험시료 2(결정화도 0.0%)는 튜브로부터 평판 상에 꺼내어도 여전히 튜브내 바닥부의 반구형상을 명확하게 유지하고 있어서 명백하게 「고결 있음」(+)으로 판단되었다. 평판 상에 꺼내어진 피험시료 2가 유지하고 있는 튜브내 바닥부의 반구형상의 형태는 평판에 가볍게 진동을 준 정도로는 붕괴하지 않을 정도였다.
결정화도가 88.3%인 피험시료 3은 피험시료 2와 마찬가지로 튜브로부터 평판 상에 꺼내어도 여전히 튜브내 바닥부의 반구형상을 명확하게 유지하고 있어서 명백하게 「고결 있음」(+)로 판단되었으나, 결정화도가 93.1%인 피험시료 4는 피험시료 1과 마찬가지로 평판 상에 꺼내자마자 붕괴하여 「고결 없음」(-)로 판단되었다.
또한, 피험시료 2 내지 4는 상술한 바와 같이 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 99.9%의 피험시료 1을 베이스로 하여 조제한 것이지만, 상술한 HPLC 분석에 따르면, 그들 아스코르빈산 2-글루코시드 순도는 모두 99.1%에 머물렀다. 그 이유는 확실하지 않으나, 조제 도중에 어떠한 이유로 아스코르빈산 2-글루코시드가 극히 미량이지만 분해 등을 통해 없어진 것으로 추측된다.
상기의 결과는 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 99.1% 이상 함유하는 분말의 경우, 결정화도가 높을수록 고결성이 낮은 경향이 있음을 나타내고 있으며, 결정화도가 88.3%인 피험시료 3이 「고결 있음」(+)로 판단되고, 결정화도가 93.1%인 피험시료 4가 「고결 없음」(-)로 판단되었다는 사실은 상기 고결성 시험에서 「고결 있음」(+)로부터 「고결 없음」(-)로 바뀌는 임계점이 결정화도 88.3%와 93.1%의 사이에 있다는 것을 나타내고 있다.
<실험 2: 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 고결성과 결정화도의 관계>
본 실험에서는 실험 1의 결과에 기초하여 고결성과 결정화도의 관계를 더욱 상세하게 조사하기 위해서, 결정화도가 0 내지 100%의 범위에 있고, 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도가 99.1 내지 99.9%인 7종류의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 사용하여, 실험 1에서와 마찬가지로 고결성에 대해 시험하였다.
<실험 2-1: 피험시료의 조제>
실험 1-1에서 조제한 피험시료 1과 피험시료 2를 각각 적량 덜어서 균일하게 혼합함으로써, 표 2에 나타내는 피험시료 5 내지 9의 분말을 조제하였다. 실험 1-2에 기재한 방법에 따라 구한 피험시료 5 내지 9의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도와 결정화도는 표 2에 나타낸 바와 같았다. 또한, 표 2에서의 피험시료 1 및 2에 대한 결과는 표 1로부터 옮겨 적었다.
<실험 2-2: 고결성 시험>
피험시료 5 내지 9를 실험 1-4의 고결성 시험에 제공하였다. 결과를 표 2의 「고결성」란에 나타내었다. 또한, 표 2에서의 피험시료 1 및 2에 대한 「고결성」은 표 1에 기재한 피험시료 1 및 2에 대한 고결성 시험 결과를 그대로 옮겨 적은 것이다.
피험시료 1 2 5 6 7 8 9
아스코르빈산
2-글루코시드 순도(%)		 99.9 99.1 99.8 99.7 99.6 99.5 99.4
결정화도(%) 100.0 0.0 99.8 92.6 91.5 89.2 29.9
고결성 - + - - - ± +
표 2의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 결정화도가 29.9%인 피험시료 9는 「고결 있음」(+)로 판단되고, 결정화도가 89.2%인 피험시료 8은 「다소 고결 있음」(±)로 판단되었다. 이에 반해, 결정화도가 91.5%인 피험시료 7, 결정화도가 92.6%인 피험시료 6 및 결정화도가 99.8%인 피험시료 5는 모두 피험시료 1과 마찬가지로 「고결 없음」(-)로 판단되었다. 이들 결과는 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 99.1% 이상 99.9% 미만 함유하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 있어서 결정화도가 90% 이상인 경우, 본 실험 조건 하에서는 고결되지 않음을 나타내고 있다.
<실험 3: 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 결정화도에 미치는 아스코르빈산 2-글루코시드 순도의 영향>
선행하는 실험에 의해, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 99.1% 이상이라는 고순도의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 있어서, 다른 결정화도의 것이 존재함이 분명히 밝혀졌으므로, 본 실험에서는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 결정화도와 아스코르빈산 2-글루코시드 순도와의 관계에 대해 검토하였다. 또한, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도와 고결성의 관계에 대해서도 검토하였다.
<실험 3-1: 피험시료의 조제>
이하와 같이 하여, L-아스코르빈산과 덱스트린을 함유하는 수용액으로부터, 표 3에 나타낸 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 서로 다른 피험시료 10 내지 15를 조제하였다.
즉, 덱스트린(마츠야화학공업주식회사 판매, 상품명『파인덱스＃100』) 4질량부를 물 15질량부에 가열 용해하고, L-아스코르빈산 3질량부를 첨가하며, pH5.5, 액온을 55℃로 유지하면서, 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-62주 유래의 CGTase를 덱스트린 1g당 100단위, 그리고 이소아밀라아제(주식회사 하야시바라생물화학연구소 판매)를 덱스트린 1g당 250단위 첨가하고 50시간 반응시켜, 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성시켰다. 또한, 반응액 중에는 2-O-α-말토실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토트리오실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토테트라오실-L-아스코르빈산 등의α-글리코실-L-아스코르빈산류도 당연히 생성되고 있다고 추측된다.
반응액을 가열함으로써 효소를 실활시킨 후, pH4.5로 조정하고, 글루코아밀라아제(상품명 『글루쿠자임 AF6』아마노엔자임주식회사 판매)를 덱스트린 1g당 50단위 첨가하여 24시간 반응시킴으로써, 상기와 같이 α-글리코실-L-아스코르빈산류를 아스코르빈산 2-글루코시드로까지, 또, 혼재하는 올리고당을 D-글루코오스로까지 분해하였다. 이 시점에서 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드에 대한 생성률은 39%였다.
반응액을 가열함으로써 글루코아밀라아제를 실활시키고, 활성탄으로 탈색 여과한 후, 여과액을 양이온 교환수지(H+형)의 칼럼에 통액하여 탈염한 후, 음이온 교환수지(OH-형)에 L-아스코르빈산 및 아스코르빈산 2-글루시코드를 흡착시키고, 물세척하여 D-글루코오스를 제거한 후, 0.5N 염산 용액을 이용하여 용출하였다. 또한, 이 용출액을 고형분 약 50%로까지 농축하고, 이어서 강산성 양이온 교환수지(다우케미컬사 제조, 상품명 『다웩스(DAWEX) 50WX4』, Ca2 +형)를 사용하는 칼럼크로마토그래피에 제공하였다. 칼럼에 그 습윤수지 용적의 약 1/50 양만큼 부하하고, 부하량의 50배의 정제수를 1m/시간의 선속도로 통액하여 용출액을 칼럼용적의 0.05 용적량씩 분획하였다. 그런 다음, 각 분획의 조성을 실험 1-2에서 기술한 HPLC법에 따라 측정하고, 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드 함량이 80% 이상인 6분획에 대해, 그들을 약 76%의 농도까지 감압 농축하여, 얻어진 농축액을 결정관에 덜고, 종정으로서 실험 1-1에서의 피험시료 1을 2%씩 첨가하여, 농축액을 완만하게 교반하면서, 2일간에 걸쳐 액온을 40℃에서부터 15℃로까지 약 2일간에 걸쳐 자연 냉각하고, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시켰다.
그 후, 통상의 방법에 따라 바스켓형 원심분리기에 의해 마세큐트로부터 결정을 채취하고, 소량의 증류수로 세정한 후 숙성, 건조시켜, 25℃의 공기를 30분 동안 내뿜어 냉각하고 분쇄함으로써, 표 3에 나타낸 피험시료 10 내지 15를 얻었다. 또한, 피험시료 16으로서, 종래의 의약부외품급 분말인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말(상품명 『AA2G』 주식회사 하야시바라생물화학연구소 판매)을 사용하였다.
피험시료 1 2 10 11 12 13 14 15 16
아스코르빈산 2-글루코시드 순도(%) 99.9 99.1 97.4 98.0 98.6 99.1 99.5 99.7 98.9
결정화도(%) 100.0 0.0 88.7 89.0 91.6 94.8 99.4 99.5 88.9
고결성 - + + ± - - - - ±
보존성 - + + - - - - +
또한, 표 3에 나타낸 피험시료 1 및 2는 실험 1-1에서와 동일한 것이며, 이들 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도, 결정화도는 선행하는 실험에서 얻은 결과를 그대로 옮겨 적은 것이다. 또, 피험시료 10 내지 16의 고결성을 실험 1-4에서와 동일한 방법으로 시험하였다. 결과를 표 3에 나타낸다. 또한, 표 3에 나타낸 시험시료 1 및 2에 대한 고결성 실험의 결과는 표 1에서의 것을 그대로 옮겨 적은 것이다.
<실험 3-2: 보존성 시험>
실험 1-4 등에서 이루어진 고결성 시험이, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 실제 보존시의 고결성을 평가하는 시험으로서 타당한 것임을 확인하기 위해, 실험 1-1의 방법으로 얻은 피험시료 1, 시험 3-1에서 얻은 피험시료 10 내지 15 및 피험시료 16에 대해, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 실제로 보존되는 상태, 환경, 기간 등을 상정한 보존성 시험을 실시하였다.
즉, 피험시료 1 및 피험시료 10 내지 16을 10kg씩 취하여, 각각을 2중 폴리에틸렌 봉지(세로 800mm×가로 600mm)에 넣은 것을 각 피험시료당 1봉지씩 제작하였다. 그 다음에 각 폴리에틸렌 봉지를 개구부를 위로 향하게 하고, 개구한 채로 닫지 않고 스틸캔에 넣어(18리터용) 스틸캔의 뚜껑을 덮지 않고 정치하여, 고온다습을 피해 실내에서 45일간 보존하였다. 45일간 보존한 후, 스틸캔으로부터 각 피험시료가 든 폴리에틸렌 봉지를 꺼내고, 봉지로부터 피험시료를 흑색 플라스틱제 평판 상에 꺼내어, 그 때의 피험시료의 유동성과 고결상태를 육안으로 관찰하였다.
고결의 유무는 피험시료 중에 덩어리 물질이 확인되고, 보존 개시시에 비해 유동성이 저하되어 있는 경우를 「고결 있음」(+)으로 판정하고, 덩어리 물질이 확인되지 않고 보존 개시시에 비해 유동성에 변화가 없는 경우를 「고결 없음」(-)으로 판정하였다. 또한, 본 보존시험에서의 각 피험시료의 보존형태는 개구부를 고무 밴드로 막고 있지 않은 점, 건조제를 넣지 않은 점, 및 스틸캔의 뚜껑을 덮고 있지 않은 점을 제외하고, 의약부외품급 분말의 상품형태와 동일하며, 실제로 시장에 유통하여 보존될 때의 형태와 동일하다. 또한, 상기 3개의 상이점은 시험 결과를 조기에 얻을 수 있도록 보존시험에서의 보존환경을 실제의 보존환경보다 다소 가혹하게 하기 위해 설정된 상이점이다. 결과를 표 3에 함께 나타내었다.
표 3에 나타난 바와 같이, 실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 피험시료 2 및 의약부외품급의 분말인 피험시료 16을 제외하고, 나머지 피험시료 1 및 피험시료 10 내지 15에서는 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 높아짐에 따라 결정화도가 높아지는 경향이 있다. 또한, 고결성 시험에서 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 각각 97.4% 및 98.0%인 피험시료 10 및 11이 「고결 있음」(+) 또는 「다소 고결 있음」(±)으로 판단된 것에 반해, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 98.6 내지 99.7%인 피험시료 12 내지 15는 「고결 없음」(-)로 판단되었다. 이들 결과는 고결성을 좌우한다고 생각되는 아스코르빈산 2-글루코시드 순도에 대한 역치가 98.0% 부근에 있음을 나타내고 있고, 「고결 없음」(-)로 평가되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻기 위해서는 98.0%를 초과하는 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 필요하다고 결론지을 수 있다.
또, 피험시료 12 내지 15의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도는 98.6 내지 99.7%이고, 의약부외품급의 분말인 피험시료 16의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 98.9%와 거의 동일한 레벨이며, 시약급의 분말이고 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 피험시료 1의 순도보다 유의적으로 낮음에도 불구하고, 피험시료 1과 마찬가지로 고결은 전혀 확인되지 않았다. 또한, 피험시료 12 내지 15의 결정화도는 91.6 내지 99.5%로서 90% 이상이나, 의약부외품급의 분말인 피험시료 16의 결정화도는 88.9%와 90%를 밑돌았다. 이들 결과로부터 의약부외품급의 분말인 피험시료 16보다 유의적으로 고결되기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻기 위해서는 결정화도를 90% 이상으로 할 필요가 있다고 판단된다.
또한, 표 3의 최하단에 나타낸 바와 같이, 각 피험시료를 실제의 상품 형태를 모방하여 10kg을 봉지에 가득 담은 상태로 45일간 보존한 보존성 시험에서도, 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도가 각각 97.4% 및 98.0%인 피험시료 10 및 11이 「고결 있음」(+)로 판단된 것에 반해, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 98.6 내지 99.7%인 피험시료 12 내지 15는 「고결 없음」(-)로 판단되어, 고결성 시험과 마찬가지의 결과가 얻어졌다. 이 사실은 실험 1-4 등에서의 고결성 시험이 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 실제 보존환경 하에서의 고결성을 평가하는 시험으로서 타당한 것임을 나타내고 있다.
<실험 4: 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 환원력과 착색의 관계>
선행하는 실험에서 사용한 피험시료는 모두, L-아스코르빈산과 전분질을 포함하는 용액에 CGTase를 작용시키는 공정을 거쳐 얻어진 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액으로부터 조제되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이다. 이와 같은 제법에 따를 경우, 얻어지는 분말에는 양의 많고 적음은 둘째치고, 제조방법에 특유의 협잡물인 L-아스코르빈산 및 D-글루코오스가 포함되게 된다. L-아스코르빈산이나 D-글루코오스는 모두 환원성을 가지고 있으며, 포함되는 양에 따라서도 다르지만, 단백질이나 아미노산 등의 아미노기를 갖는 화합물을 포함하는 제품에 사용한 경우, 제품에 부적당한 변색을 초래할 우려가 있다. 그 중에서도 L-아스코르빈산은 산소와의 반응성이 높고, 이를 사용한 제품에 부적당한 변색을 초래할 뿐만 아니라, 종래의 의약부외품급의 분말을 장기간 보존한 경우에 때때로 확인된 분말 자체의 착색의 원인이 되기도 한다고 생각된다.
이에, 본 실험에서는 선행하는 실험에서 사용한 피험시료 1 및 피험시료 12 내지 16에 대해, 이들 분말에서의 L-아스코르빈산과 D-글루코오스의 합계량, L-아스코르빈산의 양, 나아가 분말 전체의 환원력과 착색성의 관계에 대해, 하기의 순서대로 가열처리에 의한 가속시험을 실시함으로써 검토하였다.
10ml의 나사뚜껑 달린 시험관 내에 각 시험시료를 무수물 환산으로 150mg씩 칭량하여 채취하고, 시험관의 개구부를 막은 상태로 오븐(마스다이화주식회사 판매, 상품명 『DRYING-OVEN SA310』 내에 수용하여, 80℃에서 3일간 가온하였다. 이어서, 시험관으로부터 나사뚜껑을 분리하고, 각 피험시료에 탈이온수를 3ml씩 첨가하여 용해시킨 후, 분광 광도계(주식회사 시마즈제작소 판매, 상품명 『UV-2400PC』)에 의해 400nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다. 가온에 수반되는 착색의 정도는 400nm 파장에서의 흡광도의 수치가 0.50 미만인 경우: 「착색되지 않거나, 혹은 실질적으로 착색되지 않는다」(-), 상기 흡광도의 수치가 0.50 이상인 경우 : 「착색된다」(+)의 2단계로 판정하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
또한, 각 피험시료중의 L-아스코르빈산과 D-글루코오스의 합계량은 실험 1-1에서 서술한 HPLC법에 의해 결정하였다. 또한, 분말 전체의 환원력에 대해서는 D-글루코오스를 표준물질로서 사용하며, 이 분야에서 일반적으로 사용되고 있는 소모지-넬슨법(Somogyi Nelson's method) 및 안트론 황산법에 의해 각각 환원당량 및 전체당량을 측정하고, 이들을 상술한 식 [3]에 대입하여 계산함으로써 구하였다. 각 피험시료에서의 L-아스코르빈산과 D-글루코오스의 합계량, L-아스코르빈산의 양 및 분말 전체의 환원력은 표 4에 나타낸 대로였다.
피험시료 1 12 13 14 15 16
조성(%)
(무수물
환산)

 아스코르빈산
2-글루코시드		 99.9 98.6 99.1 99.5 99.7 98.9
L-아스코르빈산과 D-글루코오스의 합계
(L-아스코르빈산)		 0.0
(0.0)		 0.2
(0.1)		 0.1
(<0.1)		 0.1
(<0.1)		 0.1
(0.0)		 0.3
(0.2)
기타 0.1 1.2 0.8 0.4 0.3 0.8
분말전체의 환원력(%) 0.05 0.98 0.86 0.2 0.12 1.12
착색성 - - - - - +
표 4에 나타낸 바와 같이, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에서는 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어진 시약급의 분말인 피험시료 1에서는 L-아스코르빈산 및 D-글루코오스 양은 모두 검출한계 이하였다. 이에 반해, 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 피험시료 12 내지 15, 및 종래의 의약부외품급 분말인 피험시료 16에서는 어느 분말에서도 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코오스가 검출되었다. 게다가, 이러한 분말에서는 피험시료 12 내지 15와 같이, L-아스코르빈산과 D-글루코오스의 합계량이 무수물 환산으로 0.2% 이하인 경우에는 「착색되지 않거나, 혹은 실질적으로 착색되지 않는다」(-)로 판단된 것에 반해, 피험시료 16과 같이, L-아스코르빈산과 D-글루코오스의 합계량이 무수물 환산으로 0.3%에 도달하면, 「착색된다」(+)로 판단되었다. 또한, 이러한 분말의 착색성에 가장 강하게 관여한다고 생각되는 L-아스코르빈산에 관해서는, 피험시료 12 내지 15와 같이 그 함량이 무수물 환산으로 0.1% 이하인 경우에는 「착색되지 않거나, 혹은 실질적으로 착색되지 않는다」(-)로 판단된 것에 반해, 피험시료 16과 같이 L-아스코르빈산 양이 무수물 환산으로 0.2%에 도달하면, 「착색된다」(+)로 판단되었다. 또한, 이미 기술한 바와 같이, L-아스코르빈산은 산소와의 반응성이 높고 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 착색에 관여하고 있다고 생각되므로, L-아스코르빈산 양이 0% 초과, 0.1% 이하인 경우에는 이러한 분말을 종래의 의약부외품급 분말의 상품형태로 장기간 보존할 경우, 실질적인 착색을 걱정하지 않아도 된다고 판단되었다.
한편, 환원력 측면에서 보면, 피험시료 12 내지 15와 같이 분말 전체의 환원력이 0% 초과, 1% 미만인 경우, 「착색되지 않거나, 혹은 실질적으로 착색되지 않는다」(-)로 판단된 것에 반해, 피험시료 16과 같이 분말 전체의 환원력이 1%를 초과하면, 「착색된다」(+)로 판단되었다. 그 결과는 상기한 L-아스코르빈산과 D-글루코오스의 합계량을 지표로 해서 판정한 결과와 잘 일치하였다.
이상의 결과는 제조방법에 기인하여, 불가피적으로, L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코오스를 검출할 수 있는 레벨로 포함하고 있어도, 분말 전체의 환원력을 0% 초과, 1% 미만으로 할 경우에는 착색의 우려가 없는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻을 수 있음을 나타내고 있다. 또한, 사용한 제품의 착색뿐만 아니라, 분말 자체의 착색이라는 관점을 포함하면, L-아스코르빈산의 함량은 무수물 환산으로 0% 초과, 0.1% 이하가 바람직함을 나타내고 있다.
<시험 5: 결정석출시의 냉각방법이 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 결정화도에 미치는 영향>
결정석출시의 냉각방법이 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 결정화도에 미치는 영향을 조사하기 위해, 하기에 나타낸 방법에 따라, 표 5에 나타낸 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말(피험시료 17 내지 22)을 조제하였다. 또한, 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 실험 1-2의 방법으로 측정하였다.
<피험시료의 조제방법>
(1) 피험시료 17
후술하는 참고예 1의 방법에 있어서, CGTase 및 이소아밀라아제의 작용시간을 참고예 1의 절반인 25시간째에서 정지하고, 아스코르빈산 2-글루코시드 함량 86% 이상으로까지 정제한 후, 아스코르빈산 2-글루코시드를 포함하는 용액을 농도 약 76%까지 감압 농축한 점, 및 얻어진 농축액을 주위에 자켓 탱크를 배치한 결정관으로 옮기고, 자켓 탱크 내의 수온을 조정함으로써, 1.5일간에 걸쳐 40℃로부터 30℃로 완만하게 냉각한 후, 0.5일간에 걸쳐 30℃로부터 15℃로 급속하게 냉각하는 의사 제어냉각법에 의해 결정을 석출시킨 점 이외에는 후술하는 참고예 1에서와 마찬가지로 하여 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 피험시료 17을 조제하였다. 또한, 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 25.3%이었다.
(2) 피험시료 18
후술하는 실시예 1의 방법에서, 원료로서 사용한 액화 감자전분을 덱스트린(마츠야화학공업주식회사 판매, 상품명 『파인덱스＃100』)으로 바꾼 점, 및 효소반응후의 용액을 정제, 감압 농축한 후, 40℃에서 15℃까지 약 2일간에 걸쳐 자연냉각하여 결정을 석출시킨 점 이외에는 실시예 1에서와 마찬가지로 하여 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 피험시료 18을 조제하였다. 또한, 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 27.0%이었다.
(3) 피험시료 19
효소반응 후의 용액을 정제, 감압 농축한 후, 주위에 자켓 탱크를 배치한 결정관으로 옮기고, 자켓 탱크 내의 수온을 조정함으로써, 1.5일간에 걸쳐 40℃로부터 30℃로 완만하게 냉각한 후, 0.5일간에 걸쳐 30℃로부터 15℃로 급속하게 냉각하는 의사 제어냉각법에 의해 결정을 석출시킨 점 이외에는 피험시료 18과 마찬가지로 하여 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 피험시료 19를 조제하였다. 또한, 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 27.0%이었다.
(4) 피험시료 20
후술하는 실시예 4의 방법에서, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 결정석출시킬 때, 아스코르빈산 2-글루코시드를 포함하는 용액을 농도 약 76%로까지 감압 농축하고, 얻어진 40℃의 용액을 결정관으로 옮긴 후, 40℃로부터 15℃까지 약 2일간에 걸쳐 자연냉각하여 결정을 석출시킨 것 이외에는 실시예 4에서와 마찬가지로 하여 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 피험시료 20을 조제하였다. 또한, 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 32.5%이었다.
(5) 피험시료 21
효소반응 후의 용액을 정제, 감압 농축한 후, 주위에 자켓 탱크를 배치한 결정관으로 옮기고, 자켓 탱크 내의 수온을 조정함으로써, 1.5일간에 걸쳐 40℃로부터 30℃로 완만하게 냉각한 후, 0.5일간에 걸쳐 30℃로부터 15℃로 급속하게 냉각하는 의사 제어냉각법에 의해 결정을 석출시킨 점 이외에는 피험시료 20과 마찬가지로 하여 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 피험시료 21을 조제하였다. 또한, 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 32.5%이었다.
(6) 피험시료 22
실험 3-1에서의 피험시료의 조제방법에서, CGTase와 이소아밀라아제에 의한 효소반응을 반응 30시간에 정지하고, 정제하여 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 86.2%까지 높인 용액을, 농도 약 76%로까지 감압농축하고, 얻어진 40℃의 용액을 결정관으로 옮긴 후, 40℃에서부터 15℃까지 약 2일간에 걸쳐 냉각하는 자연냉각법에 의해 결정을 석출시킨 것 이외에는 실험 3-1에서와 마찬가지로 하여 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 피험시료 22를 조제하였다. 또한, 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 35.3%이었다.
<아스코르빈산 2-글루코시드 순도 및 결정화도의 측정>
실험 1-2에서와 마찬가지의 방법에 의해, 피험시료 17 내지 22의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도, 및 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도를 측정하였다.
<평균 결정자 지름>
피험시료 17 내지 22의 평균 결정자 지름을 이하의 방법에 따라 측정하였다. 이미 기술한 식 [2]에 의한 산출을 위해, 각 피험시료의 결정화도의 측정에 사용한 분말 X선 회절 프로파일에 기초하여 작성된 회절 패턴에 있어서, 도 1의 부호 a 내지 e로 나타낸 회절피크에 해당하는, 회절각(2θ) 10.4°(미러지수(hkl):120), 13.2°(미러지수: 130), 18.3˚(미러지수: 230), 21.9˚(미러지수: 060) 및 22.6˚(미러지수: 131)로 검출되는 5개의 회절피크에 대한 반값폭과 회절각(2θ)에 대해, 분말 X선 회절장치(스펙트리스주식회사제, 상품명 『X' Pert PRO MPD』)에 부속하는 해석처리용 컴퓨터 소프트웨어 『X' pert Highscore Plus』를 사용하여 처리한 후, 동일 소프트웨어 중의 '셰러(Scherrer)의 식'에 의한 프로그램으로, 이들 피험시료에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 평균 결정자 지름을 산출하였다.
이상의 결과를 표 5에 나타내었다.
피험시료 17 18 19 20 21 22
아스코르빈산 2-글루코시드 생성률(%) 25.3 27.0 27.0 32.5 32.5 35.3
아스코르빈산 2-글루코시드
순도(%)		 98.6 98.5 99.2 98.3 99.3 99.6
결정화도(%) 86.0 88.5 90.7 87.3 92.1 98.9
평균 결정자
지름(Å)		 1,410 1,220 1,450 1,250 1,650 1,705
표 5에 나타낸 바와 같이, 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 27.0% 또는 32.5%인 효소반응액을 정제, 농축한 후, L-아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액으로부터 의사 제어냉각법에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시켜 조제한 피험시료 19 및 21은 결정화도가 90%를 초과하고 평균 결정자 지름은 각각 1,450Å 및 1,650Å이었다. 이에 반해, 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 25.3%인 효소반응액을 정제, 농축한 후, L-아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액으로부터 동일하게 의사 제어냉각법에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시켜 조제한 피험시료 17은, 평균 결정자 지름은 1,410Å로 비교적 컸지만, 결정화도는 90%를 만족하지 않았다. 또한, 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 피험시료 19 및 21과 동일하게 27.0% 또는 32.5%인 효소반응액을 정제, 농축한 후, L-아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액으로부터 자연냉각법에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시켜 조제한 피험시료 18 및 20은 결정화도가 90%를 만족하지 않고, 평균 결정자 지름이 각각 1,220Å 및 1,250Å로 모두 낮았다. 한편, 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 35.3%인 효소반응액을 정제, 농축한 후, L-아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액으로부터 자연냉각법에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시켜 조제한 피험시료 22는 결정화도가 98.9%로 높고, 평균 결정자 지름도 1,705Å로 높았다.
실험 5의 결과는 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 동일한 반응액으로부터 조제한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말일지라도, 의사 제어냉각법에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시킨 경우 쪽이 자연냉각에 의해 석출시킨 경우보다도 결정화도가 높고, 또한, 평균 결정자 지름도 커지는 것을 나타내고 있다. 또한, 자연냉각에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시키는 경우에는 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 35%를 초과하지 않으면, 결정화도가 90%를 초과하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 얻어지지 않는 것에 반해, 결정석출시에 의사 제어냉각법을 적용할 경우에는 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 35%를 만족하지 못하는 32.5%(피험시료 21)나 27.0%(피험시료 19)일지라도, 결정화도가 90%를 초과하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 얻어지고 있다. 이들 결과는 의사 제어냉각법이 결정화도의 상승이나 결정자 지름의 증대에 유효하며, 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 27.0% 이상이면, 정제, 농축 후, 의사 제어냉각법 또는 제어냉각법을 사용함으로써, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90%를 초과하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻을 수 있음을 나타내고 있다. 또한, 피험시료 19 및 21은 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도가 98.0% 초과, 99.9% 미만의 범위 내에 있으며 결정화도가 90%를 초과하고 있으므로, 종래의 의약부외품급의 분말에 비해 유의적으로 고결되기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이다.
<실험 6: 평균 결정자 지름이 친수성 용매에 대한 용해성에 미치는 영향>
피험시료로서, 상기 실험에서 사용한 피험시료 17 내지 22, 후술하는 실시예 1 내지 4의 방법으로 제조한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말, 실험 1-1에서 조제한 피험시료 1 및 실험 3-1에서 사용한 피험시료 16(의약부외품급의 분말)을 사용하여, 화장품이나 의약부외품에서 일반적으로 사용되고 있는 친수성 용매에 대한 용해성을 조사하였다.
즉, 상기 피험시료 혹은 실시예 1 내지 4의 분말 중 어느 하나를 각각 0.25g 칭량하고, 내부 바닥이 반구형상인 14ml의 뚜껑 달린 폴리프로필렌제 원통 튜브(벡톤 디킨슨사 판매, 상품명 '팔콘 튜브 2059'에 넣었다. 각각의 시료를 넣은 튜브에, 1,3-부틸렌글리콜(와코쥰야쿠공업주식회사제, 시약특급)을 탈이온수로 30% 농도로 희석한 것을 5ml 첨가하고, 50℃의 항온 수조에서 30분간 가온한 후, 2회 거꾸로 하여, 50℃에서 15분간 유지하고, 육안에 의해 분말이 완전히 용해되었다고 간주되는 경우를 「용해성 양호」(-)로 판정하고, 불용물의 잔존이 확인되는 경우를 「용해성 불량」(+)로 판정하였다. 이 불용물의 잔존이 확인되는 경우, 다시 50℃에서 15분간 유지하고, 그때 분말이 완전히 용해되었다고 간주되는 경우에는 「용해성 약간 불량」(±)로 판정하였다. 결과를 표 6에 나타내었다.
또한, 상기 피험시료 혹은 실시예 1 내지 4의 분말을 사용하여, 실험 1-4 및 실험 3-2의 방법에 의해, 고결성 시험 및 보존성 시험을 실시하였다. 결과를 합쳐 표 6에 나타내었다. 또한, 피험시료 1 및 16에 대한 평균 결정자 지름은 실험 5의 방법으로 측정하고, 표 6에 합쳐 나타내었다. 또한, 피험시료 1 및 16에 대한 아스코르빈산 2-글루코시드 순도, 결정화도, 고결성 및 보존성의 결과는 표 3에 기재한 피험시료 1 및 16에 대한 결과를 그대로 옮겨 적은 것이다.
피험시료 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률(%) 아스코르빈산 2-글루코시드 순도(%) 결정화도
(%)		 평균 결정자
지름(Å)		 용해성 고결성 보존성
1 99.9 100 1,770 + - -
16 98.9 88.9 1,380 - + +
17 25.3 98.6 86.0 1,410 - + +
18 27.0 98.5 88.5 1,220 - + +
19 27.0 99.2 90.7 1,450 - - -
20 32.5 98.3 87.3 1,250 - + +
21 32.5 99.3 92.1 1,650 - - -
22 35.3 99.6 98.9 1,705 ± - -
실시예1 28.0 99.3 90.3 1,460 - - -
실시예2 29.5 99.5 91.0 1,540 - - -
실시예3 31.0 99.2 91.5 1,610 - - -
실시예4 32.5 99.7 92.4 1,670 - - -
표 6에 나타낸 바와 같이, 평균 결정자 지름이 1,670Å 이하인 피험시료 16 내지 21 및 후술의 실시예 1 내지 4의 분말은 「용해성 양호」(-)로 판정되었다. 이에 반해, 평균 결정자 지름이 1,705Å인 피험시료 22는 「용해성 불량」(±)으로 판정되었다. 평균 결정자 지름이 1,770Å인 피험시료 1(시약급의 분말)은 「용해성 불량」(+)로 판정되었다. 또한, 피험시료 1, 19, 21, 22, 및 실시예 1 내지 4의 분말은 고결성 시험 및 보존성 시험에서, 「고결되지 않는다」(-)로 판정된 것에 반해, 피험시료 16 내지 18 및 20은 「고결된다」(+)로 판정되었다. 이 결과로부터, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 친수성 용매에 대한 용해성에 영향을 미치는 평균 결정자 지름의 역치는 1,705Å보다도 작다고 추측되며, 평균 결정자 지름이 1,700Å 미만, 보다 상세하게는 1,670Å 이하인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 시약급 분말보다도 친수성 용매에 대한 용해성이 우수하다고 판단되었다. 그리고, 용해성, 고결성, 및 보존성의 어느 측면에서도 좋은 평가가 얻어진 피험시료 19, 21, 및 실시예 1 내지 4의 분말 중, 가장 작은 평균 결정자 지름은 1,450Å(피험시료 19)이므로, 바람직한 평균 결정자 지름의 범위는 1,400Å 이상 1,700Å 미만, 보다 바람직하게는 1,450Å 이상 1,670Å 이하이라고 판단되었다.
<실험 7: 각종 미생물 유래 CGTase에 의한 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률>
액화 전분과 L-아스코르빈산을 함유하는 용액에 CGTase를 작용시킨 다음, 글루코아밀라아제를 작용시키는 효소반응에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성시키는 효소반응시스템에 있어서, CGTase의 유래 차이가, 효소반응에서 얻어지는 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률에 어떠한 영향을 미칠지를 조사하기 위해, 이하의 실험을 실시하였다.
<시판 CGTase>
각종 미생물 유래의 CGTase 중, 시판되고 있는 CGTase로서는 이하의 CGTase를 사용하였다. 즉, 바실러스 마세란스(Bacillus macerans) 유래의 GCTase로서는 시판 CGTase(상품명 『콘티자임』, 아마노엔자임주식회사 판매)를 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 유래 CGTase(주식회사 하야시바라생물화학연구소제)를 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래의 CGTase로서는 재조합형 효소로서 판매되고 있는 시판 CGTase(상품명 『Toruzyme 3.0L』, 노보자임즈 재팬 주식회사 판매)를 사용하였다.
<실험 7-1: 각종 미생물 유래 CGTase의 조제>
<실험 7-1-1: 파에니바실러스 일리노이센시스 NBRC15379주 유래 CGTase의 조제>
파에니바실러스 일리노이센시스(Paenibacillus illinoisensis) NBRC15379주를 덱스트린 2%, 염화암모늄 0.5%, 인산수소칼륨 0.05%, 황산마그네슘 0.025% 및 탄산칼슘 0.5%를 포함하는 액체 배지에서 27℃, 3일간 배양하고, 배양액을 원심분리하여 얻은 각각의 원심 상청액을 통상의 방법에 따라 황안염석, 투석함으로써 CGTase의 조(粗)효소액을 얻었다. 얻어진 CGTase 조효소액을 각각 DEAE-토요펄 650S 겔(토소주식회사제)을 사용한 음이온 교환 칼럼크로마토그래피 및 부틸-토요펄 650M 겔(토소주식회사제)를 사용한 소수(疏水) 칼럼크로마토그래피에 제공하여 정제하고, 부분 정제 CGTase를 조제하였다.
<실험 7-1-2: 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 CGTase 변이체의 조제>
지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 기원의 CGTase는 상기한 바와 같이 그 유전자가 클로닝되어, 유전자의 염기서열(서열목록의 서열번호 2로 표시되는 염기서열)로부터 성숙형 CGTase의 아미노산 서열(서열목록의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열)이 결정되어 있다. 해당 CGTase의 유전자 DNA에 하기의 수순으로 변이를 도입하여, 야생형 CGTase보다도 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성능력이 우수한 CGTase 변이체를 취득하였다.
즉, 본 발명자들이 보유하고 있는 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주(독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 수탁번호 FERM BP-11273) 유래의 CGTase 유전자를 사용하며, 그 코딩하는 아미노산 서열을 바꾸는 일 없이 변이시켜 제한효소 절단부위 등을 도입 또는 결실시키고, 그것을 플라스미드 벡터에 재조합하여, 야생형 CGTase를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 제작하였다. 해당 재조합 DNA 'pRSET-iBTC12'의 구조를 도 5에 나타내었다. 그 후, 얻어진 재조합 DNA에서의 야생형 CGTase의 활성 잔기를 포함하는 영역을 코딩하는 유전자 단편(Nde I-EcoT22I 단편)을 잘라내어, PCR 변이 키트(상품명 『GeneMorph PCR Mutagenesis Kit』, 스트라타딘사 판매)를 사용하여 시험관 내에서 무작위로 변이를 가해, 원래의 재조합 DNA로 되돌림으로써 다양한 아미노산 치환이 발생한 CGTase 변이체를 코딩하는 유전자 혼합물을 제작하였다. 그 변이 유전자를 발현 플라스미드 벡터에 삽입하여 재조합 DNA를 제작하였다. 해당 재조합 DNA를 사용하여 대장균을 형질전환하여, CGTase 변이체 유전자 라이브러리를 제작하였다.
그 다음, 얻어진 유전자 라이브러리로부터 13,000주를 초과하는 형질전환체를 분리하고, 배양하여 얻어진 균체로부터 CGTase 변이체를 포함하는 용균액을 조효소액으로 조제하였다. 얻어진 조효소액을 L-아스코르빈산과 전분 부분 분해물을 포함하는 수용액에 작용시키고, 생성되는 α-글루코실 L-아스코르빈산을 글루코아밀라아제 처리하여 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성시키며, 그 생성량을 야생형 CGTase과 비교함으로써, 아스코르빈산 2-글루코시드 고생산형 CGTas 변이체를 생산하는 형질전환체를 스크리닝하였다. 그 스크리닝 과정에서 목적으로 하는 변이 CGTase 유전자를 보유하는 형절전환체 2주, 즉 #129주 및 #268주를 얻었다. 해당 형질전환체가 각각 보유하는 변이 CGTase 유전자의 염기서열을 해독하였더니, 형질전환체 #129주가 생산하는 CGTase 변이체는 서열목록의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 2곳의 아미노산 잔기가 치환되어 있으며, 176번째의 글리신 잔기(G)가 아르기닌 잔기(R)로, 452번째의 티로신 잔기(Y)가 히스티딘 잔기(H)로 치환된 아미노산 서열, 즉 서열목록의 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것이 판명되었다. 또한, 형질전환체 #268주가 생산하는 CGTase 변이체는 서열목록의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 1곳의 아미노산 잔기가 치환되어 있으며, 228번째의 리신 잔기(K)가 이소로이신 잔기(I)로 치환된 아미노산 서열, 즉 서열목록의 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 있음이 판명되었다. 이들 CGTase 변이체를 서열목록의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 아미노산 잔기는 치환된 부위와 아미노산 치환에 기초하여 각각 G176R/Y 452H, 및 K228I로 명명하였다.
상기 CGTase 변이체를 코딩하는 유전자 DNA를 보유하는 형질전환체 2주를 각각 암피실린 Na염 100μl/ml를 포함하는 T배지(배지 1L 당, 박토-트립톤 12g, 박토-효모 엑기스 24g, 글리세롤 5ml, 17mM 인산일칼륨, 72mM 인산이칼륨을 함유)를 사용하여 37℃에서 24시간 호기적으로 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 얻은 균체를 초음파 파쇄기(상품명 『Ultra Sonic Hmogenizer UH-600』, 엠에스티 주식회사제)를 사용하여 파쇄처리하고, 파쇄액 상청액을 60℃에서 30분간 열처리하여, 숙주 유래의 비내열성 단백질을 변성, 실활시켰다. 열처리액을 다시 원심분리하여 CGTase 변이체의 부분 정제 표품(標品)을 각각 조제하였다.
또한, 상술한 각 CGTase의 효소활성은 상기한 방법에 따라 측정하고, 식 [4]를 사용하여 산출하였다.
<실험 7-2: 아스코르빈산 2-글루코시드 생성반응>
덱스트린(상품명 『파인덱스 #1』, 마츠야화학공업주식회사 판매) 5질량부를 물 20질량부에 첨가하여 가열 용해하고, L-아스코르빈산 3질량부를 첨가한 후, pH를 5.5로 조정하여 기질 용액으로 하였다. 여기에, 상술한 시판의 CGTase, 및 실험 7-1에서 조제한 CGTase 중 어느 하나를 덱스트린 고형분 1g당 100 단위 첨가하고, 55℃에서 40시간 반응시켜 반응액을 가열함으로써 효소를 실활시켜, 아스코르빈산 2-글루코시드와 함께 2-O-α-말토실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토트리오실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토테트라오실-L-아스코르빈산 등의 α-글리코실-L-아스코르빈산을 생성시켰다. 그 후, 얻어진 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, pH 4.5로 조정하고, 여기에 글루코아밀라아제제(아마노엔자임주식회사 판매, 상품명 『글루쿠자임 AF6』, 6,000단위/g)를 덱스트린 고형분 1g당 50단위 첨가하여 55℃에서 24시간 처리하고, α-글리코실-L-아스코르빈산을 아스코르빈산 2-글루코시드로까지, 또한 혼재하는 당질을 D-글루코오스로까지 분해한 후, 반응액을 가열함으로써 글루코아밀라아제를 실활시켜 효소반응액 1 내지 6을 얻었다.
<실험 7-3: 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률의 측정>
실험 7-2에서 얻은 효소반응액 1 내지 6에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률을 이하와 같이 하여 구하였다. 즉, 효소반응액 1 내지 6를 각각 정제수에 의해 2% 용액으로 만들고, 0.45μm 멤브레인 필터에 의해 여과한 후, 실험 1-2에 기재된 HPLC 분석에 제공하고, 시차굴절계에 의한 크로마토그램에 출현한 피크의 면적으로부터 반응액의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 계산하여 무수물로 환산하였다. 결과를 표 7에 나타내었다. 또한, 표 7에 나타낸 각 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률은 각 CGTase에 대해 동일 조건으로 아스코르빈산 2-글루코시드 생성반응 및 글루코아밀라아제 처리를 5회 반복한 경우에도, 약간의 편차 범위 내에서 재현성 좋게 얻어지는 값이다.
반응액 CGTase의 종류 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률*
(질량%)
1 바실러스 마세란스 유래 CGTase 16
2 파에니바실러스 일리노이센시스 NBRC15379 유래 CGTase 18
3 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91 유래 CGTase 28
4 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래 CGTase 30
5 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91 유래 CGTase 변이체 G176R/Y452H 32
6 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91 유래 CGTase 변이체 K228I 31
*글루코아밀라아제 처리후
표 7에 나타낸 바와 같이, 바실러스 마세란스 유래의 CGTase를 사용한 경우(반응액 1)에는 글루코아밀라아제 처리 후의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률은 16%에 그치며, 파에니바실러스 일리노이센시스 유래의 CGTase를 사용한 경우(반응액 2)에도, 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률은 18%로 낮았다. 한편, 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 유래의 CGTase를 사용한 경우(반응액 3)에는 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률은 28%에 달하며, 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래의 CGTase를 사용한 경우(반응액 4)에는 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률은 30%에 달하였다. 또한, 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 CGTase 변이체인 G176R/Y452H 및 K228I을 각각 사용한 경우(반응액 5 및 6)에는 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률은 각각 32% 및 31%에 달하였다.
이 결과는 바실러스 마세란스 유래 및 파에니바실러스 일리노이센시스 유래의 CGTase에서는 수율이 좋게 아스코르빈산 2-글루코시드를 제조할 수 없으며, 이들 미생물 유래의 CGTase가 아스코르빈산 2-글루코시드의 제조에 적합하지 않음을 명료하게 나타낸 것이다.
<실험 8: 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 및 제반물성에 미치는 결정석출방법의 영향>
아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시키는 결정석출방법으로서, 종래부터 사용되고 있는 자연냉각법과, 의사 제어냉각법을 사용하여, 실험 7에서 얻은 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률이 다른 효소반응액 3 내지 6으로부터 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 조제하고 분말의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 및 제반물성에 미치는 결정석출방법의 영향을 조사하였다. 또한, 효소반응액의 단계에서 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률이 현저하게 낮은 효소반응액 1 및 2, 즉 바실러스 마세란스 유래 CGTase 및 파에니바실러스 일리노이센시스 유래 CGTase를 작용시켜 얻은 효소반응액에 대해서는 효율적인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조를 기대할 수 없다고 판단하여, 분말의 조제는 실시하지 않았다.
<실험 8-1: 피험시료의 조제>
<피험시료 23 내지 26>
실험 7에서 얻은 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률이 다른 효소반응액 3 내지 6의 각각을 활성탄으로 탈색여과하여, 여과액을 양이온 교환수지(H+형)로 탈염한 후, 음이온 교환수지(OH-형)에 L-아스코르빈산 및 아스코르빈산 2-글루코시드를 흡착시키고, 물세척하여 D-글루코오스를 포함하는 당질을 제거한 후, 0.5N 염산 수용액을 사용하여 용출하였다. 또한, 이 용출액을 고형분 약 50%로까지 농축하고, 강산성 양이온 교환수지(상품명 『다이아이온 UBK 550』 Na+형, 미츠비시화학주식회사제)를 충전한 칼럼크로마토그래피에 제공하였다. 아스코르빈산 2-글루코시드 함량이 86% 이상이 되도록 아스코르빈산 2-글루코시드 고함유 획분을 채취하였다. 채취한 획분을 합쳐 고형물 농도 약 75%까지 농축하고, 효소반응액 3 내지 6의 각각에 대응하는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액 3 내지 6(아스코르빈산 2-글루코시드를 무수물 환산으로 86.3 내지 87.1% 함유)를 얻었다.
상기 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액 3 내지 6을 각각 결정관에 덜어, 각 당액의 용량에 대해 약 2%(w/v)의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 종정으로서 첨가하여 교반하면서 40℃로부터 15℃까지 약 48시간에 걸쳐 자연냉각함으로써 결정화시키고, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시킨 마세큐트를 조제하였다. 상기 마세큐트로부터 통상적인 방법으로 바스켓형 원심분리기에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 채취하고, 채취한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 마세큐트 중량에 대해 8%의 탈이온수를 사용하여 세정하여, 40℃에서 3시간 숙성, 건조시킨 후, 25℃의 청정한 공기를 30분간 내뿜어 강제냉각하고 분쇄함으로써, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말로 하였다. 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액 3 내지 6의 각각으로부터 자연냉각법으로 얻어진 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 각각 피험시료 23 내지 26으로 하였다.
<피험시료 23c 내지 26c>
상기에서 조제한 무수물 환산에 의한 아스코르빈산 2-글루코시드 함량이 서로 다른 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액 3 내지 6의 각각을 감압 하에서 고형물 농도 약 75%로까지 농축하여, 결정관에 덜고, 용액의 용량에 대해 약 2%(w/v)의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 종정으로서 첨가하여 교반하면서, 40℃에서부터 15℃까지 약 48시간에 걸쳐 의사 제어냉각법에 의해 결정화시킨 것 이외에는 상기와 마찬가지로 하여, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시킨 마세큐트를 조제하였다. 또한, 의사 제어냉각법은 전체 48시간의 결정석출시간을 24시간, 12시간, 12시간의 3구간으로 나누어, 최초 구간에서는 24시간에 걸쳐 액온을 40℃에서부터 35℃까지 냉각하고, 다음 구간에서는 12시간에 걸쳐 35℃에서 27.5℃까지 냉각하며, 그리고 마지막 구간에서는 12시간에 걸쳐 액온을 27.5℃로부터 15℃까지 냉각함으로써 실시하였다. 얻어진 마세큐트로부터 통상적인 방법으로 바스켓형 원심분리기에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 채취하고, 채취한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 마세큐트 중량에 대해 8%의 탈이온수를 이용하여 세정하고, 40℃에서 3시간 숙성, 건조시킨 후, 25℃의 청정한 공기를 30분간 내뿜어 강제냉각하고 분쇄함으로써, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말로 제조하였다. 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액 3 내지 6의 각각으로부터 의사 제어냉각법에 의해 얻어진 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 각각 피험시료 23c 내지 26c로 하였다.
<실험 8-2: 피험시료 23 내지 26 및 피험시료 23c 내지 26c의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 및 제반 물성>
상기에서 얻은 피험시료 23 내지 26 및 피험시료 23c 내지 26c에 대해, 실험 6과 마찬가지로 아스코르빈산 2-글루코시드 순도, 결정화도, 평균 결정자 지름, 고결성, 및 친수성 용매인 1,3-부틸렌글리콜에 대한 용해성을 조사하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었다. 또한, 비교를 위해, 의약부외품급 분말인 피험시료 16의 결과에 대해서도 표 6으로부터 그대로 옮겨서 표 8에 함께 나타내었다.
피험시료 아스코르빈산 2-글루코시드 순도(질량%) 결정화도
(%)		 평균 결정자 지름
(Å)		 고결성 용해성
23 98.5 87.2 1,220 + _
24 98.4 87,8 1,240 + -
25 98.5 88.5 1,280 + -
26 98.5 87.6 1,280 + -
23c 99.5 90.6 1,480 - -
24c 99.5 92.2 1,520 - -
25c 99.6 93.4 1,540 - -
26c 99.5 92.8 1,500 - -
16 98.9 88.9 1,380 + -
표 8에 나타낸 바와 같이, 피험시료 23 내지 26, 피험시료 23c 내지 26c의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에서의 무수물 환산에 의한 아스코르빈산 2-글루코시드 함량, 즉 아스코르빈산 2-글루코시드 순도는 모두 98%를 초과하며, 이들 피험시료는 종래의 의약부외품급의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 피험시료 16과 동등한 고순도의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이었다.
한편, 결정화도와 관련해서는, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 결정석출공정에서 종래의 자연냉각법을 적용하여 조제한 피험시료 23 내지 26에서는 종래의 의약부외품급의 분말인 피험시료 16과 동등한 90% 미만에 그친 것에 반해, 결정석출공정에서 의사 제어냉각법을 적용하여 조제한 피험시료 23c 내지 26c은 모두 90% 이상의 값을 나타내었으며, 의사 제어냉각법은 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 결정화도를 높이는 효과가 있음이 재차 확인되었다. 또한, 결정화도와 마찬가지로, 분말의 평균 결정자 지름에 있어서도 피험시료 23 내지 26에서는 1,220 내지 1,280Å의 범위에 그친 것에 반해, 피험시료 23c 내지 26c에서는 1,480 내지 1,540Å로 높은 값이 얻어졌다.
또한, 분말의 고결성에 대해서도 결정화도가 90% 미만, 평균 결정자 지름이 1,400Å 미만인 피험시료 23 내지 26이 「고결된다」(+)로 판정된 것에 반해, 결정화도가 90% 이상, 평균 결정자 지름이 1,400Å 이상인 피험시료 23c 내지 26c는 「고결되지 않는다」(-)로 판정되었다. 또한, 1,3-부틸렌글리콜에 대한 용해성에 관해서는 어느 피험시료든 「용해성 양호」(-)로 판정되었다.
상기 실험 7 및 8의 결과는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조에 있어서, 지오바실러스 스테아로써모필루스 유래의 CGTase 및 그 변이체 효소, 또는 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래의 CGTase를 사용하여 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률 27% 이상의 효소반응액을 얻어, 아스코르빈산 2-글루코시드 함량 86% 이상으로까지 정제하고, 결정석출공정에서 의사 제어냉각법 또는 제어냉각법을 적용하면, 결정화도 90% 이상의 고결되기 어려운 분말을 제조할 수 있음을 나타내고 있다.
<실험 9: 전분 절지 효소의 병용이 각종 미생물 유래 CGTase에 의한 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률에 미치는 영향>
액화 전분과 L-아스코르빈산을 함유하는 용액에 CGTase를 작용시키고, 그 다음 글루코아밀라아제를 작용시키는 효소반응에 의해 아스코루빈산 2-글루코시드를 생성시키는 효소반응시스템에 있어서, 전분 절지 효소의 병용이 각종 미생물 유래 CGTase를 사용한 효소 반응에서 얻어지는 반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하기 위해 이하의 실험을 실시하였다.
<실험 9-1: 아스코르빈산 2-글루코시드 생성 반응>
실험 7에서 사용한 각종 CGTase와 함께, 전분 절지 효소로서 덱스트린 고형분 1g당 1,000단위의 이소아밀라아제 효소제(슈도모나스 아밀로데라모사(Pseudomonas amyloderamosa) 유래, 주식회사 하야시바라제)를 작용시킨 것 이외에는 실험 7과 마찬가지로 아스코르빈산 2-글루코시드 생성반응을 실시하고, 글루코아밀라아제 처리하여 후술하는 표 9에 나타낸 효소반응액 7 내지 12를 각각 얻은 후, 실험 1-2의 방법으로 효소반응액 7 내지 12에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률을 측정하였다. 결과를 표 9에 나타내었다.
반응액 CGTase의 종류 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률*(질량%)
7 바실러스 마세란스 유래 CGTase 21
8 파에니바실러스 일리노이센시스 NBRC15379 유래 CGTase 25
9 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91 유래 CGTase 37
10 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래 CGTase 33
11 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91 유래 CGTase 변이체 G176R/Y452H 37
12 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91 유래 CGTase 변이체 K228I 36
*글루코아밀라아제 처리후
표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 전분 절지 효소를 병용한 경우, 바실러스 마세란스 유래 CGTase의 경우(반응액 7), 및 파에니바실러스 일리노이센시스 유래 CGTase의 경우(반응액 8)에는 글루코아밀라아제 처리 후의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률은 각각 21% 또는 25%였다. 한편, 지오바실러스 스테아로써모필루스 유래의 CGTase(반응액 9)에서는 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률은 37%, 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래의 CGTase(반응액 10)에서는 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률은 33%이었다. 또한, 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 유래 CGTase의 변이체인 G176R/Y452H 및 K228I를 사용한 경우(반응액 11 및 12)에서는 각각 37% 및 36%이었다.
CGTase 유래에 의해 편차는 있으나, CGTase에 의한 효소반응에 전분 절지 효소(이소아밀라아제)를 병용함으로써, 효소반응액 7 내지 12 중 어느 것에 있어서도, 글루코아밀라아제 처리 후의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률은 CGTase를 단독으로 사용한 경우(표 7의 반응액 1 내지 6을 참조)보다도 각각 3 내지 9% 유의적으로 증가하였다. 그러나, 바실러스 마세란스 유래 CGTase의 경우(반응액 7) 및 파에니바실러스 일리노이센시스 유래 CGTase의 경우(반응액 8)에는 전분 절지 효소를 병용한 경우일지라도, 글루코아밀라아제 처리 후의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률은 각각 21% 또는 25%에 그치고, 그 이외의 CGTase를 단독으로 사용한 경우(표 7의 반응액 3 내지 6을 참조)보다도 현저하게 낮은 생성률이었다.
상기 결과는 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 유래의 CGTase, 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래의 CGTase 및 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 유래 CGTase의 변이체인 G176R/Y452H 및 K228I에서는 전분 절지 효소를 병용함으로써, 전분 절지 효소를 사용하지 않고 CGTase 단독으로 작용시킨 경우에 비해 약 3 내지 9% 정도 높은 생성률이 얻어지므로, 보다 효율적으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 제조할 수 있음을 나타내고 있다.
또한, 상기 결과로부터, 바실러스 마세란스 유래 및 파에니바실러스 일리노이센시스 유래의 CGTase의 경우, 전분 절지 효소를 병용하였다고 하더라도 생성률 좋게 아스코르빈산 2-글루코시드를 제조할 수 없어, 이들 CGTase는 아스코르빈산 2-글루코시드의 제조에 적합하지 않음이 다시 확인되었다.
<실험 10: CGTase와 전분 절지 효소를 병용하여 얻은 반응액으로부터의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조에 미치는 결정석출방법의 영향>
본 실험에서는 CGTase와 전분 절지 효소를 병용하여 얻는 반응액으로부터의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조에 있어서, 결정석출방법이 분말의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 및 제반물성에 미치는 영향을 실험 8과 마찬가지로 검토하였다. 또한, 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률이 낮은 효소반응액 7 및 8에 대해서는 실험 8과 동일한 이유에 의해 분말의 조제는 하지 않았다.
<실험 10-1: 피험시료의 조제>
<피험시료 27 내지 30>
실험 9에서 얻은 효소반응액 9 내지 12를 각각 실험 8과 마찬가지로 정제하여, 아스코르빈산 2-글루코시드 함량 86% 이상의 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액 9 내지 12로 한 후, 실험 8-1과 동일한 자연냉각법을 적용하여 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출하고, 각각 조제한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 피험시료 27 내지 30으로 하였다.
<피험시료 27c 내지 30c>
아스코르빈산 2-글루코시드의 결정석출공정에 있어서, 실험 8과 동일한 의사 제어냉각법을 적용한 것 이외에는 피험시료 27 내지 30의 경우와 마찬가지로 하여 아스코르빈산 2-글루코시드 함량 86% 이상의 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액 9 내지 12로부터 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 조제하여 각각 피험시료 27c 내지 30c로 하였다.
<실험 10-2: 피험시료 27 내지 30 및 피험시료 27c 내지 30c의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 및 제반물성>
피험시료 27 내지 30, 및 피험시료 27c 내지 30c의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도, 결정화도, 평균 결정자 지름, 고결성 및 친수성 용매인 1,3-부틸렌글리콜에 대한 용해성을 실험 8과 동일하게 각각 조사하였다. 결과를 표 10에 나타내었다. 또한, 비교를 위해, 의약부외품급의 분말인 피험시료 16의 결과에 대해서도 표 6으로부터 그대로 옮겨와 함께 표 10에 나타내었다.
피험시료 아스코르빈산 2-글루코시드 순도(질량%) 결정화도
(%)		 평균 결정자
지름(Å)		 고결성 용해성
27 99.4 92.6 1,440 - -
28 99.2 88.0 1,280 + -
29 99.5 94.2 1,480 - -
30 99.6 93.8 1,460 - -
27c 99.7 97.6 1,660 - -
28c 99.6 97.2 1,620 - -
29c 99.8 98.0 1,680 - -
30c 99.6 97.1 1,650 - -
16 98.9 88.9 1,380 + -
표 10에서 알 수 있는 바와 같이, 피험시료 28의 경우를 제외하면, 피험시료 27, 29, 30 및 피험시료 27c 내지 30c 모두 아스코르빈산 2-글루코시드 순도는 99.2% 이상이 되며, 또한, 결정화도는 92.6% 이상, 평균 결정자 지름은 1,440Å 이상이 되고, 시험한 조건하에서는 고결성을 나타내지 않는 분말이었다. 효소반응단계에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률이 33%에 그친 효소반응액으로부터 결정석출공정에서 자연냉각법을 적용하여 조제한 피험시료 28은 아스코르빈산 2-글루코시드 순도는 99.2%이었으나, 결정화도가 88.0%, 평균 결정자 지름이 1,280Å이 되고, 또한 고결성 시험에서 「고결된다」(+)로 판정되었다. 한편, 피험시료 28c의 결과로부터 분명한 바와 같이, 효소반응단계에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률이 33%에 그친 경우일지라도, 결정석출공정에서 의사 제어냉각법을 적용하면, 결정화도는 90% 이상, 평균 결정자 지름은 1,400Å 이상이 되고 고결성을 나타내지 않는 분말을 얻을 수 있다.
상기 결과는, 아스코르빈산 2-글루코시드 생성반응에서 전분 절지 효소를 병용하여 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률을 35% 이상으로까지 높인 효소반응액으로부터는 결정석출공정에서의 냉각방법에 상관없이 결정화도가 90% 이상인 고결되기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조할 수 있음과, 아스코르빈산 2-글루코시드 생성반응에서 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률이 33% 정도와 35% 미만에 그친 경우일지라도, 결정석출공정에서 의사 제어냉각법 또는 제어냉각법을 적용하면, 결정화도가 90% 이상으로 높고, 고결되기 어려운 뛰어난 물성을 갖는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조할 수 있음을 나타내고 있다,
<실험 11: 아스코르빈산 2-글루코시드의 제조에 적합한 CGTase에 공통하는 부분 아미노산 서열>
아스코르빈산 2-글루코시드의 제조에 바람직한 CGTase를 특징지을 목적으로, 아스코르빈산 2-글루코시드의 제조에 바람직한 상기 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 유래 CGTase와 그 변이체 효소의 아미노산 서열(서열목록의 서열번호 1, 4 및 5)와, 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래 CGTase의 아미노산 서열(서열목록의 서열번호 3), 및 아스코르빈산 2-글루코시드의 제조에 적합하지 않은 상기 바실러스 마세란스 유래 CGTase의 아미노산 서열(서열목록의 서열번호 6)과 파에니바실러스 일리노이센시스 유래 CGTase의 아미노산 서열(서열목록의 서열번호 7)을 비교하였다. 또한, 아미노산 서열의 비교에서는 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 유래 CGTase와 바실러스 마세란스 유래 CGTase의 아미노산 서열로서는 출원인이 독자적으로 결정하여, 본 출원과 동일한 출원인에 의한 일본 특허공개 소61-135581호 공보에 각각 개시된 것을 사용하였다. 또한, 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래 CGTase의 아미노산 서열로서는 유전자 데이터 베이스 『GenBank』에 수탁번호 35484로서 등록되어 있는 것을 사용하였다. 또한, 파에니바실러스 일리노이센시스 유래 CGTase의 아미노산 서열로서는 파에니바실러스 일리노이센시스 NBRC15379주의 CGTase 유전자를 출원인이 독자적으로 클로닝하여 결정한 염기서열에 코딩되는 아미노산 서열을 사용하였다.
상기한 아미노산 서열의 비교에 있어서, 아스코르빈산 2-글루코시드의 제조에 바람직한 CGTase, 즉 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 유래 CGTase 및 그 변이체 효소, 그리고 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래 CGTase에 공통적으로 존재하며, 또한, 아스코르빈산 2-글루코시드의 제조에 적합하지 않은 CGTase, 즉 바실러스 마세란스 유래 CGTase와 파에니바실러스 일리노이센시스 유래 CGTase에 존재하지 않는 부분 아미노산 서열로서, 하기 (a) 내지 (d)의 부분 아미노산 서열이 확인되었다.
(a) Asn-Glu-Val-Asp-X1-Asn-Asn;
(b) Met-Ile-Gln-X2-Thr-Ala;
(c) Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn-Ile; 및
(d) Val-X3-Ser-Asn-Gly-Ser-Val.
(단, X1은 Pro 또는 Ala을, X2는 Ser 또는 Asp를, X3은 Ser 또는 Gly를 각각 의미한다.)
이상의 결과로부터, 본 발명의 제조방법에 따른 아스코르빈산 2-글루코시드의 제조에 바람직한 CGTase, 즉 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 27% 이상이 되는 CGTase는 상기 (a) 내지 (d)의 부분 아미노산 서열을 갖는다고 특징지을 수 있음이 판명되었다.
이하, 실시예, 비교예 및 참고예에 기초하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 이들에 의해 전혀 한정되는 것이 아니다.
<아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조>
액화 감자전분 4질량부를 물 20질량부에 첨가하여 가열 용해하고, L-아스코르빈산 3질량부를 첨가하며, pH를 5.5로 조정하여 기질 용액으로 하였다. 이에, 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주(독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 수탁번호 FERM BP-112733) 유래의 CGTase의 조효소액(주식회사 하야시바라생물화학연구소 제조)을 액화 감자전분의 고형분 1g당 100단위 첨가하고 55℃에서 40시간 반응시켜, 아스코르빈산 2-글루코시드와 함께, 2-O-α-말토실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토트리오실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토테트라오실-L-아스코르빈산 등의 α-글리코실-L-아스코르빈산을 생성시켰다.
본 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, pH 4.5로 조정하며, 여기에 글루코아밀라아제제(아마노엔자임주식회사 판매, 상품명『글루쿠자임 AF6』, 6,000단위/g)를 액화 감자전분의 고형분 1g당 50단위 첨가하여 55℃에서 24시간 처리하고, α-글리코실-L-아스코르빈산을 아스코르빈산 2-글루코시드로까지, 또한 혼재하는 당질을 D-글루코오스로까지 분해하였다. 본 반응액 중의 L-아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 약 28%이었다.
본 반응액을 가열하여 효소를 실활시키고, 활성탄으로 탈색여과한 후, 여과액을 양이온 교환수지(H+형)로 탈염하며, 그 후, 음이온 교환수지(OH-형)에 L-아스코르빈산 및 아스코르빈산 2-글루코시드를 흡착시키고, 물세척하여 D-글루코오스를 제거한 후, 0.5N 염산수용액으로 용출하였다. 그리고, 이 용출액을 고형분 약 50%로까지 농축하여, 강산성 양이온 교환수지(상품명 『다이아이온 UBK 550』Na+형, 미츠비시화학주식회사제)를 충전한 10개의 칼럼을 사용한 의사이동상식의 칼럼크로마토그래피에 제공하였다. 칼럼에 그 습윤수지 용적의 약 40분의 1 양정도 차지하고, 차지량의 약 5배의 용리액을 연속적으로 칼럼에 공급하며, L-아스코르빈산 함량이 적은 아스코르빈산 2-글루코시드 고함유 획분을 연속적으로 채취하였다. 채취한 획분에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 87.2%이었다.
이 획분을 감압농축하여 농도를 약 76%로 하였다. 이를 결정관에 덜어, 분석용 표준시약으로서 판매되고 있는 L-아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말(주식회사 하야시바라생물화학연구소 판매, 상품명 『아스코르빈산 2-글루코시드 999』(코드번호: AG124, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 99.9% 이상))을 종정으로서 2% 첨가하여 40℃로 하고, 천천히 교반하면서 40℃에서부터 30℃로 1.5일간에 걸쳐 냉각한 후, 30℃에서부터 15℃로 0.5일간에 걸쳐 냉각하는 의사 제어냉각법에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 석출시켰다.
석출한 결정을 바스켓형 원심분리기로 회수하고, 소량의 냉(冷)정제수로 스프레이 세정한 후, 38℃에서 3시간 숙성, 건조시키며, 그 후, 25℃의 공기를 45분간 내뿜어 냉각하고, 분쇄하여 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 99.3%, L-아스코르빈산과 D-글루코오스의 합계 함량 0.1%, L-아스코르빈산 함량 0.1% 미만, 분말 전체의 환원력 0.27%, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도 90.3%, 그 평균 결정자 지름이 1,460Å인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻었다. 또한, 상기 결정화도의 측정은 하만스법으로 수행하며, 실험 1-2에서 구한 해석값 H100 및 H0를 사용하여 실시하였다. 본 분말의 입도 분포를 측정하였더니, 입경 150μm 미만인 입자가 91.0%, 입경 53μm 이상 150μm 미만인 입자가 50.7% 포함되어 있었다.
본 분말은 의약부외품용 미백성분 등으로서 시판되고 있는 종래의 의약부외품급 분말에 비해, 고결되기 어렵고, 화장품 및 의약부외품에 일반적으로 사용되는 친수성 용매에 대한 용해성이 우수하므로 취급하기 쉽다. 본 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 점에서는 종래의 의약부외품급 분말과 아무런 차이가 없으므로, 종래의 의약부외품급 분말과 마찬가지로, 그 단독으로 혹은 다른 성분과 혼합하여 분말형상의 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 의약품 소재 등으로서 바람직하게 사용할 수 있다.
<아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조>
액화 전분과 L-아스코르빈산을 포함하는 용액에 CGTase를 작용시킬 때에, 액화 전분의 고형분 당 5단위의 풀룰라나아제(주식회사 하야시바라생물화학연구소 판매, 상품 코드(EN201), 클렙시엘라 뉴모니아(에어로박터 에어로게네스) 유래를 작용시킨 것, 및 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시킬 때, 용액의 온도를 40℃에서부터 35℃로 1.5일간에 걸쳐 냉각한 후, 35℃에서 15℃로 0.5일간에 걸쳐 냉각하는 의사 제어냉각법을 적용한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조하였다. 또한, 글루코아밀라아제 처리 후 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 약 29.5%이었다. 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 석출에 이용한 용액의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 91.8%이었다.
본 품은 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 99.5%, L-아스코르빈산과 D-글루코오스의 합계 함량 0.1%, L-아스코르빈산 함량 0.1% 미만, 분말 전체의 환원력 0.21%, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도 91.0%, 그 평균 결정자 지름이 1,540Å인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이었다. 또한, 상기 결정화도의 측정은 하만스법으로 수행하며, 실험 1-2에서 구한 해석값 H100 및 H0를 사용하여 실시하였다. 본 분말의 입도 분포를 측정하였더니, 입경 150μm 미만인 입자가 93.0%, 입경 53μm 이상 150μm 미만인 입자가 53.7% 포함되어 있었다.
본 분말은 의약부외품용 미백성분 등으로서 시판되고 있는 종래의 의약부외품급 분말에 비해, 고결되기 어렵고, 화장품 및 의약부외품에 일반적으로 사용되는 친수성 용매에 대한 용해성이 우수하므로 취급하기 쉽다. 본 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 점에서는 종래의 의약부외품급 분말과 아무런 차이가 없으므로, 종래의 의약부외품급 분말과 마찬가지로, 그 단독으로 혹은 다른 성분과 혼합하여 분말형상의 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 의약품 소재 등으로서 바람직하게 사용할 수 있다.
<아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조>
옥수수 전분 5질량부를 물 15질량부에 첨가하고, 시판의 액화 효소를 첨가하여 가열 용해한 후, L-아스코르빈산 3질량부를 첨가하고 pH를 5.5로 조정하여 기질용액으로 하였다. 여기에, 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter)속(屬) 유래의 CGTase 유전자를 재조합하여 바실러스속의 균주에서 발현시킨 시판 CGTase(노보자임(NOVOZYME)사 판매, 상품명 『Toruzyme 3.0L』(예를 들면, 특허문헌 30 및 31 참조)을 옥수수 전분의 고형분 1g당 100단위 첨가하고 55℃에서 50시간 반응시켜 아스코르빈산 2-글루코시드 및 기타 α-글리코실-L-아스코르빈산을 생성시켰다.
이 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, pH를 4.5로 조정하고, 여기에 글루코아밀라아제제(나가세켐텍스주식회사 판매, 상품명 『글루코침 #20000』, 20,000단위/g)를 옥수수전분의 고형분 1g당 50단위 첨가하고 55℃에서 24시간 반응시켜 2-O-α-말토실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토트리오실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토테트라오실-L-아스코르빈산 등의 α-글리코실-L-아스코르빈산을 아스코르빈산 2-글루코시드로까지, 또한 혼재하는 당질을 D-글루코오스로까지 분해하였다. 본 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생존률은 약 31%이었다.
본 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, 활성탄으로 탈색여과하고, 여과액을 양이온 교환수지(H+형)로 탈염하며, 그런 후, 음이온 교환수지(OH-형)에 L-아스코르빈산 및 아스코르빈산 2-글루코시드를 흡착시키고 물세척하여 D-글루코오스를 제거한 후, 0.5N 염산용액으로 용출하고, 나아가 다공성 수지(상품명 『토요펄 HW-40』, 토소주식회사제)를 사용한 칼럼크로마토그래피에 제공하여, 아스코르빈산 2-글루코시드를 높게 함유하고 L-아스코르빈산량이 적은 획분을 채취하였다. 채취한 획분에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 88.6%이었다.
이 획분을 감압농축하여 농도를 약 76%로 하고, 이를 결정관에 덜어, 실시예 1에서 제조한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 종정으로서 2% 첨가하여 40℃로 하고, 천천히 교반하면서 40℃로부터 33℃로 1.5일간에 걸쳐 냉각한 후, 33℃에서 15℃로 0.5일간에 걸쳐 냉각하는 의사 제어냉각법에 의해, 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 석출시켰다.
바스켓형 원심분리기로 결정을 회수하고, 결정을 소량의 증류수로 스프레이 세정한 후, 35℃에서 8시간 숙성, 건조시키며, 25℃의 공기를 15분간 내뿜어 냉각하고 분쇄함으로써 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 99.2%, L-아스코르빈산과 D-글루코오스의 합계 함량 0.1%, L-아스코르빈산 함량 0.1% 미만, 분말 전체의 환원력 0.17%, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도 91.5%, 그 평균 결정자 지름 1,610Å인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻었다. 또한, 상기 결정화도의 측정을 하만스법으로 수행하며, 실험 1-2에서 구한 해석값 H100 및 H0를 사용하여 실시하였다. 본 분말의 입도 분포를 측정하였더니, 입경 150μm 미만인 입자가 83.2%, 입경 53μm 이상 150μm 미만인 입자가 57.1% 포함되어 있었다.
본 분말은 의약부외품용 미백성분 등으로서 시판되고 있는 종래의 의약부외품급 분말에 비해, 고결되기 어렵고, 화장품 및 의약부외품에 일반적으로 사용되는 친수성 용매에 대한 용해성이 우수하므로 취급하기 쉽다. 본 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 점에서는 종래의 의약부외품급 분말과 아무런 차이가 없으므로, 종래의 의약부외품급 분말과 마찬가지로, 그 단독으로 혹은 다른 성분과 혼합하여 분말형상의 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 의약품 소재 등으로서 바람직하게 사용할 수 있다.
<아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조>
옥수수 전분 6질량부를 물 15질량부에 첨가하고, 시판 액화 효소를 첨가하여 가열 용해한 후, L-아스코르빈산 3질량부를 첨가한 용액에 시판 CGTase(노보자임(NOVOZYME)사 판매, 상품명 『Toruzyme 3.0L』을 작용시킨 것, 그때에 옥수수 전분의 고형분당 500단위의 이소아밀라아제(주식회사 하야시바라생물화학연구소 제조, 슈도모나스 아밀로데라모사(Pseudomonas amyloderamosa)(ATCC 21262) 유래를 작용시킨 것, 및 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시킬 때, 용액의 온도를 40℃에서부터 35℃로 24시간에 걸쳐 냉각한 후, 35℃에서 30℃로 12시간에 걸쳐, 그리고 30℃에서 15℃로 12시간에 걸쳐 냉각하는 의사 제어냉각법을 적용한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조하였다. 또한, 글루코아밀라아제 처리 후 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 약 32.5%이었다. 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 석출에 이용한 용액의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 89.6%이었다.
본 품은 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 99.7%, L-아스코르빈산과 D-글루코오스의 합계 함량 0.1%, L-아스코르빈산 함량 0.1% 미만, 분말 전체의 환원력 0.10%, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도 92.4%, 그 평균 결정자 지름이 1,670Å인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이었다. 그리고, 상기 결정화도의 측정은 하만스법으로 수행하며, 실험 1-2에서 구한 해석값 H100 및 H0를 사용하여 실시하였다. 본 분말의 입도 분포를 측정하였더니, 입경 150μm 미만인 입자가 94.5%, 입경 53μm 이상 150μm 미만인 입자가 55.3% 포함되어 있었다.
본 분말은 의약부외품용 미백성분 등으로서 시판되고 있는 종래의 의약부외품급 분말에 비해, 고결되기 어렵고, 화장품 및 의약부외품에 일반적으로 사용되는 친수성 용매에 대한 용해성이 우수하므로 취급하기 쉽다. 본 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 점에서는 종래의 의약부외품급 분말과 아무런 차이가 없으므로, 종래의 의약부외품급 분말과 마찬가지로, 단독으로 혹은 다른 성분과 혼합하여 분말형상의 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 의약품 소재 등으로서 바람직하게 사용할 수 있다.
<아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조>
옥수수 전분 5질량부를 물 15질량부에 첨가하고, 시판 액화 효소를 첨가하여 가열 용해한 후, L-아스코르빈산 3질량부를 첨가하고 pH를 5.5로 조정하여 기질용액으로 하였다. 여기에, 실험 7 및 9에서 사용한 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 유래 CGTase의 변이체 G176R/Y452H를 옥수수 전분의 고형분 1g당 100단위 첨가하고 55℃에서 50시간 반응시켜 아스코르빈산 2-글루코시드 및 기타 α-글리코실-L-아스코르빈산을 생성시켰다.
이 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, pH를 4.5로 조정하여, 여기에 글루코아밀라아제제(나가세켐텍스주식회사 판매, 상품명 『글루코침 #20000』, 20,000단위/g)를 옥수수전분의 고형분 1g당 50단위 첨가하고 55℃에서 24시간 반응시켜 2-O-α-말토실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토트리오실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토테트라오실-L-아스코르빈산 등의 α-글리코실-L-아스코르빈산을 아스코르빈산 2-글루코시드로까지, 또한 혼재하는 당질을 D-글루코오스로까지 분해하였다. 본 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생존률은 31.5%이었다.
본 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, 활성탄으로 탈색여과하고, 여과액을 양이온 교환수지(H+형)로 탈염하며, 그 다음, 음이온 교환수지(OH-형)에 L-아스코르빈산 및 아스코르빈산 2-글루코시드를 흡착시키고 물세척하여 D-글루코오스를 제거한 후, 0.5N 염산용액으로 용출하고, 나아가 다공성 수지(상품명 『토요펄 HW-40』, 토소주식회사제)를 사용한 칼럼크로마토그래피에 제공하여, 아스코르빈산 2-글루코시드를 높게 함유하고 L-아스코르빈산량이 적은 획분을 채취하였다. 채취한 획분에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 87.6%이었다.
이를 결정관에 덜어, 표준시약급의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말(상품명 『아스코르빈산 2-글루코시드 999』, 코드 번호: AG124, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 99.9% 이상, 주식회사 하야시바라생물화학연구소 판매)를 종정으로서 2% 첨가하여 40℃로 한 후, 천천히 교반하면서, 용액의 온도를 40℃에서부터 35℃로 24시간에 걸쳐 냉각한 후, 35℃에서 30℃로 12시간에 걸쳐서, 30℃에서 15℃로 다시 12시간에 걸쳐 냉각하는 의사 제어냉각법을 적용하여, 아스코르빈산 2-글리코시드 무수결정을 석출시켰다. 바스켓형 원심분리기로 결정을 회수하고, 결정을 마세큐트 중량에 대해 약 5%의 정제수로 스프레이하여 세정한 후, 35℃에서 8시간 숙성, 건조시키며, 20℃의 공기를 10분간 내뿜어 냉각하고 분쇄하여, 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 99.2%, L-아스코르빈산과 D-글루코오스를 합계 0.4%, L-아스코르빈산을 0.1% 미만 함유하고, 분말 전체의 환원력이 0.50%인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻었다.
본 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도는 90.4%, 평균 결정자 지름은 1,480Å이었다. 또한, 상기 결정화도의 측정은 하만스법으로 수행하며, 실험 1-2에서 구한 해석값 H100 및 H0를 사용하여 실시하였다. 본 분말의 입도 분포를 측정하였더니, 입경 150μm 미만인 입자가 85.2%, 입경 53μm 이상 150μm 미만인 입자가 69.3% 포함되어 있었다. 본품을 사용하여, 실험 1-4와 동일한 방법으로 고결성 시험을 실시하였더니, 「고결 없음」(-)로 판정되었다. 또한, 실험 6과 동일한 방법으로 1,3-부틸렌글리콜에 대한 용해성을 실험하였더니, 용해성 「양호」로 판정되었다.
본 제조방법에 의해 제조된 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 시판되고 있는 종래의 의약부외품급의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말(상품명 『AA2G』, 주식회사 하야시바라상사 판매)에 비해, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도에서 그다지 차이가 없음에도 불구하고, 유의적으로 고결되기 어려운 분말이며, 보존이나 취급이 용이하다. 본 품은 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정 함유 분말인 점에서는 종래의 의약부외품급의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말과 동일하며, 보존이나 취급이 용이한 만큼, 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 및 의약품 소재 등으로서 보다 바람직하게 사용할 수 있다.
<아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조>
액화 감자전분 4질량부를 물 20질량부에 첨가하여 가열 용해하고, L-아스코르빈산 3질량부를 첨가하며, pH를 5.5로 조정하여 기질용액으로 하였다. 여기에, 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주 유래의 CGT를 전분의 고형분 1g당 100단위, 플라보박테리움 오도라투스 유래 이소아밀라아제(제품명 『GODO-FIA』, 합동주정주식회사제)를 전분의 고형분 1g당 500단위 첨가하고 55℃에서 40시간 반응시켜, 아스코르빈산 2-글루코시드와 함께, 2-O-α-말토실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토트리오실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토테트라오실-L-아스코르빈산 등의 α-글리코실-L-아스코르빈산을 생성시켰다.
본 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, pH 4.5로 조정하고, 여기에 글루코아밀라아제제(아마노엔자임주식회사 판매, 상품명『글루쿠자임 AF6』, 6,000단위/g)를 전분의 고형분 1g당 50단위 첨가하며 55℃에서 24시간 처리하여, α-글루코실-L-아스코르빈산을 아스코르빈산 2-글루코시드로까지, 또한 혼재하는 당질을 D-글루코오스로까지 분해하였다. 본 반응액 중의 L-아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 약 36%이었다.
본 반응액을 가열하여 효소를 실활시키고, 활성탄으로 탈색여과한 후, 여과액을 양이온 교환수지(H+형)로 탈염하며, 그 다음, 음이온 교환수지(OH-형)에 L-아스코르빈산 및 아스코르빈산 2-글루코시드를 흡착시키고 물세척하여 D-글루코오스를 제거한 후, 0.5N 염산수용액으로 용출하였다. 또한, 이 용출액을 고형분 약 50%로까지 농축하여, 강산성 양이온 교환수지(상품명 『다이아이온 UBK 550』Na+형, 미츠비시화학주식회사제)를 충전한 10개의 칼럼을 이용한 의사이동상식의 칼럼크로마토그래피에 제공하였다. 용출액을 고형분 농도 약 50%로까지 농축하고, 칼럼에 그 수지용적의 약 1/40 양 차지하여, 차지량의 약 15배의 용리액을 칼럼에 공급함으로써 아스코르빈산 2-글루코시드를 용출하고, L-아스코르빈산 함량이 적은 아스코르빈산 2-글루코시드 고함유 획분을 채취하였다. 채취한 획분에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 약 86.6%이었다.
이 획분을 감압농축하여 농도를 약 76%로 하였다. 이를 결정관에 덜어, 시약급의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말(상품명 『아스코르빈산 2-글루코시드 999』, 코드 번호: AG124, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 99.9% 이상, 주식회사 하야시바라생물화학연구소 판매)를 종정으로서 2% 첨가하여 40℃로 하고, 천천히 교반하면서 용액의 온도를 40℃에서부터 35℃로 20시간에 걸쳐 냉각한 후, 35℃에서 30℃로 16시간에 걸쳐 냉각하며, 그리고 30℃에서 15℃로 12시간에 걸쳐 냉각하는 의사 제어냉각법을 적용함으로써 48시간에 걸쳐 냉각하여, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시켰다. 바스켓형 원심분리기로 결정을 회수하고, 결정을 마세큐트 중량에 대해 약 5%의 정제수로 스프레이하여 세정한 후, 38℃에서 3시간 숙성, 건조시키며, 20℃의 공기를 45분간 내뿜어 냉각하고 분쇄하여, 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 99.5%, L-아스코르빈산과 D-글루코오스를 합계로 0.1%, L-아스코르빈산을 0.1% 미만 함유하고 분말 전체의 환원력이 0.21%인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻었다.
본 제조방법에 의해 제조된 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도는 93.9%, 평균 결정자 지름은 1.630Å이었다. 또한, 상기 결정화도의 측정은 하만스법으로 수행하며, 실험 1-2에서 구한 해석값 H100 및 H0를 사용하여 실시하였다. 본 품의 입도 분포를 측정하였더니, 입경 150μm 미만인 입자가 91.2%, 입경 53μm 이상 150μm 미만인 입자가 57.3% 포함되어 있었다. 본 품을 사용하여, 실험 1-4와 동일한 방법에 의해 고결성 시험을 실시하였더니, 「고결 없음」(-)로 판정되었다. 또한, 실험 6과 동일한 방법에 의해 1,3-부틸렌글리콜에 대한 용해성을 실험하였더니, 용해성 「양호」로 판정되었다.
본 품은 종래의 의약부외품급의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 비해 유의적으로 고결되기 어려운 분말이며, 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 및 의약품 소재 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
<아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조>
아스코르빈산 2-글루코시드 생성반응에 있어서, CGTase로서 써모아나에로박터 유래의 재조합형 CGTase(상품명 『Toruzyme 3.0L』, 노보자임(NOVOZYME)사 판매)를, 또한, CGTase와 병용하는 전분 절지 효소로서, 바실러스 아시도풀루리티쿠스 유래의 풀룰라나아제(상품명 『프로모자임』, 노보자임 재팬사 판매)를 전분의 고형분 1g당 50단위 사용하고, 또한 결정석출공정에 있어서, 5단계에서 40℃에서부터 15℃까지 총 48시간에 걸쳐 냉각하는 의사 제어냉각법, 즉 40℃에서부터 38℃로 12시간, 38℃에서 35℃로 12시간, 35℃에서 30℃로 8시간, 30℃에서 23℃로 8시간, 그리고 23℃에서부터 15℃로 8시간에 걸쳐 냉각하는 의사 제어냉각법을 적용한 것 이외에는 실시예 6과 동일하게 하여, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조하여, 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 99.3%, L-아스코르빈산과 D-글루코오스를 합계로 0.1%, L-아스코르빈산을 0.1% 미만 함유하며 분말 전체의 환원력이 0.28%인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻었다. 또한, 본 제조에 있어서, 글루코아밀라아제 처리 후 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 32.9%이었다. 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 석출에 이용한 용액의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 86.4%이었다.
본 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도는 96.4%, 평균 결정자 지름은 1,570Å이었다. 또한, 상기 결정화도의 측정은 하만스법으로 수행하며, 실험 1-2에서 구한 해석값 H100 및 H0를 사용하여 실시하였다. 본 품의 입도 분포를 측정하였더니, 입경 150μm 미만인 입자가 92.2%, 입경 53μm 이상 150μm 미만인 입자가 54.8% 포함되어 있었다. 본 품을 사용하여, 실험 1-4와 동일한 방법에 의해 고결성 시험을 실시한 바, 「고결 없음」(-)로 판정되었다. 또한, 실험 6과 동일한 방법으로 1,3-부틸렌글리콜에 대한 용해성을 실험하였더니, 용해성 「양호」로 판정되었다.
본 제조방법에 의해 제조된 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 시판되고 있는 종래의 의약부외품급의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말(상품명 『AA2G』, 주식회사 하야시바라상사 판매)에 비해, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도에서 그다지 차이가 없음에도 불구하고, 유의적으로 고결되기 어려운 분말이며, 보존이나 취급이 용이하다.
본 품은 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정 함유 분말인 점에서는 종래의 의약부외품급의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말과 동일하며, 보존이나 취급이 용이한 만큼, 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 및 의약품 소재 등으로서 보다 바람직하게 사용할 수 있다.
<아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조>
아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 결정석출공정에 있어서, 범용의 결정석출시스템용 프로그램 항온순환장치를 사용하여, 온도제어한 열매체를 결정관(crystallizer)의 자켓에 흘려보내, 온도를 40℃로부터 15℃로, 상기 식 [7]에 근사하게 한 20단계의 냉각 프로파일로 48시간에 걸쳐 냉각하는 제어냉각법을 적용함으로써, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시킨 것 이외에는 실시예 3과 동일한 방법에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조하였다. 얻어진 분말은 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 99.6%, L-아스코르빈산과 D-글루코오스를 합계 0.1%, L-아스코르빈산을 0.1% 미만 함유하며, 분말 전체의 환원력이 0.17%인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유분말이었다. 또한, 본 제조에 있어서, 글루코아밀라아제 처리 후 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 약 31%이었다. 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 석출에 이용한 용액의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 88.7%였다.
본 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도는 93.0%, 평균 결정자 지름은 1,650Å이었다. 또한, 상기 결정화도의 측정은 하만스법으로 수행하며, 실험 1-2에서 구한 해석값 H100 및 H0를 사용하여 실시하였다. 본 품의 입도 분포를 측정하였더니, 입경 150μm 미만인 입자가 90.4%, 입경 53μm 이상 150μm 미만인 입자가 65.3% 포함되어 있었다. 본 품을 사용하여, 실험 1-4와 동일한 방법에 의해 고결성 시험을 실시하였더니, 「고결 없음」(-)로 판정되었다. 또한, 실험 6과 동일한 방법에 의해 1,3-부틸렌글리콜에 대한 용해성을 실험하였더니, 용해성 「양호」로 판정되었다.
본 제조방법에 의해 제조된 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 시판되고 있는 종래의 의약부외품급의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말(상품명 『AA2G』, 주식회사 하야시바라상사 판매)에 비해, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도에서 그다지 차이가 없음에도 불구하고, 유의적으로 고결되기 어려운 분말이며, 보존이나 취급이 용이하다.
본 품은 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정 함유 분말인 점에서는 종래의 의약부외품급의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말과 동일하며, 보존이나 취급이 용이한 만큼 식품 소재, 식품첨가물 소재, 화장품 소재, 의약부외품급 소재, 및 의약품 소재 등으로서 보다 바람직하게 사용할 수 있다.
<비교예 1 : 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조>
아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 결정석출공정에 있어서 의사 제어냉각법을 적용하지 않고 종래의 자연냉각법을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조하고, 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.6%, L-아스코르빈산과 D-글루코오스를 합계 0.5%, L-아스코르빈산을 0.3% 함유하고, 분말 전체의 환원력이 0.72%인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻었다. 또한, 본 제조에 있어서, 글루코아밀라아제 처리 후 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 28.4%, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 석출에 이용한 용액의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 86.5%이었다.
본 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도는 87.5%, 평균 결정자 지름은 1,290Å이었다. 또한, 상기 결정화도의 측정은 하만스법으로 수행하며, 실험 1-2에서 구한 해석값 H100 및 H0를 사용하여 실시하였다. 본 품의 입도 분포를 측정하였더니, 입경 150μm 미만인 입자가 74.8%, 입경 53μm 이상 150μm 미만인 입자가 68.6% 포함되어 있었다. 본 품을 사용하여, 실험 1-4와 동일한 방법에 의해 고결성 시험을 실시하였더니, 「고결 있음」(+)로 판정되었다. 또한, 실험 6과 동일한 방법에 의해 1,3-부틸렌글리콜에 대한 용해성을 실험하였더니, 용해성 「양호」로 판단되었다.
<비교예 2: 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조>
아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 결정석출공정에 있어서 의사 제어냉각법을 적용하지 않고 종래의 자연냉각법을 사용한 것 이외에는 실시예 3과 마찬가지로 하여 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조하고, 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.3%, L-아스코르빈산과 D-글루코오스를 합계 0.6%, L-아스코르빈산을 0.4% 함유하고, 분말 전체의 환원력이 0.85%인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻었다. 또한, 본 제조에 있어서, 글루코아밀라아제 처리 후 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 30.5%, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 석출에 이용한 용액의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 87.8%이었다.
본 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도는 86.6%, 평균 결정자 지름은 1,310Å이었다. 또한, 상기 결정화도의 측정은 하만스법으로 수행하며, 실험 1-2에서 구한 해석값 H100 및 H0를 사용하여 실시하였다. 본 품의 입도 분포를 측정하였더니, 입경 150μm 미만인 입자가 76.5%, 입경 53μm 이상 150μm 미만인 입자가 68.4% 포함되어 있었다. 본 품을 사용하여, 실험 1-4와 동일한 방법에 의해 고결성 시험을 실시하였더니, 「고결 있음」(+)로 판정되었다. 또한, 실험 6과 동일한 방법에 의해 1,3-부틸렌글리콜에 대한 용해성을 실험하였더니, 용해성 「양호」로 판정되었다.
<참고예 1: 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조>
감자 전분 5질량부를 물 15질량부에 첨가하고, 시판 액화 효소를 첨가하여 가열용해하며, L-아스코르빈산 3질량부를 첨가하고, pH를 5.5로 조정하여 기질 용액으로 하였다. 여기에, CGTase(주식회사 하야시바라생물화학연구소 제품, 지오바실러스 스테아로써모필루스 Tc-91주(독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 수탁번호 FERM BP-11273) 유래와 이소아밀라아제(주식회사 하야시바라 생물화학연구소 제조)를, 각각 감자 전분 1g당 100단위 및 1,000단위 첨가하여 55℃에서 50시간 반응시킴으로써 아스코르빈산 2-글루코시드 및 기타 α-글루코실-L-아스코르빈산을 생성시켰다. 이 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, pH를 4.5로 조정하고, 여기에 글루코아밀라아제제(나가세켐텍스주식회사 판매, 상품명 『글루코침 #20000』, 20,000 단위/g)를 감자 전분 1g당 50단위 첨가하고, 55℃에서 24시간 반응시켜, α-글리코실-L-아스코르빈산을 아스코르빈산 2-글루코시드로까지, 또한 혼재하는 당질을 D-글루코오스로까지 분해하였다. 본 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 약 38%였다.
본 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, 활성탄으로 탈색 여과하고, 여과액을 양이온 교환수지(H+형)으로 탈염하며, 그런 다음, 음이온 교환수지(OH-형)에 L-아스코르빈산 및 아스코르빈산 2-글루코시드를 흡착시키고 물세척하여 D-글루코오스를 제거한 후, 0.5N 염산용액으로 용출하고, 또한 다공성 수지(상품명 『토요펄 HW-40』, 토소주식회사제)를 사용한 칼럼크로마토그래피에 제공하여, 아스코르빈산 2-글루코시드를 고함량으로 함유하고 L-아스코르빈산 양이 적은 획분을 채취하였다. 채취한 획분에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 87.6%였다.
이 획분을 감압농축하여 농도를 약 76%로 하고, 이를 결정관에 덜며, 실시예 1에서 제조한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 종정으로서 2% 첨가하여 40℃로 하고, 천천히 교반하면서 자연냉각법으로 2일간 15℃까지 냉각하며, 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 석출시켰다. 바스켓형 원심분리기로 결정을 회수하고, 결정을 소량의 증류수로 스프레이하여 세정한 후, 35℃에서 8시간 숙성, 건조시키며, 20℃의 공기를 10분간 내뿜어 냉각하고 분쇄함으로써 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 98.5%, L-아스코르빈산과 D-글루코오스의 합계 함량 0.1% 미만, L-아스코르빈산 함량 0.1% 미만, 분말 전체의 환원력 0.15%, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도 91.8%, 그 평균 결정자 지름이 1,320Å인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻었다. 그리고, 상기 결정화도의 측정은 하만스법으로 수행하며, 실험 1-2에서 구한 해석값 H100 및 H0를 사용하여 실시하였다. 본 분말의 입도 분포를 측정하였더니, 입경 150μm 미만인 입자가 83.0%, 입경 53μm 이상 150μm 미만인 입자가 57.7% 포함되어 있었다. 본 분말을 사용하여, 실험 1-4, 실험 3-2 및 실험 6과 각각 동일한 방법에 의해 고결성 시험, 보존성 시험 및 용해성 시험을 실시하였더니, 본 분말은 고결성 시험 및 보존성 시험에서 「고결 없음」(-)로 판정되었지만, 용해성 시험에서 「용해성 불량」(-)로 판정되었다.
이상과 같이, 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조방법에 따르면, 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 원료로 하여, 효소반응액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 35%에 미치지 못하는 경우이더라도, 결정석출공정에 있어서 제어냉각법 또는 의사 제어냉각법을 적용함으로써, 종래의 의약부외품급의 분말보다도 유의적으로 고결되기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 제조방법은 사용하는 효소에 대해 그 선택의 폭을 넓힘과 동시에, 한정된 자원인 전분 또는 덱스트린과 L-아스코르빈산을 원료로 하여 보다 효율적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 공업적 규모로 제조하는 것을 가능하게 하는 것이며, 그 산업상의 유용성에는 특별한 것이 있다.
도 1에 있어서,
a : 결정자 지름의 산출에 사용하는 회절각(2θ) 10.4˚(미러지수(hkl): 120)의 회절피크
b : 결정자 지름의 산출에 사용하는 회절각(2θ) 13.2˚(미러지수: 130)의 회절피크
c : 결정자 지름의 산출에 사용하는 회절각(2θ) 18.3˚(미러지수: 230)의 회절피크
d : 결정자 지름의 산출에 사용하는 회절각(2θ) 21.9˚(미러지수: 060)의 회절피크
e : 결정자 지름의 산출에 사용하는 회절각(2θ) 22.6˚(미러지수: 131)의 회절피크
도 5에 있어서,
pUC ori : 플라스미드 pUC의 복제개시점
T7 : T7 프로모터
흰 화살표(Amp) : 암피실린 내성 유전자
검은 화살표 : CGTase 유전자
도 6에 있어서,
a : 제어냉각곡선
b : 직선냉각
c : 자연냉각곡선
(독)산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERMBP-11273 19730730
<110> Kabushiki Kaisha Hayashibara
<120> Process for producing a particulate composition comprising anhydrous crystalline 2-O-alpha-glucosyl-L-ascorbic acid
<130> WO1240
<160> 7
<210> 1
<211> 680
<212> PRT
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 1
Ala Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr Gln
5 10 15
Ile Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser
20 25 30
Gly Ala Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly
35 40 45
Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr
50 55 60
Asp Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val
65 70 75 80
Phe Ser Val Met Asn Asp Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr His Gly Tyr
85 90 95
Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu Ser
100 105 110
Asp Phe Gln Arg Leu Val Asp Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val
115 120 125
Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asn
130 135 140
Pro Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Leu
145 150 155 160
Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Ala Asn Met Tyr Phe His His Asn Gly Gly
165 170 175
Thr Thr Phe Ser Ser Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp
180 185 190
Leu Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp Arg Tyr Leu Lys
195 200 205
Asp Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly Ile Arg Met
210 215 220
Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu Met Asp
225 230 235 240
Glu Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu
245 250 255
Ser Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser
260 265 270
Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln Val
275 280 285
Leu Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile Gln
290 295 300
Asp Thr Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Val Thr Phe Ile
305 310 315 320
Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro Arg
325 330 335
Lys Val Asp Met Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro
340 345 350
Asn Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro
355 360 365
Asn Asn Arg Lys Met Met Ser Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr
370 375 380
Gln Val Ile Gln Lys Leu Ser Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala Leu
385 390 395 400
Ala Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr Val
405 410 415
Tyr Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val Val Leu Val Ala Val Asn Arg
420 425 430
Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Phe Thr Ala Leu Pro
435 440 445
Ala Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu Leu Asp Gly Asn Thr
450 455 460
Ile Gln Val Gly Ser Asn Gly Ser Val Asn Ala Phe Asp Leu Gly Pro
465 470 475 480
Gly Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ile
485 490 495
Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln Val Thr
500 505 510
Ile Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Thr Gly Thr Val Lys Phe Gly
515 520 525
Thr Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val Val
530 535 540
Ala Val Pro Asn Val Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Ser
545 550 555 560
Ser Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr
565 570 575
Asn Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr Asn
580 585 590
Leu Gly Gln Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly Asn
595 600 605
Trp Asp Thr Ser Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val Tyr
610 615 620
Ser Tyr Pro Thr Trp Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr
625 630 635 640
Ile Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Gln Gly Asn Val Thr Trp
645 650 655
Glu Ser Gly Ser Asn His Val Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr Gly
660 665 670
Lys Ile Ile Val Asp Trp Gln Asn
675 680
<210> 2
<211> 2133
<212> DNA
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 2
atg aga aga tgg ctt tcg cta gtc ttg agc atg tca ttt gta ttt agt 48
Met Arg Arg Trp Leu Ser Leu Val Leu Ser Met Ser Phe Val Phe Ser
1 5 10 15
gca att ttt ata gta tct gat acg cag aaa gtc acc gtt gaa gca gct 96
Ala Ile Phe Ile Val Ser Asp Thr Gln Lys Val Thr Val Glu Ala Ala
20 25 30
gga aat ctt aat aag gta aac ttt aca tca gat gtt gtc tat caa att 144
Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr Gln Ile
35 40 45
gta gtg gat cga ttt gtg gat gga aat aca tcc aat aat ccg agt gga 192
Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser Gly
50 55 60
gca tta ttt agc tca gga tgt acg aat tta cgc aag tat tgc ggt gga 240
Ala Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly Gly
65 70 75 80
gat tgg caa ggc atc atc aat aaa att aac gat ggg tat tta aca gat 288
Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Asp
85 90 95
atg ggt gtg aca gcg ata tgg att tct cag cct gta gaa aat gta ttt 336
Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val Phe
100 105 110
tct gtg atg aat gat gca agc ggt tca gcc tcc tat cat ggt tat tgg 384
Ser Val Met Asn Asp Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr His Gly Tyr Trp
115 120 125
gcg cgc gat ttc aaa aag cca aac ccg ttt ttt ggt acc ctc agt gat 432
Ala Arg Asp Phe Lys Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu Ser Asp
130 135 140
ttc caa cgt tta gtt gat gcc gca cat gca aaa gga ata aag gta att 480
Phe Gln Arg Leu Val Asp Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val Ile
145 150 155 160
att gac ttt gcc ccc aac cat act tct cct gct tca gaa acg aat cct 528
Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asn Pro
165 170 175
tct tat atg gaa aac gga cga ctg tac gat aat ggg aca ttg ctt ggc 576
Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Leu Gly
180 185 190
ggt tac aca aat gat gcc aac atg tat ttt cac cat aac ggt gga aca 624
Gly Tyr Thr Asn Asp Ala Asn Met Tyr Phe His His Asn Gly Gly Thr
195 200 205
acg ttt tcc agc tta gag gat ggg att tat cga aat ctg ttt gac ttg 672
Thr Phe Ser Ser Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp Leu
210 215 220
gcg gac ctt aac cat cag aac cct gtt att gat agg tat tta aaa gat 720
Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp Arg Tyr Leu Lys Asp
225 230 235 240
gca gta aaa atg tgg ata gat atg ggg att gat ggt atc cgt atg gat 768
Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly Ile Arg Met Asp
245 250 255
gcg gtg aag cac atg ccg ttt gga tgg caa aaa tct ctg atg gat gag 816
Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu Met Asp Glu
260 265 270
att gat aac tat cgt cct gtc ttt acg ttt ggg gag tgg ttt ttg tca 864
Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu Ser
275 280 285
gaa aat gaa gtg gac gcg aac aat cat tac ttt gcc aat gaa agt gga 912
Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser Gly
290 295 300
atg agt ttg ctc gat ttt cgt ttc gga caa aag ctt cgt caa gta ttg 960
Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln Val Leu
305 310 315 320
cgc aat aac agc gat aat tgg tat ggc ttt aat caa atg att caa gat 1008
Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile Gln Asp
325 330 335
acg gca tca gca tat gac gag gtt ctc gat caa gta aca ttc ata gac 1056
Thr Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp
340 345 350
aac cat gat atg gat cgg ttt atg att gac gga gga gat ccg cgc aag 1104
Asn His Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro Arg Lys
355 360 365
gtg gat atg gca ctt gct gta tta ttg aca tcc cgt ggc gta ccg aat 1152
Val Asp Met Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Asn
370 375 380
att tac tat ggt aca gag caa tac atg acc ggt aac ggc gat cca aac 1200
Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro Asn
385 390 395 400
aat cgt aag atg atg agt tca ttc aat aaa aat act cgc gcg tat caa 1248
Asn Arg Lys Met Met Ser Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr Gln
405 410 415
gtg att caa aaa cta tct tct ctc cga cga aac aat ccg gcg tta gct 1296
Val Ile Gln Lys Leu Ser Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala Leu Ala
420 425 430
tat ggt gat acc gaa cag cgt tgg atc aat ggc gat gtg tat gtg tat 1344
Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr Val Tyr
435 440 445
gag cga cag ttt ggc aaa gat gtt gtg tta gtt gcc gtt aat cgt agt 1392
Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val Val Leu Val Ala Val Asn Arg Ser
450 455 460
tca agc agt aat tac tcg att act ggc tta ttt aca gct tta cca gca 1440
Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Phe Thr Ala Leu Pro Ala
465 470 475 480
gga aca tat acg gat cag ctt ggc ggt ctt tta gac gga aat aca att 1488
Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu Leu Asp Gly Asn Thr Ile
485 490 495
caa gtc ggt tca aat gga tca gtt aat gca ttt gac tta gga ccg ggg 1536
Gln Val Gly Ser Asn Gly Ser Val Asn Ala Phe Asp Leu Gly Pro Gly
500 505 510
gaa gtc ggt gta tgg gca tac agt gca aca gaa agc acg cca att att 1584
Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ile Ile
515 520 525
ggt cat gtt gga ccg atg atg ggg caa gtc ggt cat caa gta acc att 1632
Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln Val Thr Ile
530 535 540
gat ggc gaa gga ttc gga aca aat acg ggc act gtg aag ttc gga acg 1680
Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Thr Gly Thr Val Lys Phe Gly Thr
545 550 555 560
aca gct gcc aat gtt gtg tct tgg tct aac aat caa atc gtt gtg gct 1728
Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val Val Ala
565 570 575
gta cca aat gtg tca cca gga aaa tat aat att acc gtc caa tca tca 1776
Val Pro Asn Val Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Ser Ser
580 585 590
agc ggt caa acg agt gcg gct tat gat aac ttt gaa gta cta aca aat 1824
Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr Asn
595 600 605
gat caa gtg tca gtg cgg ttt gtt gtt aat aac gcg act acc aat cta 1872
Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr Asn Leu
610 615 620
ggg caa aat ata tac att gtt ggc aac gta tat gag ctc ggc aac tgg 1920
Gly Gln Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly Asn Trp
625 630 635 640
gac act agt aag gca atc ggt cca atg ttc aat caa gtg gtt tac tcc 1968
Asp Thr Ser Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val Tyr Ser
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tat cct aca tgg tat ata gat gtc agt gtc cca gaa gga aag aca att 2016
Tyr Pro Thr Trp Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr Ile
660 665 670
gag ttt aag ttt att aaa aaa gac agc caa ggt aat gtc act tgg gaa 2064
Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Gln Gly Asn Val Thr Trp Glu
675 680 685
agt ggt tca aat cat gtt tat acg aca cca acg aat aca acc gga aaa 2112
Ser Gly Ser Asn His Val Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr Gly Lys
690 695 700
att ata gtg gat tgg cag aac 2133
Ile Ile Val Asp Trp Gln Asn
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<211> 681
<212> PRT
<213> Thermoanaerobacter thermosulfurigenes
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Glu Asn Ile Tyr Ala Val Leu Pro Asp Ser Thr Phe Gly Gly Ser Thr
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Asn Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro
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<213> Artificial amino acid sequence
<400> 5
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<212> PRT
<213> Bacillus macerans
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Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Gln Gly Trp Gln Lys
225 230 235 240
Ser Tyr Val Ser Ser Ile Tyr Ser Ser Ala Asn Pro Val Phe Thr Phe
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Gly Glu Trp Phe Leu Gly Pro Asp Glu Met Thr Gln Asp Asn Ile Asn
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<211> 682
<212> PRT
<213> Paenibacillus illinoisensis
<400> 7
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Ile Phe Ala Thr Ile Asn Tyr Ser Gly Val Thr Asn Thr Ala Tyr His
85 90 95
Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro Tyr Phe Gly Thr
100 105 110
Met Thr Asp Phe Gln Asn Leu Val Thr Ser Ala His Ala Lys Gly Ile
115 120 125
Lys Ile Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Phe Pro Ala Met Glu
130 135 140
Thr Asp Thr Ser Phe Ala Glu Asn Gly Lys Leu Tyr Asp Asn Gly Ser
145 150 155 160
Leu Val Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Asn Gly Tyr Phe His His Asn
165 170 175
Gly Gly Ser Asp Phe Ser Thr Leu Glu Asn Gly Ile Tyr Lys Asn Leu
180 185 190
Tyr Asp Leu Ala Asp Leu Asn His Asn Asn Ser Thr Ile Asp Thr Tyr
195 200 205
Phe Lys Asp Ala Ile Lys Leu Trp Leu Asp Met Gly Val Asp Gly Ile
210 215 220
Arg Val Asp Ala Val Lys His Met Pro Gln Gly Trp Gln Lys Asn Trp
225 230 235 240
Met Ser Ser Ile Tyr Ala His Lys Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp
245 250 255
Phe Leu Gly Ser Ala Ala Ser Asp Ala Asp Asn Thr Asp Phe Ala Asn
260 265 270
Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Asn Ser Ala Val Arg
275 280 285
Asn Val Phe Arg Asp Asn Thr Ser Asn Met Tyr Ala Leu Asp Ser Met
290 295 300
Leu Thr Ala Thr Ala Ala Asp Tyr Asn Gln Val Asn Asp Gln Val Thr
305 310 315 320
Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Lys Thr Ser Ala Val Asn
325 330 335
Asn Arg Arg Leu Glu Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu Thr Ser Arg Gly
340 345 350
Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Gly Asn Gly
355 360 365
Asp Pro Asp Asn Arg Gly Lys Met Pro Ser Phe Ser Lys Ser Thr Thr
370 375 380
Ala Phe Ser Val Ile Ser Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser Asn Pro
385 390 395 400
Ala Ile Ala Tyr Gly Ser Thr Gln Gln Arg Trp Ile Asn Asn Asp Val
405 410 415
Tyr Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Lys Ser Val Ala Val Val Ala Val
420 425 430
Asn Arg Asn Leu Thr Thr Pro Thr Ser Ile Thr Asn Leu Asn Thr Ser
435 440 445
Leu Pro Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Val Leu Gly Gly Val Leu Asn Gly
450 455 460
Asn Asn Ile Thr Ser Ser Gly Gly Asn Ile Ser Ser Phe Thr Leu Ala
465 470 475 480
Ala Gly Ala Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Ser Glu Thr Thr Pro
485 490 495
Thr Ile Gly His Val Gly Pro Val Met Gly Lys Pro Gly Asn Val Val
500 505 510
Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Ser Thr Lys Gly Thr Val Tyr Phe
515 520 525
Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Ala Ile Thr Ser Trp Glu Asp Thr
530 535 540
Gln Ile Lys Val Thr Ile Pro Pro Val Ala Gly Gly Asp Tyr Ala Val
545 550 555 560
Lys Val Ala Ala Asn Gly Val Asn Ser Asn Ala Tyr Asn Asp Phe Thr
565 570 575
Ile Leu Ser Gly Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val Ile Asn Asn Ala
580 585 590
Thr Thr Ala Leu Gly Glu Asn Ile Tyr Leu Thr Gly Asn Val Ser Glu
595 600 605
Leu Gly Asn Trp Thr Thr Gly Ala Ala Ser Ile Gly Pro Ala Phe Asn
610 615 620
Gln Val Ile His Ala Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr Asp Val Ser Val Pro
625 630 635 640
Ala Gly Lys Gln Leu Glu Phe Lys Phe Phe Lys Lys Asn Gly Ala Thr
645 650 655
Ile Thr Trp Glu Gly Gly Ser Asn His Thr Phe Thr Thr Pro Thr Ser
660 665 670
Gly Thr Ala Thr Val Thr Val Asn Trp Gln
675 680

Claims (7)

  1. 하기 (가) 내지 (마)의 공정을 포함하는, 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말의 제조방법:
    (가) 원료로서 액화 전분 또는 덱스트린 중 어느 하나와 L-아스코르빈산을 포함하는 용액에 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제를 작용시키고, 그 다음 글루코아밀라아제를 작용시켜 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산의 생성률이 27질량% 이상인 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 함유 용액을 얻는 공정;
    (나) 얻어진 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 함유 용액을 정제하여, 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 함량을 무수물 환산으로 86질량% 초과로 하는 공정;
    (다) 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산을 무수물 환산으로 86질량% 초과 함유하는 용액으로부터 제어냉각법 또는 의사(擬似) 제어냉각법에 의해 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산의 무수결정을 석출시키는 공정;
    (라) 석출한 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산의 무수결정을 채취하는 공정; 및
    (마) 채취된 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산의 무수결정을 용해, 재결정화하지 않고, 숙성, 건조시키며, 필요에 따라 분쇄하는 것에 의해, 무수물 환산으로 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산을 98.0질량% 초과, 99.9질량% 미만 함유하고, 분말 X선 회절 프로파일에 기초하여 산출되는 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상인 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말을 얻는 공정.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (가)의 공정에서, 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제와 함께 전분 절지 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말의 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 (나)의 공정은 음이온 교환수지를 충전제로서 사용하는 칼럼크로마토그래피와, 강산성 양이온 교환수지를 충전제로서 사용하는 의사이동상식(擬似移動床式)의 칼럼크로마토그래피를 수행하는 공정을 포함하고 있는, 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말의 제조방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제는 하기 (a) 내지 (d)에 나타내는 부분 아미노산 서열을 갖는 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제인, 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말의 제조방법:
    (a) Asn-Glu-Val-Asp-X1-Asn-Asn;
    (b) Met-Ile-Gln-X2-Thr-Ala;
    (c) Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn-Ile;
    (d) Val-X3-Ser-Asn-Gly-Ser-Val.
    (단, X1은 Pro 또는 Ala을, X2는 Ser 또는 Asp를, X3은 Ser 또는 Gly를 각각 의미한다.)
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제가 지오바실러스 스테아로써모필루스 또는 써모아나에로박터 써모술푸리게네스 유래의 천연형 또는 재조합형 효소인, 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말의 제조방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제는 서열목록의 서열번호 1, 3, 4, 또는 5 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 시클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제인, 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말의 제조방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    얻어지는 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말은 원료 유래의 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코오스를 함유하고, L-아스코르빈산량이 무수물 환산으로 0.1질량% 이하이며, 분말 전체의 환원력이 1질량% 미만인 것을 특징으로 하는 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말의 제조방법.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110172180A1 (en) 2010-01-13 2011-07-14 Allergan Industrie. Sas Heat stable hyaluronic acid compositions for dermatological use
CN103502260B (zh) * 2011-03-07 2016-08-17 株式会社林原 含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末的制造方法
WO2014103475A1 (ja) 2012-12-27 2014-07-03 株式会社林原 アンチエイジング用皮膚外用組成物及びその製造方法
KR101907173B1 (ko) * 2013-12-09 2018-10-11 주식회사 만도 차량용 레이더 시스템 및 그의 방위각 추출 방법
WO2015152145A1 (ja) * 2014-03-31 2015-10-08 東洋精糖株式会社 ２－Ｏ－α－Ｄ－グルコシル－Ｌ－アスコルビン酸結晶粉末の製造方法
CN103993026B (zh) * 2014-04-15 2017-01-18 福建省农业科学院土壤肥料研究所 一种高温环糊精葡萄糖基转移酶基因及其重组表达
KR20160067714A (ko) 2014-12-04 2016-06-14 주식회사 엘지화학 코폴리카보네이트 및 이를 포함하는 물품
KR101685665B1 (ko) 2014-12-04 2016-12-12 주식회사 엘지화학 코폴리카보네이트 및 이를 포함하는 조성물
CN104531629B (zh) * 2014-12-16 2017-07-21 江南大学 一种提高aa‑2g转化率的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
CN108486193A (zh) * 2018-03-28 2018-09-04 安徽泰格生物技术股份有限公司 一种维生素c葡萄糖苷的提纯方法
EP3967372A4 (en) 2019-05-07 2023-11-01 Hayashibara Co., Ltd. EXTERNAL GEL-LIKE COMPOSITION FOR THE SKIN
CN110734945A (zh) * 2019-10-30 2020-01-31 安徽泰格生物技术股份有限公司 一种合成l-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法
CN111073924A (zh) * 2020-01-10 2020-04-28 福州三合元生物科技有限公司 一种维生素c葡萄糖苷的微通道连续合成方法
CN111100169A (zh) * 2020-01-10 2020-05-05 福州三合元生物科技有限公司 一种维生素c葡萄糖苷的连续合成方法
CN111111292A (zh) * 2020-01-15 2020-05-08 福州三合元生物科技有限公司 一种维生素c葡萄糖苷的除杂提纯装置
CN111534498B (zh) * 2020-05-28 2022-03-25 江南大学 歧化比活和aa-2g产量提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
CN112626094A (zh) * 2021-01-15 2021-04-09 中国水产科学研究院黄海水产研究所 环糊精葡萄糖基转移酶的基因、氨基酸序列和应用
CN112921061A (zh) * 2021-01-25 2021-06-08 山东鲁维制药有限公司 2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸的生产方法

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5327791B2 (ko) 1973-10-02 1978-08-10
JPS5339597A (en) 1976-09-22 1978-04-11 Hiroyoshi Ochiai Saw blade type chain cutting edges
JP2612687B2 (ja) 1985-10-14 1997-05-21 株式会社 林原生物化学研究所 シクロマルトデキストリングルカノトランスフエラーゼ活性を有するポリペプチド
JP2657801B2 (ja) 1986-03-30 1997-09-30 株式会社 林原生物化学研究所 糖転移反応方法
DK0398484T3 (da) 1989-05-19 1995-07-24 Hayashibara Biochem Lab Alpha-Glycosyl-L-ascorbinsyre, fremstilling og anvendelser heraf
JP2926412B2 (ja) 1989-05-19 1999-07-28 株式会社林原生物化学研究所 α―グリコシル―Ｌ―アスコルビン酸とその製造方法並びに用途
JP2832848B2 (ja) * 1989-10-21 1998-12-09 株式会社林原生物化学研究所 結晶２―Ｏ―α―Ｄ―グルコピラノシル―Ｌ―アスコルビン酸とその製造方法並びに用途
JP2926432B2 (ja) 1990-06-11 1999-07-28 株式会社林原生物化学研究所 養毛剤
JP3060238B2 (ja) 1990-11-19 2000-07-10 株式会社林原生物化学研究所 口腔用組成物
JP2981523B2 (ja) 1990-11-19 1999-11-22 株式会社林原生物化学研究所 皮膚外用剤
JP2976348B2 (ja) 1990-11-19 1999-11-10 株式会社林原生物化学研究所 皮膚外用剤
JP2958662B2 (ja) 1990-11-19 1999-10-06 株式会社加美乃素本舗 発毛・養毛促進剤
JPH04182414A (ja) 1990-11-19 1992-06-30 Hayashibara Biochem Lab Inc 頭髪化粧料
JPH04333260A (ja) 1991-05-08 1992-11-20 Hitachi Ltd 半導体集積回路のレイアウト方法
JP3035837B2 (ja) 1991-06-06 2000-04-24 株式会社林原生物化学研究所 粉末糖質とその製造方法並びに用途
JP3134235B2 (ja) 1991-10-23 2001-02-13 株式会社林原生物化学研究所 ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法
JP3134236B2 (ja) * 1992-01-30 2001-02-13 株式会社林原生物化学研究所 α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法とその製造のための分離システム
JPH05244945A (ja) 1992-03-04 1993-09-24 Nippon Shokuhin Kako Co Ltd α−サイクロデキストリンの製造方法
JPH07304725A (ja) * 1994-05-11 1995-11-21 Mitsui Toatsu Chem Inc タウリンの固結防止方法
ATE311439T1 (de) 1995-04-21 2005-12-15 Novozymes As Varianten der cyclomaltodextrin- glucanotransferase
JP3911642B2 (ja) 1995-06-06 2007-05-09 株式会社加美乃素本舗 皮膚外用剤
FR2751810B1 (fr) 1996-07-23 1998-10-23 Sgs Thomson Microelectronics Systeme de correction d'erreurs dans des trames de donnees ayant des codes de parite horizontaux et verticaux
JP4034846B2 (ja) 1996-12-10 2008-01-16 株式会社林原生物化学研究所 結晶性粉末糖質とその製造方法並びに用途
JP3326092B2 (ja) 1997-03-28 2002-09-17 エスペック株式会社 室内側扉開き補助装置
US6271010B1 (en) 1997-09-24 2001-08-07 Novzymes A/S Cyclomaltodextrin glucanotransferase variants
JP4981198B2 (ja) * 1998-03-31 2012-07-18 格 山本 グリコシル−ｌ−アスコルビン酸のアシル化誘導体
JP2000026375A (ja) 1998-07-09 2000-01-25 Sanko Kagaku Kogyo Kk 固結性の抑制されたパラニトロベンジルアルコールの結晶粒子集合体
JP2000072417A (ja) * 1998-09-04 2000-03-07 Mitsubishi Chemicals Corp 亜硝酸ソーダの固結防止方法
KR100683236B1 (ko) * 2000-03-28 2007-02-15 에자끼구리고가부시키가이샤 당 전이물의 제조방법
WO2001090338A1 (en) 2000-05-22 2001-11-29 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo α-ISOMALTOSYLTRANSFERASE, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME AND USE THEREOF
JP4697697B2 (ja) 2000-06-08 2011-06-08 株式会社林原生物化学研究所 ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法
TWI312369B (en) 2000-08-01 2009-07-21 Hayashibara Biochem Lab A-isomaltosylglucosaccharide synthase,process for producing the same and use thereof
JP2002326924A (ja) 2001-05-07 2002-11-15 Hayashibara Biochem Lab Inc 洗顔料
BR0103406A (pt) * 2001-08-15 2004-05-04 Getec Guanabara Quimica Ind S Processo de produção de frutose cristalina de elevada pureza utilizando xarope com baixo teor de frutose originária de sacarose, e produto obtido
JP4456796B2 (ja) 2001-09-27 2010-04-28 株式会社林原生物化学研究所 コラーゲン産生増強剤の製造方法とその用途
JP4043312B2 (ja) 2002-08-06 2008-02-06 株式会社林原生物化学研究所 ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造方法
JP4349809B2 (ja) 2003-01-17 2009-10-21 株式会社林原生物化学研究所 コラーゲン生成促進剤
EP1983045A3 (en) 2003-07-01 2008-12-17 Novozymes A/S CGTase Variants
US20070129430A1 (en) 2003-10-07 2007-06-07 Satomi Miyata Agent for enhancing the production of collagen, their preparation and use
JP2005239653A (ja) 2004-02-27 2005-09-08 Nippon Zettoc Co Ltd 口腔用組成物
US8841261B2 (en) 2004-03-17 2014-09-23 Hayashibara Co., Ltd. Functional powdery product
WO2006022174A1 (ja) 2004-08-24 2006-03-02 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo アスコルビン酸２－グルコシドを有効成分とする褐変抑制剤とこれを利用する褐変抑制方法
JPWO2006033412A1 (ja) 2004-09-24 2008-05-15 株式会社林原生物化学研究所 放射線障害軽減剤
EP1796158B1 (en) 2005-01-11 2016-05-18 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Semiconductor manufacturing apparatus
JP5177338B2 (ja) 2005-02-18 2013-04-03 株式会社林原 Ｌ−アスコルビン酸グルコシド含有リポソーム液
MY142987A (en) 2005-06-08 2011-02-14 Hayashibara Biochem Lab Solution for tissue adhesion prevention and method for tissue adhesion prevention
JP4274157B2 (ja) 2005-06-17 2009-06-03 ダイキン工業株式会社 空調制御システムおよび空調制御方法
WO2006137129A1 (ja) 2005-06-21 2006-12-28 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo 皮膚外用剤
JP4982718B2 (ja) 2005-08-31 2012-07-25 株式会社林原 美肌用の経口摂取用組成物
CN101331149A (zh) * 2005-11-08 2008-12-24 科学与工业研究会 从植物油的除臭机馏出物制备高纯度植物甾醇的方法
WO2007086327A1 (ja) 2006-01-24 2007-08-02 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo 毛乳頭細胞増殖促進剤
JP4268175B2 (ja) 2006-05-09 2009-05-27 東海技研株式会社 車両判別システム
CL2007002949A1 (es) * 2006-10-13 2008-05-30 Basf Ag Forma cristalina del compuesto 2-cloro-5-(3,6-dihidro-3-metil-2,6-dioxo-4-(trifluorometil)-1-(2h)-pirimidinil)-4-fluoro-n-((metil(1-metiletil)amino)sulfonil)benzamida; proceso para la preparacion de dicha forma cristalina; composicion fitoprotectora;
BRPI0705181A2 (pt) * 2007-10-16 2009-06-16 Dedini Sa Ind De Base processo e equipamento para cristalização de açúcar por resfriamento controlado
WO2010138210A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Kalamazoo Holdings, Inc. Methods of saponifying xanthophyll esters and isolating xanthophylls
JP2012067013A (ja) * 2009-09-03 2012-04-05 Hayashibara Biochem Lab Inc ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末とその製造方法並びに用途
WO2012033218A1 (ja) * 2010-09-07 2012-03-15 株式会社林原生物化学研究所 ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸含水結晶及び２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸含水結晶含有粉末とそれらの製造方法並びに用途
CN103502260B (zh) * 2011-03-07 2016-08-17 株式会社林原 含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末的制造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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The Canadian Journal of Chemical Engineering, Vol. 70, pp. 120-126 (1992.)*

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