CN104232642A

CN104232642A - 一种茶树低温诱导型启动子

Info

Publication number: CN104232642A
Application number: CN201410359224.1A
Authority: CN
Inventors: 黎星辉; 杜昱林; 王玉花
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2014-07-24
Filing date: 2014-07-24
Publication date: 2014-12-24

Abstract

本发明属于基因工程领域，提供一种来源于茶树的诱导型启动子CsPE1α及其表达。本发明提供的诱导型启动子为如下1)-2)中任一种DNA分子：1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有启动子功能的DNA分子。本发明提供的启动子可驱动目的基因在植物中表达，有助于人们对茶树生长发育的研究，且为植物特别是山茶科的遗传改造提供帮助，本发明提供的启动子在低温胁迫下诱导启动抗寒基因来有效防治冻害。同时，茶树耐寒性提高，适应气候的能力提升，就能够使纬度更高的地方生产茶叶。

Description

一种茶树低温诱导型启动子

一、技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种低温诱导型启动子，包括含有该启动子的结构和载体，以及含有该启动子或者所述结构或者载体的宿主细胞、转基因植物。

二、技术背景

在细胞代谢过程中，丙酮酸脱氢酶系(pyruvate dehydrogenase complex，PDC)占据关键的代谢位置，对能量代谢的影响意义重大。而PDC-E1α基因是连接能量代谢途径的闸门，该基因如果出现异常势必影响整个能量代谢途径。

植物基因工程中常用的启动子按其作用方式及功能可分为三类：组成型启动子(constitutive promoter)、组织特异型启动子(tissue-specific promoter)和诱导型启动子(inducible promoter)。本发明所提供的启动子CsPE1α属于诱导型启动子。诱导型启动子一直以来都是植物基因工程研究的重点和难点。低温作为最常见的逆境胁迫之一，对植物尤其是茶树的生长发育影响深远，但对其相关启动子的鉴定分离表达研究少之又少。因此，对茶树低温诱导型启动子的克隆与研究具有十分重要的意义。

三、发明内容

1、技术问题

本发明目的是提供一种低温诱导型启动子，为植物生长发育和生理代谢的研究提供基础，尤其是在茶树的遗传育种中提供一条快速、经济、有效的途径。

2、技术方案

本发明的发明人首先采集中山陵茶场茶树花粉，使用改良的CTAB法提取DNA。然后根据本课题组克隆得到的茶树花粉CsE1α基因的cDNA序列(GenBank登录号：JQ999982)设计引物，使用TAIL-PCR方法扩增其启动子。验证之后，引入酶切位点，构建瞬时表达载体(pBI121-CsPE1α-GFP)。基因枪轰击法对低温诱导性启动子CsPE1α进行瞬时表达分析。

3、有益效果

本发明针对上述现有技术的情况，首次提供了一个茶树低温诱导型启动子。该启动子能够有效响应低温胁迫，调节下游基因表达量。对茶树低温诱导性启动子的研究有助于认识E1α基因的功能及丙酮酸脱氢酶系在茶树中的作用机理。可以利用本发明启动子构建成各种植物表达载体，用于通过植物基因工程技术改善植物品质和其他有益生产性状。

本发明所提供的低温诱导型启动子，可接受低温刺激而使下游基因高效表达，克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异性的持续、高效表达所造成的浪费，并且满足某些需要外源基因特异表达的需求。将该启动子应用于转基因植物中，可以提高转基因植物的耐寒性，更好的抵御寒害、冻害，扩大种植范围。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

本发明提供的低温诱导型启动子来源于茶树，有助于茶树生长发育的研究。众所周知，明前茶品质优良，市场前景广阔。提高茶树抗寒能力可以提前茶树发芽时间，延长明前茶采摘时间，提高产量。同时，茶树耐寒性提高，适应气候的能力提升，就能够使纬度更高的地方生产茶叶，进而能够扩大茶叶的生产区域，提高茶叶产量。另外，控制好茶树的能量代谢，就能够更好的调节茶树生长周期。通过合理灌溉，适时增肥，可以提高鲜叶品质，从而获得显著的经济效益。

茶叶是最重要的经济作物之一，寒害、冻害等低温胁迫会造成茶叶产量减少以及品质下降。茶树抗寒基因的克隆以及启动子的分离可以使我们更好地了解植物体响应低温胁迫的机理，并为基因工程改良奠定基础。

四、附图说明

图1从茶树花粉基因组DNA中TAIL-PCR扩增CsE1α的启动子的电泳图谱。

其中，M泳道为DL2000Marker，从上到下片段依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；箭头处即为切胶回收的目的基因。

图2启动子CsPE1α中预测到的顺式表达元件，除了基本转录元件：CAAT-框和TATA-框等外，该启动子含有2个GATA-框，1个LTR，1个G-框，1个ARR1AT，1个TGA-element等顺式元件。

图3重组载体pBI121-CsPE1α-GFP的PCR鉴定图谱。

其中，M泳道为DL2000Marker，从上到下片段依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道2为PCR所得产物的结果。

图4荧光体式显微镜下经基因枪轰击转入重组载体pBI121-CsPE1α-GFP的洋葱内表皮细胞的GFP荧光表达结果。

图5激光共聚焦显微镜下经基因枪轰击转入重组载体pBI121-CsPE1α-GFP的洋葱内表皮细胞的GFP荧光表达结果。

五、具体实施方式

下述实施例中所用方法若无特殊说明均为本领域惯用的技术手段，所用的试剂、材料，如无特殊说明均可通过商业途径得到。

下面结合附图对本发明的方法进行详细的描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。

实施例1、植物逆境胁迫诱导表达型启动子CsPE1α的获得

1.引物设计

根据茶树花粉CsE1α基因的cDNA序列，设计引物扩增其启动子，具体引物序列如下：

特异性引物序列：

GSP1：如SEQ ID NO.2所示；

GSP2：如SEQ ID NO.3所示；

GSP3：如SEQ ID NO.4所示；

随机引物：

AD1：如SEQ ID NO.5所示：5′-tgwgnagwan casaga-3′，其中，w＝a或t；n＝a或g或c或t；s＝g或c；

AD2：如SEQ ID NO.6所示：5′-cawcgicnga iasgaa-3′，其中，w＝a或t；i＝a或g或c或t；n＝a或g或c或t；s＝g或c；

AD3：如SEQ ID NO.7所示：5′-ntcgastwts gwgtt-3′，其中，n＝a或g或c或t；s＝g或c；w＝a或t；

AD4：如SEQ ID NO.8所示：5′-ntcgastwts gwgtt-3′，其中，n＝a或g或c或t；s＝g或c；w＝a或t；

AD5：如SEQ ID NO.9所示：5′-gtcgaswgan awgaa-3′，其中，s＝g或c；w＝a或t；n＝a或g或c或t；

AD6：如SEQ ID NO.10所示：5′-wgtgnagwan canaga-3′，其中，w＝a或t；n＝a或g或c或t；。

2.TAIL-PCR扩增

以茶树花粉基因组DNA为模板，以AD和GSP1为引物进行PCR扩增反应，反应体系为：模板DNA 1μL，dNTP Mixture(每种2.5mm)8μL，10×LA PCR BufferII(Mg²⁺plus)5μL，TaKaRa LA Taq(5U/μl)0.5μL，AD Primer(100pmol/μl)1μL，GSP1(10pmol/μl)，ddH2O 33.5μL，总体积50μL。反应程序为：94℃变性1min，再98℃1min；紧接着5个循环为94℃30s，68℃1min，72℃2min；接着94℃30s，25℃3min，72℃2min；然后按照(94℃30s，68℃1min，72℃2min)-(94℃30s，68℃1min，72℃2min)-(94℃30s，44℃1min，72℃2min)方向进行15个循环；最后72℃延伸10min。

反应完成后，将上述PCR反应液稀释50倍作为第二轮PCR扩增模板。第二轮PCR反应：以AD和GSP2引物进行PCR扩增，反应程序为：按照(94℃30s，68℃1min，72℃2min)-(94℃30s，68℃1min，72℃2min)-(94℃30s，44℃1min，72℃2min)方向进行15个循环；最后72℃延伸10min。

反应完成后，将上述PCR反应液稀释50倍作为第三轮PCR扩增模板。第三轮PCR反应：以AD和GSP3引物进行PCR扩增，反应程序为：按照(94℃30s，68℃1min，72℃2min)-(94℃30s，68℃1min，72℃2min)-(94℃30s，44℃1min，72℃2min)方向进行15个循环；最后72℃延伸10min。

将三级PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(图1)，回收纯化0.8kb的目的条带，将其连接到pMD18-T载体(购自TAKARA公司)，回收的目的片段与pMD-18T载体于16℃进行连接2-6h，形成连接产物，连接反应体系如下：

将上述连接产物热击转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，转入过程如下：

a.将感受态细胞与5.0μL连接产物取出，至冰上融化，然后混匀；

b.冰浴30min，于42℃水浴热激90s，在迅速至冰上放置2-3min；

c.加入灭菌的LB液体培养基1mL，置于摇床于37℃下180rpm振荡培养1h：

d.2000rpm离心1min，弃上清800μL，混匀剩余液体，用L形涂布棒均匀涂布于含0.1％Amp的LB固体培养基上；

e.将培养皿倒置于恒温培养箱中，37℃黑暗培养12-16h；

f.用灭菌的牙签挑取平板上的单菌落至2mL含0.1％Amp的LB液体培养基中，于37℃下220rpm振荡培养8-12h；

上述菌液用PCR鉴定。以上述菌液为模板，用1.2％的琼脂糖进行PCR电泳检测。若能检测到目的条带，则说明大肠杆菌转化成功。将能检测到目的条带的菌液送至南京金斯瑞生物公司(Genscript，中国)进行测序。

测序结果表明，该DNA片段长898bp，去掉562bp重叠区域，该片段为序列表中序列1的336bp大小的核苷酸序列，即为基因CsE1α的启动子CsPE1α。将序列1放在启动子顺式元件预测网站PLACE(http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和plantCARE(http：//intra.psb.ugent.be：8080/PlantCARE/)上进行分析，除了基本转录元件：CAAT-框和TATA-框等外，该启动子含有2个GATA-框，1个LTR，1个G-框，1个ARR1AT，1个TGA-element等顺式元件(图2)，这些是CsPE1α对光、低温及激素响应的重要的顺式元件(低温相关：1、CCAATBOX1，CCAAT；2、EECCRCAH1，GANTTNC；3、LTRECOREATCOR15，CCGAC；4、MYB2CONSENSUSAT，YAACKG)。这也进一步佐证了该启动子的表达具有逆境胁迫诱导性。

实施例2、重组表达载体(pBI121-CsPE1α-GFP)的构建

1、将大肠杆菌DH5α重组子菌液用如下引物：pE1-ScaI-R PBI121-GFP和pE1-HindIII-F PBI121-GFP进行PCR扩增，引入酶切位点Sca I和Hind III。PCR扩增过程，同实施例1中的第三轮。

pE1-ScaI-R PBI121-GFP 如SEQ ID NO.11所示

pE1-HindIII-F PBI121-GFP 如SEQ ID NO.12所示

2、用限制性内切酶Sca I和Hind III双酶切载体pBI121-GFP，切去CaMV35S区域，回收约11kb的载体骨架。

3、用限制性内切酶Sca I和Hind III双酶切实施例1得到的DH5α菌液抽提的质粒，得到酶切产物。

4、将步骤1的载体骨架和步骤2的酶切产物在T₄DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒；测序验证序列的正确性；测序结果表明所得质粒为在pBI121-GFP载体的Sca I和Hind III酶切位点之间插入具有序列表中序列1所示核苷酸序列的核酸片段，将该质粒命名为pBI121-CsPE1α-GFP。测序结果表明，在该载体中，GFP基因上游只有本发明序列1所示片段，没有其它任何启动子，将重组载体pBI121-CsPE1α-GFP用步骤1中所述引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳验证无误(图3)。

实施例3、植物逆境胁迫诱导表达型启动子CsPE1α的瞬时表达分析

按照BioRad公司PDS-1000/HE Biolistic型的基因枪轰击操作方法，将重组载体pBI121-CsPE1α-GFP基因枪法转化经高渗培养的洋葱内表皮，轰击后的洋葱内表皮用MS培养基、37℃、暗培养1天后，分别用荧光体式显微镜和激光共聚焦显微镜观察瞬时表达情况，部分结果如图4、5所示。

结果表明，在GFP激发光下，转pBI121-CsPE1α-GFP的洋葱内表皮细胞可发射荧光；CsPE1α可驱动下游基因表达。

Claims

1.一种茶树低温诱导型启动子，其特征在于：如SEQ ID NO.1所示的DNA分子序列。