CN104450633B - 能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法及应用，构建方法步骤为：①将拟南芥中细胞色素‑NADPH‑还原酶1基因AtCPR1的5’端的前138个碱基切除，得到SEQ ID NO.2所示序列；②将以SEQ ID NO.3所示的人参中原人参二醇合酶基因PPDS的3’端终止密码子TAA去除，与SEQ ID NO.2所示序列的5’端用编码多肽GSTSSG的碱基序列连接，构建出融合蛋白质的基因元件；③将融合蛋白质的基因元件与酿酒酵母细胞内源启动子和终止子连接，构建融合蛋白质基因表达盒，并转化进入酿酒酵母细胞表达。本发明构建的融合蛋白质能使达玛烯二醇到原人参二醇的转化效率提高。

Description

能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法及应用。
背景技术
人参皂苷是中药人参的主要活性成分，具有保护心血管，抗疲劳，抗衰老和抗癌的药理作用。传统的人参栽培、组织培养和下游的植物组织提取已很难满足市场对人参皂苷的需求。
作为一种三萜类化合物，酿酒酵母内源代谢途径可为人参皂苷的合成提供前体2,3-氧化鲨烯。随后的环氧化、氧化以及糖基添加分别由达玛烯二醇合成酶、原人参二醇合成酶和糖基转移酶完成。达玛烯二醇合成酶基因于2006年被发现。Tansakul等报道PNA(DDBJ数据库，序号AB265170)是催化达玛烯二醇合成的基因。Han等报道了另外一个DDS(DDBJ/EMBL/GenBanK数据库，序号AB122080)。2011年，Jung-Yeon Han等通过对茉莉酸甲酯诱导的人参不定根进行cDNA建库，对转录组测序后经过一系列筛选，确定PPDS基因(cyp716a47)编码原人参二醇合成酶。2014年，GT的筛选也取得一定的进展，周志华等综合已发表的人参转录组的信息，筛选出能将原人参二醇转化为人参皂苷compound K(CK)的糖基转移酶。
基于以上人参皂苷合成途径中相关基因的挖掘，张学礼对酿酒酵母进行工程化，引入DS、PPDS和拟南芥中的AtCPR1，并对酿酒酵母甲羟戊酸途径限速过程进行过表达，构建了产原人参二醇的人工酿酒酵母细胞。周志华将筛选到的GT基因植入酿酒酵母中，得到了能产CK的酿酒酵母细胞。
PPDS是一种细胞色素P450单加氧酶。前期的研究发现，在人工构建的原人参二醇酿酒酵母合成途径中，PPDS是一个限速的步骤，单纯的增加PPDS及其还原酶的拷贝并不能解决问题,致使达玛烯二醇的转化效率相对较低。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质。
本发明的第二个目的是提供能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构建方法。
本发明的第三个目的是提供能提高达玛烯二醇转化效率融合蛋白质的应用。
本发明的技术方案概述如下：
能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构建方法，包括如下步骤：
①将拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因AtCPR1的5’端的前138个碱基切除，得到SEQ ID NO.2所示序列，所述拟南芥中AtCPR1基因以SEQ ID NO.1所示；
②将以SEQ ID NO.3所示的人参中原人参二醇合酶基因PPDS的3’端终止密码子TAA去除，与SEQ ID NO.2所示序列的5’端用编码多肽GSTSSG的碱基序列连接，构建出PPDS-linker2-AtCPR1融合蛋白质的基因元件；
③将PPDS-linker2-AtCPR1融合蛋白质的基因元件与酿酒酵母细胞内源启动子和终止子连接，构建PPDS-linker2-AtCPR1融合蛋白质基因表达盒，并转化进入酿酒酵母细胞表达。
上述方法构建的能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质。
上述融合蛋白质在酿酒酵母中合成人参皂苷中的应用。
所述GSTSSG的碱基序列如5’-GGTTCTACTTCTTCAGGT-3’，但不仅限于此序列。
所述酿酒酵母内源启动子如PGK1p(磷酸甘油酸激酶1启动子)，序列SEQ ID NO.7。
所述酿酒酵母内源终止子如ADH3t(乙醇脱氢酶3)序列SEQ ID NO.12.
SEQ ID NO.1所示的AtCPR1基因序列为拟南芥NADPH-细胞色素P450还原酶1的基因针对酿酒酵母的密码子的优化序列。
SEQ ID NO.2所示的基因序列为序列SEQ ID NO.1去除前138bp后得到。
SEQ ID NO.3所示的PPDS基因序列为人参中原人参二醇合成酶的基因针对酿酒酵母的密码子的优化序列。
本发明的优点：
实验证明，本发明构建的能提高达玛烯二醇转化效率的PPDS-linker2-AtCPR1融合蛋白质在酿酒酵母中比单独存在的PPDS和AtCPR1催化效率高。这种构建方法得到的融合蛋白提高了达玛烯二醇的转化效率，有利于人参皂苷在微生物中的高效合成。
附图说明
图1.PGK1p-PPDS-linker2-AtCPR1-ADH3t融合模块电泳图。
图2.PPDS和AtCPR1蛋白质在酿酒酵母细胞内的示意图。图2A为自然条件下两种蛋白质在酿酒酵母细胞内的示意图；图2B为本发明所构建的PPDS-linker2-AtCPR1融合蛋白质在酿酒酵母细胞内的示意图。
图3.达玛烯二醇和原人参二醇LC-MS分析。
图4.自然条件下PPDS和AtCPR1与PPDS-linker2-AtCPR1融合蛋白催化能力对比。
图5.各菌株达玛烯二醇和原人参二醇的产量对比。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
合成达玛烯二醇酿酒酵母细胞的构建
一、模块构建
根据人参中达玛烯二醇合酶的氨基酸序列，进行针对酿酒酵母的密码子优化，然后通过化学合成的方法(金唯智生物科技有限公司合成)得到编码达玛烯二醇合成酶的基因DS为SEQ ID NO.4；酿酒酵母内源的tHMG1(SEQ ID NO.5)，erg1(SEQ ID NO.6)，以及启动子PGK1p(SEQ ID NO.7)，TEF1p(SEQ ID NO.8)，TDH3p(SEQ ID NO.9)和终止子CYC1t(SEQID NO.10)，ADH1t(SEQ ID NO.11)，ADH3t(SEQ ID NO.12)均来自酿酒酵母w303-1a基因组；筛选标记基因leu2来自质粒prs405(美国ATCC)，his3来自质粒pxp320(购自Addgene,Inc.WWW.addgene.org)。
以酿酒酵母W303-1a(美国，ATCC)基因组为模板，以PGK1p-DS-F(SEQ ID NO.13)(和PGK1p-DS-R(SEQ ID NO.14)以及DS-CYC1t-F(SEQ ID NO.17)和DS-CYC1t-R(SEQ IDNO.18)为引物，分别扩增PGK1p启动子和CYC1t终止子。
以达玛烯二醇合成酶的基因DS(SEQ ID NO.4)为模板，以DS-F(SEQ ID NO.15)和DS-R(SEQ ID NO.16)为引物扩增DS基因。将PGK1p启动子、DS基因和CYC1t终止子用融合PCR的方法融合成DS的表达模块PGK1p-DS-CYC1t；以酿酒酵母W303-1a基因组为模板，以TEF1p-erg1-F(SEQ ID NO.19)和TEF1p-erg1-R(SEQ ID NO.20)以及erg1-ADH1t-F(SEQ IDNO.23)和erg1-ADH1t-R(SEQ ID NO.24)为引物，分别扩增TEF1p启动子和ADH1t终止子。
以W303-1a基因组为模板，以erg1-F(SEQ ID NO.21)和erg1-R(SEQ ID NO.22)为引物扩增erg1基因片段。将TEF1p启动子、erg1基因片段和ADH1t终止子用融合PCR的方法融合成erg1的表达模块TEF1p-erg1-ADH1t，所用序列见序列表。
以酿酒酵母W303-1a基因组为模板，以TDH3p-tHMG1-F(SEQ ID NO.25)和TDH3-tHMG1-R(SEQ ID NO.26)以及tHMG1-ADH3t-F(SEQ ID NO.29)和tHMG1-ADH3t-R(SEQ IDNO.30)为引物，分别扩增TDH3p启动子和ADH3t终止子。
以W303-1a基因组为模板，以tHMG1-F(SEQ ID NO.27)和tHMG1-R(SEQ ID NO.28)为引物扩增tHMG1基因片段。将TDH3p启动子、tHMG1基因片段和ADH3t终止子用融合PCR的方法融合成tHMG1的表达模块TDH3p-tHMG1-ADH3t，所用序列见序列表。
另外，以prs405为模板，以leu-F(SEQ ID NO.33)和leu-R(SEQ ID NO.34)为引物扩增leu2标记基因，以酿酒酵母W303-1a基因组为模板，以δ1-F(SEQ ID NO.39)和δ1-R(SEQID NO.40)为引物，扩增δ位点部分片段，并采用融合PCR的方法构建leu2-δ1转化元件；以pxp320为模板，以his-F(SEQ ID NO.31)和his-R(SEQ ID NO.32)为引物扩增his3标记基因，以酿酒酵母W303-1a基因组为模板，以rDNA1-F(SEQ ID NO.35)和rDNA1-R(SEQ IDNO.36)为引物扩增rDNA部分片段，并采用融合PCR的方法构建his3-rDNA1转化元件。模块的自组装转化还需要以酿酒酵母基因组为模板，分别以rDNA2-F(SEQ ID NO.37)、rDNA2-R(SEQ ID NO.38)和δ2-F(SEQ ID NO.41)、δ2-R(SEQ ID NO.42)为引物扩增rDNA2和δ2片段。模块构建完成后PCR扩增各模块，并用胶回收的方法纯化各转化模块。
本发明所用PCR酶为北京全式金生物技术有限公司的pfu聚合酶，50μL的PCR扩增体系如下：DNA模板，1μL；前引(10μM)和后引(10μM)各1μL；dNTP(2.5mM)，5μL；10×Buffer，10μL；Pfu聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、退火10秒、72℃延伸1分钟(32个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。
本发明所用融合PCR体系如下：DNA片段总量800ng，摩尔比1:1；dNTP(2.5mM)，5μL；10×Buffer，10μL；Pfu聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性10秒、退火55℃30秒、72℃延伸1分钟(11个循环)，72℃延伸5分钟(1个循环)。
二、酿酒酵母转化
上述模块的转化分两组进行。出发酿酒酵母W303-1a在YPD培养基中培养12小时后取200μL加入2mL新鲜的YPD培养基中，培养4-5小时。3000转常温下离心5min收集菌体，弃去上清后用灭菌的ddH2O冲洗菌体，再次在3000转常温下离心5min收集菌体，弃去上清。然后将1mL 100mM的醋酸锂加入菌体中，室温下放置5min后在3000转常温下离心5min收集菌体，制备酿酒酵母感受态细胞。转化混合体系包括240μL PEG(50％W/V),36μL 1.0M醋酸锂，10μL ss-DNA，转化片段PGK1p-DS-CYC1t，TEF1p-erg1-ADH1t，his3-rDNA1和rDNA2片段各200ng，最后用ddH2O补齐至360μL。按上述顺序将各项依次加入刚制备的感受态细胞中，离心漩涡1min，在42℃水浴30min，然后4000转常温下离心2min，移去上清后加入1mLYPD培养基，30℃150rpm培养2h。然后4000转常温下离心5min，弃去上清，无菌水洗涤2次，并用100μL无菌水重悬细胞，涂缺失组氨酸的平板进行筛选。培养条件为30℃，培养48h以上。得到转化DS和过表达erg1的酿酒酵母菌W1。
以W1为出发菌株，过表达DS和tHMG1。以PGK1p-DS-CYC1t为模板，以leu-PGKp-F(SEQ ID NO.72)和DS-CYC1t-R(SEQ ID NO.18)为引物，扩增PGK1p-DS-CYC1t表达盒。酿酒酵母感受态细胞的制备方法同上所述，转化片段PGK1p-DS-CYC1t，TDH3p-tHMG1-ADH3t，leu2-δ1，和δ2各200ng，转化方法和筛选方法如上所述。然后进行菌落PCR验证后，得到过表达DS和tHMG1的酿酒酵母菌株W2。
实施例2、合成原人参二醇酿酒酵母细胞W3和W3plus的构建
根据原人参二醇合酶和拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1的氨基酸序列，进行针对酿酒酵母的密码子优化，然后通过化学合成的方法(金唯智生物科技有限公司合成)得到编码人参中原人参二醇合成酶的基因PPDS基因为序列表中SEQ ID NO.3和拟南芥中AtCPR1基因为序列表中的基因序列SEQ ID NO.1。TDH3p，PGK1p和终止子CYC1t，ADH3t均来自酿酒酵母w303-1a基因组；筛选标记基因ura3来自质粒pxp218(Addgene,Inc.WWW.addgene.org)。
以酿酒酵母W303-1a基因组为模板，以TDH3p-AtCPR1-F(SEQ ID NO.43)和TDH3p-AtCPR1-R(SEQ ID NO.44)以及AtCPR1-ADH3T-F(SEQ ID NO.47)和AtCPR1-ADH3T-R(SEQ IDNO.48)为引物，分别扩增TDH3p启动子和ADH3T终止子。以AtCPR1(SEQ ID NO.1)为模板，以AtCPR1-F(SEQ ID NO.45)和AtCPR1-R(SEQ ID NO.46)为引物扩增AtCPR1基因片段。将TDH3p启动子、AtCPR1基因片段和ADH3T终止子用融合PCR的方法融合成AtCPR1的表达模块TDH3p-AtCPR1-ADH3t，PCR和融合PCR的方法同实施例1.
以酿酒酵母W303-1a基因组为模板，以PGK1p-PPDS-F(SEQ ID NO.49)和PGK1p-PPDS-R(SEQ ID NO.50)以及PPDS-CYC1t-F(SEQ ID NO.53)和PPDS-CYC1t-R(SEQ IDNO.54)为引物，分别扩增PGK1p启动子和CYC1终止子。以PPDS(SEQ ID NO.3)为模板，以PPDS-F(SEQ ID NO.51)和PPDS-R(SEQ ID NO.52)为引物扩增PPDS基因片段。将PGK1p启动子、PPDS基因片段和CYC1t终止子用融合PCR的方法融合成PPDS的表达模块PGK1p-PPDS-CYC1t，PCR和融合PCR的方法同实施例1.
另外，以pxp218为模板，以ura-F(SEQ ID NO.55)和ura-R(SEQ ID NO.56)为引物扩增ura3标记基因，以酿酒酵母W303-1a基因组为模板，以δ1-F2(SEQ ID NO.57)和δ1-R2(SEQ ID NO.58)为引物扩增δ位点部分片段，并采用融合PCR的方法构建ura3-δ1转化元件；以W303基因组为模板，以δ2-F(SEQ ID NO.59)和δ2-R(SEQ ID NO.60)为引物，扩增转化元件δ2。采用实施例1的转化方法，将PGK1p-PPDS-CYC1t，TDH3p-AtCPR1-ADH3t，ura3-δ1和δ2转化片段以酿酒酵母自组装的方式整合到酿酒酵母基因组上δ位点上，得到转化子后进行菌落PCR验证，得到合成原人参二醇的酿酒酵母菌株W3。
在W3的基础上，增加PPDS和AtCPR1表达模块的拷贝，主要方法如下。以酿酒酵母BY4742(美国ATCC)基因组为模板，以Ade2-F(SEQ ID NO.63)和Ade2-R(SEQ ID NO.64)为引物扩增ade2标记基因表达元件，以prs405质粒为模板，以leu1-F2(SEQ ID NO.65)和leu1-R2(SEQ ID NO.66)为引物扩增leu2位点部分片段，并采用融合PCR的方法构建ade2-leu1转化元件；以prs405质粒为模板，以leu2-F(SEQ ID NO.67)和leu2-R(SEQ ID NO.68)为引物，扩增转化元件leu2。同时，以PGK1p-PPDS-CYC1t为模板，以PGK1P-PDDS-F2(SEQ ID NO.61)和PDDS-CYC1t-R(SEQ ID NO.54)为引物扩增PGK1p-PPDS-CYC1t模块；以TDH3p-AtCPR1-F(SEQ ID NO.43)和TDH3p-AtCPR1-R2(SEQ ID NO.62)为引物扩增TEF1p-AtCPR1-ADH3t模块。采用实施例1的转化方法，将PGK1p-PPDS-CYC1t，TDH3p-AtCPR1-ADH3t，ade2-leu1和leu2转化片段各200ng以酿酒酵母自组装的方式整合到酿酒酵母基因组leu2位点，菌落PCR验证后，得到增加PPDS和AtCPR1模块拷贝的菌株W3plus。
实施例3、能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构建
根据人参中原人参二醇合酶基因PPDS和拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因AtCPR1的氨基酸序列，进行针对酿酒酵母的密码子优化，然后通过化学合成的方法(金唯智生物科技有限公司合成)得到基因片段。人参中PPDS基因以SEQ ID NO.3所示，拟南芥中AtCPR1基因以SEQ ID NO.1所示；将拟南芥中AtCPR1基因5’端的前138个碱基切除，得到SEQID NO.2所示序列。内源启动子PGK1p(SEQ ID NO.7)和内源终止子ADH3t(SEQ ID NO.12)均来自酿酒酵母w303-1a基因组；筛选标记基因ura3来自质粒pxp218。
两个蛋白质用编码多肽GSTSSG的碱基序列连接，本实施例中编码linker2的碱基序列为5’-GGTTCTACTTCTTCAGGT-3’(SEQ ID NO.71),将该碱基序列设计到引物中并采用融合PCR的方法实现两个基因片段的连接，具体实施过程为：以人参中原人参二醇合酶基因PPDS(SEQ ID NO.3)为模板，以序列表中PPDS-F(SEQ ID NO.51)和PPDS-linker2-R(SEQ IDNO.69)为引物，扩增PPDS-linker2片段，该片段去除了人参中原人参二醇合酶基因PPDS基因的3’端终止密码子TAA，同时还含有编码多肽GSTSSG的碱基序列5’-GGTTCTACTTCTTCAGGT-3’(SEQ ID NO.71)；以拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因AtCPR15’端的前138个碱基切除序列(SEQ ID NO.2)为模板，以linker2-AtCPR1-F(SEQ IDNO.70)和AtCPR1-R(SEQ ID NO.46)为引物，扩增linker2-AtCPR1片段，该片段包含编码多肽GSTSSG的碱基序列5’-GGTTCTACTTCTTCAGGT-3’(SEQ ID NO.71)和去除5’端138bp的AtCPR1基因序列(SEQ ID NO.2)。将PPDS-linker2和linker2-AtCPR1基因片段用融合PCR的方法连接成PPDS-linker2-AtCPR1的基因元件，该元件为PPDS-linker2-AtCPR1融合蛋白质的基因元件。PCR和融合PCR的方法同实施例1。
PPDS-linker2-AtCPR1融合蛋白质的基因元件与酿酒酵母细胞内源启动子和终止子连接，构建PPDS-linker2-AtCPR1融合蛋白质基因表达盒，具体实施方式为：以PGK1p-PPDS-F(SEQ ID NO.49)和PGK1p-PPDS-R(SEQ ID NO.50)为引物，以W303-1a基因组为模板，扩增PGK1p启动子；以AtCPR1-ADH3t-F(SEQ ID NO.47)和AtCPR1-ADH3t-R(SEQ ID NO.48)为引物，以W303-1a基因组为模板，扩增ADH3t终止子。将PPDS-linker2-AtCPR1融合酶的基因元件PPDS-linker2-AtCPR1与酿酒酵母细胞启动子PGK1p和终止子ADH3t用融合PCR连接，构建PPDS-linker2-AtCPR1融合酶基因表达盒PGK1p-PPDS-linker2-AtCPR1-ADH3t(图1)。
以pxp218为模板，以ura-F(SEQ ID NO.55)和ura-R(SEQ ID NO.56)为引物扩增ura3标记基因，以酿酒酵母W303-1a基因组为模板，以δ1-F2(SEQ ID NO.57)和δ1-R2(SEQID NO.58)为引物扩增δ位点部分片段，并采用融合PCR的方法构建ura3-δ1转化元件；以W303-1a基因组为模板，以δ2-F(SEQ ID NO.59)和δ2-R(SEQ ID NO.60)为引物，扩增转化元件δ2。采用实施例1的转化方法，将PGK1p-PPDS-linker2-AtCPR1-ADH3t表达盒，ura3-δ1和δ2转化片段各200ng以酿酒酵母自组装的方式转化进入实施例2得到的酿酒酵母细胞W2的基因组δ位点上，得到转化子后进行菌落PCR验证后，得到合成原人参二醇的酿酒酵母菌株W3a。
实施例4、融合P450酶的催化能力测定
一、酿酒酵母微粒体的制备
实施例1，2，3中得到的酿酒酵母细胞W2，W3和W3b分别在YPD培养基中进行培养(30℃,220rmp)。培养24h后离心(3000rmp，5min)收集细胞。酿酒酵母细胞用TEK缓冲液(100mMKCl，50mM Tris-HCl，1mM EDTA)重悬，6100g离心3min。去除上清，加入与菌体量等量的玻璃珠，并加入提取缓冲液(20mMβ-巯基乙醇，1％BSA，0.6M山梨醇，50mM Tris-HCl，1mM EDTA)。剧烈震荡20min后，6100g离心15min，将上清过膜后转移至干净的离心管中，加入MgCl2(50mM)后在冰上放置1h沉淀微粒体。然后12500g离心20min。上清去除后，离心管底部的微粒体转移至TEG缓冲液中(30％甘油，50mM Tris-HCl，1mM EDTA)，并用研磨杵快速研磨进行均一化处理。
二、CO示差法测定P450酶
取4mL酿酒酵母细胞微粒体制备液，加入80μL 0.5mmol/L连二亚硫酸钠混匀，于冰浴中放置2min。将4mL上述制备液体分转入两个比色皿中，其中一份用CO气体鼓泡1min，另一份不鼓泡，分别测定两份悬液的紫外吸收光谱。所用仪器为TU-1810型紫外可见分光光度计(比色皿光程1cm)，扫描波长范围400-500nm。以通CO鼓泡的悬液为样品液，未通CO的悬液为参比液，绘制示差紫外吸收光谱图。记录45Onm和490nm波长处的吸收值，按以下公式计算P450含量(摩尔消光系数ε为91cm-1mM-1):P450(mM)＝(A450nm-A490nm)/91。
三、P450酶的酶活力的测定
在500μL 100mM磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.4)加入10mg微粒体。达玛烯二醇浓度500μM，在30℃水浴中温育，加入NADPH(1mM)开始反应，每隔5min取一定量的混合液，加入等体积的正己烷萃取，12000rmp离心2min后过0.22有机膜备用，最后用HPLC测定原人参二醇的含量。液相色谱条件：进样量20μL，安捷伦ZORBAX SB-Aq；流动相为甲醇：乙腈＝4:6，流速：1mL/min，紫外检测器波长203nm。
结果：PPDS酶的含量用W3，和W3b微粒体中P450酶的含量减去W2中P450酶的含量所得。经计算，W3中PPDS的含量为9.82±0.83μM/g微粒体，W3b中PPDS的含量为9.52±0.84μM/g微粒体。由此可知，酿酒酵母微粒体中的PPDS浓度差别较小，它们的酶活测定结果如图4所示。图4中，本实验所构建的PPDS-linker2-AtCPR1融合蛋白质的催化效率明显高于自然条件下PPDS和AtCPR1的催化效率。
实施例5、工程菌株的发酵与发酵产物的LC-MS检测。
将实施例2,3中得到的人工合成酿酒酵母细胞W3，W3plus和W3b分别在YPD培养基中进行培养(30℃,220rmp)。6天后离心收集细胞，加入丙酮，在冰水浴中进行超声波破碎10min，然后在12000转/min常温条件下离心2min，取上清过0.22mm有机膜后备用。
达玛烯二醇和原人参二醇的定性用LC-MS进行。液相色谱条件：进样量5μL，安捷伦ZORBAX SB-Aq；流动相为90％乙腈，流速：0.2mL/min。质谱条件：雾化气和干燥气都为N2；碰撞电压：-70V；喷雾电压：3.8kV；离子源：APCI离子源温度：120℃；脱溶温度：300℃；柱后流出物导入离子源速率：5μL/min；质谱扫描质量数范围：200-1000Da。
达玛烯二醇和原人参二醇的定量用HPLC进行，液相色谱条件：进样量20μL，安捷伦ZORBAX SB-Aq；流动相为甲醇：乙腈＝4:6，流速：1mL/min。达玛烯二醇购自云南西力生物技术有限公司(WWW.biobiopha.com)。原人参二醇购自北京索莱宝科技有限公司(http://www.solarbio.cn/)。
结果如附图5所示：W3达玛烯二醇和原人参二醇的产量分别为96.8mg/L和155.6mg/L；W3plus增加了PPDS和AtCPR1表达模块的拷贝数，达玛烯二醇和原人参二醇的产量分别为102.5mg/L和150.6mg/L；W3b达玛烯二醇和原人参二醇的产量分别为14.5mg/L和259.6mg/L；
实验证明，在酿酒酵母W303-1a宿主中，单纯的增加PPDS和AtCPR1表达模块的拷贝数并不能提高达玛烯二醇的转化率。所构建的PPDS-linker2-AtCPR1融合蛋白质能有效提高达玛烯二醇的转化效率，从而提高原人参二醇的产量。

Claims (3)

1.能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构建方法，其特征是包括如下步骤：
①将拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因AtCPR1的5’端的前138个碱基切除，得到SEQ ID NO.2所示序列，所述拟南芥中AtCPR1基因以SEQ ID NO.1所示；
②将以SEQ ID NO.3所示的人参中原人参二醇合酶基因PPDS的3’端终止密码子TAA去除，与SEQ ID NO.2所示序列的5’端用编码多肽GSTSSG的碱基序列连接，构建出PPDS-linker2-AtCPR1融合蛋白质的基因元件；
③将PPDS-linker2-AtCPR1融合蛋白质的基因元件与酿酒酵母细胞内源启动子和终止子连接，构建PPDS-linker2-AtCPR1融合蛋白质基因表达盒，并转化进入酿酒酵母细胞表达。
2.权利要求1的方法构建的能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质。
3.权利要求2的融合蛋白质在酿酒酵母中合成人参皂苷中的应用。
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