CN104388455B - 莱茵衣藻相关基因的RNAi载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种莱茵衣藻相关基因的RNAi载体及其构建方法和应用，所述RNAi载体含有一个莱茵衣藻嵌合组成型表达启动子HSP70A/RBCS2、内含子和3’UTR和潮霉素筛选标记表达框序列，莱茵衣藻嵌合组成型表达启动子HSP70A/RBCS2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，3’UTR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，潮霉素筛选标记表达框序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明利用PCR技术把目的基因的部分cDNA片段先构建到中间载体pEASY‑T1上，然后再通过两次酶切相继把目标基因的正向和反向片段连接到莱茵衣藻RNAi骨架载体上，简化了载体构建步骤，缩短了载体构建时间，提高了效率，同时可以直接应用到衣藻其它基因的功能研究方面。
Description
技术领域
本发明涉及RNAi载体领域，具体地指一种莱茵衣藻相关基因的RNAi载体及其构建方法和应用。
背景技术
莱茵衣藻属于绿藻门、团藻目、衣藻科，是真核单细胞生物，进化上比较古老，介于高等植物和动物之间。莱茵衣藻培养条件简单、生长周期短、光合效率高、遗传背景清楚，与酵母细胞有许多共同的特征，素有“绿色酵母”之称。其生物学特性与高等植物和动物密切相关，是目前用于研究纤毛的模式生物中最为广泛使用的一个。
近年来，我们关于纤毛的知识大多来自于对莱茵衣藻的研究，比如：我们对纤毛结构的了解，“鞭毛内运输”的机制的发现以及与纤毛相关疾病的确定等。“鞭毛内运输”(intraflagellar transport,简称IFT)是发生于纤毛轴丝和纤毛膜之间从纤毛基部到顶端的一种蛋白质复合体的双向运输过程。运动的蛋白复合体被称为IFT颗粒(IFTparticles)，由15～17个多肽组成，可分为蛋白质复合体A和B；巴德-毕氏综合征(Bardet-Biedl syndrome,BBS)蛋白具有协调蛋白质复合体A和B之间联系的功能。其中，巴德-毕氏(Bardet-Biedl syndrome，BBS)综合症就是一种由多种基因突变造成的、与原生纤毛功能缺失相关的疾病。包含12种致病基因，分别为BBS1～12。BBS患者的症状包括视网膜衰退、肾囊形成、多指(趾)症、嗅觉失敏、高血压、肥胖症乃至精神发育迟滞症等。最近的研究发现BBS蛋白位于纤毛或基体，它们参与了纤毛的组装过程和信号传导过程。IFT马达蛋白或颗粒蛋白的缺陷将限制形成新的纤毛，亦可造成已形成的纤毛发生缩短解聚。在莱茵衣藻中，抑制BBS5的表达，纤毛将不能形成；BBS1或BBS4基因突变，莱茵衣藻丧失了趋光性，IFT蛋白颗粒的组装和运输没有受到影响，但是其失去趋光性的分子机制尚不清楚，有待于我们进一步深入研究。
2007年莱茵衣藻基因组测序的完成为莱茵衣藻反向遗传学的研究提供了可能。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。它是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，目前已成为功能基因组研究领域中一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，在一定程度上起到了基因Knock-down的效果。因此若用RNAi技术对衣藻BBS基因或IFT颗粒蛋白基因进行研究，将会促进我们深刻了解和认识莱茵衣藻趋光性及纤毛组装的分子机制，同时有可能揭示出“纤毛相关疾病”发生的分子机理。
目前衣藻中已经有相应的RNAi载体，但其构建步骤较为繁琐，需要多次酶切和连接才能构建成功，而且其转化后阳性克隆子的筛选效果也不理想。
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是提供一种莱茵衣藻相关基因的RNAi载体及其构建方法和应用。本发明在对莱茵衣藻靶基因敲除的过程中，构建各种中间重组载体，获得了含有莱茵衣藻启动子、内含子、3’UTR和潮霉素筛选标记表达框序列的莱茵衣藻RNAi骨架载体，然后再把BBS1靶基因的正向和反向片段序列相继构建到莱茵衣藻RNAi骨架载体上，形成BBS1基因的RNAi载体。从而实现对莱茵衣藻BBS1目标基因的沉默，改变莱茵衣藻的趋光性，为莱茵衣藻趋光性分子机制的研究奠定基础，同时构建的RNAi载体也可应用到衣藻中其它基因的研究，因此具有较好的应用价值。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种莱茵衣藻相关基因的RNAi载体，所述RNAi载体含有一个莱茵衣藻嵌合组成型表达启动子HSP70A/RBCS2、内含子和3’UTR和潮霉素筛选标记表达框序列，其中，莱茵衣藻嵌合组成型表达启动子HSP70A/RBCS2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，3’UTR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，潮霉素筛选标记表达框序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
进一步地，所述RNAi载体含有还有一个hpRNA表达盒，所述hpRNA表达盒包括顺序连接的启动子、相关基因正向片段、内含子、相关基因反向片段、3’UTR和潮霉素筛选标记表达框序列。
再进一步地，所述内含子为磷酸核酮糖激酶的第四段内含子，所述磷酸核酮糖激酶的第四段内含子的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示
再进一步地，所述相关基因为BBS1基因或BBS4基因或IFT20基因，其中，BBS1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，BBS4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，IFT20基因核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
本发明提供了一种莱茵衣藻BBS1基因的RNAi载体制备方法，包括以下步骤：
1)pGH-intron中间载体的构建
根据已经发表的磷酸核酮糖激酶序列信息GenBank号：AAA33090.1，设计一对引物：
以莱茵衣藻基因组DNA为模板，进行PCR扩增磷酸核酮糖激酶的第四段内含子，回收PCR产物连接pEASR-T1载体，连接产物转化DH5α细胞，阳性转化子提取质粒进行测序，获得磷酸核酮糖激酶的第四段内含子序列，即间隔序列；然后将间隔序列插入pGH载体内，得到中间载体pGH-intron；
2)pChlamy_RNAi骨架载体的构建
A：莱茵衣藻嵌合组成型表达启动子pHSP70A/RBCS2序列的获得
以Invitrogen公司Chlamydomonas Engineering kits中的pChlamy_3载体质粒为模板，设计一对引物：
进行PCR扩增，然后连接到pEASY-T1载体上、测序，获得莱茵衣藻嵌合组成型表达启动子HSP70A/RBCS2序列；
B：构建含有莱茵衣藻嵌合组成型表达启动子pHSP70A/RBCS2序列的重组载体pGH-HSP70A/RBCS2-intron
用Pst I和Kpn I酶切步骤2)A得到的带有莱茵衣藻启动子的pEASY-T1重组载体，然后与同样经Pst I和Kpn I酶切的重组载体pGH-intron连接，得到含有莱茵衣藻启动子HSP70A/RBCS2的重组载体pGH-HSP70A/RBCS2-intron；
C：莱茵衣藻3'UTR及潮霉素筛选标记表达框序列的获得
同样以invitrogen公司Chlamydomonas Engineering kits中的pChlamy_3载体质粒为模板，
设计一对引物：
进行PCR扩增，然后连接到pEASY-T1载体上、测序，得到我们要构建的莱茵衣藻RNAi载体的3'UTR和潮霉素筛选标记表达框序列；
D：构建含有莱茵衣藻启动子、3'UTR和潮霉素筛选标记表达框序列的莱茵衣藻pChlamy_RNAi骨架载体
用Xba I和Not I酶切步骤2)中小步骤C)中得到的带有莱茵衣藻3'UTR和潮霉素筛选标记表达框序列的pEASY-T1重组载体，然后与同样经Xba I和Not I酶切的中间载体pGH-HSP70A/RBCS2-intron连接，得到含有莱茵衣藻启动子、3'UTR和潮霉素筛选标记表达框序列的莱茵衣藻pChlamy_RNAi骨架载体；
3)BBS1基因部分cDNA目的片段的获得
为了确认cDNA选取片段对BBS1基因干扰效果的影响，我们选取了BBS1基因上的两段序列，分别命名为BBS1.1和BBS1.2，具体方法如下：用TRIzoL提取莱茵衣藻总RNA，反转录、以其cDNA为模板，设计以下两对引物：
以上述两对引物进行PCR扩增，然后分别连接到pEASY-T1载体上、测序，形成pEASY-T1-BBS1.1/2.1中间载体，获得BBS1基因两段cDNA片段BBS1.1和BBS2.1；
4)pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_FR RNAi载体的构建
A：含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_F RNAi载体的构建
酶切含有BBS1基因正向目的片段的pEASY-T1-BBS1.1/2.1中间载体质粒，与同样经KpnⅠ和SpeⅠ的pChlamy_RNAi骨架载体连接，获得含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_F RNAi载体；
B：含有BBS1基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_FR RNAi载体的构建
酶切含有BBS1基因反向目的片段的pEASY-T1-BBS1.1/2.1中间载体质粒，与同样经Nde Ⅰ和Xba Ⅰ酶切的含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_F RNAi载体连接，获得含有BBS1基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_FR RNAi载体，即莱茵衣藻茵衣藻BBS1基因RNAi载体。
本发明还提供了一种莱茵衣藻BBS4基因的RNAi载体制备方法，包括以下步骤：
使用上述方法获得含有莱茵衣藻启动子、3’UTR和潮霉素筛选标记表达框序列的莱茵衣藻pChlamy_RNAi骨架载体；
1)BBS4基因部分cDNA目的片段的获得
用TRIzoL提取莱茵衣藻总RNA，反转录、以其cDNA为模板，根据BBS4基因设计以下引物：
以上述引物进行PCR扩增，然后分别连接到pEASY-T1载体上、测序，形成pEASY-T1-BBS4中间载体，获得BBS4基因一段cDNA序列；
2)pChlamy_RNAi_BBS4FR RNAi载体的构建
A：含有BBS4基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS4F RNAi载体的构建
酶切含有BBS4基因正向目的片段的pEASY-T1-BBS4中间载体质粒，与同样经KpnⅠ和SpeⅠ的pChlamy_RNAi骨架载体连接，获得含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS4F RNAi载体；
B：含有BBS4基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS4FR RNAi载体的构建
酶切含有BBS4基因反向目的片段的pEASY-T1-BBS4中间载体质粒，与同样经Nde Ⅰ和Xba Ⅰ酶切的含有BBS4基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS4F RNAi载体连接，获得含有BBS1基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS4FR RNAi载体，即莱茵衣藻茵衣藻BBS4基因RNAi载体。
本发明还提供了一种莱茵衣藻IFT20基因基因的RNAi载体制备方法，包括以下步骤：
使用上述方法获得含有莱茵衣藻启动子、3’UTR和潮霉素筛选标记表达框序列的莱茵衣藻pChlamy_RNAi骨架载体；
1)IFT20基因部分cDNA目的片段的获得
用TRIzoL提取莱茵衣藻总RNA，反转录、以其cDNA为模板，根据IFT20基因序列设计以下引物：
用上述引物进行PCR扩增，然后分别连接到pEASY-T1载体上、测序，形成pEASY-T1-IFT20中间载体，获得IFT20基因cDNA片段；
2)pChlamy_RNAi_IFT20FR RNAi载体的构建
A：含有IFT20基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_IFT20F RNAi载体的构建
酶切含有IFT20基因正向目的片段的pEASY-T1-IFT20中间载体质粒，与同样经KpnⅠ和Spe Ⅰ的pChlamy_RNAi骨架载体连接，获得含有IFT20基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_IFT20F RNAi载体；
B：含有IFT20基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_IFT20FR RNAi载体的构建
酶切含有IFT20基因反向目的片段的pEASY-T1-IFT20中间载体质粒，与同样经NdeⅠ和Xba Ⅰ酶切的含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_IFT20F RNAi载体连接，获得含有BBS1基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_IFT20FR RNAi载体，即莱茵衣藻茵衣藻IFT20基因RNAi载体。
本发明提供了一种莱茵衣藻相关基因的RNAi载体的应用，研究莱茵衣藻趋光性的分子机制的应用；研究鞭毛颗粒蛋白复合体是如何装载和卸载货物及马达蛋白的活性又是如何调控中的应用。
本发明的有益效果在于：
1)本发明的构建方法简单、经济、快捷。相对于已有的莱茵衣藻RNAi载体，本发明构建的莱茵衣藻RNAi骨架载体，只需把目标基因的两端加上合适的酶切位点，利用PCR技术把目的基因的部分cDNA片段先构建到中间载体pEASY-T1上，然后再通过两次酶切相继把目标基因的正向和反向片段连接到莱茵衣藻RNAi骨架载体上，简化了载体构建步骤，缩短了载体构建时间，提高了效率，同时可以直接应用到衣藻其它基因的功能研究方面。
2)本发明获得的cDNA片段连接到pEASY-T1中间载体，测序正确后，后面只需酶切步骤，避免了后续经过PCR步骤及反向目的片段测序难的问题。
3)本发明采用莱茵衣藻磷酸核酮糖激酶的内含子，沉默效率高。
4)本发明进行潮霉素筛选的时候，先在液体中培养一周左右再在固体平板上进行筛选，阳性转化子得率高，达到95％以上。
5)本发明获得的BBS1基因阳性转化子为莱茵衣藻趋光性分子机制的研究奠定了基础。
图1为莱茵衣藻BBS1基因RNAi骨架载体的构建示意图；
图中，HSP：嵌合的HSP70A/RBC启动子序列；intron：莱茵衣藻磷酸核酮糖激酶的一段内含子序列；3’UTR+hygromycin：RbcS2的终止子序列及潮霉素选择标记表达框序列；BBSForward：目的基因的正向片段；BBS Reverse：目的基因的反向片段；
图2为本发明中莱茵衣藻磷酸核酮糖激酶第四段内含子PCR产物的1％琼脂糖电泳图，
图中泳道M为DNA marker；1，2为核酮糖激酶第四段内含子PCR产物；
图3为本发明中莱茵衣藻嵌合组成型表达启动子pHSP70A/RBCS2和3’UTR与潮霉素筛选标记表达框序列PCR产物的1％琼脂糖电泳图，
图中，泳道M为DNA marker；1，2为莱茵衣藻嵌合组成型表达启动子pHSP70A/RBCS2的PCR产物；3，4为莱茵衣藻3’UTR与潮霉素筛选标记表达框序列的PCR产物；
图4为莱茵衣藻BBS1基因的两段cDNA片段PCR产物的1％琼脂糖电泳图，
图中，泳道M为DNA marker；1，2是BBS1基因部分cDNA片段BBS1.1的PCR产物；3，4是BBS1基因上另一个位置的部分cDNA片段BBS2.1的PCR产物。
图5为构建好的BBS1基因RNAi载体pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_FR的双酶切(Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ)鉴定结果。
图中，泳道M为DNA marker；1是pChlamy_RNAi_BBS1.1_FR RNAi载体质粒的双酶切鉴定结果；2是pChlamy_RNAi_BBS 2.1_FR RNAi载体质粒的双酶切鉴定结果。
图6为潮霉素筛选培养基上阳性转化子的筛选结果。
图中，BBS1.1和BBS2.1分别为转pChlamy_RNAi_BBS1.1_FR和pChlamy_RNAi_BBS2.1_FR质粒后获得的莱茵衣藻阳性转化子，CC503为野生型。
图7为野生型与转RNAi载体的莱茵衣藻BBS1基因的Real-time PCR分析结果。
图中，BBS1.1和BBS2.1分别为转pChlamy_RNAi_BBS1.1_FR和pChlamy_RNAi_BBS2.1_FR质粒后获得的莱茵衣藻阳性转化子，CC503为野生型。
图8为野生型CC503和转基因莱茵衣藻的趋光性表型。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
下述实施例中采用的试剂主要为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品；各种限制性内切酶为NEWENGLAND产品；反转录试剂盒购自Fermentas，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯，仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。
所用引物序列均在北京擎科合成，本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1莱茵衣藻BBS1基因的RNAi载体的构建
1、莱茵衣藻DNA的提取
在无菌条件下，取5ml液体培养的莱茵衣藻样品4000g离心5min，弃上清。加入600μl CTAB缓冲液，混匀，于65℃水浴保温1h。加入10μl RNAase，37℃放置30min。加入等体积的氯仿，充分抽提几分钟。10000g离心5min，把上清转移到新的离心管中。加入等体积异丙醇沉淀DNA，-20℃放置10～30min。10000g离心5min，弃上清。加入1ml 75％的乙醇洗涤沉淀DNA两次。弃乙醇，干燥DNA，加入50μl ddH2O溶解DNA。
2、间隔序列的选取及获得
根据已经发表的磷酸核酮糖激酶序列信息(GenBank号：AAA33090.1)，设计一对引物：
以莱茵衣藻基因组DNA为模板，进行PCR扩增磷酸核酮糖激酶的第四段内含子(见图2)，回收PCR产物连接到pEASR-T1载体，连接产物转化DH5α细胞，提取质粒并测序，获得酸核酮糖激酶的第四段内含子序列，即间隔序列。
3、两端带有多克隆位点间隔序列的合成
将设计好的两端带有合适多克隆位点的间隔序列委托捷瑞生物工程有限公司进行合成，并构建到他们公司提供的pGH载体上，形成中间载体pGH-intron。
4、莱茵衣藻嵌合组成型表达启动子pHSP70A/RBCS2序列的获得
以Invitrogen公司Chlamydomonas Engineering kits中的pChlamy_3载体质粒为模板，设计一对引物：
进行PCR扩增，得到5′端引入Pst I酶切位点、3′端引入Kpn I酶切位点的莱茵衣藻嵌合组成型表达启动子HSP70A/RBCS2片段(见图3)，然后将该片段与pEASY-T载体连接并测序，测序结果表明5′端和3′端所引入酶切位点确为Pst I和Kpn I酶切位点。
5.构建含有莱茵衣藻嵌合组成型表达启动子pHSP70A/RBCS2序列的重组载体pGH-HSP70A/RBCS2-intron
用Pst I和Kpn I酶切步骤4)中得到的带有相应酶切位点的莱茵衣藻启动子HSP70A/RBCS2的pEASY-T载体，然后与同样经Pst I和Kpn I酶切的中间载体pGH-intron连接，得到含有莱茵衣藻启动子HSP70A/RBCS2的重组载体pGH-HSP70A/RBCS2-intron。
6、莱茵衣藻3’UTR及潮霉素筛选标记表达框序列的获得
同样以invitrogen公司Chlamydomonas Engineering kits中的pChlamy_3载体质粒为模板，设计一对引物：
进行PCR扩增，得到5′端引入Xba I酶切位点、3′端引入Not I酶切位点的莱茵衣藻3’UTR和潮霉素筛选标记表达框序列片段(见图3)，然后将该片段与pEASY-T载体连接并测序，测序结果表明5′端和3′端所引入酶切位点确为Xba I和Not I酶切位点。
7、构建含有莱茵衣藻启动子、3’UTR和潮霉素筛选标记表达框序列的莱茵衣藻pChlamy_RNAi骨架载体
用Xba I和Not I酶切步骤6.得到的带有相应酶切位点的莱茵衣藻3’UTR和潮霉素筛选标记表达框序列的pEASY-T载体，然后与同样经Xba Ⅰ和Not Ⅰ酶切的中间载体pGH-HSP70A/RBCS2-intron连接，得到含有莱茵衣藻启动子、3’UTR和潮霉素筛选标记表达框序列的莱茵衣藻pChlamy_RNAi骨架载体。
8、莱茵衣藻RNA的提取
取1ml莱茵衣藻于1.5ml离心管中，4000rpm/min离心1min后收集，弃上清。加入1ml的TRIzoL RNA提取液，混匀室温静置5min，加入0.2ml氯仿，振荡混匀，4℃，12000rpm/min离心15min。转移上清液，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min后，12000rpm/min离心10min。弃上清，75％的乙醇1ml清洗沉淀两次，4℃，7500rpm/min离心5min，干燥后用50μl RNase-free水溶解RNA。
9、莱茵衣藻cDNA第一条链的合成
以莱茵衣藻总RNA为模板，使用RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase Kit(反转录试剂盒，Fermentas)进行cDNA的合成。取植物总RNA 1-2μg，Oligo(dT)40μM 1μl，用DEPC处理水补足至12μl，混匀后，短暂离心将其收集于管底，置于PCR仪上65℃孵育5min，然后迅速在冰上冷却，再加入反应混合物8μl(5×Reaction Buffer 4μl，10mM dNTP 2μl，RNA酶抑制剂1μl，RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase 1μl)，混匀，短暂离心将其收集于管底，PCR仪上42℃保温60min，然后70℃保温5min以终止反应，-70℃保存备用。
10.BBS1基因部分其中一个位置cDNA片段的获得
提取莱茵衣藻总RNA，反转录，以其cDNA为模板，设计一对引物：
用上述一对引物进行PCR扩增，PCR产物分别连接到pEASY-T1载体上、测序，形成pEASY-T1-BBS1.1中间载体，获得BBS1基因其中一个位置部分cDNA片段BBS1.1。
11、含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS1.1_F RNAi载体的构建
酶切含有BBS1基因正向目的片段的pEASY-T1-BBS1.1中间载体质粒，与同样经KpnⅠ和Spe Ⅰ的pChlamy_RNAi骨架载体连接，获得含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS1.1_F RNAi载体。
12、含有BBS1基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS1.1_FR RNAi载体的构建
酶切含有BBS1基因反向目的片段的pEASY-T1-BBS1.1中间载体质粒，与同样经NdeⅠ和Xba Ⅰ酶切的含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS1.1_F RNAi载体连接，获得含有BBS1基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS1.1_FR RNAi载体。然后我们用Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ对该载体进行了双酶切鉴定，结果见图5。
实施例2
本实施例与实施例1的方法基本相同，不同之处在于；
10、BBS1基因另一位置部分cDNA片段的获得
提取莱茵衣藻总RNA，反转录，以其cDNA为模板，设计一对引物：
上述引物进行PCR扩增，PCR产物分别连接到pEASY-T1载体上、测序，形成pEASY-T1-BBS2.1中间载体，获得BBS1基因另一位置cDNA片段。
11、含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS2.1_F RNAi载体的构建
酶切含有BBS1基因正向目的片段的pEASY-T1-BBS2.1中间载体质粒，与同样经KpnⅠ和Spe Ⅰ的pChlamy_RNAi骨架载体连接，获得含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS2.1_F RNAi载体。
12、含有BBS1基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS2._FR RNAi载体的构建
酶切含有BBS1基因反向目的片段的pEASY-T1-BBS2.1中间载体质粒，与同样经NdeⅠ和Xba Ⅰ酶切的含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS2.1_F RNAi载体连接，获得含有BBS1基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS2.1_FR RNAi载体。然后我们用Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ对该载体进行了双酶切鉴定，结果见图5。
实施例3莱茵衣藻BBS4基因的RNAi载体的构建
本实施例与实施例1的方法基本相同，不同之处在于；
10.BBS4基因部分cDNA片段的获得
提取莱茵衣藻总RNA，反转录，以其cDNA为模板，设计一对引物：
用上述引物进行PCR扩增，PCR产物分别连接到pEASY-T1载体上、测序，形成pEASY-T1-BBS4中间载体，获得BBS4基因的cDNA片段。
11、含有BBS4基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS4F RNAi载体的构建
酶切含有BBS4基因正向目的片段的pEASY-T1-BBS4中间载体质粒，与同样经Kpn Ⅰ和Spe Ⅰ的pChlamy_RNAi骨架载体连接，获得含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS4F RNAi载体。
12、含有BBS4基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS4FR RNAi载体的构建
酶切含有BBS4基因反向目的片段的pEASY-T1-BBS4中间载体质粒，与同样经Nde Ⅰ和Xba Ⅰ酶切的含有BBS4基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS4F RNAi载体连接，获得含有BBS4基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS4FR RNAi载体。然后我们用Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ对该载体进行了双酶切鉴定。
实施例4莱茵衣藻IFT20F基因的RNAi载体的构建
本实施例与实施例1的方法基本相同，不同之处在于；一对引物为：
实施例5
实施例1构建的BBS1基因RNAi载体在改变莱茵衣藻趋光性中的应用
应用本发明构建的BBS1基因RNAi载体pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_FR转化莱茵衣藻CC503，抑制了BBS1基因的表达，改变了莱茵衣藻的趋光性，达到了我们预期的目的。
1.BBS1基因RNAi载体的转化与筛选
取对数期生长莱茵衣藻(2～5×106cells/ml)70ml，4000rpm/min离心收集后，平铺于TAP固体平板之上，呈一元硬币大小。于正常条件下(温度25℃，12h光照/12h黑暗)培养1-2d后用于基因枪转化。基因枪转化条件：8cm高度；4.5MP可裂膜。转化后，在弱光下培养2d后进行潮霉素筛选，将固体平板上莱茵衣藻转移至含10mg/L潮霉素的50ml液体培养基中，摇床筛选培养(温度25℃，12h光照/12h黑暗，150r/min)，培养7-10d直至液体培养基中莱茵衣藻的绿色完全褪去，再取2ml涂在固体平板上进行固体筛选(10mg/L hygromycin)，7d左右单克隆长出(见图6)。
2.Real-time PCR分析BBS1基因的沉默效果
取CC503野生型及转pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_FR质粒的莱茵衣藻，分别提取总RNA。其中转pChlamy_RNAi_BBS1.1_1.2质粒获得的阳性转化子后代命名为BBS1.1_n(n代表哪个单克隆)，转pChlamy_RNAi_BBS2.1_2.2质粒获得的阳性转化子后代命名为BBS2.1_n(n代表哪个单克隆)。以反转录合成的cDNA第一链为Real-time PCR的模板；参照基因用S26RNA引物对：
靶基因用引物对：
分别进行Real-time PCR扩增。反应程序：95℃预变性10s；PCR反应：5s/95℃，25s/55℃，40Cycles；融解曲线分析：10s/55℃，5℃/s，95℃结束；荧光定量PCR数据采用2-ΔΔCt法分析；检测转pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_FR RNAi基因莱茵衣藻目标基因的mRNA表达变化，结果表明我们针对BBS1基因进行干扰，确实抑制了BBS1的表达(见图7)。
3.莱茵衣藻趋光性分析
分别取对数生长期的野生型CC503及转基因莱茵衣藻，放入一定体积的培养皿中，然后用锡箔纸包严，只留一定大小的空隙以便光源射入，2小时后，观察两株系莱茵衣藻的趋光性变化。结果如图8所示：本发明对BBS1基因上的两段cDNA片段进行了干扰，干扰效果均较好，野生型莱茵衣藻CC503绝大部分跑到光的一侧，而干扰BBS1基因后转基因莱茵衣藻对光基本上无变化。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (1)
1.一种莱茵衣藻BBS1基因的RNAi载体在改变莱茵衣藻趋光性中的应用，其特征在于：所述RNAi载体含有一个莱茵衣藻嵌合组成型表达启动子HSP70A/RBCS2、BBS1基因正向片段、内含子、BBS1基因反向片段、3’UTR和潮霉素筛选标记表达框序列，其中，莱茵衣藻嵌合组成型表达启动子HSP70A/RBCS2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，3’UTR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，潮霉素筛选标记表达框序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；内含子为磷酸核酮糖激酶的第四段内含子，磷酸核酮糖激酶的第四段内含子的核苷酸序列如SEQID No.4所示，BBS1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
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