JPS6339597A - 糖転移反応方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、糖転移反応方法とこれを利用した飲食物の製
造方法に関する。更に詳細には、特定のアミノ酸配列を
有し、且つシクロマルトデキストリン　グルカノトラン
スフェラーゼ活性を有するポリペプチドを澱粉質に作用
させることを特徴とする糖転移反応方法とこれにより生
成する糖転移反応物を含有せしめることを特徴とする飲
食物の製造方法に関する。

（従来の技術） シクロマルトデキストリン　グルカノトランスフェラー
ゼ（以下、本明細書ではＣＧＴ−ａｓｅ　　と略称する
。）は、マセランス　アミラーゼとも言わし、古くカラ
バチルス　マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍａｃｅｒａ
ｎｓ　）の産生ずる酵素として知られている。

近年、ＣＧＴ−ａｓｅ　ｉｊ　、バチルス　マセランス
タケテナくバチルス　ステアロサーモフィラス（１３ａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
　）　、バチルス　サーキュラ：／　、ｘ、　（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　）、バチルス　メガ
テリウム（１３ａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
　）、バチルス　ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏ
ｌｙｍｙｘａ　）　、クレプシーラ　ニューモニアｘ　
（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）な
どの微生物によっても産生されることが知られている。

しかしながら、これら微生物から産生されるＣＧＴ−ａ
ｓｅは、一部の酵素的性質しか知られておらず、工業的
に安心して広範に利用するにはなお不充分であシ、とシ
わけ、飲食物の製造に利用するに際しては、よシ解明さ
れたＣＧＴ−ａｓｅを利用することが望まれている。

（発明の解決しようとする問題点） 本発明者等は、ＣＧＴ−ａｓｅを工業的に安心して利用
するために、より詳細に解明されたＣＧＴ−ａｓｅ、と
９わけアミノ酸配列まで解明されたＣＧＴ−ａｓｅ活性
を有するポリペプチド（以下、本明細書では、単にポリ
ペプチドと略称する。）を飲食物の製造方法に利用する
ことについて鋭意研究した。

その結果、ポリペプチドは、部分アミノ酸配列として、 （ａ）　　Ａｓｎ−Ｉ＋１ｙｓ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ　。

（ｂ）　　Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ。

（ｃ）　　　　Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ
−Ｐｈｅ。

（ｄ）　　ＩｌｅＴｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ
　、および（ｅ）　　Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙから選ばれる１種以上の配列
を有していることが判明し、更に詳細には、前記の部分
配列がＮ末端側から近い順に、（ａ）、（ｂ）、（Ｃ）
、（ｄ）、（ｅ）の部分配列を有していることが判明し
た。

そして、その特徴的性質は、可溶性澱粉から７クロデキ
ストリンを生成し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法で７０．０００±１０，０００　の分子量を示
すポリペプチドであって、比活性２００±３０単位／■
蛋白質である。

また、バチルス　ステアロサーモフィラス由来のポリペ
プチドは、後に説明するように、表２−１に示されるア
ミノ酸配列を有していることが判明した。

更テ、バチルス　マセランス由来のポリペプチドは、後
に説明するように、表５−１に示されるアミノ酸配列を
有していることが判明した。

更に、本発明のアミノ酸配列が解明されたポリペプチド
は、澱粉質に作用して糖転移反応に利用できるだけでな
く、糖転移反応物とともに飲食物に含有せしめ風味を損
うことなくそのまま食用に供し得ることも判明した。

以下、本発明の内容を詳述し、併せて本発明の詳細な説
明する。本明細書の記載においてアミノ酸、ペプチド、
その他に関し略号で表記する場合、それらは当該分野に
おける慣用略号に基づくものである。それらの例を以下
に列記する。アミノ酸に関し、光学異性体があり得る場
合には、特に明示しなければＬ体を示すものとする。

ＤＮＡ　　：デオキシリポ核酸 ＲＮＡ　　：リポ核酸 Ａ　　：アデニン Ｔ　　：チミ／ Ｇ　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ｄＮＴＰ　：デオキシヌークレオチド三すン酸ｄｄＮＴ
Ｐ　：ジデオキシヌークレオチド三すン酸ａｃ’ｒｐ　
　：デオキシシチジン三すン酸ＳＤＳ　　ニドデシル硫
酸ナトリウム Ａｌａ　：アラニン Ａｒｇ　　：アルギニン ＡＳｎ　：アスパラギン Ａｓ　ｐ　　：アスパラギン酸 Ｃｙｓ：’システィン Ｇｌｎ　　：グルタミン Ｑｌｕ　　：グルノミン酸 Ｇｌｙ　：グリシノ ）ｔｉｓ　　：ヒスチジン Ｉ　１　ｅ　　＊インロイシン Ｌｅｕ　　：ロイシン ＬｙＳ　：リジン Ｍｅｔ　　：メチオニン ｐｈｅ　　：フェニルアラニン ｐｒｏ　　ニブロリン Ｓｅｒ　　：セリン ’ｌ’ｈｒ　　：スレオニン Ｔｒｐ　　：）リプトファン Ｔ　ｙ　ｒ　　：チロシン Ｖａｌ　　：バリン 本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＱ
　Ｔ　ａｓｅ産生菌からポリペプチド遺伝子をクローニ
ングした後、その塩基配列を解読して決定した。

一方、ポリペプチドのＮ末端を含有する部分のアミノ酸
配列は、ポリペプチドを高純度に精製した後、気相プロ
ティン　シークエンサーを用いて調べた。

ポリペプチド遺伝子のクローニング ポリペプチド産生能を有する供与体微生物よりその微生
物のＤＮＡを分離精製した後、例えば、超音波、制限酵
素などで切断し、得られたＤＮＡ断片と、同様にしてベ
クターを切断して得られたベクター断片とを、例えば、
ＤＮＡリガーゼなどより結合させ、ポリペプチド遺伝子
を含む組換え１）ＮＡを形成する。

この際、供与体微生物としては、ポリペプチド産生能を
有する微生物、例えば、特開昭４７−２０３７３号公報
、特開昭５０−６３１８９号公報、特開昭５０−８８２
９０号公報およびハンス　ベンダー（Ｈａｎｓ　Ｂｅｎ
ｄｅｒ　）、アーカイプス　オプ　マイクロバイオロジ
ー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ　）　、　Ｖｏｌ　、１１１．２７１〜２８２（１９
７７年）などに示されているバチルス　マセランス、バ
チルス　メガテリウム、バチルス　サーキュランス、バ
チルス　ポリミキサ、バチルスステアロサーモフィラス
などのバチルス属、クレープシーラ　ニューモニアエナ
トのクレーブシーラ属などの細菌が適宜選ばれる。

また、ポリペプチド産生能を遺伝子組換えによシ導入し
た形質転換微生物を供与体微生物として利用することも
できる。

供与体微生物由来のＤＮＡは、供与体微生物を、例えば
、液体培地で約１〜３日間通気攪拌培養し、得られる培
養物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させるこ
とによって調製することができる。溶菌方法は、例えば
、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素
による処理や超音波処理などが用いられる。また、必要
によりプロテアーゼなどの他の酵素剤やラウリル硫酸ナ
トリウムなどの界面活性剤を併用することも、更に凍結
融解処理を施すことも自由である。

このようにして得られる溶菌物からＤＮＡを分離、精製
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出、除蛋
白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、ア
ルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合せるこ
とによって行うことができる。

ＤＮＡを切断する方法は、例えば、超音波処理、制限酵
素処理などにより行うことができるが、得られるＤＮＡ
断片とベクター断片との結合を容易にするためには、制
限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する。例
えば、ＥｃｏＲ［、Ｈｉｎｄ　１１、ＢａｍＨＩ　、　
Ｓａｌ　Ｉ、Ｓｌａ　ｌ　、　Ｘｍａ　Ｉ　、　Ｍｂｏ
　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ、Ｓａｃ　１％ｐｓｔ　ｌなどの■型
制限酵素が適している。

ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖しうるフ
ァージ又はプラスミドが適している。

ファージとしては、例えば、エツシエリヒアコリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）　を宿主微生物とす
る場合には、λｇｔ・λＣ１λｇｔ−λＢなどが、バチ
ルス　ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ　）を宿主微生物とする場合には、ρ１１、ψ１、ψ
１０５などが使用できる。

また、プラスミドとしては、例えば、エッシエリヒア　
コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ＰＢ
Ｒ３２５などが、バチルス　ズブチリスを宿主微生物と
する場合には、ｐＵＢｌｌｏ　、　ｐＴＺ　４（ＰｒＦ
３）、ｐｃ１９４などが使用でき、更に、例えば、エノ
シエリヒア　コリ、バチルス　スフチリスなどつ二種以
上の宿主微生物で自律的増殖の可能な、例えば、ｐＨＶ
１４、ＴＲｐ　７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのベクター
を利用することも可能である。このようなベクターを、
先きに述べたＤＮＡと同様に制限酵素などで切断し、ベ
クター断片を得る。

ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は、公知
のＤＮＡ！Ｊガーゼを用いる方法であればよく、例えば
、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングの後、生
体外で適当なりＮＡリガーゼの作用により組換えＤＮＡ
を作成する。必要ならば、アニ−ＩＪングの後、宿主微
生物に導入して、生体内のＤＮＡ！Ｊガーゼを利用して
組換えＤＮＡにすることもできる。

宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的増
殖が可能でその形質発現のできるものであればよい。な
かでも、α−アミラーゼ（ＥＣ３，２，１，１）産生能
を欠いている微生物は、ポリペプチド産生量の測定が容
易であるだけでなく、産生されるポリペプチドの分離、
精製も容易であシ有利に利用できる。

宿主微生物に組換えＤＮＡを導入する方法は、公知の方
法、例えば、宿主微生物がエノシエリヒア属に属する微
生物の場合にはカルシュラムイオン存在下で行ない、バ
チルス属に属する微生物の場合にはコンピテントセル法
又はプロトプラスト法などを採用することができる。

組換えＤＮＡが導入された形質転換微生物の選択方法は
、澱粉を含む平板培地上で生育し、かつ、澱粉からシク
ロデキストリンを生成するものを選択すればよい。

このようにして一度選択されたポリペプチド遺伝子を含
む組換えＤＮＡは、形質転換微生物から取り出して、他
の宿主微生物に導入することも容易に実施できることが
判明した。またポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡ
を制限酵素などにより切断してポリペプチド遺伝子を含
むＤＮＡ断片とし、これと同様にプラスミドなどのベク
ターを切断して得られるベクター断片とを結合させるこ
とも容易に実施できることが判明した。

また、ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡは、制限
酵素ｐｖｕ　ＩＩ　（東洋紡績株式会社製造）による切
断部位を有しており、制限酵素ｐｖｕ　ＩＩの作用を受
はポリペプチド遺伝子が切断され、その形質発現能を失
うことが判明した。

ポリペプチド遺伝子の塩基配列 ポリペプチドの遺伝子塩基配列は、ジーン（Ｑｅｎｅ　
）、Ｖｏｌ、９．２５９〜２６８　（１９８２年）に示
されているジデオキシ　チェーンターミネータ−法で解
読すればよい。

この方法は、クローニングによシ得られたポリペプチド
遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラスミドｐＵｃ１８など
のプラスミドに制限酵素を利用して、そのクローニング
部位に挿入する。得られた組換えプラスミドは、形質転
換によってエッシエリヒア　コリ　ＪＭ　８３などに移
入し、次いで組換えプラスミドを有する微生物を選択す
る。

この微生物を増殖させたものを用いて組換えプラスミド
を調製する。

得られた組換えプラスミドを合成プライマーとアニーリ
ングし、これにフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）断片を働ら
かせてプライマーを伸長させ相補ＤＮＡを生成させる。

この反応物をポリアクリルアミドゲル電気泳動、次いで
、ラジオオートグラフィー法を行った後、ポリペプチド
遺伝子の塩基配列を決定する。

また、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペプ
チド遺伝子の塩基配列も、同様にして決定する。

ポリペプチドのアミノ酸配列 ポリペプチドのアミノ酸配列は、塩基配列より決定する
。

また、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペプ
チドのアミノ酸配列も、同様にして決定する。

ポ１ペプ　ドのＮ　端　１有する部分アミノ酸配列ポリ
ペプチド産生能を有するバチルス属に属する微生物を栄
養培地で培養してポリペプチドを産生させる。培養終了
後、遠心分離して上清を採取し、これを硫安分画、イオ
ン交換クロマトグラフイー、高速液体クロマトグラフィ
ーにより精製し高純度ポリペプチドとする。この試料を
用いてジャーナル　オプ　バイオロジカル　ケミストリ
ー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　（
：：ｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　、　Ｖｏｌ、２５６゜７９
９０〜７９９７　（１９８１年）の記載に準じて、気相
プロティン　シークエンサーにより分解し、高速液体ク
ロマトグラフィーで固定して、ポリペプチドのＮ末端を
含有する部分アミノ酸配列を決定する。

／ｒ転　微生物によるポリペプチドの調製上述のように
して得られた形質転換微生物を栄。

養培地で培養することにより多量のポリペプチドを安定
して産生じうろことを見いだした。

栄養培地には、例えば、炭素源、窒素源、ミネラル、更
に必要ならば、アミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養
素などを含有させればよい。

この際、炭素源としては、澱粉、澱粉部分加水分解物、
グルコース、フラクトース、スクロースなどの糖質が有
利に用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、ア
ンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素源
、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンステイープ
リカー、肉エキスなどの有機窒素源が適宜用いられる。

培養方法は、例えば、液体培地をｐＨ４〜１０、温度２
５〜６５℃の範囲に維持しつつ、通気攪拌などの好気的
条件下で約１〜４日間培養し、ポリペプチドを生成蓄積
せしめればよい。

培養物中のポリペプチドは、そのままを採取し利用する
こともできるが、一般には常法に従って、濾過、遠心分
離などによりポリペプチド溶液と微生物菌体とに分離し
た後に利用される。

ポリペプチドが菌体中に存在する場合には、細胞を超音
波、界面活性剤、細胞壁溶解酵素などで処理し、次いで
濾過、遠心分離などしてポリペプチド溶液を採取する。

このようにして得られるポリペプチド溶液を、例えば、
減圧濃縮、膜濃縮し、更に、硫安、硫酸ソーダなどによ
る塩析、メタノール、エタノール、アセトンなどによる
分別沈澱法などを適宜組み合せて精製し、より高純度の
ポリペプチドを採取して利用することも自由である。

本発明で利用するポリペプチドは、特定するアミノ酸配
列まで解明され、安心して利用しうるものであればよく
、先に述べた遺伝子組換えによる形質転換微生物からの
もののみに限定されるものではない。

本発明で特定するアミノ酸配列を有するポリペプチドは
、本発明糖転移反応方法に有利に利用できる。

即ち、本発明糖転移反応方法は、ポリペプチドを糊化澱
粉、液化澱粉、アミロースなどの澱粉質に作用させて分
子内転移反応を起させ、例えば、α−シクロデキストリ
ン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン
などを生成せしめるか、または、澱粉質などの糖供与体
と澱粉質以外の糖類、配糖体などの糖受容体との混合物
に作用させて分子間転移反応を起させ、各種糖転移反応
物を生成せしめる方法である。

分子間転移反応に利用する場合には、例えば、澱粉、液
化澱粉、デキストリン、シクロデキストリン、アミロー
スなどの澱粉質を糖供与体とし、例えば、キシロース、
ソルボース、フラクトースなどの単糖類、シュクロース
、マルチ」−ス、イソマルチユロースなどの二糖類から
選ばれる糖質甘味料を糖受容体として、これら糖供与体
と糖受容体との混合物にポリペプチドを作用させ、α−
グルコシル、α−マルトシル、α−マルトトリオンルな
どα−グリコジル化された糖質甘味料を調製することは
、きわめて有利に実施できる。得られるα−グリコジル
化された糖質甘味料は、原料の糖質甘味料と比較して呈
味がまろやかに改善されており、その水溶性が増大し、
結晶析出が防止され、その糖質甘味料の用途を著しく拡
大１〜、各種飲食物に有利に利用できる。

また、分子間転移反応において、糖受容体と七て、例え
ば、ステビオサイド、レバウデイオサイドなどのステビ
オール配糖体、グリチルリチン、ツヤサポニン、茶サポ
ニン、ジンセッサイド、ルチン、エスクリンなどの配糖
体を用いる際には、前記澱粉質などの糖供与体と配糖体
との混合物にポリペプチドを作用させることにより、α
−グルコシル、α−マルトシル、α−マルトトリオシル
などのα−グリコジル化された配糖体を調製することも
また有利に実施できる。

得られるα−グリコジル化された配糖体は、原料の配糖
体と比較して、苦味、渋味などの嫌味が解消し、水溶性
が増大するなどの物性が改善され、その配糖体の用途を
著しく拡大することができる。

特に、α−グリコジル化されたステビオール配糖体やα
−グリコジル化されたグリチルリチンなどの場合には、
その呈味の改善が著しく、砂糖に近い甘味質になること
より、各種飲食物、経口医薬品などに有利に利用できる
。また、本発明は、これら糖転移反応方法を利用した飲
食物の製造方法である。

即ち、飲食物の製造に際し、ポリペプチドを澱粉質に作
用させ、生成する糖転移反応物を含有せしめて品質の向
上した飲食物を製造する方法である。

本発明でいう澱粉質とは、ポリペプチドが作用して分子
内または分子間転移反応を起しうる澱粉質であればよく
、例えば、澱粉、アミロース、アミロペクチンまたは、
これらを酸または酵素で部分加水分解したデキストリン
などの澱粉質、およびこれら澱粉質を多量に含有してい
る米、大麦、小麦、トウモロコシ、アズキ、ササゲなど
の穀類、サツマイモ、ジャガイモなどのイモ類、または
これらのチップ、グリッツ、粉末などをいう。

飲食物の製造に際して、澱粉質にポリペプチドを作用さ
せ、生成する糖転移反応物を含有せしめる方法は、本発
明の目的が達成できればよく、例えば、予じめ糊化分散
させた澱粉質溶液にポリペプチドを作用させて、これを
そのまま若しくは必要に応じて濃縮、乾燥させた後、飲
食物に配合してもよい。

マタ、バチルス　ステアロサーモフィラス由来のポリペ
プチドのように好熱性の場合には、予じめ澱粉質とポリ
ペプチドとを共存させて、澱粉質の糊化と糖転移反応と
を同時に行なって飲食物を製造してもよい。また、ポリ
ペプチドとともに他の酵素、例えば、アミラーゼ、グロ
テアーゼ、リパーゼなどを併用することも自由である。

このようにして得られる飲食物は、ポリペプチドの作用
によシ澱粉質の老化を抑制し、飲食物の口当り、呈味改
良、風味向上するだけでなく、結晶析出防止、乳化性、
保湿性などの物性を改善し、しかも、これら性質が変化
しにくく、高品質を長期間維持できるので、極めて商品
価値が高い。

本発明を適用しうる飲食物としては、澱粉質を含有して
いるか、または、澱粉質を原料とする飲食物が好適であ
って、例えば、クツキー、ビスケット、おかき、スポン
ジケーキ、ういろう、求肥、餅などの菓子類、菓子パン
、食パンなどのパン類、うどん、そば、ラーメン、マカ
ロニなどの麺類、カマポコ、魚肉ソーセージなどの魚肉
練製品、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スー
プの素、α−グリコジル　ステビオサイド、α−グリコ
ジル　グリチルリチンなどの調味料、甘酒、かたくシ、
しるこなどの飲料、清酒、味淋、ビール、酢、醤油、味
噌などの醗酵飲食物などが好適である。

以下、実験で本発明の詳細な説明する。

実験１　バチルス　ステアロサーモフィラス　ポリペプ
チド遺伝子のエッシエリヒア　コリへのクローニング ［１１バチルス　ステアロサーモフィラスの耐熱性ポリ
ペプチド遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製バチルス　ス
テアロサーモフィラスの耐熱性ポリペプチド遺伝子を含
む染色体ＤＮＡは、斉藤、三浦等の方法〔ピオキミ力　
エト　ピオフィジカ　アクタ（１３ｉｏｃｈｉｍｉｃａ
　ｅｔ　ＢｉｏｐｈｉｓｉｃａＡｃｔａ　）　、　Ｖｏ
ｌ、７２．６１９〜６２９　（１９６３年）〕Ｋ準じて
調製した。即ち、バチルス　ステアロサーモフィラス　
ＦＥＲＭ　Ｐ　Ａ２２２５をプレイン　ハート　インフ
ュージョン培地で５０℃、−夜通気攪拌培養した。培養
液を遠心分離にて集菌し、得られた菌体をＴＥＳ緩衝液
（ｐＨ８，０、トリスアミノメタン、塩酸、ＥＤＴＡ、
塩化ナトリウム含有）に懸濁し、次にリゾチーム′！！
−−当り２■の割合で加え、３７℃で３０分間深持した
。これを、−２０℃で一夜結凍した後、ＴＳＳ緩衝液（
ｐＨ９，０、トリスアミノメタン、ＨＣｔ、ラウリル硫
酸ナトリウム、塩化ナトリウム含有）を加え、６０℃に
加温した後、ＴＥＳフェノール混液（ＴＥＳ緩衝液（ｐ
Ｉ（７，５）１容とフェノール４容との混合液）を加え
、氷水中で冷却後、遠心分離し上清を得た。この上清に
２倍容の冷エタノールを加え粗染色体ＤＮＡを回収し、
これをＳＳＣ緩衝液（ＰＨ７，１、塩化ナトリウム、ク
エン酸３ナトリウム含有）に溶解し、リボヌクレアーゼ
（シグマ社製造、商品名　ＲＮａｓｅ　Ａ）およびプロ
テアーゼ（科研袈薬株式会社製造、商品名ｐｒｏｎａｓ
ｅ　Ｅ　）を作用させ、次いで、ＴＢＳフェノール混液
を加え、冷却し遠心分離して、得られる一ヒ清に２倍容
の冷エタノールを加え精製染色体ＤＮＡｔ−回収し、緩
衝液（ｐＨ７，５、トリスアミノメタン、ＨＣｌ５ＥＤ
ＴＡ含有）に溶解して一２０℃に保存した。

（２）　　プラスミド　ｐＢＲ３２２の調製プラスミド
　ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）は、ゼイ　メイ
ヤーズ（Ｊ、　Ｍｅｙｅｒｓ　）等の方法〔ジャーナル
　オブ　バクテリオロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　１３
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）　、　Ｖｏｌ、　１２７．
１５２４〜１５３７（１９７６年）〕に準じてエッシェ
リヒア　コリから分離、調製した。

（３）　　ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作
製実験１−（１１で調製した耐熱性ポリペプチド遣。

伝子を含む精製染色体ＤＮＡに対して、制限酵素Ｍｂｏ
　ｌ　（株式会社ニッポンジーン製造）を作用させ、Ｄ
ＮＡ断片が１〜２０　Ｋｂｐになるよう染色体ＤＮＡを
部分的に切断した。一方、実験１−（２）で調製したプ
ラスミドｐＢＲ３２２に対して、制限酵素１３ａｍＨＩ
　（株式会社ニッポンジーン製造）を作用させ、完全に
切断し、次いで、プラスミド断片のセルフライゲーショ
ンを防止するため、エッシエリヒア　コリ由来のアルカ
リフォスファターゼ（宝酒造株式会社製造）を作用させ
、ｐＢＲ３２２断片の５′末端を脱リン酸化した。

両断片の結合は、Ｔ４ＤＮＡ　ＩＪガーゼ（株式会社ニ
ツポンジーン製造）を４℃で一夜反応させて行ない、組
換えＤＮＡを作製した。

（４）　　組換えＤＮＡのエッシエリヒア　コリへの導
入宿主微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているエ
ツシェリヒア　コリＨＢＩＯＩ　（ＡＴＣＣ３３６９４
）を用いた。

本微生物をＬ−ブロスで３７℃、４時間培養し集菌した
後、１０ｍＭ塩化す）　ＩＪウム、５０　ｍＭ塩化マン
ガンを含有する１０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５，６）に
懸濁し、遠心分離にて集菌し、続いて２５ｍＭ塩化カル
シウム、１２５ｍＭ塩化マンガンを含有する１０　ｍＭ
酢酸塩緩衝液（ｐＨ５，６）に懸濁したものに、実験１
−＋３１で得た組換えＤＮＡを加え、氷水中で３０分間
静置した。更に、３７℃に加温し、Ｌ−プロスを加え３
７℃で３０分間°保ち、これを抗生物質アンピシリン５
０μｔ／ｍｔを含有し、かつ澱粉２ｒｎｆｉ／ｒｎｔを
含有するＬ−アガー平板培地上に拡げ、３７℃で２４時
間保ち、コロニーを形成させた。

本平板から、ヨード呈色法により、澱粉を分解し、サイ
クロデキストリンを生成しているコロニーを選択し、ポ
リペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡが導入されている
形質転換微生物を選択した。本微生物を増殖させ、実験
１−１２１のプラスミドの調製方法に準じて組換えＤＮ
Ａを取り出し、これに各種制限酵素を作用させ、その切
断部位を決定した後、制限酵素Ｅ（！０ＲＩ（株式会社
ニッポンジーン製造）で組換えＤＮＡとプラスミドｐＢ
Ｒ３２２とに完全切断し、次いで、実験１−　（３１と
同様にＴ４ＤＮＡ　ＩＪガーゼを作用させ、組換えＤＮ
Ａを作製し、実験１−（４１の方法に準じてポリペプチ
ド遺伝子を含む小型の組換えＤＮＡ’！ｒ保有する形質
転換微生物を選択した。

更に、この小型の組換えＤＮＡとプラスミドｐＢＲ３２
２を制限酵素Ｓａｌ　Ｉ　（株式会社ニッポンジーン製
造）で完全切断し、以後、前記のＥＣ！ＯＲＩの場合と
同様に処理して、ポリペプチド遺伝子を含む更に小型の
組換えＤＮＡｔ−保有する形質転換微生物を選択した。

本微生物の一菌株をエッシェリヒア　コリＴＣＨ２０１
（ＦＥＲＭ　Ｐ−７９２４）と命名し、これが保有する
組換えＤＮＡをｐ　ＴＣ）Ｉ２０１と命名し魁 平且換えＤＮＡ　　ｐＴｃＨ２０１について、バチルス
　ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部分の制限酵素切
断地図を第１図に示す。

第１図から明らかなように、制限酵素ｐｖｕ　ｕ（東洋
紡績株式会社製造）、Ｋｐｎ　ｌ、　Ｈｉｎｄ　ｌ（株
式会社ニッポンジーン製造）、Ｘｂａ　Ｉ　（宝酒造株
式会社製造）で切断を受けることが判明した。

一方、制限酵素ＥｃｏＲＩ　、　ＢａｍＨ［、ｐｓｔｌ
。

Ｘｈｏｌ、Ｂｇｌ　ＩＩ、Ａｃｃ　ｌ　（以上、株式会
社ニッポンジーン製造）では切断されなかった。

実験２　バチルス　ステアロサーモフィラスポリペプチ
ド遺伝子のバチルス　ズブチ リスへのクローニング （１）　　組換えＤ　Ｎ　Ａ　　ｐＴｃＨ２０１の調製
組換えＤＮＡ　　ｐＴｃＨ２０１は、実験１−１２１の
方法に準じてエッシェリヒア　コリ　ＴＣＨ２０１（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−７９２４）から分離調製した。

（２）　　プラスミド　Ｉ）ＵＢＩＩＯの調製プラスミ
ド　ｐＵＢｌｌｏ　（ＡＴＣＣ３７０１５）は、グリツ
ガン（ｇｒｙｃｚａｎ　）　　らの方法〔ジャーナルオ
プ　パクテリオロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）　。

Ｖｏｌ、１３４．３１８〜３２９　（１９７８年）〕に
準じてバチルス　ズブチリスから分離、調製した。

（３）　　ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作
製実験２−（１１で調製した耐熱性ポリペプチド遺伝子
を含む組換えＤＮＡ　　ｐＴｃＨ２０１に対して、制限
酵素ＥｃｏＲｌおよびＸｂａ　Ｉを同時に作用させ完全
に切断した。

一方、実験２−　＋２１で調製したプラスミドｐＵＢ１
１０に対して、制限溝素ＥｅＯＲＩおよびＸｂａ　１を
同様に作用させ完全に切断した。

両断片の結合は、Ｔ４ＤＮＡ　！Ｊガーゼを用いて、実
験１−　（３１と同様に作用させ組換えＤＮＡを作製し
た。

（４）　　組換えＤＮＡのバチルス　ズブチリスへの４
人宿主微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているバ
チルス　ズブチリス　７１５Ａｔ−用いた。

本機生物’ｒプレイン　ハート　イン７ユージヨン培地
で２８℃、５時間培養し集菌した後、シ工−ファー（５
ｃｈａｅｆｆｅｒ　）等の方法〔プロシーディング　オ
プ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンンズ　
オブ　ザ　ユナイテッドスティツ　オプ　アメリカ（ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　
ｏｆ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ
　ｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉ
ｃａ　）、　Ｖｏｌ、７３．２１５１〜２１５５（１９
７６年）〕に準じてプロトプラスト懸濁液を調製した。

水液に、実験２−（３１で調製した組換えＤＮＡを加え
、関口等の方法〔アグリカルチュラルアンド　バイオロ
ジカル　ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａ
ｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）
。

Ｖｏｌ、４６．１６１７〜１６２１　（１９８２年）〕
に準じて形質転換を行った後、ＨＣＰ培地に抗生物質カ
ナマイシン２５０μｆ／ｍｌｆ含有し、かつ澱粉１０■
／−を含有するアガー平板培地上に拡げ、２８℃、７２
時間保ち、コロニーを形成させた。

以後、実験１−（４１の方法に準じて耐熱性ポリペプチ
ド遺伝子を含む組換えＤＮＡが導入されている形質転換
微生物を選択した。本微生物のの一菌株をバチルス　ズ
ブチリス　ＴＣＵ２１１（ＦＥＲＭ　Ｐ−７９２７）　
　と命名し、これが保有する組換えＤＮＡをｐＴＣＵ２
１１と命名した。

組換えＤＮＡ　　ｐＴｃＵ２１１について、バチルスス
テアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部分の制限酵素切断地
図を第２図に示す、第２図から明らかなように、制限酵
素ｐｖｕ　ｌ、［ｐｎ　Ｉ　、　）（ｉｎｄ　ｌで切断
を受けることが判明した。

一方、制限酵素ＥｅＯＲＩ　、　ＢａｍＨＩ、ｐｓｔ　
ｌ、Ｘｈｏ　Ｉ、Ｂｇｔ　ＩＩ、Ａｃｃ　ｌ、Ｘｂａ　
Ｉ　　では切断されなかった。

実験３　バチルス　ステアロサーモフィラス由来ポリペ
プチドのＮ末端を含有した部分アミノ酸配列 （１１ポリペプチドの調製 バチルス　ステアロサーモフィラス　ＦＥＲＭ−ＰＮｏ
、２２２５　ｋ、実験　５に示す方法と同様にして液体
培養し、培地中にポリペプチドを産生させた。遠心分離
にて上滑を採取し、硫安塩析によりポリペプチド画分を
得、次いで、陰イオン交換体カラムクロマトグラフィー
（東洋曹達株式会社装造、商品名　ＤＥＡＥ・トヨパー
ル　６５０使用）、クロマトフオーカッシング法（ファ
ルマシア社製造、商品名　Ｍｏｎｏ　ｐ使用）により精
製して、高度に精製されたポリペプチドを採取した。

水晶は、ケイ　ウェーバ−アンド　エムオズボー：／　
（Ｋ、　Ｗｅｂｅｒ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｑｓｂｏｒｎ　）
、ジャーｆル　オブ　バイオロジカル　ケミストリイ（
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　）　、　Ｖｏｌ、　２４４゜４４０６　
（１９６９年）の記載に準じて行ったＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法で７０，０００±１０．００
０の分子量を示した。

また、比活性は、２００±３０単位／η蛋白質を示した
。

本発明でいうＣＧＴａｓｅ活性１単位とは、ｐＨ５，５
，０，０２Ｍの酢酸緩衝液及び２　Ｘ　１０　”Ｈの塩
化カルシウムを含む０．３ｗ／ｗ％のソリュブルスター
チ溶液５−に適当に希釈した酵素液０．２−を加え４０
℃で１０分間反応した後、その反応液０．５−をとり、
０．０２　Ｎ−硫酸水溶液１５ｒｎｌに混合して反応を
停止させ、更にこの反応停止液に０．Ｉ　Ｎヨウ素ヨウ
化カリウム溶液０．２　ｒｎｌを加えて発色させ、次い
で６６０ｎｍにおける吸光度を’ｆｉｌｌ定して、４０
℃で１０分間反応させることによりソリニブルスターチ
１５胃のヨウ素の呈色を完全）で消失させる酵素量をい
う。

（２１Ｎ末端を含有する部分アミノ酸配列実験３−（＋
ｌの方法で調製したポリペプチドを、気相プロティン　
シークエンサー（アプライドバイオシステム社製造、商
品名　４７０Ａ型）にかけ、次いで、高速液体クロマト
グラフィーによυ分析して、Ｎ末端を含有する部分アミ
ノ酸配列を決定した。

結果は、Ａｌ　ａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（、ｅｕ−Ａｓｎ−
Ｌｙｓ−Ｖａ　１−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒの配列を有
していることが判明した。

実験４　バチルス　ステアロサーモフィラス由来ポリペ
プチド遺伝子の塩基配列およびポリペプチドのアミノ酸
配列 （１１プラスミド　ｐＵｃ１８の調製 プラスミド　ｐＵＣ１８は、これを導入したエッシエリ
ヒア　コリ　ＪＭ　８３　（ＡＴＣＣ３５６０７）から
、実験１−１２１の方法に準じて調製した。

（２）　　ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作
製実験１−＋３１の方法に準じて組換えＤＮＡを作製し
た。

即ち、実験２−（３）の方法で調製したポリペプチド遺
伝子を含む断片に、更にご各種制限酵素を作用させて切
断し、また、実験４−［１１の方法で調製したプラスミ
ド　ｐＵＣ１８を同様に各種制限酵素で切断し、これら
両断片にＴ４ＤＡＮ　ＩＪガーゼを作用させて組換えＤ
ＮＡを作製した。

（３）　　Ｈ１換より　Ｎ　Ａのエッシェリヒア　コリ
への導入宿主微生物として、エッシェリヒア　コリＪＭ
８３を用いた。

この微生物に、実験１−（４）の方法に準じて、組換え
ＤＮＡを移入し、形質転換させた。

次いで、５−７”コモ−４−１０ロー３−インドリル−
β−ガラクトシド（５、−ｂｒｏｍｏ　−４−ｃｈｌｏ
ｒｏ　−３−１ｎｄｏｌｙ−β−ｇａ１ａｃｔｏｓｉｄ
ｅ　ｏｒ　Ｘｇａｌ　）を含有する培地に生育させ、無
色のプラークを形成した微生物を形質転換微生物として
選択した。

（４）形質転換微生物からの組換えＤＮＡの調製形質転
換微生物を、抗生物質アンピシリン５０μ？／−を含む
し一グロスで培養し、得られる菌体からアルカリ溶菌法
により組換えＤＮＡを調製した。

（５）　　組換えＤＮＡの塩基配列 ジデオキシ　チェーンターミネータ法に従って解読した
。

すなわち、実験４−１４１で調製した組換えＤＮＡと合
成プライマー（１７塩基）を加え、６０℃で２０分間ア
ニーリングした後、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、〔α−３２
Ｐ）ｄＣＴＰおよびクレノー断片を加え。

３７℃で３０分間反応させ、ブライマーを５′側から３
′方向へ伸長させて相補ＤＮＡ金生酸生成た。

これに過剰のｄＮＴＰを加えて、さらに３７℃で３０分
間反応させた後、ホルムアミド色素溶液を加えて反応を
停止させた。次いで、３分間煮沸し、これを６多ポリア
クリルアミドゲルを用いて、約２５ｍＡで電気泳動し、
伸長した相補ＤＮＡを分離した。電気泳動した後、ゲル
を固定し乾燥させた。

本ゲルを用いて、オートラジオグラフィーを行ない、オ
ートラジオグラム上の塩基断片のシーフェンス解析を行
ってポリペプチド遺伝子の塩基配列？決定した。

その結果は、第１−１表に示した。

また、それの５′側の上流に続くシグナルペプチド遺伝
子の塩基配列も同様にして調べた。

その結果は、第１−２表に示した。

（６）　　ポリペプチドのアミノ酸配列第１−１表の塩
基配列を用いて、ポリペプチドのアミノ酸配列を決定し
、その結果を第２−１表に示した。

また、それのＮ末端側の上流に続くシグナルペプチドの
アミノ酸配列を決定し、その結果を第２−２表に示した
。

以上の結果から、バチルス　ステアロサーモフィラス由
来ポリペプチドのアミノ酸配列は、第２−１表の配列を
有していることが明らかになった。

■υ−０（＝−−スー弓−；ム：Ｉ：　−＋　Ｌ−１−
ｅｌ　　　２−弓一一い、弓−よ−〇。ニー哨φυ二蛸
囚　　＜−〉−リ＜〉〉す←く蛸＝＠　’−：　＜　：
）り←く＝ΦいＩ＋−≧−λＶ為−’＝　：　ｅ−一一
哨一−υＩ−＞：ｈＡ−２−−一弓弓−Ｉ／Ｉ弓Ｖごス
ーーー＜＝←ｌ−（！ｌ’）Ｃ；−リ〉）Ｃｏｏ　＜　
＞Σ〉−〉←Ｉ−１：＞ｅ　Ｌ、　−：ＯＬ　（１０＆
−１１１１：　ｅ　ＯＱ−１１’ｌ　ｉｌ’ｌ　Ｑ−■
−−−λ〜−−Ｊ：二−ニー噴い−ｉ為−いＶｒ　Ｉ：
：　Ｇ　＜　１−　）　（ニー←−−←乙（（（Ｌ　（
Ｊ　：　＜−；υ−Ｉ＋ｅ　＞　４１−１１１　Ｇ：　
（ｌ　Ｉ：ｊ　−ｓ　＞　＞　Ｉｌｌ　４）　（：　−
ｖ−；シニーーーｅ！５スーー哨田−−−−哨−クリエ
クト（ζ−〉−ロー＜＞ａりｍ−＜〉実験５　形質転換
微生物に：るポリペプチドの調製バチルス　ステアロサ
ーモフィラス由来〕耐熱性ポリペプチド遺伝子を含む祖
換えＤ　Ｎ　Ａを、　導入した形質転換微生物エンシェ
リヒア　コリＴＣＨ２０１（ＦＥＲＭ　　Ｐ−７９２４
）　　およびバチルスズブチリス　ＴＣＵ２１１　（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−７９２７）を用いてポリペプチドを調製し
た。

また、これら形質転換微生物と宿主微生物ならびに供与
体微生物バチルス　ステアロサーモフィラスの産生ずる
ポリペプチド産生量をその活性で比紋した。

液体培地は、コーンステイープリカー１．０ｗ／ｖチ、
硫酸アンモニウム　０．１ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム　
１．Ｑｗ／ｖ％、澱粉１　ｗ／　ｖ％および水からなり
、ｐＨ７，２に調製して１２０℃で２０分間滅菌し、冷
却して調製した。エッシエリヒア　コ’）ＴＣＨ２０１
の場合には、この培地に、抗生物質アンピシリンを−当
り５０μ２の割合で加えて植菌し、またエッシェリヒア
　コリ　ＨＢ　１０１の場合には抗生物質を加えずに植
菌し、それぞれ３７℃、４８時間通気攪拌培養した。

また、バチルス　ズブチリス　ＴＣＵ２１１の大金には
、前記液体培地に抗生物質カナマイシ：を−当り５μｍ
の割合で加えて植菌し、また、バチルス　ズブチリス　
７１５Ａの場合には抗イ物質を加えずに植菌し、それぞ
れ２８℃で７２時「培養した。

マタ、バチルス　ステアロサーモフィラスＦＥＲＭ−Ｐ
　Ａ２２２５の場合には、前記液体培力℃ に抗生物質を加えることなく、５０で槌時間培さ＾ した。各培養液を、遠心分離し、上清と菌体、に分離し
、上清はそのまま活性測定し、菌体は超音波処理にて破
壊した後活性測定し、培養液量に換算して活性を求めた
。結果は、第３表に示す。

第　　　３　　　表 第３表の結果から明らかなごとく、形質転換微生物から
のポリペプチド産生量は向上しており、工業的生産方法
として好都合である。

また、これら上清を硫安０．６飽和で塩析して粗ポリペ
プチド剤を調製、採取した。このポリペプチド剤を用い
て、澱粉からスクロースへの糖転移量、澱粉からのシフ
ロブキスｌ−ＩＪン生成量、シクロデキストリンα、β
、γの生成比率、至適温度、至適１）Ｈ１安安定度、安
定ｐＨなどの酵素的性質について比較したところ、形質
転換微生物のポリペプチドは、供与体微生物バチルス　
ステアロサーモフィラスのそれとよく一致した。

実験６　バチルス　マセランス　ポリペプチド遺伝子の
エッシェリヒア　コリへのクローニング （１＋　　バチルス　マセランスのポリペプチド遺伝子
を含む染色体ＤＮＡの調製 バチルス　マセランスのポリペプチド遺伝子を含む染色
体ＤＮＡは、バチルス　マセランス１７　Ａ　’ｅ　２
８℃で培養した以外は、実験１−（ｌｌの方法に準じて
調製した。

（２）　　ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作
製実験６−（１）で調製したバチルス　マセランス由来
のポリペプチド遺伝子を含む精製染色体ＤＮＡに対して
、制限酵素１ｉｎｄ　Ｉ　（株式会社日本ジーン製造）
を作用させ、実験１−（３）と同様に部分的に切断した
。

一方、実験Ｌ−４２１の方法で調製したプラスミド　ｐ
　Ｂ　Ｒ３２２に対して、制限酵素Ｂｉｎｄ　Ｎ　を作
用させ、完全に切断し、次いで、実験１−　＋３１で述
べた方法で５′末端の脱リン酸化を行ない、更に両断片
の結合を、実験１−（３１の方法に準じて行ない、組換
えＤＮＡを作製した。

（３）　　組換えＤＮＡのエソシェリヒア　コリへの導
入宿主微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているエ
ッシェリヒア　コリ　ＨＢ　１０１　（ＡＴＣＣ３３６
９４）を用いて、実験１−（４）の方法に準じて、組換
えＤＮＡが導入されている形質転換微生物を選択した。

この微生物から組換えＤＮＡを取り出し、これに各種制
限酵素を作用させ、その切断部位を決定した後、制限酵
素５ａｕ３ＡＩ（株式会社ニッポンジーン製造）で部分
切断し、一方、実験１−　（２＋の方法で得たプラスミ
ドｐＢＲ３２２を制限酵素Ｂａｍ）（Ｉで完全に切断し
た後、実験１−　＋３１と同様に５′末端の脱リン酸化
を行い、更に、Ｔ４ＤＮＡ　ＩＪガーゼを同様に作用さ
せ、組換えＤＮＡを作製し、実験１−（４１の方法に準
じてポリペプチド遺伝子を含む小型の組換えＤＮＡを保
有する形質転換微生物を選択した。

本微生物の一菌株をエッシエリヒア　コリＭＡＨ２（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−７９２５）と命名し、これが保有する組換
えＤＮＡをｐＭＡＨ２と命名した。

組換えＤＮＡ　　ｐＭＡＨ２について、バチルスマセラ
ンス由来のＤＮＡ部分の制限酵素切断地図を第３図に示
す。

第３図から明らかなように、制限酵素ｐｖｕ　ｎ、Ｓａ
ｌ　ｌ、　Ａｖａ　Ｉ　（株式会社日本ジーン製造）、
ｐｓｔ　＋　（株式会社日本ジーン製造）で切断を受け
ることが判明した。

一方、制限酵素ＥｃｏＲＩ　、　）（ｉｎｄ　ｌ、Ｋｐ
ｎ　［、ＥａｍＨｌ　、　Ｘｂａ　Ｉ、ＸｈＯ！、Ｓｍ
ａ　ｌでは切断されなかった。

実験７　バチルス　マセランス　ポリペプチド遺伝子の
バチルス　ズブチリスへのクローニング （１１組換えＤＮＡ　　ｐＭＡＨ２の調製組換えＤＮＡ
　　ｐＭＡＨ２は、実験１−（２１の方法に準じてエッ
シエリヒア　コリ　ＭＡＨ２（ＦＥＲＭＰ−７９２５）
から分離調製した。

（２）　　ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作
製実験７−＋１１で調製したポリペプチド遺伝子を含む
組換えＤＮＡ　　ｐＭＡＨ２に対して、制限酵素ＥＣＯ
ＲＩおよびＢａｍＨＩを同時に作用させ完全に切断した
。

一方、実験２−　（２１の方法で調製したプラスミド　
ｐＵＢＩＩＯに対して、制限酵素ＥＣＯＲ１およびＢａ
ｍＨｌ　ｆ同時に作用させ完全に切断した。

両・断片の結合は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて実験１
−ｆ３）と同様に作用させ組換えＤＮＡを作製した。

（３）組換えＤＮＡのバチルス　ズブチリスへの導入宿
主微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているバチル
ス　ズブチリス　７１５Ａを用いて、実験２−＋４１の
方法に準じて、バチルス　マセランス由来のポリペプチ
ド遺伝子を含む組換えＤＮＡが導入されている形質転換
微生物？選択した。

本微生物の一菌株をバチルス　ズブチリスＭＡＵ２１０
（ＦＥＲＭ　　Ｐ−７９２６）　　と命名し、これが保
有する組換えＤＮＡをＩ）ＭＡＵ２１０と命名した。組
換えＤＮＡ　　ｐＭＡＵ２１０について、バチルス　マ
セランス由来Ｄ　Ｎ’Ａ部分の制限酵素切断地図を第４
図に示す。第４図から明らかなように、制限酵素ｐｖｕ
　ｎ、Ｓａｌ　ｌ　、　Ａｖａ　ｌ、ｐｓｔ　［で切断
を受けることが判明した。

一方、制限酵素Ｅ（！ＯＲＩ、Ｈｉｎｄ　Ｉ、　Ｋｐｎ
　Ｉ、ＢａｍＨＩ、Ｘｂａ　１　、　Ｘｈｏ　Ｉ　、　
Ｓｍａ　Ｉでは切断されなかった。

実験８　バチルス　マセランス由来ポリペプチドのＮ末
端を含有する部分アミノ酸配列 （り　　ポリペプチドの調製 バチルス　ズブチリス　ＭＡＵ２１０　（ＦＥ、ＲＭＰ
−７９２６）を、実験１０に示す方法と同様に液体培養
して培地中にポリペプチドを産生させた。

次いで、実験４−　ｆｉｌの方法に準じて精製し、きわ
めて高純度のポリペプチドを採取した。

水晶は、ＳＤＳ−ポリアクリル電気泳動法で７０．００
０±１０，０００の分子量を示し、比活性２００士３０
単位ｉｒｑ蛋白質を示した。

（２）Ｎ末端を含有する部分アミノ酸配列実験８−１１
１の方法で調製したポリペプチドを用いて、実験３−（
２１と同様にしてＮ末端を含有する部分アミノ酸配列を
決定した。

その結果は、５ｅｒ−ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−８ｅｒ
−Ｖａ　１−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕの配列を
有していることが判明した。

実験９　バチルス　マセランス由来ポリペプチド遺伝子
の塩基配列およびポリペプチドのアミノ酸配列 （１１ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製実
験４−　＋３１の方法に準じて組換えＤＮＡｅ作成した
。

すなわち、実験７−　（２）の方法で調製したポリペプ
チド遺伝子を含む断片に、更に各種制限酵素を作用させ
て切断し、また、実験４−Ｊ２１の方法で調製したｐＵ
ｃ１８を同様に制限酵素で切断し、これら両断片にＴ４
ＤＮＡリガーゼを作用させて組換えＤＮＡを作製した。

（２）　　組換えＤＮＡのエツシエリヒア　コリへの導
入宿主微生物として、エツシエリヒア　コリＪＭ８３’
ｉ用いて、実験４−＋３＋の方法に準じて組換えＤＮＡ
を移入し、形質転換微生物を選択した。

（３）形質転換微生物からの組換ＤＮＡの調製実験４−
（４１の方法に準じて、組換えＤＮＡを調製した。

（４）組換えＤＮＡの塩基配列 実験４−　（５）の方法に準じて、ポリペプチド遺伝子
の塩基配列を決定した。

その結果は、第４−１表に示した。

また、それの（５′側に続くシグナルペプチド遺伝子の
配列も、同様にして調べた。

その結果は、第４−２表に示した。

（５）　　ポリペプチドのアミノ酸配列第４−１表の塩
基配列を用いて、ポリペプチドのアミノ酸配列を決定し
、その結果を第５−１表に示し之。

また、それのＮ末端側に続くシグナルペプチドのアミノ
酸配列を決定し、その結果を第５−２表に示した。

以上の結果から、バチルス　マセランス由来のポリペプ
チドのアミノ酸配列は、第５−１表の配列を有している
ことが明らかになった。

なお、第２−１表と第５−１表の結果から、いずれのポ
リペプチドにも共通な部分アミノ酸配列として、 （ａ）　　Ａｓｎ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−’ｌ’ｈｒ　。

（ｂ）　　Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ。

（ｃ）　　Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ａｓｐ−
Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−ｐ
ｈｅ　。

（ｄ）　　Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ（ｖＩｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａ
ｒｇ　、および（ｅ）　　Ａｓｎ−ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−、Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙの配列を有しているこ
とが判明し、しかも、これら部分アミノ酸配列は、Ｎ末
端側から近い順に（ａ）、（ｂ）、（Ｃ）、（ｄ）、（
ｅ）の部分配列を有していることが判明した。

ヒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　−ｈ−←　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　−υＬ・　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　；← （。、− し・　　　　　　　　　　　　−υ− し−　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　り〉１ｔ＋Ｌ＋＝いユム屯−ニニー≧Ｓ−−
メい一二田−−−ｗ　（：　Ｌ　＝い一；あ；簿劾を数
註Ｇ詳じ藝；＝シＨＥ”　；”Ｓコニ主計テサ弁七託ｊ
計シ詫社起上北 ←くりく一←＜クーユ」σ−りく口しくユＣり＜　！　
−（＠：七３睡テ正；ｊ＝計］七＝☆計Σ土二譚Ｉ／Ｉ
Ｕ　：←＜＜＜ｒｂ＞＜−＜＜＜＞←〉ζくクク＝←く
二く：１含忙主上Ｅ盆；主主：皿上ごごＥよ３皿ご示Ｐ
ＱＡ主ユくく−←＋Ｌ＜＞←←＝」−ζロＬＬ−Ｊ−響
くＬＬ＜Ｈ−Ｉ：　−！−＞　ａ）　−ｍ　Ｑ、　Ｌ　
ｎ　＆＋＞　ｕｊ　Ｌ−ｂ　；（：：　ｊ　：　Ｌ　Ｌ
　Ｑ、　Ｃｈ　−＞　ｖ＋−ｇあＧ−：：、、：二次ぎ
三５酎ぴ；査３；＝；二；Ｇ二：基巳＝ご二女起七七上
井箕！二ｔ＝上主二テ≠」Ｌりσす〈←エーク（Ｌ−（
（二くζ＝くクートリくくミとｙｔ；ｌご七＝二＝記ご
＝乞；を簀旦七旦１吐−く一←＝１＋リク＜（＜、Ｊｌ
ｊ（ＪΣりく：−り一りくＣ←ａ３＋：らづη４−為い
０唖桟＝り鴨Ｏ≧−〇−〜−−ム′　　　数ｃ：＝Ｅ：
”＝Ｇ三？ぞ；二三社’；Ｇ＞：：二Ｖｒ　ｊ”　；わ
　　ロ；；ごご記＝ニニ二上＝ｌｌ＝５；上記＝Ｉ；二
七二＞＞ａａ−ａ＜＜＝←く←←く口＞　−−Ｕ　（Ｖ
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本虹本茹ジ却≠罪実験１０　形質転換微生物によるポリ
ペプチドの調製バｆ　／ｌ／ス　マセランス由来ポリペ
プチド遺伝子を含む組換えＤＮＡを導入した形質転換微
生物エッシェリヒア　コリ　ＭＡＨ２（ＦＥＲＭＰ−７
９２５）およびバチルス　ズブチリス　ＭＡＵ２１０　
（ＦＥＲＭ　Ｐ−７９２６）　　用いてポリペプチドを
調製した。また、これら形質転換微生物と宿主微生物な
らびに供与体微生物バチルス　マセランスの産生ずるポ
リペプチド産生量をその活性で比較した。液体培地は実
験５の方法で調製した。

エッシエリヒア　コリ　ＭＡＨ２の場合には、この培地
に抗生物質アンピシリンを−当り５０μ２の割合で加え
て植菌し、また、エッシエリヒアコ’）　　ＨＢＩＯＩ
　の場合には抗生物質を加えずに植菌し、それぞれ３５
℃で２４時間通気攪拌培養した。

また、バチルス　ズブチリス　ＭＡＵ２１０の場合には
、前記液体培地に抗生物質カナマイシンｆ　ｍｅ当り５
μ７の割合で加えて植菌し、またバチルス　ズブチリス
　７１５Ａの場合には抗生物質を加えずに植菌し、それ
ぞれ２８℃、７２時間培養した。

また、バチルス　マセランス　１７Ａの場合には、前記
液体培地に抗生物質を加えることなく、２８℃で７２時
間培養した。

各培養液は、実験５の場合と同様に処理して活性を測定
した。結果は第６表に示す。

第　　　６　　　表 第６表の結果から明らかなごとく、形質転換微生物から
のポリペプチド産生量は向上しておシ、工業的生産方法
として好適である。

また、これら上清を硫安０．６飽和で塩析して粗ポリペ
プチド剤を調製採取した。

このポリペプチド剤を用いて、実験５の場合と同様に各
種の酵素的性質について比較したところ、形質転換微生
物のポリペプチドは、供与体微生物バチルス　マセラン
スのそれとよく一致した。

以下、２〜３の実施例について述べる。

実施例１　ういろう 白玉粉４６０ｆに、実験８−　（１７の方法でバチルス
　マセランスから調製したポリペプチドを４．０００単
位含有せしめた水２２０　ｒｎｌ全力「えてよくこねた
後、砂糖９３０１を加え、さらに上新粉２８０ｔｆ混ぜ
てよくこねた。これを濡れたふきんに入れ、常法に従っ
て３０分間蒸し上げた後、冷却し、切断成形してういろ
うを製造した。

本品は、半透明で老化を起しにくく、口当り、風味は良
好で、長期間高品質を維持した。

実施例２食パン 小麦粉６５０２に、実験３−（１１の方法に準じてバチ
ルス　ステアロサーモフィラスかう調製したポリペプチ
ド３　、０００単位を加え、次いで、砂糖２０２、食塩
１１　ｒを少量の水に溶解して加え、よくかき１ぜ、さ
らに圧搾酵母１３２、ショートニングオイル１３グ、イ
ーストフード２７を加えると共に、適量の水を追加して
よく練り、ドウを作成し、以後は常法に従って２６℃で
２時間発酵させ、熟成時間１５分、ベンチタイム１５分
、次いでオープン温度約２００℃で約４０分間蒸いて、
食パンを製造した。

本品は、風味良好で、適度の弾性を有し、経日変化も少
なかった。

実施例３　甘　　酒 米飯ＩＫｇに、実験５の方法で調製したポリペプチドｋ
　２，０００単位加え、７０℃で３時間反応させた後、
５５℃に下げ、市販の麹３００１を加えて２４時間反応
させて甘酒を製造した。

本品は、風味、日当シとも良好であった。

実施例４　蒸しようかん 小麦粉６００１に、かたくり粉２５０７、食塩２０２、
さらしあん４００２、砂糖Ｉ　Ｋｙ、マルトース１．４
Ｋｓ＋および実験３−（１）の方法で製造したポリペプ
チド１　、０００単位を含有する水２．４ｔとよく練合
せた後、これを成形し、常法に従って約４０分間蒸し上
げた。

本品は、老化を起しにくく、口当り、風味が良好で、長
期間高品質を維持した。

実施例５　味　　噌 常法に従って、米麹３．５匂、蒸煮した大豆５〜および
食塩０．７に９を用いて容器に仕込む際、実験８−　（
１１の方法で調製したバチルス　マセランスから調製し
たポリペプチド５，０００単位を均一に配合して仕込み
、約４０℃で１０日間熟成して味噌を製造した。

本品は、風味良好で、適度の光沢を有している。

実２％　９１Ｊ　６　　ンクロデキストリン含有水飴１
０Ｗ／Ｗ％馬鈴薯澱粉乳に、実験５の方法でバチルス　
ズブチリスＴＣＵ２１１から調製したポリペプチドを澱
粉ダラム当り２単位になるように加え、ｐＨ６，５、温
度８５℃で液化し、７０℃に冷却してポリペプチドを同
量追加し、４００時間反応せ、常法に従って、活性炭で
脱色、イオン交換樹脂で脱塩して精製し、濃縮してシク
ロデキストリンを含有する水飴を固形物当シ収率９２係
で得た。本水飴は保香性の良好な水飴で、風味良好な飲
食物の原材料に、また香気を大切にする香料、化粧品な
どの配合材として有利に利用できる。

また、この水飴を、トルエン、トリクロロエタンなど有
機沈澱剤を使用する方法、カラムクロマトグラフィーな
どの公知の方法によって、α−シクロデキストリン、β
−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンを分離
採取することも有利に実施できる。

実２Ｍ　例７　　α−グリコジル　シュクロースコーン
スターチ全濃度３５ｗ／ｗ％に調製し、蓚酸を澱粉当り
０．２ＷＺＷ係添加して１２０℃にオートクレーブし、
ＤＥ２０に止め、炭酸カルシウムで中和し、濾過してデ
キストリン液を得た。

水液固形物に対して１／２濃度のシュクロースを加え、
これに実験１０の方法でバチルス　ズブチリス　ＭＡＵ
２１０から調製したポリペプチドを澱粉ダラム当９１５
単位になるよう加え、ｐＨ６，０、温度５５℃で４００
時間反応せた。反応終了後、常法に従って活性炭で脱色
、イオン交換樹脂で脱塩して精製し、濃縮して無色、透
明な水飴を固形物当シ収率９４チで得た。本水飴は多量
のα−グルコシル　シュクロースを含有し、まろやかな
甘味を有し、非晶質であるので、製菓材料などして有利
に利用できる。

実施例８　α−グリコジル　ステビオサイドステビオシ
ド２００７とデキストリン（ＤＥ８）６００２と全水３
ｔに加熱溶解した後、７０℃に冷却し、これに実験５の
方法でバチルス　ズブチリスＴＣＵ２１１から調製した
ポリペプチドをデキスト１．ｊングラム当り５単位にな
るよう加えｐＨ６，０、温度６５℃で３５時間反応させ
た。反応終了後、９５℃に１５分間加熱し、濾過精製、
濃縮し、乾燥、粉末化して、α−グリコジル　ステビオ
サイド全含有する粉末甘味料を固形物当り収率９２係で
得た。

本甘味料は、ステビオサイドの嫌味を解消した砂糖に近
い甘味質を有し、その甘味度は砂糖の約１００倍であっ
た。

本甘味料は、虫歯の心配もなく、はとんどカロリーもな
いのでダイエツト甘味料として、また他の甘味料などと
併用して各種飲食物の調味て自由に利用できる。

実施例９　α−グリコジルジンセッサイド薬用人参エキ
ス６０７とβ−シクロデキストリン１８０りとを水５０
０−に加熱溶解し、７０℃に冷却してｐＨ６，０に調整
し、これに実験１０の方法でバチルス　ズブチリス　Ｍ
ＡＵ２１０から調製したポリペプチドをβ−ジクロデキ
ストリンダラム当り３単位になるように加え、温度全６
５℃に冷却し、ｐＨ６，０で４００時間反応せた。反応
終了後、９５℃に１５分間加熱、失活させて濾過した後
、Ｐ液を、合成吸着剤（Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ社製、
アンバーライト　ＸＡＤ−７）３ｔｆ充填したカラムに
通液し、このカラム全充分水洗して遊離の糖類を除去し
た。次いで、このカラムに５Ｑｖ／ｖチエタノール１０
７を流し、この流出液を濃縮、乾燥して約２１２のα−
グリコジルジンセッサイド含有粉末を得た。本粉末は、
ジンセッサイドの苦味、渋味、えぐ味などの嫌味が解消
されているので、そのまま経口摂取してもよく、必要な
らば、甘味料、酸味料などで味付けして利用してもよい
。

本α−グリコジルジンセッサイドを含有する粉末は、ジ
ンセッサイドと同様に強壮、−強精、健胃、整腸、補血
、消炎、去痰などの効を有するので、健康食品、内服薬
などとして有利に利用できる。

（発明の効果） 上記したことから明らかなように、本発明は、ポリペプ
チドのアミノ酸配列を解明し、その解明されたポリペプ
チドを用いる糖転移反応であり、また、飲食物を製造す
る方法である。

本発明は、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
用いることにより、安心して糖転移反応とが判明し、そ
の工業的意義はきわめて大きい。

更に、飲食物の製造に際して、澱粉質に含有せしめたポ
リペプチドが、飲食物の風味を損うことなく、しかも安
心してそのまま食用に供しつることも大きな特徴である
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組換えＤＮＡ　　ｐＴｃＨ２０１について、
バチルス　ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部分の制
限酵素切断地図全示す。 第２図は、組換えＤＮＡ　、ｐＴＣＵ２１１について、
バチルス　ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部分の制
限酵素切断地図を示す。 第３図は、組換えＤ　Ｎ　Ａ　　ｐ　Ｍ　Ａ　Ｈ２につ
いて、バチルス　マセランス由来ＤＮＡ部分の制限酵素
切断地図を示す。 第４図は、組換えＤＮＡ　　ｐＭＡＵ２１０について、
バチルス　マセランス由来ＤＮ、Ａ部分の制限酵素切断
地図を示す。

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. （１）部分アミノ酸配列として、 （ａ）【遺伝子配列があります】、 （ｂ）【遺伝子配列があります】、 （ｃ）【遺伝子配列があります】、 （ｄ）【遺伝子配列があります】、および （ｅ）【遺伝子配列があります】 から選ばれる１種以上の配列を有し、且つシク ロマルトデキストリングルカノトランスフェ ラーゼ活性を有するポリペプチドを澱粉質に作 用させることを特徴とする糖転移反応方法。
2. （２）ポリペプチドが、部分アミノ酸配列として、Ｎ末
   端側から近い順に、 （ａ）【遺伝子配列があります】、 （ｂ）【遺伝子配列があります】、 （ｃ）【遺伝子配列があります】、 （ｄ）【遺伝子配列があります】、および （ｅ）【遺伝子配列があります】 の配列を有していることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の糖転移反応方法。
3. （３）ポリペプチドが、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動法で７０，０００±１０，０００の分子量を
   示すことを特徴とする特許請求の範囲第１項または第２
   項記載の糖転移反応方法。
4. （４）ポリペプチドが、そのＮ末端を含有する部分アミ
   ノ酸配列として、【遺伝子配列があります】の配列を有
   していることを特徴とする特許請求の範囲第１項、第２
   項または第３項記載の糖転移反応方法。
5. （５）ポリペプチドが、アミノ酸配列として、 【遺伝子配列があります】 を有していることを特徴とする特許請求の範囲第１項、
   第２項、第３項または第４項記載の糖転移反応方法。
6. （６）ポリペプチドが、そのＮ末端を含有する部分アミ
   ノ酸配列として、【遺伝子配列があります】の配列を有
   していることを特徴とする特許請求の範囲第１項、第２
   項または第３項記載の糖転移反応方法。
7. （７）ポリペプチドが、アミノ酸配列として、 【遺伝子配列があります】 を有していることを特徴とする特許請求の範囲第１項、
   第２項、第３項または第６項記載の糖転移反応方法。
8. （８）ポリペプチドが、シクロマルトデキストリングル
   カノトランスフェラーゼ産生能を有する微生物由来のポ
   リペプチドであることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項または第
   ７項記載の糖転移反応方法。
9. （９）ポリペプチドが、バチルスステアロサーモフィラ
   ス由来のポリペプチドであることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項、第２項、第３項、第４項または第５項記
   載の糖転移反応方法。
10. （１０）ポリペプチドが、バチルスマセランス由来のポ
    リペプチドであることを特徴とする特許請求の範囲第１
    項、第２項、第３項、第６項または第７項記載の糖転移
    反応方法。
11. （１１）澱粉質が、澱粉、アミロース、シクロデキスト
    リン、デキストリンから選ばれることを特徴とする特許
    請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、
    第６項、第７項、第８項、第９項または第１０項記載の
    糖転移反応方法。
12. （１２）糖転移反応が、分子内転移反応または分子間転
    移反応であることを特徴とする特許請求の範囲第１項、
    第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第７項、第
    ８項、第９項、第１０項または第１１項記載の糖転移反
    応方法。
13. （１３）飲食物の製造に際し、部分アミノ酸配列として
    、 （ａ）【遺伝子配列があります】、 （ｂ）【遺伝子配列があります】、 （ｃ）【遺伝子配列があります】、 （ｄ）【遺伝子配列があります】、および （ｅ）【遺伝子配列があります】 から選ばれる１種以上の配列を有し、且つシクロマルト
    デキストリングルカノトランスフェラーゼ活性を有する
    ポリペプチドを澱粉質に作用させ、生成する糖転移反応
    物を含有せしめることを特徴とする飲食物の製造方法。
14. （１４）ポリペプチドが、部分アミノ酸配列として、Ｎ
    末端側から近い順に、 （ａ）【遺伝子配列があります】、 （ｂ）【遺伝子配列があります】、 （ｃ）【遺伝子配列があります】、 （ｄ）【遺伝子配列があります】、および （ｅ）【遺伝子配列があります】 の配列を有していることを特徴とする特許請求の範囲第
    １３項記載の飲食物の製造方法。
15. （１５）ポリペプチドが、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
    ゲル電気泳動法で７０，０００±１０，０００の分子量
    を示すことを特徴とする特許請求の範囲第１３項または
    第１４項記載の飲食物の製造方法。
16. （１６）ポリペプチドが、そのＮ末端を含有する部分ア
    ミノ酸配列として、【遺伝子配列があります】の配列を
    有していることを特徴とする特許請求の範囲第１３項、
    第１４項または第１５項記載の飲食物の製造方法。
17. （１７）ポリペプチドが、アミノ酸配列として、 【遺伝子配列があります】 を有していることを特徴とする特許請求の範囲第１３項
    、第１４項、第１５項または第１６項記載の飲食物の製
    造方法。
18. （１８）ポリペプチドが、そのＮ末端を含有する部分ア
    ミノ酸配列として、【遺伝子配列があります】の配列を
    有していることを特徴とする特許請求の範囲第１３項、
    第１４項または第１５項記載の飲食物の製造方法。
19. （１９）ポリペプチドが、アミノ酸配列として、 【遺伝子配列があります】 を有していることを特徴とする特許請求の範囲第１３項
    、第１４項、第１５項または第１８項記載の飲食物の製
    造方法。
20. （２０）ポリペプチドが、バチルス属に属する微生物由
    来のポリペプチドであることを特徴とする特許請求の範
    囲第１３項、第１４項、第１５項、第１６項、第１７項
    、第１８項または第１９項記載の飲食物の製造方法。
21. （２１）糖転移反応物が、分子内転移反応物または分子
    間転移反応物であることを特徴とする特許請求の範囲第
    １３項、第１４項、第１５項、第１６項、第１７項、第
    １８項、第１９項または第２０項記載の飲食物の製造方
    法。
22. （２２）分子内転移反応物がシクロデキストリンである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第２１項記載の飲食物
    の製造方法。
23. （２３）分子間転移反応物が、澱粉質と澱粉質以外の糖
    受容体とから生成したものであることを特徴とする特許
    請求の範囲第２１項記載の飲食物の製造方法。
24. （２４）分子間反応物がα−グリコシル　シュクロース
    、α−グリコシルステビオサイド、α−グリコシルグリ
    チルリチンであることを特徴とする特許請求の範囲第２
    １項または第２３項記載の飲食物の製造方法。
25. （２５）飲食物が、澱粉質含有飲食物、醗酵飲食物また
    は甘味料であることを特徴とする特許請求の範囲第１３
    項、第１４項、第１５項、第１６項、第１７項、第１８
    項、第１９項、第２０項、第２１項、第２２項、第２３
    項または第２４項記載の飲食物の製造方法。