KR102004945B1 - 아밀로수크라제의 발현 시스템 및 이를 이용한 투라노스의 생산 - Google Patents

Abstract

본 발명은 설탕을 포함하는 기질로부터 투라노스를 생산할 수 있는 아밀로수크라제 효소 단백질에 관한 것이다.

Description

아밀로수크라제의 발현 시스템 및 이를 이용한 투라노스의 생산 {Expression system for producing amylosucrase and method of producing turanose using the same}

본 발명은 투라노스 생산 효소 및 이를 이용하여 투라노스를 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

투라노스는 자연적으로 벌에서 생기는 환원성 이당류로서 설탕 단맛의 약 50%에 해당하는 단맛을 나타내는 설탕의 유사체이며 3-O-α-D-글루코피라노실-D-프락토즈의 화학적 구조를 지닌다. 투라노스는 치아 우식 유발 미생물에 의해 발효되지 않기 때문에 충치 예방에 도움이 되며, 칼로리 없는 감미료로서 사용될 수 있으며, 따라서 음식, 화장품 및 약학 산업계에서 중요한 역할을 수행할 수 있다.

한국특허 제10-11772184호는 아밀로수크라제를 이용하여 설탕과 프럭토스를 기질로 투라노스를 제조하는 방법을 포함한다. 그러나, 기존 효소들은 고열에서 활성을 나타내지 못하거나 유지하지 못하여, 공정에 적합한 최적 온도인 50℃에서 투라노스 전환반응 시 수크로스가 모두 소모되기 전에 활성을 잃는다. 결과적으로 아밀로수크라제에 의한 투라노스 전환 반응 시 최종 전환액에 설탕이 남게 되어 추후 투라노스 고순도 분리를 하는 데 결정적 방해 요인이 된다. 또한 기존의 효소에 의한 투라노스 제조는 반응 속도가 매우 느려서 상업화에 적합하지 않다. 따라서 50℃이상의 온도에서 투라노스 전환반응 시에 수크로스를 모두 소모하며, 반응 속도가 개선된 아밀로수크라제를 개발하는 것이 매우 중요하다.

투라노스 생산 활성을 갖는 아밀로수크라제는 미생물 Neisseria polysaccharea, Deinococcus geothermalis 및 Alteromonas macleodii 등에서 유래된 것이 알려져 있다.

본 발명은 비피도박테리움 터모필럼 유래의 아밀로수크라제 효소 단백질 또는 이의 변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아밀로수크라제 효소 단백질을 이용하여 투라노스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 종래 알려진 투라노스 생성 특성을 갖는 균주가 아닌, 비피도박테리움 터모필럼에서 유래되며, 투라노스 생성 특성을 갖는 아밀로수크라제 효소 및 이의 변이 효소를 이용하여 높은 수율로 투라노스를 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 투라노스 생성 특성을 갖는 아밀로수크라제 효소 및 이의 변이 효소 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 효소는 비피도박테리움 터모필럼(Bifidobacterium thermophilum) 유래의 효소 단백질일 수 있다.

본 발명의 효소 단백질은 투라노스를 생산하는 아밀로수크라제(amylosucrase)로서, 수크로스 단독 또는 수크로스 및 프럭토스를 포함하는 기질 용액으로부터 투라노스를 생성할 수 있다. 사용된 수크로스 및/또는 프럭토스의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 기질로서 0.25M 또는 0.75M 프럭토스로 보강된 1.0M 또는 2.5M 수크로스 용액 상에서 작용될 때에도 상기 효소는 반응하여 투라노스를 생산할 수 있다.

상기 효소 단백질을 수크로스 단독 또는 수크로스 및 프럭토스를 포함하는 기질과 반응하여 생성된 투라노스를 함유하는 당 시럽 조성물, 예를 들어, 투라노스, 수크로스, 프럭토스, 트레할룰로스, 포도당 및 올리고당, 희소당(알룰로스, 알로스 등)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 당류를 포함하는 당 시럽 조성물을 제조할 수 있다. 상기 비피도박테리움 터모필럼 유래된 효소 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있으나, 투라노스를 생성할 수 있는 활성이 있는 한 이에 한정되지 않고 상기 서열번호 4의 아미노산 서열 중 1 이상의 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실된 변이 단백질을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 서열번호 4의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 93% 이상 또는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상 상동성 있는 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질일 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 효소 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 서열번호 4를 갖는 아미노산 서열의 542번째 아미노산이, 전하를 갖는 아미노산으로 치환된 서열을 갖는 효소 단백질일 수 있으며, 예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 아미노산, 바람직하게는 리신 또는 아스파르트산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질일 수 있다. 예를 들어 본 발명의 효소 단백질은 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 효소 단백질일 수 있다.

또한 본 발명의 효소 단백질은 아래 특성으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다.

(1) 단량체의 분자량이 65 내지 75 kDa,

(2) 최적 온도가 30 내지 65℃,

(3) 최적 pH가 6.0 내지 9.0,

(4) 설탕 함유 기질로부터 투라노스 생성,

(5) 50℃의 온도 및 pH 7.0에서 투라노스 전환 활성이 1.0 내지 2.4 U, 및

(6) 2M 수크로스 및 0.75M 프럭토스 함유 기질에 1시간 내지 48시간 동안 반응하여 생성되는 투라노스의 양이 20 내지 70중량%.

상기 단량체 분자량은 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 법(SDS-PAGE)으로 측정된 효소 단량체의 분자량으로, 65 내지 75kDa 바람직하게는 66 내지 80kDa, 더욱 바람직하게는 68kDa인 것일 수 있다.

상기 최적 온도는 효소의 투라노스 생산 활성이 최대가 되는 온도로서, 30 내지 65℃, 바람직하게는 40 내지 65℃, 41 내지 65℃, 42 내지 65℃, 또는 41 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 45 내지 55℃, 더욱 바람직하게는 50℃일 수 있다. 종래 알려진 아밀로수크라제는 최적 활성 온도가 35℃내외이고, 40℃ 이상, 예를 들면 45 ℃ 또는 50℃ 의 온도에서 전환반응을 실행 할 경우 낮은 활성과 내열성의 부재로 인하여 전환액에 수크로스가 남지 않고 투라노스를 포함한 생성물만 남을 때 까지 효소의 활성이 유지가 되지 않았기 때문에 산업화에 어려움이 있었다. 그러나 본 발명의 효소 단백질은 40℃ 이상 또는 40℃ 초과하는 온도, 예를 들면 41℃, 42℃, 43℃, 45 ℃ 또는 50℃ 의 온도에서 수크로스가 모두 분해가 될 때까지 반응이 유지가 되기 때문에 산업화에 바람직하다.

상기 최적 pH는 효소의 투라노스 생산 활성이 최대가 되는 pH로서, pH 6.0 내지 9.0, 바람직하게는 pH 6.5 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 pH 7.0일 수 있다.

본 발명의 효소 단백질의 투라노스 전환 활성(Unit:U)은 2M 수크로스와 0.75M의 프럭토스에 효소를 첨가 했을 때 1mg의 효소에 의해 1분 동안 생성되는 투라노스 양(μmole)을 의미한다.

본 발명의 효소 단백질은, 50℃의 온도 및 pH 7.0에서 본 발명의 효소 단백질의 투라노스 전환 활성은 1.0 내지 10.0 U, 바람직하게는 3.0 내지 10.0 U, 더욱 바람직하게는 3.0 내지 9.0 U일 수 있다. 예를 들어 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질은 3.0 U, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질은 8.9 U, 상기 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질은 9.9 U의 투라노스 전환 활성을 가질 수 있다. 이는, 서열번호 4의 542번째 아미노산이 효소 단백질의 활성에 영향을 미치는 위치로서, 해당 비극성아미노산을 전하를 갖는 극성 아미노산으로 치환함으로부터 기인한 것이다.

종래 알려진 아밀로수크라제는 최적 활성 온도가 35℃내외이고, 50℃에서 전환반응을 실행 할 경우 낮은 활성과 내열성의 부재로 인하여 전환액에 수크로스가 남지 않고 투라노스를 포함한 생성물만 남을 때 까지 효소의 활성이 유지가 되지 않았기 때문에 산업화에 어려움이 있었다. 그러나 본 발명의 효소 단백질은 50℃에서 2M 수크로스, 0.75M 프럭토스와 반응했을 때, 수크로스가 모두 분해가 될 때까지 반응이 유지가 되기 때문에 야생형(서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질) 자체만으로도 산업화의 최소한의 조건을 만족한다고 할 수 있다. 또한, 상기 542번의 비극성 아미노산을 전하를 띠는 아미노산으로 변형시킨 결과(서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질), 활성이 2배 이상 증가하였기 때문에 원가절감과 직결되는 생산성 문제를 개선하는 효과를 기대할 수 있다.

또한 본 발명의 효소 단백질은 GRAS(Generally Recognized as Safe) 균주에서 발현하여 활성을 나타내며, 예를 들어 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 야생형 효소 단백질뿐 아니라, 변이된 효소 단백질, 예를 들어 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 변이 효소 단백질로의 변형에 따른 활성 증가 효과가 GRAS 균주에서도 재현된다. 따라서 본 발명은 투라노스를 GRAS 균주에서 발현하여 안전한 식품원료로 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 효소 개량을 통해 높은 반응 안정성과 활성을 가지고 있는 효소를 확보함으로써 산업에 적용하기에 적합하다.

본 명세서에서 효소 단백질에 의해 설탕을 포함하는 기질로부터 생성되는 당 시럽 조성물 내 투라노스 함량은 50℃의 온도 및 pH 7.0에서 2M 수크로스 및 0.75M 프럭토스의 기질과 1 내지 48시간, 바람직하게는 3 내지 48시간, 더욱 바람직하게는 12 내지 48시간 반응하여 수크로스가 반응액에 남아있지 않게 되는 시점의 생성물에 포함된 투라노스 양, 즉 상기 기질로부터 상대적으로 전환된 투라노스의 중량%로 정의되며, 예를 들어 본 발명의 효소 단백질의 투라노스 전환율은 20 내지 70 중량%, 바람직하게는 30 내지 55 중량%, 더욱 바람직하게는 35 내지 50 중량%, 더욱 바람직하게는 40 내지 50 중량%일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질의 투라노스 전환율은 35 내지 45 중량%, 바람직하게는 40 내지 43 중량%일 수 있으며, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질의 투라노스 전환율은 40 내지 50 중량%, 바람직하게는 43 내지 49 중량%일 수 있다.

본 발명의 또 다른 예는, 상기 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 미생물을 제공한다.

상기 효소 단백질에 관한 사항은 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터 또는 이를 발현하는 재조합 미생물에 동일하게 적용될 수 있다.

예를 들어 본 발명의 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 4 내지 서열번호 6의 아미노산 서열 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 바람직하게는, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지며, 상기 서열번호 6의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 상기한 염기 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 서열도 포함하는 것이다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 그 서열을 분석한 경우, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기 서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상 상동성이 있는 염기 서열을 포함한다.

당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등에 의해 본 발명에 따른 유전자의 하나 또는 그 이상의 염기 서열을 용이하게 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 상동성을 갖는 범위 내에서 동일한 활성을 갖는 효소 단백질을 코딩하는 유전자를 용이하게 제조할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

상기 유전자는 그 자체로, 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터란 목적한 유전자의 염기 서열과, 상기 유전자 염기 서열을 발현하는데 필수적인 적정 염기 서열이 작동 가능하게 연결된 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 적정 염기 서열은 프로모터 및 전사 종결인자로 이루어지는 하나 이상의 요소와 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 예를 들면, 화학물질 유도성 요소 (inducible element) 및 온도 민감성 요소(temperature sensitive element)등과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 화학물질 유도성 요소(inducible element)는 lac 오페론 및 T7 프로모터, trc 프로모터 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 T7 프로모터는 바이러스인 T7 파지에서 유래된 것으로 프로모터와 함께 T7 터미네이터를 포함한다.

상기 재조합 벡터는 당업계에 널리 알려진 다양한 방법을 통해 클로닝을 위 한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다(Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:411-421). 본 발명에서 사용되는 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니며, 발현 벡터는 유전자 재조합에 이용되어온 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하다. 바람직하게는 대장균 내 발현에 적합한 pRSet, pET, pBR, pTrc, pLex, pUC 벡터 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 '형질전환'은 원래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합, 세포의 유전형질이 변화되는 분자생물학적 현상을 말한다. 상기 벡터를 안정적이며 연속적으로 클로닝 및/또는 발현시킬 수 있는 형질전환 대상 미생물로는 활성형의 상기 효소 단백질을 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지되어 있는 어떠한 미생물도 이 용할 수 있으며, 예컨대 E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X1776, E. coli W3110 등의 다양한 대장균, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균,코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 코리네 박테리아 속 그리고 살모넬라 티피무리움 등의 살모넬사 속 균, 기타 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 대장균(E. coli) 일 수 있다.

상기 벡터를 사용하여 형질전환시키기 위한 방법은 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 상기 효소 단백질은 수크로스를 투라노스로 전환시키는 투라노스 전환능이 있는 효소 단백질이다. 따라서, 상기 효소 단백질 또는 이를 발현하는 재조합 균주는 투라노스 제조에 적용될 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 예를 들어 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 재조합 미생물은 예를 들어 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 아밀로수크라제 효소 단백질을 발현하는 재조합 균주일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예로서, 투라노스를 생성하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 터모필럼 유래의 효소 단백질, 이를 발현하는 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물의 배양물 또는 상기 재조합 미생물의 파쇄물(또는 파쇄물의 상등액)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 투라노스 생산용 조성물을 제공한다.

상기 효소 단백질에 관한 사항은 상기 투라노스 생산용 조성물에 동일하게 적용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예로서, 투라노스를 생성하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 터모필럼 유래의 효소 단백질, 이를 발현하는 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물의 배양물 또는 상기 재조합 미생물의 파쇄물(또는 파쇄물의 상등액)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 투라노스 생산용 조성물을 기질과 반응시키는 단계를 포함하는 투라노스 생산 방법을 제공한다.

상기 효소 단백질에 관한 사항은 상기 제조 방법에 동일하게 적용될 수 있다.

상기 투라노스 생산 방법에 있어서, 효율적인 투라노스 생산을 위하여, 사용되는 기질은 수크로스 단독 또는 상기 수크로스에 프럭토스를 추가적으로 보강하여 사용할 수 있다. 사용된 수크로스 및 프럭토스의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 기질로서 0.25M 또는 0.75M 프럭토스로 보강된 1.0M 또는 2.5M 수크로스 용액 상에서 작용될 때에도 상기 효소는 반응하여 투라노스를 생산할 수 있다.

상기 효소 단백질을 기질과 반응시키는 단계는 상기 단백질을 기질과 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 상기 효소 단백질을 기질과 접촉시키는 단계는, 예컨대, 상기 효소 단백질 등을 기질과 혼합하는 단계 또는 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담체에 기질을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 또 다른 예에서 상기 효소 단백질 등을 기질과 반응시키는 단계는 상기 재조합 균주의 균체를 기질이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 상기 효소 단백질은 수크로스 또는 프럭토스를 투라노스로 전환하여 수크로스 또는 프럭토스로부터 투라노스를 생산할 수 있다.

상기 생산 방법은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 재조합 미생물 또는 상기 재조합 미생물로부터 분리된 효소 단백질을 기질과 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 재조합 미생물의 배양 단계는, 사용되는 미생물, 예를 들어 균주의 특성에 따라 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 선택되는 배지 및 배양 조건 하에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 배지로서는 대장균을 비롯한 임의의 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지하거나 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함하며, 바람직하게는 2YT 배지, LB 배지, SOB 배지 또는 TB 배지 등이 될 수 있다. 상기 배양은 연속, 반연속, 또는 회분식 배양일 수 있다.

상기 배양물은 일반적으로 대장균을 배양하는데 적합한 조건을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들면, 35 내지 37℃에서 상기 재조합 미생물을 150 내지 250rpm에서 진탕배양하여 배양물을 얻을 수 있다. 또한 바람직하게는 이때 온도를 14 내지 30℃ 로 하여 단백질 과발현을 유도 할 수 있다.

상기 균체는 상기 미생물의 배양물에 대해 원심분리, 여과 등을 수행하여 얻을 수 있으며, 또한 상기 얻어진 균체를 균질화시키고 원심분리하여 수득된 상층액 또는 상기 상층액을 분획화하거나, 크로마토그래피 등을 통해 분리 정제하여 효소 단백질을 얻을 수 있다.

예컨대, 회수된 균체를 50mM 인산 완충용액으로 현탁한 후 파쇄하여 원심분리 한 후, 상등액만 Ni-NTA 컬럼 (Qiagen) 에서 흡착시킨 후 20mM, 200mM 이미다졸의 농도로 목적 단백질을 회수할 수 있다.

상기 투라노스 생산 방법에 있어서, 효율적인 투라노스 생산을 위하여, 사용되는 효소 단백질의 양은 전체 반응물(기질 및 단백질 모두을 포함) 기준으로 50 U/ml 내지 1500 U/ml 일 수 있다. 효소의 사용량이 상기 농도보다 낮으면 투라노스 전환 효율이 낮아 질 수 있고, 상기 농도보다 높으면 산업에서의 경제성이 낮아지므로 상기 범위가 적당하다.

또한, 상기 기질과 반응시키는 단계는 바람직하게는 본 발명의 효소 단백질의 최적 활성화 조건 하에 이루어질 수 있다.

즉, 상기 반응은 30 내지 65℃, 바람직하게는 40 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 45 내지 55℃, 더욱 바람직하게는 50℃의 온도에서 이루어질 수 있으며, pH 6.0 내지 9.0, 바람직하게는 pH 6.5 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 pH 7.0에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 방법에 의하여 프럭토스로부터 수득된 투라노스는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예로서, 상기 투라노스 생산 방법으로 생산된 투라노스 함유 당 시럽 조성물을 제공한다.

상기 효소 단백질 및 투라노스 생산 방법에 관한 사항은 상기 투라노스 함유 당 시럽 조성물에 동일하게 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 비피도박테리움 터모필럼(Bifidobacterium thermophilum) 유래 효소 단백질은 프럭토스 또는 수크로스로부터 투라노스를 고수율로 생성할 수 있어 투라노스의 산업적 이용에 유용하다.

도 1은 재조합 투라노스 3-에피머화 효소 발현용 재조합 DNA를 포함하는 발현벡터 pRSet(A)를 나타내는 도면이다.
도 2는 비피도박테리움 터모필럼 아밀로수크라제 발현을 나타내는 SDS-PAGE 도면이다.
도 3는 정제된 비피도박테리움 터모필럼 아밀로수크라제의 최적 온도를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 정제된 비피도박테리움 터모필럼 아밀로수크라제의 최적 pH를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 정제된 비피도박테리움 터모필럼 아밀로수크라제의 효소 농도에 따른 시간당 생성하는 투라노스의 농도 측정량을 나타내는 도면이다.
도 6은 정제된 비피도박테리움 터모필럼 아밀로수크라제 돌연변이체 V542D (서열번호6)의 최적 pH를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 정제된 비피도박테리움 터모필럼 아밀로수크라제의 돌연변이체 V542D(서열번호6)의 효소 농도에 따른 시간당 생성하는 투라노스의 농도 측정량을 나타내는 도면이다.
도 8은 정제된 비피도박테리움 터모필럼 아밀로수크라제의 돌연변이체 V542K(서열번호5)의 최적 pH를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 정제된 비피도박테리움 터모필럼 아밀로수크라제의 돌연변이체 V542K(서열번호5)의 효소 농도에 따른 시간당 생성하는 투라노스의 농도 측정량을 나타내는 도면이다.
도 10은 실시예의 균질기(Bead beater)를 이용하여 배양한 세포를 용해시킨 후 SDS-PAGE를 통해 단백질의 발현량을 비교한 사진이다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만 본 발명은 하기 실시예에 한정된 것이 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정이 가능함은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 넓게 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.

실시예 1. 아밀로수크라제를 생산하는 재조합 균주 제조

발현균주로 사용될 대장균에 최적화되도록 비피도박테리움 터모필럼으로부터 유래된 아밀로수크라제(서열번호 4)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 1)를 바이오니아(Bioneer.Co.Korea)에 의뢰하여 합성하였다.

합성된 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 제한효소 NheI과 XhoI(NEB)을 사용하여 발현 벡터인 pRSet(A)(invitrogen)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pRSet(A)-아밀로수크라제(pRSet(A)-BtAS)를 제조하였다(도 1). 이후 제조된 재조합 벡터로 heat shock 방법(Sambrook and Russell: MolecularCloning.)에 의하여 대장균 BL21(DE3)(invitrogen)를 형질전환 하여 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 균주를 제조하였다. 형질전환된 재조합 균주를 5ml LB-ampicilline 배지(Difco)에 접종한 후 600nm에서의 흡광도(OD)가 1.5에 도달할 때까지 37℃의 온도 및 200rpm에서 진탕배양 한 후, 이 배양액을 500ml LB-ampicilline 배지에 접종, 37℃ 의 온도 및 200rpm에서 진탕배양 하였다. 이 배양액의 600nm에서 흡광도가 0.5일 때 0.1mM의 IPTG를 첨가하여 목적 효소의 과발현을 유도하였다. (이때 과발현 유도시점부터 배양조건은 16 의 온도 및 150rpm으로 전환하여 16시간 동안 유지하였다.

이후 원심분리기 6000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 0.85%(w/v) NaCl로 2회 세척 후 균체를 이용한 투라노스 생산 및 효소정제에 사용하였다. 또한, 회수한 상등액은 효소 활성 특정을 위해 사용하였다.

실시예 2. 변이형 아밀로수크라제를 생산하는 재조합 균주 제조

2.1 PCR에 의한 돌연변이 작제 및 클로닝

아밀로수크라제 돌연변이체는 stratagene사의 quikchange 부위-지향성 돌연변이 유발법을 사용하여 제작되었다. 구체적으로 insert만을 PCR을 통해 증폭하고 플라스미드 DNA로 subcloning하는 방식이 아닌, plasmid DNA 전체를 PCR을 통해 증폭하고, template DNA는 DpnI 효소로 분해하는 방식을 사용하였다. Quikchange 부위-지향성 돌연변이 유발법은 보다 빠르게 돌연변이를 유발할 수 있다는 장점이 있다.

야생형 아밀로수크라제 효소를 암호화 하는 DNA pET21a의 벡터 DNA에 클로닝 되어 있는 플라스미드 DNA를 복제를 하는 주형으로 사용하였다. 제조된 변이형 아밀로수크라제 발현용 재조합 DNA를 포함하는 발현벡터는, 도 1에 도식화된 벡터에서 insert에 해당하는 서열, 즉 각각 하나의 뉴클레오타이드가 치환된 pRSet(A)-BtAS V542D, pRSet(A)-BtAS V542K이다.

V542D 돌연변이체를 제작하기 위하여 주형 DNA 250ng, V542D forward 프라이머 125ng, V542D reverse 프라이머 125ng, pfu ultra high fidelity DNA polymerase 2.5ul, 10X 반응 버퍼 5ul, 10mM dNTP 1ul를 포함하는 최종부피 50ul에 PCR을 세팅하였다. 상기 반응은 GeneAmp PCR system 9700 에서 95℃ (1분)에서 1회의 사이클, [95℃(50초), 60℃ (50초), 68℃ (6분)]의 18회의 사이클, 68℃ (7분)에서 1회의 사이클을 포함한다. 돌연변이가 유발되지 않은 주형 DNA를 인식하여 분해하는 DpnI 효소를 PCR이 끝난 50ul 부피의 반응액에 500U(10U/ul) 넣고 37℃ 에서 1 시간 동안 처리하였다.

Ehgks, V5425K 돌연변이체를 제작하기 위하여 주형 DNA 250ng, V5425K forward 프라이머 125ng, V5425K reverse 프라이머 125ng, pfu ultra high fidelity DNA polymerase 2.5ul, 10X 반응 버퍼 5ul, 10mM dNTP 1ul를 포함하는 최종부피 50ul에 PCR을 세팅하였다. 상기 반응에 필요한 프라이머 염기 서열은 표1과 같다. 상기 반응은 GeneAmp PCR system 9700 에서 95℃(1분)에서 1회의 사이클, [95℃(50초), 60℃ (50초), 68℃ (7분)]의 18회의 사이클, 68℃ (7분)에서 1회의 사이클을 포함한다. 돌연변이가 유발되지 않은 주형 DNA를 인식하여 분해하는 DpnI 효소를 PCR이 끝난 50ul 부피의 반응액에 500U(10U/ul) 넣고 37℃ 에서 1 시간 동안 처리하였다.

돌연변이체 작제에 사용된 프라이머의 서열은 아래 표 1에 나타내었으며, PCR 과정을 아래 표 2에 정리하였다.

명칭	서열	Tm
V542D_FWD (서열번호 7)	5'- CGCCCCTGACGCTTGGGACACGACGTGGGACGCGC -3'	73℃
V542D_RVS (서열번호 8)	5'- GCGCGTCCCACGTCGTGTCCCAAGCGTCAGGGGCG -3'	72℃
V542K_FWD (서열번호 9)	5'- CGCCCCTGACGCTTGGAAGACGACGTGGGACGCGC -3'	73℃
V542K_RVS (서열번호 10)	5'- GCGCGTCCCACGTCGTCTTCCAAGCGTCAGGGGCG -3'	72℃

segment	step	cycles	temperature(℃)	time
1	initialization	1	95	1 min
2	Denaturation	18	95	50 sec
	annealing		60	50 sec
	elongation		68	7 min
3	final elongation	1	68	∞

2.2 형질 전환 및 발현

E.coli DH10B를 최초 숙주로서 사용하였다. 상기 실시예 2.1의 PCR 반응액에 DpnI이 첨가 된 혼합액을 바로 DH10B에 형질 전환한다. PCR 반응액과 DpnI의 혼합 용액을 5ul 피펫팅 하여 초저온 냉동고에 보관되어있던 CaCl₂법으로 제작된 competent cell인 DH10B 50ul에 heat shock 방법으로 형질 전환한다. LB-ampicillin 고체 배지에 도말하고 37℃ 에서 배양한다. 고체 배지 상에 생성된 콜로니 중에서 3개를 선별하여 3ml LB-ampicillin 액체 배지에서 배양한 후 miniprep kit(quiagen) 을 이용하여 plasmid DNA를 추출한다. 시퀀싱은 외부기관(마크로젠, 한국)에서 실시하였으며, 그 결과 투라노스 생성용 아밀로수크라제 효소를 암호화 하는 DNA 부위에 돌연변이가 유발되었으며, 구체적으로 아미노산 서열 V542D 변이(서열번호 5) 및 아미노산 서열 V542K 변이(서열번호 6)가 유발되었음을 확인하였다. 돌연변이 유발이 확인된 plasmid DNA는 냉동고에 보관 되어있던 CaCl2법으로 제작된 competent cell인 E.coli BL21 solu (DE3) 50ul에 heat shock 방법으로 형질전환 하였다. LB-ampicillin 고체 배지에 도말하고 37℃ 에서 배양하였다.

형질전환으로 획득한 아밀로수크라제 돌연변이를 암호화 하는 plasmid DNA를 포함하고 있는 E.coli BL21 solu (DE3)의 콜로니를 피킹하여 3ml LB-ampicillin 액체 배지에 접종하고 37℃ 에서 12시간 배양하였다. 뿌옇게 자란 3ml 배양볼륨의 미생물을 1ml 피펫팅 하여 250ml 삼각 플라스크에 담긴 50ml의 LB-ampicillin 액체배지에 접종하여 37℃ 에서 배양하였다. 600nm에서 흡광도가 0.6이 될 때 IPTG가 0.1mM 되도록 induction을 한 후 16℃에서 배양하였다. 모든 배양은 200 rpm 교반 인큐베이터에서 이루어졌다. 16℃에서 배양한 지 12시간 후에 3500gX의 원심분리기에서 30분 동안 원심분리 하여 미생물을 회수하였다. V542D, V542K 돌연변이 유도체는 모두 같은 방법으로 배양하였다.

시험예 1. 아밀로수크라제 정제 및 특성 확인

아밀로수크라제를 이용하여 투라노스를 생산하기 위해서는 먼저 정제된 효소를 사용하여 효소의 특성을 정확히 결정하였다.

1.1 아밀로수크라제의 정제

실시예 1 및 2에서 회수된 균체를 lysis buffer(PBS buffer, 10mM imidazole)에 혼탁시킨 후 Bead beater를 20초 3회 회전으로 작동으로 파쇄하였다. 파쇄액을 13000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 상등액만을 모은 후, 미리 lysis buffer로 평형시킨 Ni-NTA컬럼(Ni-NTASuperflow. Qiagen)에 적용시킨 다음 PBS 버퍼에 40 mM imidazole이 함유된 완충용액을 순차적으로 흘려주었다. 마지막 과정인 PBS 버퍼에 200 mM imidazole을 흘려줌으로써 목적 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질은 효소 활성 측정용 완충용액(50mM Tris-HCl pH7.0)으로 전환하여 다음 실험에 사용하였다. 이 방법으로 부분 정제된 실시예 1의 균체 유래의 야생형 아밀로수크라제 및 실시예 2의 균체 유래의 변이형 아밀로수크라제(V542D 및 V542K) 를 얻었다.

SDS-PAGE를 통하여 상기 실시예 1의 야생형 균체에서 용출된 아밀로수크라제(야생형 효소)의 단량체 크기가 약 68 킬로달톤(KDa)인 것을 확인하였다(도 2).

1.2 아밀로수크라제의 온도에 따른 활성 분석

시험예 1.1에서 얻어진 야생형 효소의 온도 변화에 따른 활성을 살펴보기 위하여 투라노스 생산 활성을 간접적으로 측정할 수 있는 DNS 법에 의한 활성분석을 실시하였다. 이 때 활성측정은 기질 100mM 수크로스에 상기 시험예 1.1에서 정제된 야생형 아밀로수크라제 BtAS 0.02mg/ml 처리하고 pH 7 및 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60℃의 온도에서 30분간 반응하고, DNS 시약을 넣어 반응을 중지하고, 100℃ 의 온도에서 5분간 가열하여 DNS의 환원당 발색 반응을 유도하고 얼음 위에서 식힌 후, 575nm에서 ABS를 측정 한 후 프럭토스 스탠다드와 비교하여 계산하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었으며, 상기 효소는 30 내지 65℃의 온도 범위에서 활성을 나타냈으며, 특히 50 ℃의 온도에서 최대 활성을 보임을 확인하였다.

1.3 아밀로수크라제 pH에 따른 활성 분석

시험예 1.1에서 얻어진, 야생형 효소와 변이형 효소의 pH 변화에 따른 활성을 알아보기 위해, 상기 시험예 1.2와 동일한 방법으로 활성을 측정하되, 50℃의 온도에서 Mcilvaine buffer pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5, 그리고 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 7.4, 8.0 및 8.5 의 완충용액을 각각 사용하여, 최대활성을 나타내는 pH을 살펴보았다.

도 4, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 야생형 효소뿐만 아니라 V542D 및 V542K 변이형 효소 모두는 pH 6.5-8.0 범위에서 높은 활성을 보였으며, 그 중 pH7.0에서 활성이 특히 높게 나타났다. 또한 pH7.0에 해당되는 완충용액 중에서도 Tris 완충용액 에서 활성이 최대로 나타나 해당 완충용액에서 가장 높은 활성을 보임을 확인할 수 있었다.

50℃의 온도 및 pH 7.0에서 비피도박테리움 터모필럼 야생형 유래 아밀로수크라제의 최대 활성은 1.3 가수분해 Unit이었다. 또한, 비피도박테리움 터모필럼 아밀로수크라제 변이주 V542D 유래 아밀로수크라제는 1.7 가수분해 Unit, 비피도박테리움 터모필럼 아밀로수크라제 변이주 V542K 유래 아밀로수크라제는 1.5 가수분해 Unit의 활성을 지닌다.

시험예 2. 아밀로수크라제의 투라노스 전환 활성

시험예 1.1에서 얻어진 아밀로수크라제의 투라노스 전환 활성을 살펴보기 위하여, 2M 수크로스, 0.75M 프럭토스의 기질에 시험예 1.1에서 정제된 아밀로수크라제 100 가수분해 Unit/L~1000 가수분해 Unit/L를 넣고 투라노스 전환반응을 시작했다. 본 발명에서 상기 '가수분해 Unit'은 가수분해 활성으로, 100mM의 수크로스에 1mg의 아밀로수크라제를 처리하여 50℃에서 30분 간 반응했을 때 분당 생성되는 프럭토스의 양 μmole을 의미한다.

비피도박테리움 터모필럼 야생형 유래 효소의 농도와 시간당 생성하는 투라노스의 농도의 상관 관계를 도 5에 나타내었다. 수식은 y = 0.0569x + 1.5747이며, 2M 수크로스와 0.75M의 프럭토스에 효소를 첨가 했을 때 시간당 생성되는 투라노스를 나타내며, 이를 이용하여 비피도박테리움 터모필럼 유래의 아밀로수크라제 전환 활성은 3.0 U임을 확인하였다.

또한, 도 7 및 도 9는 각각 비피도박테리움 터모필럼 변이주 V542D 및 V542K 유래 효소의 농도와 시간당 생성하는 투라노스의 농도의 상관 관계를 나타내는 그래프이다. 도 7, 도 9 의 수식 모두 x값은 넣어준 효소의 농도 (U/L)를 의미하며, y값은 시간당 생성되는 투라노스의 농도를 g/L로 나타낸 것으로서 단위는 g/L/hr이다. 수식은 y = 0.082x + 7.3862 이고, 변이 아밀로수크라제 V542D를 2M 수크로스와 0.75M의 프럭토스에 첨가 했을 때 시간당 생성되는 투라노스를 계산하였다. 그 결과, 비피도박테리움 터모필럼 유래의 아밀로수크라제 V542D의 투라노스 전환 활성은 8.9 U임을 확인하였다.

동일한 방법으로 아밀로수크라제 V542K를 2M수크로스와 0.75M의 프럭토스에 100U/L~500U/L만큼 넣고 시간대 별로 시료를 채취하여 분석한 결과, 도 9에서 보는 효소 농도와 투라노스 생성에 관한 상관 관계는 y = 0.1879x + 8.0043이었다. 이를 통하여 비피도박테리움 터모필럼 유래의 변이 아밀로수크라제 V542K의 투라노스 전환 활성은 9.9U임을 확인하였다.

2M 수크로스, 0.75M프럭토스를 기질로 하여 50℃에서 반응 할 때, 변이 아밀로수크라제 V542D는 8.9U, 변이 아밀로수크라제 V542K는 9.9U의 활성을 지녀, 야생형 아밀로수크라제 3.0U의 두 배 이상에 해당하는 수치로, DNA돌연변이법으로 효소 활성을 상당한 수준으로 개선 한 것이라고 할 수 있다.

시험예 3. 아밀로수크라제에 의한 투라노스 생성

시험예 1.1에서 얻어진 야생형 효소 및 변이형 효소의 투라노스의 전환율을 살피기 위하여, 아밀로수크라제가 최대 활성을 보이는 50℃의 온도 및 pH 7.0에서 2M 수크로스와 0.75M의 프럭토스와 반응하여, 수크로스가 반응액에 남아있지 않게 되는 시점에서 HPLC 분석을 실시하고 그 결과를 아래 표 3에 나타내었다.

상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하여 (Agilent 1260 RID) 수행하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80℃ , 유속은 0.6ml/min로 하였다.

(단위: 전환율 (w/w) %)	Glucan	Turanose	Trehalose
야생형	18	41	2.1
V542D	18.5	46.9	3.4
V542K	18.1	46.1	4.2

실시예 1의 야생형 균주에서 유래된 아밀로수크라제의 기질(100 %)로부터 투라노스 전환율은 41 %이었다. V542D 변이 효소는 투라노스 전환율이 46.9 %, V542K 변이 효소의 투라노스 전환율이 46.1%로, 야생형 대비 투라노스로의 전환율이 약 5% 가량 증가한 것을 확인하였다.

실시예 3. GRAS(Generally Recognized as Safe) system 적용을 위한 플라스미드의 제조

3.1. BtAS.C wild 유전자를 이용한 벡터제조

Bifidobacterium thermophilum으로부터 유래된 아밀로수크라제 효소의 암호화 유전자를 Corynebacterium glutamicum의 codon usage에 optimization하여 합성한 유전자(서열번호 11)를 BtAS.C라 명명하였다. 합성 유전자 BtAS.C를 제한효소 BglII와 SalI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pCES208(J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pCES208/아밀로수크라제 효소(pCES_s1BtAS.C)를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터(pCES_s1BtAS.C)의 개열지도는 도 1과 같다.

3.2. BtAS.C 돌연변이체 유전자를 이용한 벡터제조

합성 유전자 BtAS.C를 주형으로 하여 stratagene사의 quikchange 부위-지향성 돌연변이 유발법을 실시하였다. 돌연변이체를 제작하기 위하여 주형 DNA 250ng, forward와 reverse 프라이머 각각 125ng, pfu ultra high fidelity DNA polymerase 2.5ul, 10X 반응 버퍼 5ul, 10mM dNTP 1ul를 포함하는 최종부피 50ul에 PCR을 세팅하였다. 상기 반응에 필요한 프라이머 염기 서열은 아래 표와 같다.

명칭	서열
BtAS.C_V542K_FWD (서열번호 12)	5'- GCTTCGCACCAGACGCATGGAAGACCACCTGGGACGCACACG -3'
BtAS.C_V542K_RVS (서열번호 13)	5'- CGTGTGCGTCCCAGGTGGTCTTCCATGCGTCTGGTGCGAAGC -3'

상기 반응은 GeneAmp PCR system 9700 에서 95℃(1분)에서 1회의 사이클, [95℃(50초), 60℃ (50초), 68℃ (7분)]의 18회의 사이클, 68℃ (7분)에서 1회의 사이클을 포함한다. 돌연변이가 유발되지 않은 주형 DNA를 인식하여 분해하는 DpnI 효소를 PCR이 끝난 50ul 부피의 반응액에 500U(10U/ul) 넣고 37℃ 에서 1 시간 동안 처리하였다.

3.3. 숙주세포 형질전환

실시예 3.2 에서 제작한 플라스미드를 전기천공법(electroporation)을 사용하여 코리네박테리움 글루타리쿰을 형질전환시켰다. 콜로니를 picking하여 카나마이신(Kanamycin)을 최종농도 15ug/ml로 첨가한 LB 배지(트립톤 10g/L, NaCl 10g/L, 효모 추출물 5g/L) 4ml에 접종한 후, 배양조건 30℃ 및 250rpm에서 약 16시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 상기 배양액 중 1ml을 수득하여 15ug/ml의 카나마이신을 포함하고 있는 100ml LB 배지에 접종하여 본 배양을 16시간 이상 진행하였다.

3.4. 목적단백질 발현 확인

균질기(Beadbeater)를 이용하여 배양한 세포를 용해(lysis)시킨 후 상등액만 취득하여 샘플버퍼와 1 : 1 부피비로 혼합 후 100℃ 에서 5분간 가열한다. 준비한 샘플은 12% SDS-PAGE gel (조성 : running gel - 3.3 ml H₂O, 4.0 ml 30% acrylamide, 2.5 ml 1.5M Tris buffer(pH 8.8), 100 ㎕ 10% SDS, 100 ㎕, 10% APS, 4 ㎕ TEMED / stacking gel - 1.4 ml H2O, 0.33 ml 30% acrylamide, 0.25 ml 1.0M Tris buffer(pH 6.8), 20 ㎕ 10% SDS, 20 ㎕ 10% APS, 2 ㎕ TEMED)에 180V로 50분 가량 전기영동하여 단백질 발현을 확인한다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

BtAS.C wild 및 BtAS.C V542K의 발현을 SDS-PAGE gel상에서 확인 후 정확한 발현량의 측정을 위해 Ni-NTA resin을 이용한 His-tag정제 진행하여, 계산식(발현율(%) = (Purified protein(mg) / Total soluble protein(mg)) * 100)을 이용하여 발현율 계산하여 아래 표에 나타내었다.

목적 단백질	Promoter 유래	균주내 전체 단백질 (mg)	아밀로수크라제 효소(mg)	발현율 (%)
BtAS.C Wild	s1	9.52	2.43	25.5
BtAS.C V542K	s1	8.78	2.22	25.3

상기 표에서 균주 내 전체 단백질은 아밀로수크라제 효소를 발현하는 코리네박테리움 균주 내부에 포함된 전체 단백질이고, 아밀로수크라제 효소는 그 중 아밀로수크라제 효소만을 정제하여 확보한 것이다. 따라서 발현율은 코리네박테리움 균주에 존재하는 전체 단백질에서 목적단백질이 어느 정도 비율로 발현되는지 계산한 값이다.

시험예 4. 세포 파쇄물을 이용한 투라노스 생산

2M 수크로스와 0.75M 프럭토스를 함유하는 원료에, 실시예 3에서 얻어진 아밀로수크라제 효소 발현 균체 중 pCES_s1BtAS.C 및 pCES_s1BtAS.C V542K를 각각 발현시킨 세포를 5mg/ml의 농도로 pH 7.0 Tris-HCl 50mM에 혼탁한 후 균질기(Beadbeater)를 이용하여 배양한 세포를 용해(lysis)시켜 상등액만 취득하여 50℃ 조건에서 반응을 진행한 후에 100℃ 에서 5분간 끓여서 반응 중지하였다. 각각의 세포 상등액을 이용하여 상기 조건에서 전환반응을 진행하고, 반응시간 별로 샘플링 한 후에 투라노스 생산을 확인하였다.

상기 얻어진 생산물을 확인하고자, 액체 크로마토그래피 (LC) 분석을 통해 기질(수크로스, 프럭토스)과 생산물질(투라노스)의 피크를 확인하였다. 상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하여 (Agilent 1260 RID) 수행하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80℃ , 유속은 0.6ml/min로 하였다.

상기 얻어진 결과로써 반응시간 별 시료 분석 결과를 아래 표에 나타내었다. 하기 표 6에서 당조성은 전체 당류 중량(%)를 기준으로 나타낸 각 물질의 중량(%)이다.

상기 표에 나타난 것과 같이, 반응시간이 길어질수록 수크로스는 줄어들고 생산물인 투라노스는 증가한 것을 확인할 수 있다. 또한 동일한 48시간 반응 결과에서 BtAS.C wild보다 BtAS.C V542K가 더 많은 양의 투라노스를 생산한 것을 확인할 수 있다. 위 결과를 통해 BtAS.C 효소가 GRAS 균주에서 발현하여 활성을 나타내며, 효소 개량의 효과가 GRAS 균주에서도 재현되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명은 투라노스를 GRAS 균주에서 발현하여 안전한 식품원료로 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 효소 개량을 통해 높은 반응 안정성과 활성을 가지고 있는 효소를 확보함으로써 산업에 적용하기에 적합한 균주인 것으로 확인된다.

<110> SAMYANG CORPORATION INDUSTRY ACADEMY COOPERATION FOUNDATION OF SEJONG UNIVERSITY <120> Expression system for producing amylosucrase and method of producing turanose using the same <130> DPP20173325KR <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1812 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amylosucrase BtAS wild type <400> 1 atggaagcca catatcgcga ttccgtattc gccgaacggc tcgccccgcg ctgcgcagaa 60 cttgaacaac ttttccgctc gttgtacggg gattcccctg aattcgacca cttcgaacag 120 gtcatggcca aggcccacgc cgaccggcca gccgacctca aacgcctcga cgccgcccgt 180 gaacacgatc cgcaatggta ccgtcgcggc gacatgttcg gcatgaccat gtacaccgac 240 ctgttcgccg gcaaactcac cgatctcgcc aagcatatcg actatctcaa agagcagcat 300 ctgacctacc tgcacctcat gccgctgctg accatgcccc accccgacaa cgacggcggc 360 tacgccatcg aggatttcga caccgtcgac ccgactatcg gcaccaatga ggacctcgcc 420 gacctcaccg cgaaactgcg cgaagccggc atcagcctgt gccttgattt cgtcatgaac 480 cacaccgcat ccacccaccg gtgggcgaaa gccgcacaag ccggcgaccc cgaataccag 540 gactactact tctgctatga cgaccgcacc atccccgacc aatatgacgc cgtcgtcccg 600 caagtcttcc cgaccgccgc ccccggcaac ttcacatgga atgagcagat gggcaaatgg 660 gtcatgaccc agttctaccc gttccaatgg gacctcaact accgcaatcc caaggtcttc 720 gtcgtcatga tgtccagcct gctgcacctg gccaacctcg gcgtcgaagt cttccgcatc 780 gacgcggtgc cgtacatctg gaagcaactc ggcaccaact gccgcaacct gccgcaagtc 840 cacaccatcg tgcgcatgat gcgcatcatg tccgaaatcg tctgcccggc cgtcgtgttc 900 aaaggtgaag tcgtcatggc tcccaaggag ctcgccgcct acttcggcac ccccgagaag 960 cccgaatgcc acatgctgta caacgtgtcc gtcatggtca acttgtggag cgcgctcgcc 1020 aacggcgaca cccgcctgct taaaacccag atcgacaagc tcgacgccct gcccgacaac 1080 tgctggttcg tcaactatct gcgctgccat gacgatatcg gctggggtct ggacgaggat 1140 gtcgaacgcc agttgggcat cgacccgctc aagcacaagg aattcctcta ccacttctac 1200 gagggcatgg tgcccggcag ctgggcgatg ggcgagctgt acaactatga tccggcgtcc 1260 ggtgacgcgc gcagctgcgg caccacggcg agcttgtgcg gtattgagcg tgcgctgatc 1320 acgcatgacc ggccgctgta tgagcgttcc atccagcgtg atctgctcat gcaccacgct 1380 atgggcttcc tgcgtgggtt cccgatgctc aactgcggcg acgagatcgg ccagctcaac 1440 ggctgggatt ataaggaaga cccggaccgt gtcgctgaca gccgcaatct gcaccgcagc 1500 aagttcaact ggaagaacgc cgcgaagcgc gatgtccccg gaaccttgcc aaaccggctg 1560 tgggaaggca tggcggatgt gcggcagatg cgctcggacc catgcttcgc ccctgacgct 1620 tgggtgacga cgtgggacgc gcatgatgac ggtattctcg cgatggtccg gcagtcaggt 1680 gggcgcacac tgctcggcgt gttcaatttc gcgaaccgtg acgccacggc gacgcttgac 1740 agcatcgagg gcgtgagcct gccgcgtacg gtggcgctca agccatacga gtggaagatc 1800 gaggcctgct ga 1812 <210> 2 <211> 1812 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amylosucrase BtAS V542K <400> 2 atggaagcca catatcgcga ttccgtattc gccgaacggc tcgccccgcg ctgcgcagaa 60 cttgaacaac ttttccgctc gttgtacggg gattcccctg aattcgacca cttcgaacag 120 gtcatggcca aggcccacgc cgaccggcca gccgacctca aacgcctcga cgccgcccgt 180 gaacacgatc cgcaatggta ccgtcgcggc gacatgttcg gcatgaccat gtacaccgac 240 ctgttcgccg gcaaactcac cgatctcgcc aagcatatcg actatctcaa agagcagcat 300 ctgacctacc tgcacctcat gccgctgctg accatgcccc accccgacaa cgacggcggc 360 tacgccatcg 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gcttgggaca cgacgtggga cgcgc 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS V542D reverse primer <400> 8 gcgcgtccca cgtcgtgtcc caagcgtcag gggcg 35 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS V542K forward primer <400> 9 cgcccctgac gcttggaaga cgacgtggga cgcgc 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS V542K reverse primer <400> 10 gcgcgtccca cgtcgtcttc caagcgtcag gggcg 35 <210> 11 <211> 2080 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS.C <400> 11 agatctgaaa ggattacaaa atgcatcatc atcatcatca tgaattcagc cagcaagaca 60 gcgatatgga ggcaacctac cgcgactccg ttttcgcaga gcgcctggca ccacgctgcg 120 cagagctgga gcagctgttc cgctccctgt acggcgactc cccagagttc gaccacttcg 180 agcaggttat ggcaaaggca cacgcagacc gcccagcaga cctgaagcgc ctggacgcag 240 cacgcgagca cgacccacag tggtaccgcc gcggcgacat gttcggcatg accatgtaca 300 ccgacctgtt cgcaggcaag ctgaccgacc tggcaaagca catcgactac ctgaaggagc 360 agcacctgac ctacctgcac ctgatgccac tgctgaccat gccacaccca gacaacgacg 420 gcggctacgc aatcgaggac ttcgacaccg ttgacccaac catcggcacc aacgaggacc 480 tggcagacct gaccgcaaag ctgcgcgagg caggcatctc cctgtgcctg gacttcgtta 540 tgaaccacac cgcatccacc caccgctggg caaaggcagc acaggcaggc gacccagagt 600 accaggacta ctacttctgc tacgacgacc gcaccatccc agaccagtac gacgcagttg 660 ttccacaggt tttcccaacc gcagcaccag gcaacttcac ctggaacgag cagatgggca 720 agtgggttat gacccagttc tacccattcc agtgggacct gaactaccgc aacccaaagg 780 ttttcgttgt tatgatgtcc tccctgctgc acctggcaaa cctgggcgtt gaggttttcc 840 gcatcgacgc agttccatac atctggaagc agctgggcac caactgccgc aacctgccac 900 aggttcacac catcgttcgc atgatgcgca tcatgtccga gatcgtttgc ccagcagttg 960 ttttcaaggg cgaggttgtt atggcaccaa aggagctggc agcatacttc ggcaccccag 1020 agaagccaga gtgccacatg ctgtacaacg tttccgttat ggttaacctg tggtccgcac 1080 tggcaaacgg cgacacccgc ctgctgaaga cccagatcga caagctggac gcactgccag 1140 acaactgctg gttcgttaac tacctgcgct gccacgacga catcggctgg ggcctggacg 1200 aggacgttga gcgccagctg ggcatcgacc cactgaagca caaggagttc ctgtaccact 1260 tctacgaggg catggttcca ggctcctggg caatgggcga gctgtacaac tacgacccag 1320 catccggcga cgcacgctcc tgcggcacca ccgcatccct gtgcggcatc gagcgcgcac 1380 tgatcaccca cgaccgccca ctgtacgagc gctccatcca gcgcgacctg ctgatgcacc 1440 acgcaatggg cttcctgcgc ggcttcccaa tgctgaactg cggcgacgag atcggccagc 1500 tgaacggctg ggactacaag gaggacccag accgcgttgc agactcccgc aacctgcacc 1560 gctccaagtt caactggaag aacgcagcaa agcgcgacgt tccaggcacc ctgccaaacc 1620 gcctgtggga gggcatggca gacgttcgcc agatgcgctc cgacccatgc ttcgcaccag 1680 acgcatgggt taccacctgg gacgcacacg acgacggcat cctggcaatg gttcgccagt 1740 ccggcggccg caccctgctg ggcgttttca acttcgcaaa ccgcgacgca accgcaaccc 1800 tggactccat cgagggcgtt tccctgccac gcaccgttgc actgaagcca tacgagtgga 1860 agatcgaggc atgctgaatc acctgtaagt cggacgaatt cagcagcggc ctggtgccgc 1920 gcggcagctg accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt 1980 gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat atccggatct agaactagtg gatcccccgg 2040 gctgcaggaa ttcgatatca agcttatcga taccgtcgac 2080 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS.C_V542K forward primer <400> 12 gcttcgcacc agacgcatgg aagaccacct gggacgcaca cg 42 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS.C_V542K reverse primer <400> 13 cgtgtgcgtc ccaggtggtc ttccatgcgt ctggtgcgaa gc 42

Claims (20)

1. 서열번호 4 로 이루어지는 아미노산 서열의 542번째 아미노산이 리신 또는 아스파르트산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지며, 수크로스를 포함하는 기질로부터 투라노스를 전환하는 활성을 가지는, 효소 단백질.
2. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은 비피도박테리움 터모필럼(Bifidobacterium thermophilum) 유래인 것인, 효소 단백질.
3. 제1항에 있어서, 상기 기질은 프럭토스를 추가로 포함하는 것인, 효소 단백질.
4. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은 아래 특성으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 특성을 갖는 것인, 효소 단백질:
   (1) 단량체의 분자량이 65 내지 75 kDa
   (2) 최적 온도가 30 내지 65℃, 및
   (3) 최적 pH가 6.0 내지 9.0.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은 50℃의 온도 및 pH 7.0에서 투라노스 전환 활성이 3.0 내지 10.0 U 인, 효소 단백질.
9. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은, 2M 수크로스 및 0.75M 프럭토스를 포함하는 기질에 1시간 내지 48시간 동안 반응하여 생성되는 투라노스의 양이 20 내지 70중량%인, 효소 단백질.
10. 서열번호 5 내지 서열번호 6의 아미노산 서열 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
11. 제10항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 내지 서열번호 3의 의 염기서열로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
12. 서열번호 5 내지 6의 아미노산 서열 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
13. 삭제
14. 서열번호 5 내지 6의 아미노산 서열 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된, 아밀로수크라제 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물.
15. 제1항 내지 제4항 및 제8항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 효소 단백질, 제14항의 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물의 배양물, 또는 상기 재조합 미생물의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 투라노스 생산용 조성물.
16. 제1항 내지 제4항 및 제8항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 효소 단백질, 제14항의 재조합 미생물 균체, 상기 재조합 미생물의 배양물, 또는 상기 재조합 미생물의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 수크로스를 포함하는 기질과 반응시키는 단계를 포함하는, 투라노스 생산 방법.
17. 삭제
18. 제1항 내지 제4항 및 제8항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 효소 단백질, 제14항의 재조합 미생물 균체, 상기 재조합 미생물의 배양물, 또는 상기 재조합 미생물의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 수크로스를 포함하는 기질과 반응시키는 단계를 포함하는, 투라노스 함유 당 시럽 조성물의 제조 방법.
19. 삭제
20. 제18항에 있어서, 2M 수크로스 및 0.75M 프럭토스를 포함하는 기질에 1 내지 48시간 동안 반응하여 생성된 당 시럽 조성 물 내 투라노스의 양이 20 내지 70중량%인, 당 시럽 조성물의 제조 방법.

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