KR100327972B1

KR100327972B1 - 서모언에어로박터 연세이 ｋｂ-1으로부터 클로닝된 포도당이성화효소의 유전자 및 그를 이용한 포도당 이성화효소의제조방법

Info

Publication number: KR100327972B1
Application number: KR1020000004522A
Authority: KR
Inventors: 변유량; 김병찬; 장형진; 김유삼
Original assignee: 변유량
Priority date: 2000-01-29
Filing date: 2000-01-29
Publication date: 2002-03-15
Also published as: KR20010077016A

Abstract

본 발명은 서모언에어로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1, KFCC-11116)으로부터 클로닝된 신규한 포도당 이성화효소의 유전자, 그를 포함한 재조합 플라스미드 및 전기 플라스미드를 대장균에 도입시켜 형질전환체를 배양하고 발현을 유도함으로써, 재조합 대장균으로부터 생산된 포도당 이성화효소의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 플라스미드를 이용하여 포도당 이성화효소를 대량으로 제조할 수 있는 바, 전기 제조된 포도당 이성화효소는 종래의 포도당 이성화효소보다 내열성이 우수함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 의하여 제조된 포도당 이성화효소를 이용하여 50%(w/w) 이상의 고농도 과당을 생산할 수 있으며, 전기 효소의 대량생산이 가능하므로 식품산업에서 유용하게 활용될 것이다.

Description

서모언에어로박터 연세이 ＫＢ-1으로부터 클로닝된 포도당 이성화효소의 유전자 및 그를 이용한 포도당 이성화효소의 제조방법{A Gene Encoding Thermoactive Glucose Isomerase Cloned from Thermoanaerobacter yonseii KB-1 and Process for Preparing Glucose Isomerase by Empolying the Same}

본 발명은 서모언에어로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1)으로부터 클로닝된 포도당 이성화효소의 유전자 및 그를 이용한 포도당 이성화효소의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 서모언에어로박터 연세이 KB-1으로부터 클로닝된 포도당 이성화효소의 유전자, 그를 포함한 재조합 플라스미드 및 전기 플라스미드를 대장균에 도입시켜 형질전환체를 배양하고 발현을 유도함으로써, 재조합 대장균으로부터 생산된 포도당 이성화효소의 제조방법에 관한 것이다.

포도당 이성화효소는 식품산업에서 포도당(glucose)을 과당(fructose)으로 전환시켜, 포도당과 과당이 혼합된 고농도의 과당시럽(high fructose syrup, HFS)을 생산하는데 사용된다. 고농도의 과당시럽은 높은 감미도와 결정화가 잘 되지 않는 특성으로 인하여, 과일통조림, 아이스크림, 제과의 잼과 젤리를 생산하는 데에 많이 사용되고 있는 설탕(sucrose)과 전화당(invert syrup)을 대체하여 식품산업에서 널리 사용되고 있다.

포도당 이성화 반응에서 포도당에서 과당으로의 전환율은 온도에 의존하는 평형반응으로서, 높은 온도에서 반응하면 할수록 과당으로의 전환율이 높아지는 것으로 보고되고 있다(참조: Tewari, Y. B. et al., Thermodynamics of the conversion of aqueous glucose to fructose,Appl. Biochem. Biotechnol.,11:17-24, 1985). 그러나, 이성화 반응온도가 높아지면 높아질수록 효소의 활성과 안정성에 큰 영향을 미치는 바, 효소의 열에의한 변성으로 오히려 활성은 감소하게 되고, 90℃ 이상의 높은 온도에서는 효소가 완전히 변성되어, 포도당 이성화 반응은 전혀 일어나지 않게 된다. 반면, 낮은 온도에서의 이성화 반응은 미생물에 의한 오염 가능성을 증가시키므로, 현재 식품산업에서의 이성화 반응은 60℃에서 행해지고 있다. 그리고, 전기 온도에서 42%(w/w, 건조중량)의 과당이 생산되고 있으나, 55%(w/w, 건조중량)의 과당이 같은 건조중량의 설탕과 비교하였을 때, 동일한 감미도를 가지므로, 현재 상업적으로 관심있는 사항은 55%(w/w, 건조중량)의 과당을 생산하는 것이다. 아울러, 전기 농도의 과당은 많은 식품산업, 특히 음료산업에서 설탕을 대체하여 사용되어지고 있다.

그러나, 현재 식품산업에서는 이성화효소 반응에 의하여 생산되는 42%(w/w, 건조중량)의 과당으로부터 55%의 과당을 생산하기 위하여, 비용이 많이 소요되는 비효소적 생산공정, 즉 크로마토그래피 공정을 사용하고 있기 때문에, 높은 이성화 반응온도에서 포도당을 이성화하여 50% 이상의 전환율을 얻을 수 있는 호열성 또는 내열성이 우수한 포도당 이성화효소를 대량으로 제조할 수 있는 기술개발의 필요성이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 내열성이 우수한 포도당 이성화효소를 제조하고자, 서모언에어로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1, KFCC 11116)으로부터 포도당 이성화효소의 유전자를 클로닝하고, 전기 유전자를 삽입한 재조합 벡터를 대장균에 도입시켜 형질전환체를 수득하고, 전기 형질전환체를 배양함으로써,포도당 이성화효소를 대량으로 제조하고 전기 효소를 이용하여 50%(w/w, 건조중량)의 고농도 과당시럽을 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 첫 번째 목적은 서모언에어로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1, KFCC-11116)으로부터 클로닝된 포도당 이성화효소의 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 전기 포도당 이성화효소의 유전자로부터 유추되는 아미노산 서열을 포함하는 포도당 이성화효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 전기 포도당 이성화효소의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 전기 재조합 플라스미드를 대장균에 도입시켜 형질전환체를 수득한 다음, 전기 형질전환체를 배양하여 포도당 이성화효소의 발현을 유도하고, 그로부터 생산된 포도당 이성화효소를 수득하는 공정을 포함하는 포도당 이성화효소의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 서모언에어로박터 연세이 KB-1의 전체 유전자로부터 포도당 이성화효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하는 방법의 개략도이다.

도 2는 본 발명의 포도당 이성화효소 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 공정도이다.

도 3은 본 발명의 포도당 이성화효소의 반응온도에 대한 영향을 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명의 포도당 이성화효소의 반응 pH에 대한 영향을 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 포도당 이성화효소의 열에 대한 안정성을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명자들은 산업적으로 유용한 호열성 또는 내열성 포도당 이성화효소를 제조하기 위하여, 서모언에어로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1, KFCC-11116)의 전체 유전자(genomic DNA)로부터 포도당 이성화효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 전기 유전자의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 포도당 이성화효소를 암호화하는 유전자는 서모언에어로박터 에타놀리쿠스(Thermoanaerobacter ethanolicus) 유래의 자일로오스 이성화효소(xylose isomerase)를 암호화하는 유전자의 염기서열과 85%의 상동성을 가지며, 서모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 유래의 자일로오스 이성화효소를 암호화하는 유전자 염기서열과는 73%의 상동성을 지님을 확인하였다.

전기 클로닝된 포도당 이성화효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여,NdeI과EcoRI으로 절단한 발현벡터 pET 22b(+)(Novagen, U.S.A.)에 전기 효소의 유전자를 삽입시켜 재조합 발현벡터 pTYGI을 제조하고(참조: 도 2), 전기 재조합 발현벡터로 대장균 BL21(Escherichia coliBL21)을 형질전환시켜 재조합 균주를 수득하였다. 본 발명의 재조합균주로부터 재조합 단백질이 다량으로 발현되는 것을 PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis) 젤상에서 확인하였으며, 효소의 특성을 조사한 결과, 본 발명의 재조합 포도당 이성화효소는 반응 최적온도가 90℃ 이상이며, 반응 최적 pH는 7이고, 90℃에서 4시간 열처리한 후의 잔존 효소활성이 50% 이상으로 열에 매우 안정함을 확인하였다.

결과적으로, 본 발명의 포도당 이성화효소를 서모언에어로박터 에타놀리쿠스 유래의 이성화반응 효소와 비교해 보면, 우선 그 효소원인 균주가 본 발명의 균주와 종 이상의 수준에서 다르며(16S 리보좀 유전자 상동성: 90.7%), 전기 균주의 경우 생육최대 온도가 78℃로 생육온도가 85℃인 본 발명의 균주보다 생육온도가 낮다. 또한, 이성화 반응 최적온도가 서모언에어로박터 에타놀리쿠스 유래의 이성화반응 효소의 경우 85℃인데 반하여, 본 발명의 이성화반응 효소는 반응최적온도가 90℃ 이상으로 내열성이 더 우수함이 확인되어 지금까지 보고된 것과 다른 새로운 포도당 이성화효소임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 정제된 재조합 포도당 이성화효소를 이용하여 50%(w/w, 건조중량)의 고농도의 과당시럽 수용액을 기질로 90℃ 내지 110℃의 온도에서 10분 내지 5시간 동안 이성화 반응시킨 결과, 50%에서 60%(w/w 건조중량) 사이의 고농도의 과당이 생성됨을 HPLC 분석을 통하여 확인하였으며, 따라서, 본 발명의 효소를 이용하여 50% 이상의 고농도의 과당을 생산하기 위한 새로운 포도당 이성화반응 공정에 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 포도당 이성화효소의 클로닝

서모언에어로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1, KFCC 11116)을 혐기적 배양방법으로 24시간 동안 2L를 배양한 후, 원심분리(4000×g, 10분)를 통하여 균체만을 수득하였다. 전기 수득된 균체로부터 전체 유전자를로어(Lawyer) 등의 방법에 따라 분리하고(참조: Lawyer, F. C. et al., Isolation, Characterization, and Expression inEscherichia coliof the DNA Polymerase Gene fromThermus aquaticus.J. Biol. Chem., 264:6427-6437, 1989), 제한효소Sau3AI(Takara Biotechnology, Japan)으로 부분절단(partial digestion)하여 12kb 이하의 유전자 단편을 수득하였다. 전기 유전자 단편을 잽발현벡터(ZAP Express Vector, Stratagene, U.S.A.)에 삽입시키고, 패키징(packaging)하여 서모언에어로박터 연세이 KB-1의 유전자 라이브러리(genomic DNA library)를 구축하였다. 종래의 호열성 또는 내열성 포도당 이성화효소를 암호화하는 유전자의 염기서열을 분석하여 상동성이 높은 부분을 찾아내고, 이를 기초로하여 프라이머를 제작하였으며, 전기 프라이머를 이용하여 상기에서 수득한 서모언에어로박터 연세이 KB-1의 전체 유전자로부터 PCR을 이용하여 DNA-DNA 혼성화반응(hybridization)에 사용할 탐침(probe)을 제조하였다. DNA-DNA 혼성화반응을 통하여 포도당 이성화효소를 포함하는 유전자를 상기에서 제조한 유전자 라이브러리로부터 선별하여, 서모언에어로박터 연세이 KB-1의 포도당 이성화효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 수득하였다. 전기에서 상술한 서모언에어로박터 연세이 KB-1 균주로부터 포도당 이성화효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하는 방법을 도 1에 개략적으로 나타내었다. 전기에서 클로닝한 포도당 이성화효소 유전자의 염기서열(참조: 서열번호 1) 및 전기 유전자로부터 유추되는 아미노산 서열(참조: 서열번호 2)을 종래의 공지된 포도당 이성화효소 유전자의 염기서열 및 아미노산서열과 비교분석한 결과, 본 발명의 포도당 이성화효소는 종래의 서모언에어로박터 에타놀리쿠스와 유전자상으로85%, 아미노산 상으로 92%의 상동성을 나타내었다(참조: 표 1). 그러나, 서모언에어로박터 에타놀리쿠스 유래의 이성화 반응효소는 우선, 그 효소원인 균주가 본 발명의 균주와 종 이상의 수준에서 다르며(16S 리보좀 유전자 상동성: 90.7%), 전기 균주의 경우 생육최대 온도가 78℃로 생육온도가 85℃인 본 발명의 균주보다 생육온도가 낮다. 또한, 이성화 반응 최적온도가 서모언에어로박터 에타놀리쿠스 유래의 이성화 반응효소의 경우 85℃인데 반하여, 본 발명의 이성화반응효소는 반응최적온도가 90℃ 이상으로 내열성이 우수함이 확인되어, 지금까지 보고된 것과 다른 새로운 포도당 이성화효소임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 포도당 이성화효소와 종래의 공지된 포도당 이성화효소의 상동성

포도당 이성화효소를 생산하는 균주	아미노산 서열 상동성 %
Thermoanaerobacter ethanolicus	92
Thermoanaerobacterium saccharolyticum	84
Thermotoga maritima	73
Bacillus stearothermophilus	73
Thermotoga neapolitana	72
Bacillus subtilis	69
Escherichia coli	52
Thermus aquaticus	29

실시예 2: 재조합 플라스미드의 제조

실시예 1에서 클로닝한 포도당 이성화효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 전기 효소의 유전자가NdeI과EcoRI의 절단부위를 갖도록 제작한 프라이머 5'-GGCATATGGAATACTTCAAAAATGTACCG-3'(참조: 서열번호 1) 및 5'-GGGAATTCACTAAATAAATACTGATTTAATATTG-3'(참조: 서열번호 2)를 이용하여 PCR 방법으로 대량으로 증폭시킨 후,NdeI과EcoRI으로 절단한 발현벡터 pET 22b(+)(Novagen, U.S.A.)에 전기 효소의 유전자를 삽입시켜 재조합 발현벡터 pTYGI을 제조하였다(참조: 도 2). 전기 재조합 발현벡터로 대장균 BL21(Escherichia coliBL21)을 형질전환시켜 재조합 균주를 수득하였다. 전기의 재조합 플라스미드 pTYGI로 형질전환된 대장균 BL21을 대장균 BL21 pTYGI 벡터(Escherichia coliBL21 pTYGI 벡터)라 명명하고, 그를 2000년 1월 21일 사단법인 한국종균협회(KFCC)에 기탁번호 KFCC-11122로 기탁하였다. 본 발명의 재조합 플라스미드 pTYGI로 형질전환된 균주로부터 포도당 이성화효소가 다량으로 발현되는 것을 PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis) 젤상에서 확인하였다.

실시예 3: 재조합 포도당 이성화효소의 활성 측정

상기 실시예 2에서 형질전환된 대장균를 LB(Luria-Bertani) 배지에 1%(v/v) 접종하여 37℃에서 2시간 동안 배양한 배양액에 최종 농도가 1mM이 되도록 락토오스를 첨가하고, 12시간 동안 재조합 포도당 이성화효소의 발현을 유도발현시켰다. 이때, 효소의 활성이 최대가 되었으며, 12시간 후에는 활성이 점차 감소됨을 확인할 수 있었다. 재조합 포도당 이성화효소의 활성은 하기와 같은 방법을 사용하여측정하였다: 형질전환된 대장균의 배양액을 원심분리(4000×g, 10분)하여 균체만을 모으고, 100mM MOPS 완충용액(4-morpholinepropanesulfonic acid, pH 7.0) 10㎖에 다시 현탁시켰다. 전기 현탁액을 초음파처리(sonication)하여 세포를 완전히 파쇄한 후, 이 자체를 조효소액으로 사용하여 포도당 이성화반응을 실시하였다. 기질로 1M 농도의 포도당 수용액을 사용하였으며, 최종 10mM 농도의 MgSO₄와 1mM 농도의 CoCl₂를 조인자(cofactor)로 첨가하여 조효소액 100㎕와 함께 최종 1㎖의 효소반응액(MOPS 완충용액, pH 7.0, 100mM)을 제조하였다. 전기 효소반응액을 90℃에서 20분간 반응시키고, 생성된 과당은 디체(Dische) 등에 의해 고안된 시스테인-카바졸-황산(cysteine-carbazole-sulfuric acid)법을 사용하여 검출하였다(참조: Dische, Z., and E. Borenfreund., A New Spectrophotometric Method for the Detection and Determination of Keto Sugars and Trioses,J. Biol. Chem.,192:583-587, 1951). 그 결과, 전기 형질전환된 균주에서 제조된 조효소액을 사용하여 포도당 이성화 반응을 실시한 경우, 상기와 동일한 방법으로 서모언에어로박터 연세이 KB-1의 배양액으로부터 조효소액을 제조하여 포도당 이성화 반응을 실시한 경우 보다 동량의 단백질량에 대하여 100배 이상의 높은 효소활성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 4: 재조합 포도당 이성화효소의 제조

상기 실시예 2와 동일한 조건으로 유도 발현시켜 수득한 재조합 포도당 이성화효소를 정제하기 위하여, 재조합균주 배양액을 원심분리(4000×g, 10분)하여 균체를 수득한 다음, 초음파처리하여 대장균의 세포벽을 파괴하고, 20,000×g에서 20분간 원심분리하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 전기 상등액을 90℃에서 60분간 열처리하고 20,000×g에서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거하고, 상등액을 수득하였다. 전기 열처리 과정에서 재조합 포도당 이성화효소를 제외한 대부분의 단백질이 제거되어 80% 이상의 정제도를 얻을 수 있었다. 95% 이상의 정제도를 얻기 위하여, 암모니움설페이트 침전법을 이용하여 잔존 오염단백질을 제거하고, 최종적으로 이온교환컬럼(Q-Sepharose Fast Flow, Pharmacia, Sweden)을 이용하여, 순수한 본 발명의 재조합 포도당 이성화효소를 제조하였다.

실시예 5: 재조합 포도당 이성화효소의 반응최적온도 및 pH

본 발명의 재조합 포도당 이성화효소의 반응최적온도와 pH를 구하기 위하여,상기 실시예 4와 동일한 방법으로 정제된 효소를 이용하여 상기 실시예 3에서와 동일한 방법으로 효소의 활성정도를 측정하였다. 반응온도는 50, 60, 70, 80, 85, 90, 92.5, 95, 97.5, 100, 105℃로 달리하여 각각의 온도에서 포도당 이성화효소활성을 측정하였고, 그 결과 90 내지 95℃에서 최대 활성을 나타내었다(참조: 도 3). 이성화 반응 최적온도가 서모언에어로박터 에타놀리쿠스 유래의 이성화반응효소의 경우 85℃인데 반하여, 본 발명의 이성화반응효소는 반응최적온도가 90℃ 이상으로 내열성이 더 우수함을 확인할 수 있었다. 효소반응 pH를 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9에서측정하였고, pH 7에서 최대활성을 나타내었다(참조: 도 4).

실시예 6: 포도당 이성화효소의 내열성 조사

본 발명의 재조합 포도당 이성화효소의 열에 대한 안정성을 조사하기 위하여, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 얻은 조효소액에 기질로 최종 1M 농도가 되도록 포도당을 첨가하고, 최종 10mM 농도의 MgSO₄와 1mM 농도의 CoCl₂를 조인자로 첨가하여 1㎖를 제조한 후, 90℃에서 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 동안 열처리하였다. 열처리후 남아있는 포도당 이성화효소의 잔존활성을 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하였고, 90℃에서 4시간 열처리하였을 경우 50% 이상의 잔존활성이 남아있는 것을 확인하였다(참조: 도 5).

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 서모언에어로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1, KFCC-11116)으로부터 클로닝된 신규한 포도당 이성화효소의 유전자 및 그를 이용한 포도당 이성화효소의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 플라스미드를 이용하여 포도당 이성화효소를 대량으로 제조할 수 있었으며, 전기 제조된 포도당 이성화효소는 종래의 포도당 이성화효소보다 내열성이 우수함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 의하여 제조된 포도당 이성화효소를 이용하여 50%(w/w) 이상의 고농도 과당을 생산할 수 있으며, 전기 효소의 대량생산이 가능하므로 식품산업에서 유용하게 활용될 것이다.

Claims

서모언에어로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1, KFCC-11116)으로부터 클로닝되었으며, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 포도당 이성화효소의 유전자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 포도당 이성화효소.
서열번호 1의 포도당 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드.
서열번호 1의 포도당 이성화효소 유전자를 포함하며, 도 2에 개시되어 있는 유전자 지도를 갖는 재조합 플라스미드 pTYGI.
제 3항 또는 제 4항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균(Escherichia coli).
제 4항의 재조합 플라스미드 pTYGI로 형질전환된 대장균 BL21 pTYGI 벡터(Escherichia coliBL21 pTYGI 벡터)(KFCC-11122).
서열번호 1의 포도당 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 대장균에 도입시켜 형질전환체를 수득한 다음, 전기 형질전환체를 배양하여 포도당 이성화 효소의 발현을 유도하고, 그로부터 생산된 포도당 이성화효소를 수득하는 공정을 포함하는 포도당 이성화효소의 제조방법.
제 7항에 있어서,

형질전환체는 대장균 BL21 pTYGI 벡터(Escherichia coliBL21 pTYGI 벡

터)(KFCC-11122)인 것을 특징으로 하는

포도당 이성화효소의 제조방법.