CN112063629B

CN112063629B - 一种樟树分枝调控因子wrky2/dib1基因的应用

Info

Publication number: CN112063629B
Application number: CN202010840313.3A
Authority: CN
Inventors: 陈彩慧; 胥猛; 钟永达; 徐立安; 余发新
Original assignee: INSTITUTE OF BIOLOGICAL RESOURCES JIANGXI ACADEMY OF SCIENCES; Nanjing Forestry University
Current assignee: INSTITUTE OF BIOLOGICAL RESOURCES JIANGXI ACADEMY OF SCIENCES; Nanjing Forestry University
Priority date: 2020-08-19
Filing date: 2020-08-19
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2040-08-19
Also published as: CN112063629A

Abstract

本发明公开了一种樟树分枝调控因子WRKY2/DIB1基因的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明以樟树叶RNA为材料，采用RACE基因全长克隆的方法，获得樟树分枝调控因子DIB1基因的全长序列，如SEQ ID NO.1所示。DIB1基因编码WRKY转录因子WRKY2。采用Gateway克隆技术构建植物过量表达载体pBI12l‑DIB1，利用农杆菌介导法将pBI121‑DIB1转入受体材料杨树中，过量表达DIB1的转基因杨树植株茎尖表现出分枝现象。因此本发明提供的调控因子，可以参与植物顶端发育调控，可以在植物基因工程中，改良植物的株型，改良品种选育进程。

Description

一种樟树分枝调控因子WRKY2/DIB1基因的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种樟树分枝调控因子WRKY2/DIB1基因的应用。

背景技术

樟树(Cinnamomum camphora)，又名香樟，樟科樟属常绿大乔木，是热带亚热带常绿阔叶林的重要组成树种之一，对亚热带常绿阔叶林的结构功能维护及生物多样性保护起着重要作用。樟树根、茎、叶、花、果中均富含精油，具有重要的开发利用价值。是医药、日用化工、食品、国防和香精香料等工业的重要原料。樟树以其常绿、枝叶繁茂、冠形美观而被很多地方作为优良的庭院、街道、公园、公路等风景区的园林绿化树种。

植物的分枝发育是一个复杂的生物学过程，受到遗传、激素、环境和营养等多种因素的调控，在植物的形态建成中具有重要的意义。在禾本科植物中例如水稻和玉米，分蘖数的多少与作物的产量有着直接的关系；在木本植物中，植物的分枝发育在林木的株型发育和形态建成中具有重要的作用。先前的研究已经表明，植物激素在植物的分枝发育过程中起着重要的作用，植物通过生长素、独脚金内酯和细胞分裂素的共同作用控制分枝发育。

转录因子(Transcription factor，TF)是一类可以调控基因表达的反式作用因子。相对于功能基因而言，单个转录因子往往可以同时调控多个功能基因的表达。因此，分析和鉴定转录因子的基因功能就显得非常有意义了。通过转基因技术，将可以同时调控多个功能基因的转录因子转化植物有望实现快速培育综合性状优良的新品种。

WRKY是植物特有的一类转录因子超家族，因其N-端含有7个高度保守的WRKYGQK氨基酸残基而得名。WRKY蛋白通过与靶基因启动子区域的顺式作用元件(T)(T)TGAC(C/T)(W-box)特异地结合来调节靶基因的表达。目前研究认为，WRKY转录因子家族成员广泛参与植物生物和非生物胁迫响应，在植物生长发育、生理、代谢过程中起着重要的调控作用。拟南芥AtWRKY71转录因子(EXB1)过量表达可以正向调控拟南芥分枝，使其分枝数大大增加，与其同源的转录因子WRKY23也可以调控分枝发育，它们功能相似。目前关于植物分枝的研究主要在于促进腋芽分枝生长发育，而有关顶芽分枝或二叉分枝方面的研究还鲜有报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种樟树分枝调控因子DIB1(DICHOTOMOUS BRANCHING1)基因的应用。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种樟树分枝调控因子DIB1基因在促进植株顶端分枝中的应用，所述的樟树分枝调控因子DIB1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的应用，包括以下步骤：

1)构建樟树分枝调控因子DIB1基因的载体；

2)将所构建的樟树分枝调控因子DIB1基因的载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到顶端分枝的转基因植物。

所述樟树分枝调控因子DIB1基因的植物过表达载体为pBI12l-DIB1。

所述载体PBI121-DIB1，在DIB1基因的5′端组装组成型强表达启动子CaMV 35S，在DIB1基因的3′端组装强终止子NOST。

所述载体PBI121-DIB1组装NPTII基因的表达盒，作为转基因植物的筛选标记，可以用卡纳青霉素进行转基因植株的筛选。

所述载体PBI121-DIB1组装LB和RB序列，在所述LB和RB序列之间组装DIB1表达框架和筛选标记基因，促使DIB1表达框架和筛选标记基因整合至植物细胞染色体中。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明以樟树叶RNA为材料，采用RACE基因全长克隆的方法，获得樟树分枝调控因子DIB1的全长序列。DIB1基因编码WRKY转录因子WRKY2。采用Gateway克隆技术构建植物过量表达载体pBI121-DIB1，该基因位于启动子CaMV35S之后，在启动子CaMV35s的驱动下，DIB1可在植物体内高效表达。利用农杆菌介导法将该转录因子转入受体材料杨树中，过量表达DIB1的转基因杨树植株茎尖表现出二叉分枝现象。因此本发明提供的调控因子，可以参与植物顶端发育调控，作为基因资源，不仅可丰富多年生植物顶端分枝的分子调控理论，而且在林木基因工程中，对于改良植物的株型具有重要应用价值。

附图说明

图1为植物表达载体pBI121-DIB1结构图；

图2为过量表达DIB1基因的转基因杨树图；图2A为过量表达DIB1基因的转基因杨的表达水平检测；图2B是过量表达DIB1基因的转基因杨树与未转基因杨树茎表型观测，箭头所指位置为分枝位置；标尺：1cm；CK：未转基因杨树植株；line5、line6和line7为DIBl的不同转基因株系。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。

本申请所用材料为樟树叶，于2017年3月，采自南京林业大学校园内。

实施例1：DIB1 cDNA全长的克隆

基于樟树叶转录组表达研究结果，设计特异引物扩增DIB1的开放阅读框(ORF)序列，再依据该序列设计5′和3′末端的RACE引物，扩增DIB1全长序列。

(1)ORF序列扩增：通过NCBI的ORF Finder预测樟树DIB1基因ORF的全长，并在起始密码子和终止密码子处设计引物进行ORF框扩增验证，ORF特异性引物包括：DIB1正向引物：5′-ATGGCCGTTGATCTGATGGG-3′和DIB1反向引物：5′-TTACACAAGGGCTGAGTCGAACA-3′。采用华越洋植物RNA提取试剂盒进行樟树叶片RNA提取，通过PrimeScript ReverseTranscriptase进行单链cDNA的反转录，反应液稀释成3倍。利用平末端的高保真DNA聚合酶Primer STAR Max DNA polymerase对DIB1基因的RACE序列进行扩增，PCR反应扩增程序：98℃10s；55℃5s；72℃10s(35个循环)；72℃3min。PCR产物使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳分离，凝胶成像系统进行拍照和切胶，并用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒进行扩增片段回收，再将新鲜的回收产物进行

-Blunt Zero克隆载体连接和大肠杆菌感受态细胞的转化，最后将菌液PCR检测的阳性菌液送至南京金斯瑞公司进行Sanger测序确认。

(2)5′和3′末端的RACE扩增：以上述序列为模板设计5′和3′RACE两轮扩增特异性引物，分别为：

CcDIB1_5′_1(5′-TCTAGGGTTAGGGTTTGGGACTGAGC-3′)；

CcDIB1_5′_2(5′-AGGAAGCGCCGGAATCTCAGAC-3′)；

CcDIB1_3′_1(5′-CCGCTGCCACTGCTCCAAGAAAA-3′)；

CcDIB1_3′_2(5′-CGAGTGAAGAAGAGCATCAG-3′)。

利用SMARTer RACE cDNAAmplification试剂盒进行5′和3′RACE cDNA反转录，以50ng cDNA为模板，利用平末端的高保真DNA聚合酶Primer STAR Max DNApolymerase对DIB1基因的RACE序列进行扩增，扩增产物的连接、转化和测序参照步骤(1)。运用BioXMv2.6软件将测序得到的5′和3′RACE序列与DIB1基因ORF片段序列进行相互比较，拼接获得DIB1基因cDNA全长，如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(WRKY转录因子WRKY2)。

实施例2：DIB1基因植物表达载体的构建与遗传转化

利用Gateway技术构建DIB1基因的过量表达载体。使用特异PCR引物(DIB1开放阅读框引物)，以cDNA为模板，进行PCR扩增，将DIB1基因开放阅读框序列构建到入门载体pCR^TM8/GW/TOPO^TM。

从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证，含有DIB1基因的入门载体与植物表达载体pBIl21进行LR反应。通过PCR检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为pBI121-DIB1(图1)，该基因位于启动子CaMV35S之后，在启动子CaMV35S的驱动下，pBI121可在受体植株内高效表达。

通过液氮冻融法将所构建的PBI121-DIB1过量表达载体转入农杆菌GV3101菌株，通过农杆菌介导的遗传转化法将基因转入山新杨。过量表达DIB1基因的转基因杨树植株茎尖表现出分枝性状(图2)。说明DIBl基因是杨树顶端分叉的关键调节因子，在林木基因工程研究中有重要应用价值。

序列表

<110> 江西省科学院生物资源研究所南京林业大学

<120> 一种樟树分枝调控因子WRKY2/DIB1基因的应用

<130> 100

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1168

<212> DNA

<213> Cinnamomum camphora

<400> 1

ggggactccg cctctgactt tttaaatgat cctctaaatc tttctggctc aaagacactt 60

cttttttcct cttcttcttt ttcttcccct tcttcttctc cttccttcct cttctaatgg 120

ccgttgatct gatgggccac accaagatgg acgaccagat cgcgatccag gaggccacgt 180

cagcaggcct gaggaacatg gagcatctga tctatctcct ctctcaccaa aaccaaacgc 240

aagcccaagc ccccgtcgac tgcagagaga tcacggattc caccgtctcc aaattcaaga 300

aggtcatctc catcctcaac cggaccggcc acgcccgctt ccgccgggga ccggtcattc 360

cggcgaggtc tgagattccg gcgcttcctg cttcggcgca ggccgcggcg gctcagtccc 420

aaaccctaac cctagacttc tcgaagccgt gtccgaacct cggatctgag atctcgaaca 480

gccatttctc caaggagagc ttcagcatct cgccgccgat ctcgtcggcg aactcgtcgt 540

tcatgtcgtc catcaccggc gacggcagcg tctcgaacgg aaagcaggga tcatcgctgc 600

tgcttgccgc cgctccggcc gtttccgccg gaaaaccgcc tctttcgtct gcttcttaca 660

agaagaaatg ccacggccac ggccactccg aggacttgtc cggcaagtac tccctctcgg 720

gccgctgcca ctgctccaag aaaaggaaat cgcgagtgaa gaagagcatc agagtgccgg 780

cgatcagtac gaagatggcc gacatcccgc cggacgagta ctcgtggaga aagtacggcc 840

agaagccgat caaaggctct ccatatccca gagggtacta caagtgcagc acaatgagag 900

gatgccccgc gaggaagcac gtggagcggg ccccagacga tccaacgatg ctgatcgtaa 960

catacgaggg cgagcatcgc cacaatcccc aaactacccc ttccgagtcc gttcctctcc 1020

tgttcgactc agcccttgtg taattgagtc cttcggaggg tattattgta aattcaaacc 1080

gttgtgactc gaaccaattt aaaaaaaaaa aaaaagaaga agaagaagga gttttacata 1140

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1168

<210> 2

<211> 308

<212> PRT

<213> Cinnamomum camphora

<400> 2

Met Ala Val Asp Leu Met Gly His Thr Lys Met Asp Asp Gln Ile Ala

1 5 10 15

Ile Gln Glu Ala Thr Ser Ala Gly Leu Arg Asn Met Glu His Leu Ile

20 25 30

Tyr Leu Leu Ser His Gln Asn Gln Thr Gln Ala Gln Ala Pro Val Asp

35 40 45

Cys Arg Glu Ile Thr Asp Ser Thr Val Ser Lys Phe Lys Lys Val Ile

50 55 60

Ser Ile Leu Asn Arg Thr Gly His Ala Arg Phe Arg Arg Gly Pro Val

65 70 75 80

Ile Pro Ala Arg Ser Glu Ile Pro Ala Leu Pro Ala Ser Ala Gln Ala

85 90 95

Ala Ala Ala Gln Ser Gln Thr Leu Thr Leu Asp Phe Ser Lys Pro Cys

100 105 110

Pro Asn Leu Gly Ser Glu Ile Ser Asn Ser His Phe Ser Lys Glu Ser

115 120 125

Phe Ser Ile Ser Pro Pro Ile Ser Ser Ala Asn Ser Ser Phe Met Ser

130 135 140

Ser Ile Thr Gly Asp Gly Ser Val Ser Asn Gly Lys Gln Gly Ser Ser

145 150 155 160

Leu Leu Leu Ala Ala Ala Pro Ala Val Ser Ala Gly Lys Pro Pro Leu

165 170 175

Ser Ser Ala Ser Tyr Lys Lys Lys Cys His Gly His Gly His Ser Glu

180 185 190

Asp Leu Ser Gly Lys Tyr Ser Leu Ser Gly Arg Cys His Cys Ser Lys

195 200 205

Lys Arg Lys Ser Arg Val Lys Lys Ser Ile Arg Val Pro Ala Ile Ser

210 215 220

Thr Lys Met Ala Asp Ile Pro Pro Asp Glu Tyr Ser Trp Arg Lys Tyr

225 230 235 240

Gly Gln Lys Pro Ile Lys Gly Ser Pro Tyr Pro Arg Gly Tyr Tyr Lys

245 250 255

Cys Ser Thr Met Arg Gly Cys Pro Ala Arg Lys His Val Glu Arg Ala

260 265 270

Pro Asp Asp Pro Thr Met Leu Ile Val Thr Tyr Glu Gly Glu His Arg

275 280 285

His Asn Pro Gln Thr Thr Pro Ser Glu Ser Val Pro Leu Leu Phe Asp

290 295 300

Ser Ala Leu Val

305

Claims

1.一种樟树分枝调控因子DIB1基因在促进杨树植株顶端分枝中的应用，所述的樟树分枝调控因子DIB1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建樟树分枝调控因子DIB1基因的载体；

3)培育筛选得到顶端分枝的转基因植物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述樟树分枝调控因子DIB1基因的载体为pBI121-DIB1。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述载体PBI121-DIB1，在DIB1基因的5′端组装组成型强表达启动子CaMV 35S，在DIB1基因的3′端组装强终止子NOST。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述载体PBl121-DIB1组装NPTII基因的表达盒，作为转基因植物的筛选标记。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述载体PBI121-DIB1组装LB和RB序列，在所述LB和RB序列之间组装DIB1表达框架和筛选标记基因。