CN115261243B - 重组酿酒酵母及其构建方法和应用 - Google Patents

重组酿酒酵母及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了重组酿酒酵母及其构建方法和应用。该构建方法包括对出发酿酒酵母进行改造，得到重组酿酒酵母，所述改造包括如下C1‑C3：C1、导入甘油‑3‑磷酸脱氢酶基因GPD1基因；C2、导入二酰基甘油酰基转移酶基因DGA1基因；C3、导入磷脂酸磷酸水解酶基因PAH1基因。该构建方法通过对脂滴的形态和/或数量的关键基因进行调控，使酿酒酵母对脂溶性物质(例如，三萜类物质)的存储能力得到增加。

Description

重组酿酒酵母及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及重组酿酒酵母及其构建方法和应用。
背景技术
细胞器脂滴是一类特殊的细胞器，在相当长的一段时间内被人们认为是一类仅用来存储能量的细胞器而不具备生物学功能，近年来随着越来越多具有生物学功能的大分子被发现，脂滴的生物学上的功能逐渐受到人们的关注。酵母脂滴(lipid droplets，LDSs)是细胞内中性脂(neutral lipids)的主要贮存场所，由磷脂单分子层包围，核心是由中性脂质填充(主要是三酰甘油TAG和甾醇酯SE)，其表面由不同的蛋白修饰，在一定程度上具有储存疏水性物质的能力。
通过代谢工程异源合成三萜疏水性物质使得细胞内浓度过高时，产物及其中间体都可能具有毒性作用。脂滴具有储存暂时多余的疏水物质的能力，角鲨烯、甾醇酯都可以隔离在LDs中，以避免对膜完整性的破坏作用。如果三萜类物质溶解在TAG为基质形成的LDs中，其积累将受到其溶解度的限制。
发明内容
本发明提供了构建重组酿酒酵母的方法，包括对出发酿酒酵母进行改造，得到重组酿酒酵母，所述改造包括如下C1-C3：
C1、导入甘油-3-磷酸脱氢酶基因GPD1基因；C2、导入二酰基甘油酰基转移酶基因DGA1基因；C3、导入磷脂酸磷酸水解酶基因PAH1基因。
可选地，根据上述的方法，所述改造还包括C4：C4、抑制或降低所述出发酿酒酵母的SEI1基因表达。
抑制或降低SEI1基因表达可通过基因敲除或基因沉默实现。所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
可选地，根据上述的方法，所述出发酿酒酵母为对菌株BYT1进行如下A1-A13改造得到的菌株，
A1、导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1基因；A2、导入甲羟戊酸激酶基因ERG12基因；A3、导入乙醇脱氢酶I基因IDI1基因；A4、导入焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因ERG19基因；A5、导入羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因HMGR基因；A6、导入羟甲基戊二酰-辅酶A合成酶基因ERG13基因；A7、导入磷酸甲戊酸激酶基因ERG8基因；A8、导入乙酰辅酶A乙酰转移酶基因ERG10基因；A9、导入角鲨烯合酶基因AtSQS2基因；A10、导入角鲨烯单加氧酶基因ERG1基因；A11、导入法尼基焦磷酸合成酶基因SmFPS基因；A12、导入达玛烯二醇合酶基因spgDDS基因；A13、导入重组融合蛋白的编码基因，所述重组融合蛋白含有Pln1蛋白、原人参二醇合酶PPDS01和细胞色素P450还原酶ATR1。
可选地，根据上述的方法，所述GPD1基因编码的GPD1蛋白质的序列为genbank登陆号：NC_001136.10序列所示；和/或，所述DGA1基因编码的DGA1蛋白质的序列为genbank登陆号：NC_001147.6序列所示；和/或，所述PAH1基因编码的PAH1蛋白质的序列为genbank登陆号：NC_001145.3序列所示；和/或，所述tHMG1基因编码的tHMG1蛋白质的序列为genbank登陆号：AJS96703.1序列的第530-1054位所示；和/或，所述ERG12基因编码的ERG12蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013935.1序列所示；和/或，所述IDI1基因编码的IDI1蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_015208.1序列所示；和/或，所述ERG19基因编码的ERG19蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_014441.1序列所示；和/或，所述HMGR基因编码的HMGR蛋白质的序列为genbank登陆号：WP_011241944.1序列所示；和/或，所述ERG13基因编码的ERG13蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013580.1序列所示；和/或，所述ERG8基因编码的ERG8蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013947.1序列所示；和/或，所述ERG10基因编码的ERG10蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_015297.1序列所示；和/或，所述AtSQS2基因编码的AtSQS2蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_195190.1序列所示；和/或，所述ERG1基因编码的ERG1蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_011691.1序列所示；和/或，所述SmFPS基因编码的SmFPS蛋白质的序列为genbank登陆号：ABV08819.1序列所示；和/或，所述spgDDS基因编码的spgDDS蛋白质的序列为genbank登陆号：ACZ71036.1所示；和/或，所述Pln1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第1位-第283位所示；和/或，所述PPDS01的氨基酸序列如SEQ IDNo.2中第288位-第773位所示；和/或，所述ATR1可为N端截短46个氨基酸的细胞色素P450还原酶46tATR1，其氨基酸序列如SEQ ID No.2中第780位-第1425位所示。具体地，所述重组融合蛋白的氨基酸序列可如SEQIDNo.2中的所示。在SEQ ID No.2中，第1位-第283位为Pln1蛋白的氨基酸序列，第284位-第287位为连接肽GGGS的氨基酸序列，第288位-第773位为PPDS01的氨基酸序列，第774位-第779位为连接肽GSTSSG的氨基酸序列，第780位-第1425位ATR1的氨基酸序列。
可选地，根据上述的方法，所述GPD1基因的序列如SEQ ID No.15中第758位-第1933位所示；和/或，所述DGA1基因的序列如SEQ ID No.16中第808位-第2064位所示；和/或，所述PAH1基因的序列如SEQ ID No.17中第438位-第3027位所示；和/或，所述tHMG1基因的序列如SEQ ID No.3中第757位-第2340位所示；和/或，所述ERG12基因的序列如SEQ IDNo.4中第801位-第2132位所示；和/或，所述IDI1基因的序列如SEQ ID No.5中第1001位-第1867位所示；和/或，所述ERG19基因的序列如SEQ ID No.6中第1001位-第2191位所示；和/或，所述HMGR基因的序列如SEQ ID No.7中第563位-第1864位所示；和/或，所述ERG13基因的序列如SEQ ID No.8中第823位-第2298位所示；和/或，所述ERG8基因的序列如SEQ IDNo.9中第801位-第2156位所示；和/或，所述ERG10基因的序列如SEQ ID No.10中第431位-第1627位所示；和/或，所述AtSQS2基因的序列如SEQ ID No.11中第751位-第1983位所示；和/或，所述ERG1基因的序列如SEQ ID No.12中第801位-第2291位所示；和/或，所述SmFPS基因的序列如SEQ ID No.13中第431位-第1480位所示；和/或，所述spgDDS基因的序列如SEQ ID No.14中第431位-2740位所示；和/或，Pln1蛋白的编码基因的序列如SEQ ID No.1中第431位-第1279位所示；和/或，蛋白PPDS01的编码基因为第1292位-第2749位；和/或，蛋白46tATR1的编码基因为第2768位-第4708位。
可选地，根据上述的方法，所述C1通过向所述出发酿酒酵母中导入GPD1基因表达盒实现；所述C2通过向所述出发酿酒酵母中导入DAG1基因表达盒实现；所述C3通过向所述出发酿酒酵母中导入PAH1基因表达盒实现；所述C4通过CRISPR/CAS9系统敲除所述出发酿酒酵母中的SEI1基因实现；所述A1通过向所述菌株BYT1中导入tHMG1基因表达盒实现；所述A2通过向所述菌株BYT1中导入ERG12基因表达盒实现；所述A3通过向所述菌株BYT1中导入IDI1基因表达盒实现；所述A4通过向所述菌株BYT1中导入ERG19基因表达盒实现；所述A5通过向所述菌株BYT1中导入HMGR基因表达盒实现；所述A6通过向所述菌株BYT1中导入ERG13基因表达盒实现；所述A7通过向所述菌株BYT1中导入ERG8基因表达盒实现；所述A8通过向所述菌株BYT1中导入ERG10基因表达盒实现；所述A9通过向所述菌株BYT1中导入AtSQS2基因表达盒实现；所述A10通过向所述菌株BYT1中导入ERG1基因表达盒实现；所述A11通过向所述菌株BYT1中导入SmFPS基因表达盒实现；所述A12通过向所述菌株BYT1中导入spgDDS基因表达盒实现；所述A13通过向所述菌株BYT1中导入重组融合蛋白的编码基因表达盒实现。
可选地，根据上述的方法，GPD1基因表达盒序列如SEQ ID No.15所示；DAG1基因表达盒如SEQ ID No.16所示；PAH1基因表达盒如SEQ ID No.17所示；tHMG1基因表达盒如SEQID No.3所示；ERG12基因表达盒序列如SEQ ID No.4所示；IDI1基因表达盒序列如SEQ IDNo.5所示；ERG19基因表达盒序列如SEQ ID No.6所示；HMGR基因表达盒序列如SEQ ID No.7所示；表达ERG13基因表达盒序列如SEQ ID No.8所示；ERG8基因表达盒序列如SEQ ID No.9所示；ERG10基因表达盒序列如SEQ ID No.10所示；AtSQS2基因表达盒序列如SEQ ID No.11所示；ERG1基因表达盒序列如SEQ ID No.12所示；SmFPS基因表达盒序列如SEQ D No.13所示。所述重组融合蛋白的编码基因表达盒序列可如SEQ ID No.1所示，其中启动子PTEF1为第1-430位，Pln1蛋白的编码基因为第431-1279位，连接肽GGGS的编码基因为第1280-1291位，蛋白PPDS01的编码基因为第1292-2749位，连接肽GSTSSG的编码基因为第2750-2767位，蛋白46tATR1的编码基因为第2768-4708位，终止子TCYC1为第4709-5015位。
通过CRISPR/CAS9系统敲除所述出发酿酒酵母中的SEI1基因具体可为将CAS9基因、gRNA基因和SEI1基因敲除片段导入所述出发酿酒酵母菌，并使CAS9基因和gRNA基因表达。所述gRNA基因编码的gRNA片段靶向SEl1基因，该靶序列例如可为CCGCTATTGGGTGCTCCTGG。SEI1基因敲除片段例如可为SEQ ID No.18所示。
可选地，根据上述的方法，所述重组酿酒酵母中，GPD1基因、DGA1基因和PAH1基因整合入所述出发酿酒酵母的Gal80位点；AtSQS2基因、ERG1基因和SmFPS基因整合入所述出发酿酒酵母的NDT80位点；tHMG1基因、ERG12基因、IDI1基因、ERG19基因、HMGR基因、ERG13基因、ERG8基因和ERG10基因整合入所述出发酿酒酵母的LEU点；所述重组融合蛋白的编码基因整合入所述出发酿酒酵母的YPL062W位点；所述spgDDS基因通过导入所述出发酿酒酵母中的表达质粒表达。
采用上述的方法构建的重组酿酒酵母也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了生产萜的方法，包括培养上述重组酿酒酵母，得到发酵产物；从所述发酵产物中得到萜。
本发明还提供了如下任一一种应用：
X1、上述的方法在制备生产萜产品中的应用；X2、上述的方法在生产萜中的应用；X3、上述的重组酿酒酵母在制备生产萜产品中的应用；X4、上述的重组酿酒酵母在生产萜中的应用。
上文中，所述萜可为原人参二醇；所述生产萜产品可为表达萜的重组菌。
在酿酒酵母细胞中，本发明通过对二酰基甘油酰基转移酶(DGA1)基因、甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1)基因以及磷脂酸磷酸水解酶(PAH1)基因的过表达来增加TAG的含量，从而提高酿酒酵母中脂滴的含量约20％，相关疏水性物质含量也将得到一定的提升；同样对一个与酵母脂滴生物组装过程中Seipin家族的一个基因SEI1进行删除，使酿酒酵母内部形成巨大化的脂滴，提升酿酒酵母细胞容纳更多脂溶性物质的能力。本发明通过对脂滴的形态和/或数量的关键基因进行调控，使酿酒酵母对脂溶性物质(例如，三萜类物质)的存储能力得到增强，一方面缓解产物及其中间体的脂毒性给酿酒酵母带来的胁迫，另一方面提高酿酒酵母储存及承载过量脂溶性物质的能力。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值表示，采用One-wayANOVA检验。
下述实施例所使用的酿酒酵母BY4742(Saccharomyces cerevisiae BY4742)，记载于Zhubo Dai et al.，Producing aglycons of ginsenosides in bakers’yeast.SciRep.2014Jan 15；4∶3698.。
下述实施例所涉及的基因片段以及蛋白质序列相关信息参见下表。
基因片段的相关信息
蛋白质序列的相关信息
实施例1
一、基因原件的克隆
1、PCR扩增获取基因片段
以酿酒酵母BY4742的基因组DNA为模板，分别采用表1中引物，扩增得到完整ORF的Pln1基因、DGA1基因、GPD1基因、PAH1基因和N端截短了46个氨基酸的ATR1基因(46tATR1)。
以含有pgPPDS基因的质粒pM13-pgPPDS(记载于文献：Dai ZB et al.，Metabolicengineering of Saccharomyces cerevisiae for production ofginsenosides.Metabolic Engineering.2013，20：145-156中，公众可从天津工业生物技术研究所所获得)为模板，采用表1中引物，扩增得到原人参二醇合酶基因PPDS01。
扩增体系如下：GXL DNA Polymerase PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物各1.5μl，DNA模板1μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50ul。
扩增条件如下：95℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火15秒、68℃延伸3分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经胶回收保存。
2、融合PCR获取融合片段
(1)将与46tATR1基因含有20bp同源区域的PPDS01基因做融合PCR，引物如表1所示。
融合PCR体系如下：PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物SexA1-PPDS01-F和Asc1-46tATR1-R各1.5μl，DNA模板为片段46tATR1和片段PPDS01各1.5μl，PrimeSTAR GXL DNAPolymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl。
扩增条件如下：95℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火15秒、68℃延伸3分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。获得融合基因片段14bp-PPDS01-GSTSSG-46tATR1，该片段经胶回收处理。
(2)将与Plnl基因含有14bp同源区域的14bp-PPDS01-GSTSSG-46tATR1基因做融合PCR，引物如表1所示。
融合PCR体系如下：PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物Pac1-Pln1-F和Asc1-46tATR1-R各1.5μl，DNA模板为片段Pln1和片段14bp-PPDS01-GSTSSG-46tATR1各1.5μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl。
扩增条件如下：95℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火15秒、68℃延伸3分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。获得融合基因片段Pln1-GGGS-PPDS01-GSTSSG-46tATR1。
3、SEI1敲除片段的获取
以酿酒酵母BY4742的基因组DNA为模板，分别采用表1中引物，扩增得到敲除片段ΔSEI1。
扩增体系如下： GXL DNA Polymerase PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物各1.5μl，DNA模板1μl，PrimeSTARGXLDNAPolymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl。
扩增条件如下：95℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火15秒、68℃延伸1分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经胶回收保存。
表1引物序列
二、重组质粒的构建
1、pM13-Plnl-GGGS-PPDS01-GSTSSG-46tATR1
用限制性内切酶PacI和AscI分别双酶切质粒pM13-pgPPDS(记载于文献：Dai ZBet a1.，2013，Metabolic Engineering 20：145-156中，公众可从天津工业生物技术研究所所获得)和基因片段Pln1-GGGS-PPDS01-GSTSSG-46tATR1，割胶回收目的片段：pEASY-Blunt-PTEF1-//-TCYC1(50ng)和pac1-Pln1-GGGS-PPDS01-GSTSSG-46tATR1-Asc1(4278bp，104ng)，将目的片段与载体进行连接，连接体系如下：5μl 2×Quick Ligation Buffer(NEB公司)、0.5μl Quick T4 DNA Ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/m1)，补充ddH2O至10μl，25℃反应13min，得到连接产物，转入Transl T1感受态细胞并进行测序验证，得到重组载体。经过测序，该重组载体为将Pln1-GGGS-PPDS01-GSTSSG-46tATR1基因的表达盒PTEF1-Pln1-GGGS-PPDS01-GSTSSG-46tATR1-TCYC1插入pEASY-Blunt Simple克隆载体(pEASY克隆载体，北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司)的克隆位点间得到的载体，并将其命名为pM13-Pln1-GGGS-PPDS01-GSTSSG-46tATR1。
2、pM2-GPD1
用限制性内切酶SexAI和AscI分别双酶切质粒pM2-tHMG1(记载在中国专利申请201210453416.X中)和片段GPD1，割胶回收获得线性载体和目的片段：pEASY-Blunt-PPGK1-//-TADH1(22ng)和GPD1(1176bp，123ng)，将目的片段进行连接，连接体系如下：5μl 2×Quick Ligation Buffer(NEB公司)、0.5μl Quick T4 DNA Ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充ddH2O至10μl，25℃反应13min，得到连接产物，转入Trans1 T1感受态细胞并进行测序验证，得到重组载体。经过测序，该重组载体为将GPD1基因的表达盒PPGK1-GPD1-TADH1插入pEASY-Blunt Simple克隆载体(pEASY克隆载体，北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司)的克隆位点间得到的载体，并将其命名为pM2-GPD1。
3、pM4-DGA1
用限制性内切酶SexAI和AscI分别双酶切质粒pM4-CYP15(记载在中国专利申请201610236283.9中)和片段DGA1，割胶回收获得线性载体和目的片段：pEASY-Blunt-PTDH3-//-TTPI1(43ng)和DGA1(1257bp，78ng)，将目的片段进行连接，连接体系如下：5μl 2×Quick Ligation Buffer(NEB公司)、0.5μl Quick T4 DNA Ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充ddH2O至10μl，25℃反应13min，得到连接产物，转入Trans1 T1感受态细胞并进行测序验证，得到重组载体。经过测序，该重组载体为将DGA1基因的表达盒PTDH3-DGA1-TTPI1插入pEASY-Blunt Simple克隆载体(pEASY克隆载体，北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司)的克隆位点间得到的载体，并将其命名为pM4-DGAl。
4、pM13-PAH1
用限制性内切酶PacI和AscI分别双酶切质粒pM13-pgPPDS(记载于文献：Dai ZBet al.，2013，Metabolic Engineering 20：145-156中，公众可从天津工业生物技术研究所所获得)和片段PAH1，割胶回收获得线性载体和目的片段：pEASY-Blunt-PTEF1-//-TCYC1(64ng)和PAH1(2589bp，118ng)，将目的片段进行连接，连接体系如下：5μl 2×QuickLigation Buffer(NEB公司)、0.5μl Quick T4 DNA Ligase(NEB公司，400,000cohesiveend units/ml)，补充ddH2O至10μl，25℃反应13min，得到连接产物，转入Trans1 T1感受态细胞并进行测序验证，得到重组载体。经过测序，该重组载体为将DGA1基因的表达盒PTEF1-PAH1-TCYC1插入pEASY-Blunt Simple克隆载体(pEASY克隆载体，北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司)的克隆位点间得到的载体，并将其命名为pM13-PAH1。
5、Leu gRNA、NDT80 gRNA、YPL062W gRNA、ΔSEI gRNA和Gal80 gRNA
以购自addgene公司的p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t质粒为模板，分别用以下引物进行扩增：gRNA反向/Leu gRNA正向、gRNA反向/NDT80 gRNA正向、gRNA反向/YPL062WgRNA正向、gRNA反向/ΔSEI gRNA正向、gRNA反向/Ga180 gRNA正向。
gRNA反向：GATCATTTATCTTTCACTGC
Leu gRNA正向：
cgcagtgaaagataaatgatcCGATGGTGATGGTGTCGCTTgttttagagctagaaatagcaag
NDT80 gRNA正向：
cgcagtgaaagataaatgatcCTGCTTCAGGTGCGGCTTGGgttttagagctagaaatagcaag
YPL062W gRNA正向：
cgcagtgaaagataaatgatcGCACGTCGCCGTGGCTGATGgttttagagctagaaatagcaag
ΔSEI gRNA正向：
cgcagtgaaagataaatgatcCCGCTATTGGGTGCTCCTGGgttttagagctagaaatagcaag
Ga180 gRNA正向：
cgcagtgaaagataaatgatcAGATTGCTGGAAATGGCGGTgttttagagctagaaatagcaag
扩增分别获得五个线性片段Linearized Leu gRNA、Linearized NDT80 gRNA、Linearized YPL062W gRNA、LinearizedΔSEI gRNA和Linearized Ga180 gRNA，将该五个片段分别转入Trans1 T1感受态细胞并进行测序验证，得到重组质粒Leu gRNA、NDT80gRNA、YPL062W gRNA、ΔSEI gRNA和Gal80 gRNA。
6、pM7-HMGR的质粒构建
以酿酒酵母BY4742的基因组DNA为模板，采用引物Pac1-TEF2-F和SexA1-TEF2-R扩增获得启动子pTEF2(562bp)，采用引物Asc1-ENO2-F和Pmel-ENO2-R扩增获得终止子tENO2(400bp)。扩增体系如下：PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)×10μl，dNTPMix×4μl，引物Pac1-TEF2-F和SexA1-TEF2-R(Asc1-ENO2-F和Pme1-ENO2-R)各1.5μl，基因组DNA模板为1.5μl，PrimeSTAR GXL DNAPolymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl。
Pac1-TEF2-F：5’-GCTTAATTAAATGGGGCCGTATACTTACATATAGTAGA-3’
SexA1-TEF2-R：5’-GCACCAGGTGTTTAGTTAATTATAGTTCGTTGACCGTATATTCTAAAAAC-3’
Asc1-ENO2-F：5’-GCGGCGCGCCAGTGCTTTTAACTAAGAATTATTAGTCTTTTCTGCT-3’
Pme1-ENO2-R：5’-GCGTTTAAACAGGTATCATCTCCATCTCCCATATGC-3’
用限制性内切酶SexAI和AscI分别双酶切质粒pUC57-synHMGR(该基因的全合成委托金斯瑞生物科技有限公司对synHMGR基因进行全合成，并将其插入pUC57载体(金斯瑞生物科技有限公司提供)的克隆位点间，得到含synHMGR基因的克隆型质粒pUC57-synHMGR)，割胶回收目的片段获得片段SexAI-synHMGR-AscI；用限制性内切酶SexAI和pacI分别双酶切片段pTEF2，割胶回收目的片段获得SexAI-pTEF2-pacI；用限制性内切酶Asc1和Pme1分别双酶切片段tENO2，割胶回收目的片段获得Asc1-tENO2-Pme1，将三个片段各50ng加入连接体系：2ul 10XT4 ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4 ligase(NEB公司，400,000cohesiveend units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物，取1ul连接产物加入，PCR体系：PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物Pac1-TEF2-F和Pme1-ENO2-R各1.5μl，连接产物为1μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl，得到表达盒PTEF2-HMGR-TENO2。将表达盒克隆到pEASY-Blunt Simple克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)，得到重组载体pM7-HMGR，测序，该载体中为将HMGR的表达盒PTEF2-MMGR-TENo2插入pEASY-Blunt Simple的克隆位点间得到的载体。
上述制备的重组质粒pM13-Plnl-GGGS-PPDS01-GSTSSG-46tATR1、pM2-GPD1、pM4-DGA1、pM13-PAH1、pM7-HMGR、Leu gRNA、NDT80 gRNA、YPL062W gRNA、ΔSEI gRNA和Ga180gRNA相关信息参见表2。
表2质粒信息
三、重组菌的构建
(一)、YSBYT5菌株的构建
1、基因模块的构建
分别用表2描述的质粒为PCR模板(pδ-tHMG1、pM9-ERG12、pM16-IDI1、pM5-ERG19、pM8-ERG13、pM11-ERG8、pM3-ERG10记载于文献：创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇.中国中药杂志，林庭庭，王冬，戴住波，张学礼，黄璐琦，2016，41(6)：1008-1015中)和表3的相应引物进行PCR扩增，分别获得功能模块片段：M1(包含PPGK1-tHMG1-TADH1表达盒)、M2(包含PPDCl-ERG12-TADH2表达盒)、M3(包含PENO2-IDI1-T-PDC1表达盒)、M4(包含PPYK1-ERG19-TPGI1表达盒)、M5(包含PTEF2-HMGR-N-TENO2表达盒)、M6(包含PFBA1-ERG13-TTDH2表达盒)和M7(包含PTDH3-ERG8-TTPI1表达盒)、M8(包含PTEF1-ERG10-TcYC1表达盒)。
扩增体系如下： GXL DNA Polymerase PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物各1.5μl，DNA模板1μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50ul。
扩增条件如下：95℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火15秒、68℃延伸3分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经胶回收保存。
表3模板、引物及其序列
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2、酵母感受态的制备
隔夜培养新鲜酵母菌液BYT1(来源于实验室保存菌株，记载于Zhubo Dai et al.，Producing aglycons of ginsenosides in bakers’yeast.Sci Rep.2014Jan 15；4：3698.)(预先转入购自addgene公司的p414-PTEF1-Cas9-TCYC1质粒)制做感受态(1％接种量，30ul种子液接3ml SD-Trp液体培养基中(0.8％全合成四缺培养基(购自北京泛基诺科技有限公司)+2％葡萄糖+0.005％His+0.01％Ura+0.01％Leu))。
操作步骤如下：
①收集菌体：取1ml酵母菌液分装到1.5mlEP管。12000rpm离心1min，弃上清，用枪吸净。沉淀用1ml无菌水洗涤，吹打离心，弃上清，洗涤两次。
②菌体处理：加入1ml处理液(处理液的配制：1M山梨醇+10mM LiAc+10mM Tris-HCl(pH 7.5))(4℃冰箱保存)+10ul DTT(购自北京兰博利德商贸有限公司，货号：1758-9030-25g)(-20℃冰箱保存)，25℃金属加热20min。
③20min后离心，弃上清，用枪吸尽，加入1ml预冷的1M sob(D-山梨醇，购自北京索莱宝科技有限公司)(4℃冰箱)，吹打，离心，弃上清。用1M sob再次洗涤二次，吸弃上清，再加入50ul Sob悬浮。
④加入2μl M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7和M8模块及2μl Leu gRNA质粒吹打混匀后转入预冷的电转杯，冰浴5min。
⑤将电转杯水擦净，2.7kv电击。加入先吸好的1ml sob放入电转杯，混匀后吸入新的1.5mlEP管。30℃、250rpm摇床培养60min。
⑥60min后，菌液离心去部分上清混匀涂在营养缺陷SD-UraTrp(0.8％全合成四缺培养基+2％葡萄糖+0.005％His+0.01％Leu+2％Ager)的平板上，30℃培养箱培养36h。
经过大约两天的培养箱培养，挑取单克隆进行PCR菌落验证，获得酵母工程菌YSBYT5，丢弃Leu gRNA质粒后，进行下一步遗传改造。
酵母工程菌YSBYT5的构建原理具体为菌株BYT1中预先转入可以表达Cas9蛋白的重组质粒p414-PTEF1-Cas9-TCYC1，而后，表达gRNA的重组质粒(Leu gRNA)与重组片段(M1-M8)一同转化进菌株中，Leu gRNA识别并结合Leu位点特定PAM区，同时激活并指导Cas9蛋白行使剪切功能，使Leu位点的双链DNA断裂开，此时含有同源区的重组片段M1-M8通过同源重组修复被整合进入菌株DNA中。
PCR菌落验证验证方法具体如下：
利用酵母基因组DNA提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司，货号：DP307-02)提取酵母菌株YSBYT5的基因组。以提取的基因组为模板，用SacII-PGK1/Asc1-tHMG1-R进行PCR扩增，得到2400bp左右的片段，说明含有M1；Pac-pPDC1/Asc1-Erg12-R进行PCR扩增，得到2200bp左右的片段，说明含有M2；pac-pENO2/IDI1-Ascl-R进行PCR扩增，得到2200bp左右的片段，说明含有M3；Pac-PYK1p/Asc1-Erg19-R进行PCR扩增，得到2200bp左右的片段，说明含有M4；pac1-pTEF2/Asc1-HMGR-N-R进行PCR扩增，得到1900bp左右的片段，说明含有M5；pFBA1-YZ-F/Asc1-Erg13-R进行PCR扩增，得到2300bp左右的片段，说明含有M6；Pac-pTDH3/Ascl-Erg8-R进行PCR扩增，得到2200bp左右的片段，说明含有M7；SacII-pTEF1/Asc1-Erg10-R进行PCR扩增，得到1700bp左右的片段，说明含有M8。上述引物具体如表4所示。
表4菌落验证引物及其序列
引物名字 序列(5′-3′)
SacII-PGK1 GCGCCGCGGACGCACAGATATTATAACATC
Asc1-tHMG1-R GGCGCGCCTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGA
Pac-pPDC1 GCGTTAATTAACATGCGACTGGGTGAGCATATGTTC
Ascl-Erg12-R GGCGCGCCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGT
Pac-pENO2 GCGTTAATTAAAATCCTACTCTTGCCGTTGCCATCC
IDI1-Asc1-R GCGGCGCGCCTTATAGCATTCTATGAATTTGCCTGTCATTTT
Pac-PYK1p GCGTTAATTAAAATGCTACTATTTTGGAGATTAATC
Asc1-Erg19-R GGCGCGCCTTATTCCTTTGGTAGACCAGTCTT
pac-pTEF2 GCTTAATTAAATGGGGCCGTATACTTACATATAGTAGA
Asc1-HMGR-N-R GGCGCGCCTTATGTGTTTTCCAAAACTTGCT
pFBA1-YZ-F TGGCTTGAACAACAATACCAGCC
Asc1-Erg13-R GGCGCGCCTTATTTTTTAACATCGTAAGATCTTCTAAA
Pac-pTDH3 GCGTTAATTAAATACTAGCGTTGAATGTTAGCGTCA
Asc1-Erg8-R GGCGCGCCTTATTTATCAAGATAAGTTTCCGGATCTIT
SacII-pTEF1 GCGCCGCGGAGTGATCCCCCACACACCATAGCTT
Asc1-Erg10-R GGCGCGCCTCATATCTTTTCAATGACAATAGAGGAAGCAC
SmFPS-Asc1 GCGGCGCGCCTTATTTCTGCCTCTTGTATATCTTGCC
AtSQS2-Asc1 GCGGCGCGCCTCAGTTTGCTCTGAGATATGCAAAGAC
ERG1-Asc1 GCGGCGCGCCTTAACCAATCAACTCACCAAACAAAAATGG
spgDDS-Ascl-R GCGGCGCGCCTCATATCTTTAATTGTTGATGCTTAGGTAACCAAAC
yp1062w-up-256 GGAATTATTCGTAACGTCATACGA
PPDS01-EGGPP-R GTTGTGTGGGTGTAAGTGGATAG
ATR1-Ce1805-F TAAGGGCATGGCGAGGGAC
yp1062w-down-249 GTGTAGCTTAGTCATTGTATTCTGAT
Gal80-up-250 GCGCAAGTTITCCGCTTIGTAATATATATT
pTDH3-YZ-F ACAAGAAGTTTAATGACGCGGAG
Gal80-down-250 CGCTGCTGCAAAGTTTTGACAG
SEI-QC-YZ-up GACAGAAAAATAGAGACAGCTTAC
(二)YSBYT30菌株的构建
1、基因模块的构建
分别用表2描述的质粒为PCR模板(pM3-smFPS和pM2-AtSQs2记载于文献：王冬，刘怡，许骄阳，王金鹤，戴住波，张学礼，黄璐琦.创建酿酒酵母细胞工厂高效生产人参皂苷前体达玛烯二醇II[J].药学学报，2018，53(08)：1233-1241中，pM11-ERG1记载在中国专利申请201210453416.X中，公众可从天津工业生物技术研究所获得)和相应引物进行PCR扩增，分别获得功能模块：M9(包含PPGK1-AtSQS2-TADH1表达盒)、M10(包含PTDH3-ERG1-TTPI1表达盒)、M11(包含PTEF1-SmFPS-TCYC1表达盒)。
扩增体系如下： GXL DNA Polymerase PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物各1.5μl，DNA模板1μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μ1)1μl，补加ddH2O至总体积50μl。
扩增条件如下：95℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火15秒、68℃延伸3分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经胶回收保存。
2、酵母感受态的制备
隔夜培养新鲜酵母菌液YSBYT5制做感受态(1％接种量，30ul种子液接3m1培养基)，操作步骤如下：
①收集菌体：取1ml酵母菌液分装到1.5mlEP管。12000rpm离心1min，弃上清，用枪吸净。沉淀用1ml无菌水洗涤，吹打离心，弃上清，洗涤两次。
②菌体处理：加入1ml处理液(4℃冰箱保存)+10ul DTT(-20℃冰箱保存)，25℃金属加热20min。
③20min后离心，弃上清，用枪吸尽，加入1ml预冷的1M sob(4℃冰箱)，吹打，离心，弃上清。用1M sob再次洗涤二次，吸弃上清，再加入50ul Sob悬浮。
④加入2μl M9、M10和M11模块及2μl NDT80 gRNA质粒吹打混匀后转入预冷的电转杯，冰浴5min。
⑤将电转杯水擦净，2.7kv电击。加入先吸好的1ml sob放入电转杯，混匀后吸入新的1.5mlEP管。30℃、250rpm摇床培养60min。
⑥60min后，菌液离心去部分上清混匀涂在营养缺陷Sd-UraTrp(0.8％全合成四缺培养基+2％葡萄糖+0.005％His+0.01％Leu+2％Ager)的平板上，30℃培养箱培养36h。
经过大约两天的培养箱培养，挑取单克隆进行PCR菌落验证，获得酵母工程菌YSBYT30，丢弃NDT80 gRNA质粒，进行下一步遗传改造
酵母工程菌YSBYT30构建原理具体为菌株YSBYT5中有可以表达Cas9蛋白的重组质粒p414-PTEF1-Cas9-TCYC1，表达NDT80 gRNA的重组质粒(NDT80 gRNA)与重组片段(M9-M11)一同转化进菌株YSBYT5中，gRNA识别并结合NDT80位点特定PAM区，同时激活并指导Cas9蛋白行使剪切功能，使NDT80位点的双链DNA断裂开，此时含有同源区的重组片段M9-M11通过同源重组修复被整合进入酵母DNA中。
PCR菌落验证方法具体如下：
利用酵母基因组DNA提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司，货号：DP307-02)提取酵母菌株YSBYT30的基因组。以提取的基因组为模板，用SacII-pTEF1/SmFPS-Asc1进行PCR扩增，得到1500bp左右的片段，说明含有M11；用SacII-PGK1/AtSQS2-Ascl进行PCR扩增，得到2000bp左右的片段，说明含有M9；用Pac-pTDH3/ERG1-Asc1进行PCR扩增，得到2300bp左右的片段，说明含有M10。引物序列见表4。
(三)T30-DD菌株的构建
1、酵母感受态的制备
隔夜培养新鲜酵母菌液YSBYT30制做感受态(1％接种量，30u1种子液接3ml培养基)，操作步骤如下：
①收集菌体：取1ml酵母菌液分装到1.5mlEP管。12000rpm离心1min，弃上清，用枪吸净。沉淀用1ml无菌水洗涤，吹打离心，弃上清，洗涤两次。
②菌体处理：加入1ml处理液(4℃冰箱保存)+10ul DTT(-20℃冰箱保存)，25℃金属加热20min。
③20min后离心，弃上清，用枪吸尽，加入1ml预冷的1M sob(4℃冰箱)，吹打，离心，弃上清。用1M sob再次洗涤二次，吸弃上清，再加入50ul Sob悬浮。
④加入2μl pRS425-SpgDDS质粒(记载于文献：王冬，刘怡，许骄阳，王金鹤，戴住波，张学礼，黄璐琦.创建酿酒酵母细胞工厂高效生产人参皂苷前体达玛烯二醇II[J].药学学报，2018，53(08)：1233-1241中，文献中该质粒记载为pRS425-DDS)吹打混匀后转入预冷的电转杯，冰浴5min。
⑤将电转杯水擦净，2.7kv电击。加入先吸好的1ml sob放入电转杯，混匀后吸入新的1.5mlEP管。30℃、250rpm摇床培养60min。
⑥60min后，菌液离心去部分上清混匀涂在营养缺陷SD-TrpLeu(0.8％全合成四缺培养基+2％葡萄糖+0.005％His+0.01％Ura+2％Ager)的平板上，30℃培养箱培养36h。
经过大约两天的培养箱培养，挑取单克隆进行PCR菌落验证，获得酵母工程菌T30-DD，进行下一步遗传改造。
PCR菌落验证方法具体包括利用酵母基因组DNA提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司，货号：DP307-02)提取酵母菌株T30-DD的DNA。以提取的DNA为模板，用引物SacII-pTEF1/spgDDS-Asc1-R对菌株进行PCR验证，得到2800bp左右的片段，说明成功转入pRS425-SpgDDS质粒。引物序列见表4。
(四)LPTA菌株的构建
1、基因模块的构建
分别用表2质粒信息描述的质粒为PCR模板和表3的相应引物进行PCR扩增，分别获得功能模块：M12(包含PTEF1-Pln1-GGGS-PPDS01-GSTSSG-46tATR1-TCYC1表达盒)。
扩增体系如下： GXL DNA Polymerase PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix4μl，引物各1.5μl，DNA模板1μl，PrimeSTARGXLDNAPolymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50ul。
扩增条件如下：95℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火15秒、68℃延伸4分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经胶回收保存。
2、酵母感受态的制备
隔夜培养新鲜酵母菌液T30-DD制做感受态(1％接种量，30u1种子液接3ml培养基)，操作步骤如下：
①收集菌体：取1ml酵母菌液分装到1.5mlEP管。12000rpm离心1min，弃上清，用枪吸净。沉淀用1ml无菌水洗涤，吹打离心，弃上清，洗涤两次。
②菌体处理：加入1ml处理液(4℃冰箱保存)+10ul DTT(-20℃冰箱保存)，25℃金属加热20min。
③20min后离心，弃上清，用枪吸尽，加入1ml预冷的1M sob(4℃冰箱)，吹打，离心，弃上清。用1M sob再次洗涤二次，吸弃上清，再加入50ul Sob悬浮。
④加入2μl M12模块及2μl YPL062W gRNA质粒吹打混匀后转入预冷的电转杯，冰浴5min。
⑤将电转杯水擦净，2.7kv电击。加入先吸好的1ml sob放入电转杯，混匀后吸入新的1.5mlEP管。30℃、250rpm摇床培养60min。
⑥60min后，菌液离心去部分上清混匀涂在营养缺陷SD-UraTrpLeu(0.8％全合成四缺培养基+2％葡萄糖+0.005％His+2％Ager)的平板上，30℃培养箱培养36h。经过大约两天的培养箱培养，挑取单克隆进行PCR菌落验证，获得酵母工程菌LPTA。丢弃YPL062W gRNA质粒，进行下一步遗传改造
LPTA菌株的验证：
利用酵母基因组DNA提取试剂盒提取酵母菌株LPTA的基因组。以提取的基因组为模板，用引物ypl062w-up-256/PPDS01-EGPP-R进行PCR验证，得到3000bp左右的片段，用引物ATR1-Ce1805-F/yp1062w-down-249对菌株进行PCR验证，得到1000bp左右的片段，说明成功转入M12(PTEF1-Plnl-GGGS-PPDS01-GSTSSG-46tATR1-TCYC1)片段。引物序列具体参见表4。
(五)LPTA-M菌株的构建
1、基因模块的构建
分别用表2描述的质粒为PCR模板和表3相应描述的引物进行PCR扩增，分别获得功能模块：M13(包含PPGK1-GPD1-TCYC1表达盒)和M14(包含PTDH3-DGA1-TTPI1表达盒及M15(包含PTEF1-PAH1-TCYC1表达盒)。
扩增体系如下： GXL DNA Polymerase PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物各1.5μl，DNA模板1μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl。
扩增条件如下：95℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火15秒、68℃延伸3分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经胶回收保存。
2、酵母感受态的制备
隔夜培养新鲜酵母菌液LPTA制做感受态(1％接种量，30ul种子液接3ml培养基)，操作步骤如下：
①收集菌体：取1ml酵母菌液分装到1.5mlEP管。12000rpm离心1min，弃上清，用枪吸净。沉淀用1ml无菌水洗涤，吹打离心，弃上清，洗涤两次。
②菌体处理：加入1ml处理液(4℃冰箱保存)+10ul DTT(-20℃冰箱保存)，25℃金属加热20min。
③20min后离心，弃上清，用枪吸尽，加入1ml预冷的1M sob(4℃冰箱)，吹打，离心，弃上清。用1M sob再次洗涤二次，吸弃上清，再加入50ul Sob悬浮。
④在细胞悬浮液中加入M13、M14和M15模块各2μl及2μl Gal80 gRNA，吹打混匀后转入预冷的电转杯，冰浴5min。
⑤将电转杯水擦净，2.7kv电击。加入先吸好的1ml sob放入电转杯，混匀后吸入新的1.5mlEP管。30℃、250rpm摇床培养60min。
⑥60min后，菌液离心去部分上清混匀涂在营养缺陷的平板上SD-UraTrpLeu(购自北京泛基诺科技有限公司)，30℃培养箱培养36h。
经过大约两天的培养箱培养，挑取单克隆进行PCR菌落验证，获得酵母工程菌LPTA-M菌株。丢弃Gal80 gRNA质粒，进行下一步遗传改造
利用酵母基因组DNA提取试剂盒提取酵母菌株LPTA-M的基因组。以提取的基因组为模板，用引物Gal80-up-250/Asc1-GPD1-R进行PCR验证，得到2200bp左右的片段，用引物pTDH3-YZ-F/Asc1-DGA1-R对菌株进行PCR验证，得到2100bp左右的片段，用引物pac1-PAH1-F/Gal80-down-250对菌株进行PCR验证，得到3100bp左右的片段，说明成功转入M13-M15。引物序列具体参见表4。
(六)LPTA-MB菌株的构建
1、酵母感受态的制备
隔夜培养新鲜酵母菌液LPTA-M制做感受态(1％接种量，30ul种子液接3ml培养基)，操作步骤如下：
①收集菌体：取1ml酵母菌液分装到1.5mlEP管。12000rpm离心1min，弃上清，用枪吸净。沉淀用1ml无菌水洗涤，吹打离心，弃上清，洗涤两次。
②菌体处理：加入1ml处理液(4℃冰箱保存)+10ul DTT(-20℃冰箱保存)，25℃金属加热20min。
③20min后离心，弃上清，用枪吸尽，加入1ml预冷的1M sob(4℃冰箱)，吹打，离心，弃上清。用1M sob再次洗涤二次，吸弃上清，再加入50ul Sob悬浮。
④在细胞悬浮液中加入2μl敲除片段ΔSEI1及2μl SEI1 gRNA吹打混匀后转入预冷的电转杯，冰浴5min。
⑤将电转杯水擦净，2.7kv电击。加入先吸好的1ml sob放入电转杯，混匀后吸入新的1.5mlEP管。30℃、250rpm摇床培养60min。
⑥60min后，菌液离心去部分上清混匀涂在营养缺陷的平板上(SD-UraTrpLeu)，30℃培养箱培养36h。
经过大约两天的培养箱培养，挑取单克隆进行PCR菌落验证，获得酵母工程菌LPTA-MB菌株。
利用酵母基因组DNA提取试剂盒提取酵母菌株LPTA-MB的基因组。以提取的基因组为模板，用引物SEI-QC-YZ-up/SEI1-QC-down-R进行PCR验证，得到487bp左右的片段，说明成功敲除SEI1基因。引物序列具体参见表4。
上述制备的菌株YSBYT5、YSBYT30、T30-DD、LPTA、LPTA-M、LPTA-MB相关信息参见表5。
表5工程菌株信息
实施例2、提升酵母脂滴含量以提高原人参二醇合酶(PPDs)催化能力
1、摇瓶发酵
①工程菌LPTA和LPTA-M培养
在相应固体选择培养基SD-UraTrpLeu中活化酵母工程菌株LPTA和LPTA-M，每个基因型工程菌株转接一个单克隆，于相应液体选择培养基SD-UraTrpLeu中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1％的接种量接种于含15ml相应液体选择培养基的100ml三角瓶中，每个单克隆平行转接三组，30℃，250rpm振荡培养6天。
②工程菌LPTA和LPTA-M产物提取
摇瓶发酵后6天的菌液，吸取2ml菌液，12000rpm离心1min，弃上清，用枪吸净。沉淀用ddH2O清洗两次后转移至破碎管中，12000rpm离心1min，弃上清液；向沉淀中加入玻璃珠(直径0.5mm)和1ml萃取液(萃取液由甲醇和丙酮组成，甲醇与丙酮的体积比为1∶1)，震荡破碎5min，2次，超声破碎30min；12000rpm离心2min，弃沉淀，将上清液过0.22μm有机滤膜至液相瓶中得到溶液，分别命名为LPTA溶液和LPTA-M溶液。
2、HPLC定性定量分析
①HPLC定性分析
标准品为原人参二醇PPD、达码烯二醇DD，均购买于上海源叶生物科技有限公司。样品为LPTA溶液和LPTA-M溶液。
仪器：安捷伦高效液相色谱1260
HPLC检测条件：DAD监测器，监测波长203nm，Waters 色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相A为10％甲醇，流动相B为乙腈，等度洗脱20min，10％A+90％B
②HPLC定量分析
各工程菌发酵6天时产量如下：
通过HPLC检测结果表明LPTA工程菌的PPD产量19.30mg/L/OD，DD的产量为3.03mg/L/OD，疏水性产物DD和PPD的总产量(或者说积累量)为22.33mg/L/OD；相应的LPTA-M工程菌的PPD产量为19.45mg/L/OD，DD的产量为3.86mg/L/OD，疏水性产物DD和PPD的总产量(或者说积累量)为23.31mg/L/OD，总积累量提升了4.39％。该实施例说明在工程菌中更多的脂滴数量提供更多的存储介质，从而同时提高了工程菌中DD和PPD的总产量。
实施例3、扩大酵母脂滴大小以提高酿酒酵母储存原人参二醇(PPD)及其前体达码烯二醇(DD)的能力
1、摇瓶发酵
①工程菌LPTA-M和LPTA-MB培养
在相应固体选择培养基SD-UraTrpLeu中活化酵母工程菌株LPTA-M和LPTA-MB，每个基因型工程菌株转接一个单克隆，于相应液体选择培养基SD-UraTrpLeu中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1％的接种量接种于含15ml相应液体选择培养基的100ml三角瓶中，每个单克隆平行转接三组，30℃，250rpm振荡培养6天。
②工程菌LPTA-M和LPTA-MB产物提取
摇瓶发酵后6天的菌液，吸取2ml菌液，12000rpm离心1min，弃上清，用枪吸净。沉淀用ddH2O清洗两次后转移至破碎管中，12000rpm离心1min，弃上清液；向沉淀中加入玻璃珠(直径0.5mm)和1ml萃取液(萃取液由甲醇和丙酮组成，甲醇与丙酮的体积比为1∶1)，震荡破碎5min，2次，超声破碎30min；12000rpm离心2min，弃沉淀，将上清液过0.22μm有机滤膜至液相瓶中得到溶液，分别命名为LPTA-M溶液和LPTA-MB溶液。
2、HPLC定性定量分析
①HPLC定性分析
标准品为原人参二醇PPD、达码烯二醇DD，均购买于上海源叶生物科技有限公司。样品为LPTA-M溶液和LPTA-MB溶液。
仪器：安捷伦高效液相色谱1260
HPLC检测条件：DAD监测器，监测波长203nm，Waters 色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相A为10％甲醇，流动相B为乙腈，等度洗脱20min，10％A+90％B
②HPLC定量分析
各工程菌发酵6天时产量如下：
通过HPLC检测结果表明LPTA-M工程菌的PPD产量19.45mg/L/OD，DD的产量为3.86mg/L/OD，疏水性产物DD和PPD的总产量(或者说积累量)为23.31mg/L/OD；相应的LPTA-MB工程菌的PPD产量为17.17mg/L/OD，DD的产量为11.35mg/L/OD，疏水性产物DD和PPD的总产量(或者说积累量)为28.52mg/L/OD，总积累量提升了22.35％。该实施例说明敲除SEI1基因使酿酒酵母产生更大的脂滴，进而细胞对脂溶性物质的承载能力大大提升，虽然PPD产量稍许降低，但PPD和DD的总产量显著提升。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 重组酿酒酵母及其构建方法和应用
<130> 210859
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5015
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat 60
tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat 120
ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa 180
aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg 240
tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga tttttttctc tttcgatgac ctcccattga 300
tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta 360
ttacaacttt ttttacttct tgctcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt 420
taattacaaa atgtctgaat catctatttc ttcttctaaa ccatctgtgg aattgccaca 480
agcaacctgg tcgcatctgc aaagataccc agctttatcc aagtttatta aatatgcgga 540
atctctgcca cctgtggaga gattgatttc cttcaacctc gttgttttgg gatctgtgaa 600
ccagtgggtt tccgaatcgt ccagctctcc tcgtctggtg aagcaagttg ttgctgctgg 660
gaaggaaggg gccttcaagt tggacgagtt agttaacctc ttggtgttca aggagggtgt 720
cgacggcttg ctgtacaatt ggaaatcaca ttccaacacg ccagggatct ggctggtgtg 780
gttcttcgtc gactacgtcg ccaacatttc taatactctg ttgagggagt tcctgatcaa 840
gccattgcac ttgcaaggtt ctaccgcatc gaaggagatc ggctcttccg gtgaggagaa 900
caaggtcact gatgcttctt ctttgcccca cgtggcagag ttgtcttcaa cgaccagagg 960
tatgtcgcag gagatccagt ccaaggtcaa gtcgaactat atcgacccaa ccaaggacct 1020
ggctaaagaa aagtacgacg ccatagtgaa gcccacaact gacaagttgc agtctgtgta 1080
catcgaccca acaaagacta agcttaacga aacctaccaa cgcttcacca ctgtctatga 1140
aaacaatcta agtaaatctg aaagcgtccc taaagccatt gtatccaccg ggttggactt 1200
gggcaatgcc accattgaga agctaaaggc ctcaagagaa gaccaaacca attctaagcc 1260
cgcggctgtg tcgaccaatg gtggtggttc tatggcagcc gctatggttt tgttcttttc 1320
attgtcctta ttgttgttac ctttgttatt gttgtttgct tatttctctt acactaaaag 1380
aataccacaa aaagaaaatg attccaaggc tcctttacct ccaggtcaaa ccggttggcc 1440
attgatcggt gaaactttga actatttgtc atgtgttaag tccggtgtca gtgaaaactt 1500
cgtaaagtac agaaaggaaa agtactctcc aaaggttttc agaacttcat tgttaggtga 1560
accaatggcc attttatgcg gtcctgaagg taataagttc ttgtactcta cagaaaagaa 1620
attggtacaa gtttggtttc catcttcagt tgaaaagatg ttccctagat ctcatggtga 1680
atcaaacgca gataacttct ctaaagttag aggtaaaatg atgttcttgt taaaggtcga 1740
tggtatgaaa aagtatgtag gtttgatgga cagagttatg aagcaattct tggaaacaga 1800
ttggaacaga caacaacaaa ttaatgtaca caacaccgtt aaaaagtaca ccgtcactat 1860
gtcctgtaga gtattcatga gtatagatga cgaagaacaa gttaccagat tgggttccag 1920
tattcaaaac atagaagctg gtttgttagc agtcccaatc aatattcctg gtacagccat 1980
gaacagagct atcaaaacag taaagttgtt aaccagagaa gtcgaagccg taattaaaca 2040
aagaaaggtt gacttgttgg aaaataagca agcatctcaa ccacaagatt tgttgagtca 2100
tttgttgttg actgctaacc aagatggtca atttttatct gaatcagaca tcgcatcaca 2160
cttaattggt ttgatgcaag gtggttacac tacattgaac ggtacaatca ccttcgtctt 2220
gaactatttg gcagaattcc ctgacgtcta caatcaagta ttgaaggaac aagttgaaat 2280
cgccaactct aagcatccaa aggaattgtt gaactgggaa gatttgagaa agatgaagta 2340
ctcatggaac gttgctcaag aagtcttgag aattatacct ccaggtgttg gtacttttag 2400
agaagcaatt accgatttca cttatgccgg ttacttaatt cctaaaggtt ggaagatgca 2460
cttgatacca catgacactc acaagaatcc tacatacttc ccatctcctg aaaagttcga 2520
tcctactaga ttcgagggta acggtccagc tccttatact tttacaccat tcggtggtgg 2580
tccaagaatg tgccctggta tcgaatacgc aagattagtt atattgatct ttatgcataa 2640
tgttgtcaca aacttcagat gggaaaaatt gatcccaaac gaaaagatct tgactgaccc 2700
tatcccaaga ttcgcccacg gtttacctat ccacttacac ccacacaacg gttctacttc 2760
ttcaggttgg aagaaaacga cggcggatcg gagcggggag ctgaagcctt tgatgatccc 2820
taagtctctt atggctaagg acgaggatga tgatttggat ttgggatccg ggaagactag 2880
agtctctatc ttcttcggta cgcagactgg aacagctgag ggatttgcta aggcattatc 2940
cgaagaaatc aaagcgagat atgaaaaagc agcagtcaaa gtcattgact tggatgacta 3000
tgctgccgat gatgaccagt atgaagagaa attgaagaag gaaactttgg catttttctg 3060
tgttgctact tatggagatg gagagcctac tgacaatgct gccagatttt acaaatggtt 3120
tacggaggaa aatgaacggg atataaagct tcaacaacta gcatatggtg tgtttgctct 3180
tggtaatcgc caatatgaac attttaataa gatcgggata gttcttgatg aagagttatg 3240
taagaaaggt gcaaagcgtc ttattgaagt cggtctagga gatgatgatc agagcattga 3300
ggatgatttt aatgcctgga aagaatcact atggtctgag ctagacaagc tcctcaaaga 3360
cgaggatgat aaaagtgtgg caactcctta tacagctgtt attcctgaat accgggtggt 3420
gactcatgat cctcggttta caactcaaaa atcaatggaa tcaaatgtgg ccaatggaaa 3480
tactactatt gacattcatc atccctgcag agttgatgtt gctgtgcaga aggagcttca 3540
cacacatgaa tctgatcggt cttgcattca tctcgagttc gacatatcca ggacgggtat 3600
tacatatgaa acaggtgacc atgtaggtgt atatgctgaa aatcatgttg aaatagttga 3660
agaagctgga aaattgcttg gccactcttt agatttagta ttttccatac atgctgacaa 3720
ggaagatggc tccccattgg aaagcgcagt gccgcctcct ttccctggtc catgcacact 3780
tgggactggt ttggcaagat acgcagacct tttgaaccct cctcgaaagt ctgcgttagt 3840
tgccttggcg gcctatgcca ctgaaccaag tgaagccgag aaacttaagc acctgacatc 3900
acctgatgga aaggatgagt actcacaatg gattgttgca agtcagagaa gtcttttaga 3960
ggtgatggct gcttttccat ctgcaaaacc cccactaggt gtattttttg ctgcaatagc 4020
tcctcgtcta caacctcgtt actactccat ctcatcctcg ccaagattgg cgccaagtag 4080
agttcatgtt acatccgcac tagtatatgg tccaactcct actggtagaa tccacaaggg 4140
tgtgtgttct acgtggatga agaatgcagt tcctgcggag aaaagtcatg aatgtagtgg 4200
agccccaatc tttattcgag catctaattt caagttacca tccaaccctt caactccaat 4260
cgttatggtg ggacctggga ctgggctggc accttttaga ggttttctgc aggaaaggat 4320
ggcactaaaa gaagatggag aagaactagg ttcatctttg ctcttctttg ggtgtagaaa 4380
tcgacagatg gactttatat acgaggatga gctcaataat tttgttgatc aaggcgtaat 4440
atctgagctc atcatggcat tctcccgtga aggagctcag aaggagtatg ttcaacataa 4500
gatgatggag aaggcagcac aagtttggga tctaataaag gaagaaggat atctctatgt 4560
atgcggtgat gctaagggca tggcgaggga cgtccaccga actctacaca ccattgttca 4620
ggagcaggaa ggtgtgagtt cgtcagaggc agaggctata gttaagaaac ttcaaaccga 4680
aggaagatac ctcagagatg tctggtgacc gctgatccta gagggccgca tcatgtaatt 4740
agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg 4800
agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag 4860
aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa 4920
cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcaa 4980
gctgcggccc tgcattaatg aatcggccaa cgcgc 5181
<210> 2
<211> 1425
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Glu Ser Ser Ile Ser Ser Ser Lys Pro Ser Val Glu Leu Pro
1 5 10 15
Gln Ala Thr Trp Ser His Leu Gln Arg Tyr Pro Ala Leu Ser Lys Phe
20 25 30
Ile Lys Tyr Ala Glu Ser Leu Pro Pro Val Glu Arg Leu Ile Ser Phe
35 40 45
Asn Leu Val Val Leu Gly Ser Val Asn Gln Trp Val Ser Glu Ser Ser
50 55 60
Ser Ser Pro Arg Leu Val Lys Gln Val Val Ala Ala Gly Lys Glu Gly
65 70 75 80
Ala Phe Lys Leu Asp Glu Leu Val Asn Leu Leu Val Phe Lys Glu Gly
85 90 95
Val Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Trp Lys Ser His Ser Asn Thr Pro Gly
100 105 110
Ile Trp Leu Val Trp Phe Phe Val Asp Tyr Val Ala Asn Ile Ser Asn
115 120 125
Thr Leu Leu Arg Glu Phe Leu Ile Lys Pro Leu His Leu Gln Gly Ser
130 135 140
Thr Ala Ser Lys Glu Ile Gly Ser Ser Gly Glu Glu Asn Lys Val Thr
145 150 155 160
Asp Ala Ser Ser Leu Pro His Val Ala Glu Leu Ser Ser Thr Thr Arg
165 170 175
Gly Met Ser Gln Glu Ile Gln Ser Lys Val Lys Ser Asn Tyr Ile Asp
180 185 190
Pro Thr Lys Asp Leu Ala Lys Glu Lys Tyr Asp Ala Ile Val Lys Pro
195 200 205
Thr Thr Asp Lys Leu Gln Ser Val Tyr Ile Asp Pro Thr Lys Thr Lys
210 215 220
Leu Asn Glu Thr Tyr Gln Arg Phe Thr Thr Val Tyr Glu Asn Asn Leu
225 230 235 240
Ser Lys Ser Glu Ser Val Pro Lys Ala Ile Val Ser Thr Gly Leu Asp
245 250 255
Leu Gly Asn Ala Thr Ile Glu Lys Leu Lys Ala Ser Arg Glu Asp Gln
260 265 270
Thr Asn Ser Lys Pro Ala Ala Val Ser Thr Asn Gly Gly Gly Ser Met
275 280 285
Ala Ala Ala Met Val Leu Phe Phe Ser Leu Ser Leu Leu Leu Leu Pro
290 295 300
Leu Leu Leu Leu Phe Ala Tyr Phe Ser Tyr Thr Lys Arg Ile Pro Gln
305 310 315 320
Lys Glu Asn Asp Ser Lys Ala Pro Leu Pro Pro Gly Gln Thr Gly Trp
325 330 335
Pro Leu Ile Gly Glu Thr Leu Asn Tyr Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly
340 345 350
Val Ser Glu Asn Phe Val Lys Tyr Arg Lys Glu Lys Tyr Ser Pro Lys
355 360 365
Val Phe Arg Thr Ser Leu Leu Gly Glu Pro Met Ala Ile Leu Cys Gly
370 375 380
Pro Glu Gly Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Thr Glu Lys Lys Leu Val Gln
385 390 395 400
Val Trp Phe Pro Ser Ser Val Glu Lys Met Phe Pro Arg Ser His Gly
405 410 415
Glu Ser Asn Ala Asp Asn Phe Ser Lys Val Arg Gly Lys Met Met Phe
420 425 430
Leu Leu Lys Val Asp Gly Met Lys Lys Tyr Val Gly Leu Met Asp Arg
435 440 445
Val Met Lys Gln Phe Leu Glu Thr Asp Trp Asn Arg Gln Gln Gln Ile
450 455 460
Asn Val His Asn Thr Val Lys Lys Tyr Thr Val Thr Met Ser Cys Arg
465 470 475 480
Val Phe Met Ser Ile Asp Asp Glu Glu Gln Val Thr Arg Leu Gly Ser
485 490 495
Ser Ile Gln Asn Ile Glu Ala Gly Leu Leu Ala Val Pro Ile Asn Ile
500 505 510
Pro Gly Thr Ala Met Asn Arg Ala Ile Lys Thr Val Lys Leu Leu Thr
515 520 525
Arg Glu Val Glu Ala Val Ile Lys Gln Arg Lys Val Asp Leu Leu Glu
530 535 540
Asn Lys Gln Ala Ser Gln Pro Gln Asp Leu Leu Ser His Leu Leu Leu
545 550 555 560
Thr Ala Asn Gln Asp Gly Gln Phe Leu Ser Glu Ser Asp Ile Ala Ser
565 570 575
His Leu Ile Gly Leu Met Gln Gly Gly Tyr Thr Thr Leu Asn Gly Thr
580 585 590
Ile Thr Phe Val Leu Asn Tyr Leu Ala Glu Phe Pro Asp Val Tyr Asn
595 600 605
Gln Val Leu Lys Glu Gln Val Glu Ile Ala Asn Ser Lys His Pro Lys
610 615 620
Glu Leu Leu Asn Trp Glu Asp Leu Arg Lys Met Lys Tyr Ser Trp Asn
625 630 635 640
Val Ala Gln Glu Val Leu Arg Ile Ile Pro Pro Gly Val Gly Thr Phe
645 650 655
Arg Glu Ala Ile Thr Asp Phe Thr Tyr Ala Gly Tyr Leu Ile Pro Lys
660 665 670
Gly Trp Lys Met His Leu Ile Pro His Asp Thr His Lys Asn Pro Thr
675 680 685
Tyr Phe Pro Ser Pro Glu Lys Phe Asp Pro Thr Arg Phe Glu Gly Asn
690 695 700
Gly Pro Ala Pro Tyr Thr Phe Thr Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg Met
705 710 715 720
Cys Pro Gly Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Val Ile Leu Ile Phe Met His
725 730 735
Asn Val Val Thr Asn Phe Arg Trp Glu Lys Leu Ile Pro Asn Glu Lys
740 745 750
Ile Leu Thr Asp Pro Ile Pro Arg Phe Ala His Gly Leu Pro Ile His
755 760 765
Leu His Pro His Asn Gly Ser Thr Ser Ser Gly Trp Lys Lys Thr Thr
770 775 780
Ala Asp Arg Ser Gly Glu Leu Lys Pro Leu Met Ile Pro Lys Ser Leu
785 790 795 800
Met Ala Lys Asp Glu Asp Asp Asp Leu Asp Leu Gly Ser Gly Lys Thr
805 810 815
Arg Val Ser Ile Phe Phe Gly Thr Gln Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe
820 825 830
Ala Lys Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Lys Ala Ala
835 840 845
Val Lys Val Ile Asp Leu Asp Asp Tyr Ala Ala Asp Asp Asp Gln Tyr
850 855 860
Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Thr Leu Ala Phe Phe Cys Val Ala Thr
865 870 875 880
Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp
885 890 895
Phe Thr Glu Glu Asn Glu Arg Asp Ile Lys Leu Gln Gln Leu Ala Tyr
900 905 910
Gly Val Phe Ala Leu Gly Asn Arg Gln Tyr Glu His Phe Asn Lys Ile
915 920 925
Gly Ile Val Leu Asp Glu Glu Leu Cys Lys Lys Gly Ala Lys Arg Leu
930 935 940
Ile Glu Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp Gln Ser Ile Glu Asp Asp Phe
945 950 955 960
Asn Ala Trp Lys Glu Ser Leu Trp Ser Glu Leu Asp Lys Leu Leu Lys
965 970 975
Asp Glu Asp Asp Lys Ser Val Ala Thr Pro Tyr Thr Ala Val Ile Pro
980 985 990
Glu Tyr Arg Val Val Thr His Asp Pro Arg Phe Thr Thr Gln Lys Ser
995 1000 1005
Met Glu Ser Asn Val Ala Asn Gly Asn Thr Thr Ile Asp Ile His His
1010 1015 1020
Pro Cys Arg Val Asp Val Ala Val Gln Lys Glu Leu His Thr His Glu
1025 1030 1035 1040
Ser Asp Arg Ser Cys Ile His Leu Glu Phe Asp Ile Ser Arg Thr Gly
1045 1050 1055
Ile Thr Tyr Glu Thr Gly Asp His Val Gly Val Tyr Ala Glu Asn His
1060 1065 1070
Val Glu Ile Val Glu Glu Ala Gly Lys Leu Leu Gly His Ser Leu Asp
1075 1080 1085
Leu Val Phe Ser Ile His Ala Asp Lys Glu Asp Gly Ser Pro Leu Glu
1090 1095 1100
Ser Ala Val Pro Pro Pro Phe Pro Gly Pro Cys Thr Leu Gly Thr Gly
1105 1110 1115 1120
Leu Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Asn Pro Pro Arg Lys Ser Ala Leu
1125 1130 1135
Val Ala Leu Ala Ala Tyr Ala Thr Glu Pro Ser Glu Ala Glu Lys Leu
1140 1145 1150
Lys His Leu Thr Ser Pro Asp Gly Lys Asp Glu Tyr Ser Gln Trp Ile
1155 1160 1165
Val Ala Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val Met Ala Ala Phe Pro Ser
1170 1175 1180
Ala Lys Pro Pro Leu Gly Val Phe Phe Ala Ala Ile Ala Pro Arg Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Leu Ala Pro Ser
1205 1210 1215
Arg Val His Val Thr Ser Ala Leu Val Tyr Gly Pro Thr Pro Thr Gly
1220 1225 1230
Arg Ile His Lys Gly Val Cys Ser Thr Trp Met Lys Asn Ala Val Pro
1235 1240 1245
Ala Glu Lys Ser His Glu Cys Ser Gly Ala Pro Ile Phe Ile Arg Ala
1250 1255 1260
Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asn Pro Ser Thr Pro Ile Val Met Val
1265 1270 1275 1280
Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly Phe Leu Gln Glu Arg
1285 1290 1295
Met Ala Leu Lys Glu Asp Gly Glu Glu Leu Gly Ser Ser Leu Leu Phe
1300 1305 1310
Phe Gly Cys Arg Asn Arg Gln Met Asp Phe Ile Tyr Glu Asp Glu Leu
1315 1320 1325
Asn Asn Phe Val Asp Gln Gly Val Ile Ser Glu Leu Ile Met Ala Phe
1330 1335 1340
Ser Arg Glu Gly Ala Gln Lys Glu Tyr Val Gln His Lys Met Met Glu
1345 1350 1355 1360
Lys Ala Ala Gln Val Trp Asp Leu Ile Lys Glu Glu Gly Tyr Leu Tyr
1365 1370 1375
Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala Arg Asp Val His Arg Thr Leu
1380 1385 1390
His Thr Ile Val Gln Glu Gln Glu Gly Val Ser Ser Ser Glu Ala Glu
1395 1400 1405
Ala Ile Val Lys Lys Leu Gln Thr Glu Gly Arg Tyr Leu Arg Asp Val
1410 1415 1420
Trp
1425
<210> 3
<211> 2498
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc gtgagtaagg 60
aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc gcgaatcctt 120
tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt ttccctcctt 180
cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga aattaccgtc 240
gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc tcgacttcct 300
gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag cgacggctca 360
caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt agtaccacat 420
gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg ttactctctc 480
tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca cacactcttt 540
tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac atttacatat 600
atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt tctaattcgt 660
agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc aaggaagtaa 720
ttatctactt tttacaacaa atataaaaca aaaacaatgg ctgcagacca attggtgaaa 780
actgaagtca ccaagaagtc ttttactgct cctgtacaaa aggcttctac accagtttta 840
accaataaaa cagtcatttc tggatcgaaa gtcaaaagtt tatcatctgc gcaatcgagc 900
tcatcaggac cttcatcatc tagtgaggaa gatgattccc gcgatattga aagcttggat 960
aagaaaatac gtcctttaga agaattagaa gcattattaa gtagtggaaa tacaaaacaa 1020
ttgaagaaca aagaggtcgc tgccttggtt attcacggta agttaccttt gtacgctttg 1080
gagaaaaaat taggtgatac tacgagagcg gttgcggtac gtaggaaggc tctttcaatt 1140
ttggcagaag ctcctgtatt agcatctgat cgtttaccat ataaaaatta tgactacgac 1200
cgcgtatttg gcgcttgttg tgaaaatgtt ataggttaca tgcctttgcc cgttggtgtt 1260
ataggcccct tggttatcga tggtacatct tatcatatac caatggcaac tacagagggt 1320
tgtttggtag cttctgccat gcgtggctgt aaggcaatca atgctggcgg tggtgcaaca 1380
actgttttaa ctaaggatgg tatgacaaga ggcccagtag tccgtttccc aactttgaaa 1440
agatctggtg cctgtaagat atggttagac tcagaagagg gacaaaacgc aattaaaaaa 1500
gcttttaact ctacatcaag atttgcacgt ctgcaacata ttcaaacttg tctagcagga 1560
gatttactct tcatgagatt tagaacaact actggtgacg caatgggtat gaatatgatt 1620
tctaaaggtg tcgaatactc attaaagcaa atggtagaag agtatggctg ggaagatatg 1680
gaggttgtct ccgtttctgg taactactgt accgacaaaa aaccagctgc catcaactgg 1740
atcgaaggtc gtggtaagag tgtcgtcgca gaagctacta ttcctggtga tgttgtcaga 1800
aaagtgttaa aaagtgatgt ttccgcattg gttgagttga acattgctaa gaatttggtt 1860
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gctgttttct tggcattagg acaagatcct gcacaaaatg ttgaaagttc caactgtata 1980
acattgatga aagaagtgga cggtgatttg agaatttccg tatccatgcc atccatcgaa 2040
gtaggtacca tcggtggtgg tactgttcta gaaccacaag gtgccatgtt ggacttatta 2100
ggtgtaagag gcccgcatgc taccgctcct ggtaccaacg cacgtcaatt agcaagaata 2160
gttgcctgtg ccgtcttggc aggtgaatta tccttatgtg ctgccctagc agccggccat 2220
ttggttcaaa gtcatatgac ccacaacagg aaacctgctg aaccaacaaa acctaacaat 2280
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agttataaaa aaaataagtg tatacaaatt ttaaagtgac tcttaggttt taaaacgaaa 2400
attcttattc ttgagtaact ctttcctgta ggtcaggttg ctttctcagg tatagcatga 2460
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<210> 4
<211> 2532
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catgcgactg ggtgagcata tgttccgctg atgtgatgtg caagataaac aagcaaggca 60
gaaactaact tcttcttcat gtaataaaca caccccgcgt ttatttacct atctctaaac 120
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ttatgtatgc tcttctgact tttcgtgtga tgaggctcgt ggaaaaaatg aataatttat 360
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cgttcaacac caccttattt tctaactatt ttttttttag ctcatttgaa tcagcttatg 600
gtgatggcac atttttgcat aaacctagct gtcctcgttg aacataggaa aaaaaaatat 660
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aactcgttag tcttttggat ccgttgttag ctcaactatc cgaatccttc cactaccatg 1140
cagcgttttg tttcctgtat atgtttgttt gcctatgccc ccatgccaag aatattaagt 1200
tttctttaaa gtctacttta cccatcggtg ctgggttggg ctcaagcgcc tctatttctg 1260
tatcactggc cttagctatg gcctacttgg gggggttaat aggatctaat gacttggaaa 1320
agctgtcaga aaacgataag catatagtga atcaatgggc cttcataggt gaaaagtgta 1380
ttcacggtac cccttcagga atagataacg ctgtggccac ttatggtaat gccctgctat 1440
ttgaaaaaga ctcacataat ggaacaataa acacaaacaa ttttaagttc ttagatgatt 1500
tcccagccat tccaatgatc ctaacctata ctagaattcc aaggtctaca aaagatcttg 1560
ttgctcgcgt tcgtgtgttg gtcaccgaga aatttcctga agttatgaag ccaattctag 1620
atgccatggg tgaatgtgcc ctacaaggct tagagatcat gactaagtta agtaaatgta 1680
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tgataagaat aaatcatgga ctgcttgtct caatcggtgt ttctcatcct ggattagaac 1800
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tcaaaaagaa attgcaagat gattttagtt acgagacatt tgaaacagac ttgggtggga 1980
ctggctgctg tttgttaagc gcaaaaaatt tgaataaaga tcttaaaatc aaatccctag 2040
tattccaatt atttgaaaat aaaactacca caaagcaaca aattgacgat ctattattgc 2100
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agttttcatt atcaagtatg cctatattag tatatagcat ctttagatga cagtgttcga 2220
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<212> DNA
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<400> 10
agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat 60
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ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa 180
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<210> 11
<211> 2141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<210> 12
<211> 2693
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat 60
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tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga tttttttctc tttcgatgac ctcccattga 300
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc gtgagtaagg 60
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taccatccac acggcatagg agcacttggt gcgtttggag cgtttgcaac agaaggttgt 1440
aactattcca agattttccc aggtattcct atttctctga tgacactggt cacacaattt 1500
catatcccat tgtatagaga ctacttattg gcgttaggta tttcttcagt atctcggaaa 1560
aacgctttaa ggactctaag caaaaatcag tcgatctgca ttgttgttgg tggcgctagg 1620
gaatctttat taagttcaac aaatggtaca caactgattt taaacaaaag aaagggtttt 1680
attaaactgg ccattcaaac ggggaatatt aacctagtgc ctgtgtttgc atttggagag 1740
gtggactgtt ataatgttct gagcacaaaa aaagattcag tcctgggtaa aatgcaacta 1800
tggttcaaag aaaactttgg ttttaccatt cccattttct acgcaagagg attattcaat 1860
tacgatttcg gtttgttgcc atttagagcg cctatcaatg ttgttgttgg aaggcctata 1920
tacgttgaaa agaaaataac aaatccgcca gatgatgttg ttaatcattt ccatgatttg 1980
tatattgcgg agttgaaaag actatattac gaaaatagag aaaaatatgg ggtaccggat 2040
gcagaattga agatagttgg gtaaggcgcg ccgattaata taattatata aaaatattat 2100
cttcttttct ttatatctag tgttatgtaa aataaattga tgactacgga aagctttttt 2160
atattgtttc tttttcattc tgagccactt aaatttcgtg aatgttcttg taagggacgg 2220
tagatttaca agtgatacaa caaaaagcaa ggcgcttttt ctaataaaaa gaagaaaagc 2280
atttaacaat tgaacacctc tatatcaacg aagaatatta ctttgtctct aaatccttgt 2340
aaaatgtgta cgatctctat atgggttact cataagtgta ccgaagactg cattgaaagt 2400
ttatgttttt tcactggagg cgtcattttc gcgttgagaa gatgttctta tccaaatttc 2460
aactgttata taga 2474
<210> 17
<211> 3342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat 60
tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat 120
ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa 180
aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg 240
tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga tttttttctc tttcgatgac ctcccattga 300
tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta 360
ttacaacttt ttttacttct tgctcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt 420
taattacaaa ttaattaaat gcagtacgta ggcagagctc ttgggtctgt gtctaaaaca 480
tggtcttcta tcaatccggc tacgctatca ggtgctatag atgtcattgt agtggagcat 540
ccagacggaa ggctatcatg ttctcccttt catgtgaggt tcggcaaatt tcaaattcta 600
aagccatctc aaaagaaagt ccaagtgttt ataaatgaga aactgagtaa tatgccaatg 660
aaactgagtg attctggaga agcctatttc gttttcgaga tgggtgacca ggtcactgat 720
gtccctgacg aattgcttgt gtcgcccgtg atgagcgcca catcaagccc ccctcaatca 780
cctgaaacat ccatcttaga aggaggaacc gagggtgaag gtgaaggtga aaatgaaaat 840
aagaagaagg aaaagaaagt gctagaggaa ccagattttt tagatatcaa tgacactgga 900
gattcaggca gtaaaaatag tgaaactaca gggtcgcttt ctcctactga atcctctaca 960
acgacaccac cagattcagt tgaagagagg aagcttgttg agcagcgtac aaagaacttt 1020
cagcaaaaac taaacaaaaa actcactgaa atccatatac ccagtaaact tgataacaat 1080
ggcgacttac tactagacac tgaaggttac aagccaaaca agaatatgat gcatgacaca 1140
gacatacaac tgaagcagtt gttaaaggac gaattcggta atgattcaga tatttccagt 1200
tttatcaagg aggacaaaaa tggcaacatc aagatcgtaa atccttacga gcaccttact 1260
gatttatctc ctccaggtac gcctccaaca atggccacaa gcggatcagt tttaggctta 1320
gatgcaatgg aatcaggaag tactttgaat tcgttatctt cttcaccttc tggttccgat 1380
actgaggacg aaacatcatt tagcaaagaa caaagcagta aaagtgaaaa aactagcaag 1440
aaaggaacag cagggagcgg tgagaccgag aaaagataca tacgaacgat aagattgact 1500
aatgaccagt taaagtgcct aaatttaact tatggtgaaa atgatctgaa attttccgta 1560
gatcacggaa aagctattgt tacgtcaaaa ttattcgttt ggaggtggga tgttccaatt 1620
gttatcagtg atattgatgg caccatcaca aaatcggacg ctttaggcca tgttctggca 1680
atgataggaa aagactggac gcacttgggt gtagccaagt tatttagcga gatctccagg 1740
aatggctata atatactcta tctaactgca agaagtgctg gacaagctga ttccacgagg 1800
agttatttgc gatcaattga acagaatggc agcaaactac caaatgggcc tgtgatttta 1860
tcacccgata gaacgatggc tgcgttaagg cgggaagtaa tactaaaaaa acctgaagtc 1920
tttaaaatcg cgtgtctaaa cgacataaga tccttgtatt ttgaagacag tgataacgaa 1980
gtggatacag aggaaaaatc aacaccattt tttgccggct ttggtaatag gattactgat 2040
gctttatctt acagaactgt ggggatacct agttcaagaa ttttcacaat aaatacagag 2100
ggtgaggttc atatggaatt attggagtta gcaggttaca gaagctccta tattcatatc 2160
aatgagcttg tcgatcattt ctttccacca gtcagccttg atagtgtcga tctaagaact 2220
aatacttcca tggttcctgg ctccccccct aatagaacgt tggataactt tgactcagaa 2280
attacttcag gtcgcaaaac gctatttaga ggcaatcagg aagagaaatt cacagacgta 2340
aatttttgga gagacccgtt agtcgacatc gacaacttat cggatattag caatgatgat 2400
tctgataaca tcgatgaaga tactgacgta tcacaacaaa gcaacattag tagaaatagg 2460
gcaaattcag tcaaaaccgc caaggtcact aaagccccgc aaagaaatgt gagcggcagc 2520
acaaataaca acgaagtttt agccgcttcg tctgatgtag aaaatgcgtc tgacctggtg 2580
agttcccata gtagctcagg atccacgccc aataaatcta caatgtccaa aggggacatt 2640
ggaaaacaaa tatatttgga gctaggttct ccacttgcat cgccaaaact aagatattta 2700
gacgatatgg atgatgaaga ctccaattac aatagaacta aatcaaggag agcatcttct 2760
gcagccgcga ctagtatcga taaagagttc aaaaagctct ctgtgtcaaa ggccggcgct 2820
ccaacaagaa ttgtttcaaa gatcaacgtt tcaaatgacg tacattcact tgggaattca 2880
gataccgaat cacgaaggga gcaaagtgtt aatgaaacag ggcgcaatca gctaccccac 2940
aactcaatgg acgataaaga tttggattca agagtaagcg atgaattcga tgacgatgaa 3000
ttcgacgaag atgaattcga agattaaggc gcgccccgct gatcctagag ggccgcatca 3060
tgtaattagt tatgtcacgc ttacattcac gccctccccc cacatccgct ctaaccgaaa 3120
aggaaggagt tagacaacct gaagtctagg tccctattta tttttttata gttatgttag 3180
tattaagaac gttatttata tttcaaattt ttcttttttt tctgtacaga cgcgtgtacg 3240
catgtaacat tatactgaaa accttgcttg agaaggtttt gggacgctcg aaggctttaa 3300
tttgcaagct gcggccctgc attaatgaat cggccaacgc gc 3342
<210> 18
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaaatgtgaa tccaaggttt caagaaaata agataaagtg aataggaagg tagaattgta 60
cttctcgcta tataatttta aaacctagct gttattttct aagtaagtag gctcttccag 120
cattctgctt cttcgccctg aataaaaaaa agatgatcag cgaaaaaact caaaatgaaa 180
ataagagatg gattcttcaa agttataatt catatgcaga ataaagattc taaagaaaat 240
gcacacaatg catattccat ccggtgatgt tctgataccg aagccgaagc ttattactga 300
agaaacagat ccactgcata taataaagac gaggcaaaag acacatggtc ggcccgtgac 360
cattgcaggc ccaatggttc ggtattccaa gttaccattc cgtcagttgt gccgagaata 420
taacgttgat atagtttact cccccatgat 450

Claims (9)

1.构建重组酿酒酵母的方法，其特征在于：包括对出发酿酒酵母进行改造，得到重组酿酒酵母，所述改造包括如下C1-C3：
C1、导入甘油-3-磷酸脱氢酶基因GPD1基因；
C2、导入二酰基甘油酰基转移酶基因DGA1基因；
C3、导入磷脂酸磷酸水解酶基因PAH1基因；
所述出发酿酒酵母为对菌株BYT1进行如下A1-A13改造得到的菌株，
A1、导入3- 羟基 -3- 甲基戊二酰辅酶 A 还原酶基因tHMG1基因；
A2、导入甲羟戊酸激酶基因ERG12基因；
A3、导入乙醇脱氢酶I基因IDI1基因；
A4、导入焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因ERG19基因；
A5、导入羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因HMGR基因；
A6、导入羟甲基戊二酰-辅酶A合成酶基因ERG13基因；
A7、导入磷酸甲戊酸激酶基因ERG8基因；
A8、导入乙酰辅酶A乙酰转移酶基因ERG10基因；
A9、导入角鲨烯合酶基因AtSQS2基因；
A10、导入角鲨烯单加氧酶基因ERG1基因；
A11、导入法尼基焦磷酸合成酶基因SmFPS基因；
A12、导入达玛烯二醇合酶基因spgDDS基因；
A13、导入重组融合蛋白的编码基因，所述重组融合蛋白含有Pln1蛋白、原人参二醇合酶PPDS和细胞色素P450还原酶ATR1，所述ATR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第780位-第1425位所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述改造还包括C4：
C4、抑制或降低所述出发酿酒酵母的SEI1基因表达。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述GPD1基因编码的GPD1蛋白质的序列为genbank登陆号：NC_001136.10序列所示；
和/或，所述DGA1基因编码的DGA1蛋白质的序列为genbank登陆号：NC_001147.6序列所示；
和/或，所述PAH1基因编码的PAH1蛋白质的序列为genbank登陆号：NC_001145.3序列所示；
和/或，所述tHMG1基因编码的tHMG1蛋白质的序列为genbank登陆号：AJS96703.1序列的第530-1054位所示；
和/或，所述ERG12基因编码的ERG12蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013935.1序列所示；
和/或，所述IDI1基因编码的IDI1蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_015208.1序列所示；
和/或，所述ERG19基因编码的ERG19蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_014441.1序列所示；
和/或，所述HMGR基因编码的HMGR蛋白质的序列为genbank登陆号：WP_011241944.1序列所示；
和/或，所述ERG13基因编码的ERG13蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013580.1序列所示；
和/或，所述ERG8基因编码的ERG8蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013947.1序列所示；
和/或，所述ERG10基因编码的ERG10蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_015297.1序列所示；
和/或，所述AtSQS2基因编码的AtSQS2蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_195190.1序列所示；
和/或，所述ERG1基因编码的ERG1蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_011691.1序列所示；
和/或，所述SmFPS基因编码的SmFPS蛋白质的序列为genbank登陆号：ABV08819.1序列所示；
和/或，所述spgDDS基因编码的spgDDS蛋白质的序列为genbank登陆号：ACZ71036.1所示；
和/或，所述Pln1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第1位-第283位所示；
和/或，所述PPDS的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第288位-第773位所示。
4.根据权利要3所述的方法，其特征在于：
所述GPD1基因的序列如SEQ ID No.15中第758位-第1933位所示；
和/或，所述DGA1基因的序列如SEQ ID No.16中第808位-第2064位所示；
和/或，所述PAH1基因的序列如SEQ ID No.17中第438位-第3027位所示；
和/或，所述tHMG1基因的序列如SEQ ID No.3中第757位-第2340位所示；
和/或，所述ERG12基因的序列如SEQ ID No.4中第801位-第2132位所示；
和/或，所述IDI1基因的序列如SEQ ID No.5中第1001位-第1867位所示；
和/或，所述ERG19基因的序列如SEQ ID No.6中第1001位-第2191位所示；
和/或，所述HMGR基因的序列如SEQ ID No.7中第563位-第1864位所示；
和/或，所述ERG13基因的序列如SEQ ID No.8中第823位-第2298位所示；
和/或，所述ERG8基因的序列如SEQ ID No.9中第801位-第2156位所示；
和/或，所述ERG10基因的序列如SEQ ID No.10中第431位-第1627位所示；
和/或，所述AtSQS2基因的序列如SEQ ID No.11中第751位-第1983位所示；
和/或，所述ERG1基因的序列如SEQ ID No.12中第801位-第2291位所示；
和/或，所述SmFPS基因的序列如SEQ ID No.13中第431位-第1480位所示；
和/或，所述spgDDS基因的序列如SEQ ID No.14中第431位-2740位所示；
和/或，Pln1蛋白的编码基因的序列如SEQ ID No.1中第431位-第1279位所示；
和/或，蛋白PPDS的编码基因为第1292位-第2749位；
和/或，蛋白46tATR1的编码基因为第2768位-第4708位。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述C1通过向所述出发酿酒酵母中导入GPD1基因表达盒实现；
所述C2通过向所述出发酿酒酵母中导入DAG1基因表达盒实现；
所述C3通过向所述出发酿酒酵母中导入PAH1基因表达盒实现；
所述C4通过CRISPR/CAS9系统敲除所述出发酿酒酵母中的SEI1基因实现；
所述A1通过向所述菌株BYT1中导入tHMG1基因表达盒实现；
所述A2通过向所述菌株BYT1中导入ERG12基因表达盒实现；
所述A3通过向所述菌株BYT1中导入IDI1基因表达盒实现；
所述A4通过向所述菌株BYT1中导入ERG19基因表达盒实现；
所述A5通过向所述菌株BYT1中导入HMGR基因表达盒实现；
所述A6通过向所述菌株BYT1中导入ERG13基因表达盒实现；
所述A7通过向所述菌株BYT1中导入ERG8基因表达盒实现；
所述A8通过向所述菌株BYT1中导入ERG10基因表达盒实现；
所述A9通过向所述菌株BYT1中导入AtSQS2基因表达盒实现；
所述A10通过向所述菌株BYT1中导入ERG1基因表达盒实现；
所述A11通过向所述菌株BYT1中导入SmFPS基因表达盒实现；
所述A12通过向所述菌株BYT1中导入spgDDS基因表达盒实现；
所述A13通过向所述菌株BYT1中导入重组融合蛋白的编码基因表达盒实现。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组酿酒酵母中，GPD1基因、DGA1基因和PAH1基因整合入所述出发酿酒酵母的Gal80位点；AtSQS2基因、ERG1基因和SmFPS基因整合入所述出发酿酒酵母的NDT80位点；tHMG1基因、ERG12基因、IDI1基因、ERG19基因、HMGR基因、ERG13基因、ERG8基因和ERG10基因整合入所述出发酿酒酵母的LEU点；所述重组融合蛋白的编码基因整合入所述出发酿酒酵母的YPL062W位点；所述spgDDS基因通过导入所述出发酿酒酵母中的表达质粒表达。
7.采用权利要求1-6任一项所述的方法构建的重组酿酒酵母。
8.生产萜的方法，其特征在于：包括培养权利要求7所述重组酿酒酵母，得到发酵产物；从所述发酵产物中得到萜；所述萜为原人参二醇或/和达玛烯二醇。
9.下述任一一种应用，
X1、权利要求1-6中任一所述的方法在制备生产萜产品中的应用；
X2、权利要求1-6中任一所述的方法在生产萜中的应用；
X3、权利要求7所述的重组酿酒酵母在制备生产萜产品中的应用；
X4、权利要求7所述的重组酿酒酵母在生产萜中的应用；
其中，所述萜为原人参二醇或/和达玛烯二醇。
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