CN114085785A - 一种酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酿酒酵母基因工程菌，是通过将酿酒酵母菌中的GAL4启动子替换为铜离子抑制启动子pCTR1或pCTR3，将GAL80启动子替换为铜离子诱导启动子pCUP1构建而成，该工程菌在种子培养期，受铜离子作用会抑制GAL基因调控系统中控制外源基因的pGAL1，pGAL2，pGAL7和pGAL10启动子的表达，避免了产物过早生产，显著提高了传代稳定性。而且该工程菌的GAL基因调控系统不受半乳糖浓度的影响，提高了萜类化合物生物表达，其构建方法简单，生产成本低，发酵生产阶段，无需添加任何诱导剂即可实现目标产物的生产，适合大规模生产，该工程菌在萜类化合物的生产领域有着巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
酿酒酵母是国际公认的安全模式菌株且遗传操作方法成熟，酿酒酵母被广泛地应用于生物类产品、高附加值天然产物及饲料的添加剂的生产。但生产过程中基因过早的泄露表达，会导致外源代谢途径中间产物和蛋白的积累，对宿主细胞造成毒害作用，菌株出于自我保护机制，会通过基因突变的方式将外源基因去除掉，出现所谓的菌株退化，进而生产效率大大降低。因此避免目的基因过早泄露表达是构建酿酒酵母工程菌过程中必须考虑的。
酿酒酵母自身内源的GAL调控系统，是通过GAL4和GAL480蛋白影响着 GAL基因的转录与表达，其中GAL4是转录调节相关的蛋白，GAL4蛋白的表达受SNF1网络和GAL80蛋白的调控，当存在葡萄糖时，SNF1抑制GAL4蛋白的表达从而导致GAL基因不表达；当不存在葡萄糖时，且不存在半乳糖，GAL4 蛋白被GAL80蛋白结合，使得GAL40蛋白不能结合GAL基因的启动子区；当存在半乳糖时，GAL3与GAL80竞争性结合半乳糖，从而释放GAL4蛋白，最终使得GAL基因的启动子起作用。因此在诱导阶段需要添加半乳糖，但是半乳糖昂贵，不利于工业生产成本的降低。如果敲除GAL80基因，GAL基因的启动子受葡萄糖控制，在高葡萄糖浓度时抑制，低葡萄糖浓度启动。酿酒酵母的生长又与培养基中的葡萄糖含量息息相关，会增加调控的复杂性，经常出现目的基因提前泄露表达，导致菌株退化。也有将GAL调控系统改成GAL启动子受铜离子诱导启动的，在生产生时添加铜离子诱导目的基因表达，但在培养过程中添加过量铜离子不符合食品安全的要求，也增加了污水处理的成本。
因此，构建一套遗传稳定且不需要额外添加其他诱导剂的基因调控系统，对于酿酒酵母工程菌的构建显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供的一种酿酒酵母基因工程菌，在所述酿酒酵母基因工程菌的 GAL基因调控系统中，GAL4的启动子包括pCTR1或者pCTR3中的任一种， GAL80的启动子包括pCUP1；所述pCTR1的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；所述pCTR3的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；所述pCUP1的核苷酸序列如SEQ NO.3所示。
进一步的，所述pCTR1或者pCTR3替换的GAL4的启动子为GAL4基因起始密码子前456bp，核苷酸序列如SEQ NO.4所示；所述pCUP1替换的GAL80 的启动子为GAL80基因起始密码子前426bp，核苷酸序列如SEQ NO.5所示。
进一步的，在一定铜离子浓度下，所述GAL基因调控系统中控制外源基因表达的启动子pGAL1，pGAL2，pGAL7或者pGAL10被抑制表达。
本发明还提供了上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
步骤S1，构建含启动子pCTR1的GAL4模块重组质粒pCuZ100，或者构建含启动子pCTR3的GAL4模块重组质粒pCuZ101；
步骤S2，构建含启动子pCUP1的GAL80模块重组质粒pCuZ102；
步骤S3，将步骤S1和步骤S2所得的重组质粒转入宿主菌酿酒酵母中，依次经抗生素抗性筛选，然后通过菌落PCR获取GAL4的启动子为pCTR1和 GAL80的启动子为pCUP1的阳性菌落；或者通过菌落PCR获取GAL4的启动子为pCTR3和GAL80的启动子为pCUP1的阳性菌落；即得到酿酒酵母基因工程菌。
进一步的，步骤S3中，所述宿主菌酿酒酵母包括酿酒酵母30000B、酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1D、酿酒酵母BY4741和酿酒酵母GS-A3中的任一种；所述GS-A3于2021年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为.CCTCC NO:M20211191。
进一步的，构建重组质粒pCuZ100的方法包括以下步骤：
步骤S1，以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用pGAL4-left- F和pGAL4-left-R、pCTR1-F和pCTR1-R、pGAL4-right-F和pGAL4-right-R引物进行PCR反应，获得DNA片段pGAL4-left、pCTR1和pGAL4-right；
步骤S2，以质粒载体pFZ202为模板，用引物G418-1-F和G418-1-R 进行PCR反应，获得G418表达盒G418-1；
步骤S3，将步骤S1获得的DNA片段pGAL4-left、pCTR1和pGAL4- right和步骤S2获得的表达盒G418-1，通过用引物pGAL4left-F和pGAL4-right-R 进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段G418_pCTR1；
步骤S4，将步骤S4获得的DNA片段G418_pCTR1与质粒pMD19-T 连接，获得重组质粒载体，记为pCuZ100。
进一步的，构建重组质粒pCuZ101的方法包括以下步骤：
步骤S1，以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用pGAL4-left- F和pGAL4-left-R、pCTR3-F和pCTR3-R、pGAL4-right-1-F和pGAL4-right-R 引物进行PCR反应，获得DNA片段pGAL4-left、pCTR3和pGAL4-1-right；
步骤S2，以质粒载体pFZ202为模板，用引物G418-1-F和G418-2-R 进行PCR反应，获得G418表达盒G418-2；
步骤S3，将步骤S1获得的DNA片段pGAL4-left、pCTR3和pGAL4-1-right 和步骤S2获得的表达盒G418-2，通过用引物pGAL4-left-F和pGAL4-right-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段G418_pCTR3；
步骤S4，将步骤S4获得的DNA片段G418_pCTR3与质粒pMD19-T 连接，获得重组质粒载体，记为pCuZ101。
进一步的，构建重组质粒pCuZ102的方法包括以下步骤：
步骤S1，以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用pGAL80-left-F和 pGAL80-left-R、pCUP1-F和p CUP1-R、pGAL80-right-1-F和pGAL80-right-R引物进行PCR反应，获得DNA片段pGAL80-left、pCUP1和pGAL80-right；
步骤S2，以质粒载体pFZ202为模板，用引物Hyg-1-F和Hyg-1-R进行PCR 反应，获得潮霉素表达盒Hyg；
步骤S3，将步骤S1获得的DNA片段pGAL80-left、pCUP1和pGAL80-right 和步骤S2获得的表达盒Hyg，通过用引物pGAL80-left-F和pGAL80-right-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段Hyg_pCUP1；
步骤S4，将步骤S4获得的DNA片段Hyg_pCUP1与质粒pMD19-T连接，获得重组质粒载体，记为pCuZ102。
本发明还提供了采用上述酿酒酵母基因工程菌的应用，在所述酿酒酵母基因工程菌的种子培养基中添加在一定铜离子浓度，能够提高所述酿酒酵母基因工程菌传代稳定性。
进一步的，所述铜离子浓度范围为100～300μmol/L。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
(1)本发明提供的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，是通过将酿酒酵母菌中的GAL4启动子替换为铜离子抑制启动子pCTR1或pCTR3，将GAL80启动子替换为铜离子诱导启动子pCUP1，构建出一种受铜离子抑制的GAL基因调控系统的酿酒酵母基因工程菌。该工程菌在种子培养阶段添加一定浓度的铜离子，会抑制GAL基因调控系统中控制外源基因的pGAL1，pGAL2，pGAL7和 pGAL10启动子的表达，避免了产物过早生产，显著提高了传代稳定性，可传代至少20代。而且该工程菌在发酵生产阶段，无需添加任何诱导剂即可实现目标产物的生产。
(2)本发明提供的酿酒酵母基因工程菌的GAL基因调控系统不受半乳糖浓度的影响，改变了原有酿酒酵母原有的GAL基因调控系统，提高了萜类化合物生物表达。
(3)本发明提供的酿酒酵母基因工程菌的构建方法简单，生产成本低，适合大规模生产，该构建方法在萜类化合物的生产领域有着巨大的应用前景。
附图说明
图1为本发明的酿酒酵母基因工程菌的GAL基因调控系统原理示意图；
图2为本发明构建的重组质粒pCuZ100的结构示意图；
图3为本发明构建的重组质粒pCuZ101的结构示意图；
图4为本发明构建的重组质粒pCuZ102的结构示意图；
图5为酿酒酵母基因工程菌GS-A3-Cu-1菌株和酿酒酵母GS-A3-Glu-1菌株平板传代稳定性对比图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明实施方式作进一步地描述。
本发明在研究的过程中使用的材料和方法如下：
本发明中的全基因合成、引物合成及测序皆由武汉天一华煜基因科技有限公司完成，用到的高保真酶(PrimeSTAR GXL DNA Polymerase)，普通Taq 酶(Premix Taq)，pMD19-T Vector等购买于武汉友名生物技术有限公司，限制性内切酶购买于湖北晶茂生物技术有限公司；酿酒酵母30000B为市售。
本发明中的全基因合成、引物合成及测序皆由武汉天一华煜基因科技有限公司完成，用到的高保真酶(PrimeSTAR GXL DNA Polymerase)，普通Taq 酶(Premix Taq)，pMD19-T Vector等购买于武汉友名生物技术有限公司，限制性内切酶购买于湖北晶茂生物技术有限公司；酿酒酵母30000B为市售。
本发明中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备﹑转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著,黄培堂等译，科学出版社，2002)进行。
LB固体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，20g/L 琼脂粉；
YPD培养基：10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖；发酵时添加10％的肉豆蔻酸异丙酯，防止产物挥发；
YPD固体培养基:10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖，20g/L 琼脂粉。
下列实施例中还有未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明,为从商业途径得到的试剂和材料。
如图1所示，本发明构建的的酿酒酵母基因工程菌，含有稳定的受铜离子抑制的GAL基因调控系统，是通过将酿酒酵母菌中的GAL4启动子替换为铜离子抑制启动子pCTR1或pCTR3，将GAL80启动子替换为铜离子诱导启动子 pCUP1，构建得到的。
实施例1-2和对比例1中使用的引物序列信息如表1所示：
表1：引物序列
实施例1
酿酒酵母基因工程菌GS-A3-Cu-1的构建：
步骤S1，构建重组质粒pCuZ100
pCuZ100ΔpGAL4：：G418_pCTR1
以酿酒酵母30000B的基因组为模板，用引物pGAL4-left-F和pGAL4-left-R、pCTR1-F和pCTR1-R、pGAL4-right-F和pGAL4-right-R分别扩增获得 pGAL4-left、pCTR1和pGAL4-right；
以质粒pFZ202为模板，用引物G418-1-F和G418-1--R扩增获得G418表达盒G418-1；
用引物pGAL4left-F和pGAL4-right-R通过重叠延伸PCR将四个片段连接在一起，连接pMD19-T载体，转入大肠内扩增，酶切和测序验证正确后，得到质粒pCuZ100，如图2所示。
步骤S2，构建重组质粒pCuZ102
pCuZ102ΔpGAL80：：hyg_pCUP1
以酿酒酵母3000B的基因组DNA为模板，分别用pGAL80-left-F和 pGAL80-left-R、pCUP1-F和p CUP1-R、pGAL80-right-1-F和pGAL80-right-R引物进行PCR反应，获得DNA片段pGAL80-left、pCUP1和pGAL80-right；
以质粒载体pFZ202为模板，用引物Hyg-1-F和Hyg-1-R扩增，获得潮霉素表达盒Hyg；
用引物pGAL80-left-F和pGAL80-right-R通过重叠延伸PCR将四个片段连接在一起，连接pMD19-T载体，转入大肠内扩增，酶切和测序验证正确后，得到质粒pCuZ102，如图4所示。
步骤S3，酿酒酵母基因工程菌GS-A3-Cu-1的构建
用限制性内切酶PmeI分别线性化质粒pCuZ100和pCuZ102，回收带有目的基因的片段，分两步将片段用酵母醋酸锂转化法将转化pCuZ100和pCuZ102，至酿酒酵母GS-A3-C，挑取转化子并提基因组PCR验证，获得对应正确的转化菌株GS-A3-Cu-1。
实施例2
酿酒酵母基因工程菌GS-A3-Cu-2的构建：
步骤S1，构建重组质粒pCuZ101
pCuZ101ΔpGAL4：：G418_pCTR3
以酿酒酵母30000B的基因组为模板，分别用pGAL4-left-F和pGAL4-left-R、pCTR3-F和pCTR3-R、pGAL4-right-1-F和pGAL4-right-R引物进行PCR反应，获得DNA片段pGAL4-left、pCTR3和pGAL4-1-right；
以质粒pFZ202为模板，用引物G418-1-F和G418-2-R扩增获得G418表达盒G418-2；
用引物pGAL4-left-F和pGAL4-right-R通过重叠延伸PCR将四个片段连接在一起，连接pMD19-T载体，转入大肠内扩增，酶切和测序验证正确后，得到质粒pCuZ101，如图3所示。
步骤S2，构建重组质粒pCuZ102
pCuZ102ΔpGAL80：：hyg_pCUP1
以酿酒酵母3000B的基因组DNA为模板，分别用pGAL80-left-F和 pGAL80-left-R、pCUP1-F和p CUP1-R、pGAL80-right-1-F和pGAL80-right-R引物进行PCR反应，获得DNA片段pGAL80-left、pCUP1和pGAL80-right；
以质粒载体pFZ202为模板，用引物Hyg-1-F和Hyg-1-R扩增，获得潮霉素表达盒Hyg；
用引物pGAL80-left-F和pGAL80-right-R通过重叠延伸PCR将四个片段连接在一起，连接pMD19-T载体，转入大肠内扩增，酶切和测序验证正确后，得到质粒pCuZ102，如图4所示。
步骤S3，酿酒酵母基因工程菌GS-A3-Cu-2的构建
用限制性内切酶PmeI分别线性化质粒pCuZ101和pCuZ102，回收带有目的基因的片段，分两步将片段用酵母醋酸锂转化法将转化pCuZ100和pCuZ102，至酿酒酵母GS-A3-C，挑取转化子并提基因组PCR验证，获得对应正确的转化菌株GS-A3-Cu-2。
对比例1
酿酒酵母基因工程菌GS-A3-Clu-1的构建：
敲除酿酒酵母GS-A3-C菌株中的GAL80基因，得到GAL基因的启动子受葡萄糖控制的重组酿酒酵母GS-A3-Glu-1。
步骤S1，构建重组质粒pCZ107
pCZ107ΔGAL80：：Hyg
以酿酒酵母3000B的基因组DNA为模板，分别用GAL80left-F和 GAL80left-R、GAL80right-F和GAL80right-R引物进行PCR反应，获得DNA 片段GAL80left和GAL80right；
以质粒载体pFZ201为模板，用引物Hyg-7-F和Hyg-7-R扩增，获得潮霉素表达盒Hyg-7；
用引物pGAL80-left-F和pGAL80-right-R通过重叠延伸PCR将三个片段连接在一起，连接pMD19-T载体，转入大肠内扩增，酶切和测序验证正确后，得到质粒pCZ107。
步骤S2，酿酒酵母基因工程菌GS-A3-Glu-1的构建
用限制性内切酶PmeI线性化质粒pCZ107，回收带有目的基因的片段，将片段用酵母醋酸锂转化法转化至酿酒酵母GS-A3-C，挑取转化子并提基因组 PCR验证，,获得对应正确的转化菌株GS-A3-Glu-1。
实施例1-2和对比例1中使用的酿酒酵母GS-A3-C的构建：
步骤S1，构建重组质粒pCZ104
pCZ104ΔURA3：：Hyg_tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1_ERG20_Linker_PAH1_tERG20
(1)以酿酒酵母30000B的基因组为模板﹐用引物tCYC1-F和tCYC1-R、 tHMG1-F和tHMG1-R、pGAL1pGAL10-F和pGAL1pGAL10-R分别扩增获得 tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1；
(2)用引物tCYC1-F和pGAL1pGAL10-R通过重叠延伸PCR反应，将三个片段连接在一起，获得DNA片段：tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1；
(3)以酿酒酵母30000B的基因组为模板﹐用引物ERG20-F和 ERG20-GSG-R扩增获得ERG20_Linker；
(4)用引物GSG-PAH1-F和PAH1-R、扩增获得Linker_PAH1；
(5)用引物tERG20-F和tERG20-1-R扩增获得tERG20
(6)用引物ERG20-F和tERG20-R通过重叠延伸PCR反应，分别将三个片段连接在一起，获得DNA片段：ERG20_Linker_PAH1_tERG20；
(7)以酿酒酵母30000B的基因组为模板﹐用引物URA3-left-F和URA3-left-R、URA3-right-F和URA3-right-R分别扩增获得URA3的左右同源臂 URA3-left和URA3-right；
(8)以质粒pFZ201为模板，用引物Hyg-2-F和Hyg-R扩增获得潮霉素表达盒Hyg；
(9)用引物URA3left-F和URA3left-R通过重叠延伸PCR将 tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1和ERG20_Linker_PAH1_tERG20，URA3-left， URA3-right和Hyg五个DNA片段连接在一起，连接pMD19-T载体，转入大肠内扩增，酶切和测序验证正确后，得到质粒pCuZ104。
步骤S2，构建重组质粒pCZ101
pCZ101ΔpEGR9：：G418_pCUP1
以酿酒酵母30000B的基因组为模板﹐用引物pERG9-left-F和 pERG9-left-R、pCUP1-F和pCUP1-R、pERG9-right-F和pERG9-right-R分别扩增获得pERG9-left、pCUP1和pERG9-right；
以质粒pFZ202为模板，用引物G418-F和G418-R扩增，获得G418表达盒 G418；
用引物pERG9-left-F和pERG9-right-R通过重叠延伸PCR反应，将四个片段连接在一起，连接pMD19-T载体，转入大肠内扩增，酶切和测序验证正确后，得到质粒pCZ101。
步骤S3，构建酿酒酵母GS-A3-C
用限制性内切酶PmeI分别线性化质粒pCZ104和pCZ101，回收带有目的基因的片段，分两步将片段用酵母醋酸锂转化法转化至酿酒酵母GS-A3，挑取转化子并提基因组PCR验证，获得对应正确的转化菌株，并用Cre重组酶去除掉抗性基因后获得酿酒酵母GS-A3-C。
为了证明本发明的酿酒酵母基因工程菌中的GAL基因调控系统在种子阶段添加一定浓度的铜离子，可以严格限制外源基因的表达，避免产物过早生产，显著提高携带该GAL基因调控系统的工程菌的传代稳定性，在转入发酵阶段后，需任何诱导剂就可以实现产物的生产。将实施例1构建的酿酒酵母基因工程菌 GS-A3-Cu-1、实施例2构建的酿酒酵母基因工程菌GS-A3-Cu-2和对比例1构建的GAL基因的启动子受葡萄糖控制的重组酿酒酵母GS-A3-Glu-1，分别进行摇瓶和平板传代实验，进行对比研究。
1.摇瓶发酵验证不同铜离子浓度对法尼醇产量的影响
分别取10μL保存在甘油管的菌株GS-A3-Cu-1，GS-A3-Cu-2和GS-A3-Glu-1 到含有5mLYPD(含铜离子终浓度为200μmol/L)培养基的PA瓶中，30℃摇床220rpm培养16h，获得一级种子；将一级种子以1％的转接量转到含有200 mL含有不同浓度铜离子YPD培养基的摇瓶中，30℃摇床220rpm培养五天，测定法尼醇的含量。添加的铜离子浓度在0-300μmol/L的范围之间。
测定发酵液中法尼醇浓度的方法：
检测流程：
将45mL发酵液置于50mL离心管中，于10000r/min离心10min，小心吸取上层肉豆蔻酸异丙酯液体，用色谱级正己烷稀释至合适浓度检测。
仪器：使用安捷伦7890A气相色谱仪，色谱柱为Agilent HP-5(30mx0.32 mmx0.25μm)，柱箱温度：初始温度100℃，保留2min，以10℃/min升至280℃, 保留3min，进样口温度280℃，进样量1μL，柱流量1mL/min，注入分流比1:50，检测器(FID)温度280℃，氮气作为载气，入口压力是12-18psi，模式为恒流模式，标准品：法尼醇(SIGMA)。
结果如表2所示，GS-A3-Glu-1产量基本不受铜离子浓度的影响。而对于 GS-A3-Cu-1和GS-A3-Cu-2，随着铜离子浓度的增加，对产物表达的抑制也在加强，在80μmol/L左右完全抑制。同时发现GS-A3-Cu-1的产量比GS-A3-Cu-2 偏高一些，说明，铜离子抑制启动子pCTR1和pCTR3的启动效率还是有所差距。进一步说明，本发明的构建的GAL基因调控系统，使得酿酒酵母基因工程菌 GS-A3-Cu-1和GS-A3-Cu-1在发酵生产阶段，无需添加任何诱导剂即可实现目标产物的生产。相较于受半乳糖诱导启动的GAL系统，本方案在产产物阶段不需要添加昂贵的半乳糖，大大节省了生产成本；相较于直接敲除GAL80，产物的表达受葡萄糖抑制的方案，本方案的控制更加严格，不会在前期生长阶段出现产物的泄露表达，进而影响最终产量；相较于将GAL系统改造成受铜离子诱导启动的方案，本方案不需要在产产物阶段添加大量铜离子，减少了污水处理的负担，更加环保。本方案改造的受铜离子抑制的GAL系统，只需要在种子阶段添加少量铜离子，即可严格限制产物的泄露表达，在产产物阶段无需添加任何诱导物便可开启产物的表达，是一种经济环保的选择，具有明显优势。
表2：
2.酿酒酵母基因工程菌GS-A3-Cu-1与酿酒酵母GS-A3-Glu-1平板传代稳定性对比
取10μL保存在甘油管的菌株划线于含铜离子终浓度为200μmol/L的YPD 平板上，30℃培养箱培养三天；从三天的平板上挑点到新的含铜离子终浓度为 200μmol/L的YPD平板上划线传代，30℃培养箱培养三天，如此往复传20代，每代菌YPD摇瓶发酵检测法尼醇产量。
结果如图5所示，相较于敲除GAL80基因受葡萄糖控制菌株GS-A3-Glu-1，受铜离子抑制的GAL基因调控的菌株GS-A3-Cu-1，基因工程菌株GS-A3-Cu-1 可稳定传代至少20代。说明在添加一定浓度的铜离子的条件下，可以严格限制基因的表达，避免产物过早生产，显著提高本发明的酿酒酵母基因工程菌的传代稳定性。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北冠众通科技有限公司
<120> 一种酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用
<141> 2021-10-20
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 503
<212> DNA
<213> 酿酒酵母 pCTR1
<400> 1
tttgttatct aagcaacttg gcacatttcc ctactatact acaaaccgat acgtaaatac 60
ttccctaaat agcatatgaa ttattcagta atttttaagg atcgaaactg cacctcaact 120
attcgttact gtggttatgt tctcatgtat tgatgcaaat catgggatat ttgctcaaga 180
cgacggtaaa atgagcaaaa atggcacgat cctgaaaaga gcacttttca agattcgggc 240
tacaaaatgc aacataaaaa atgttgtatt gtcatctcga gagggtcttg tatgttttat 300
tcctcttatg attagttcac attagtaaaa cagatacgca gtgtgctctt aataaacaac 360
tactccatag ctttatttgc ataacaaaac ttttaagcac aaacttaaac aggtggagta 420
atagttcggc ggcgactcaa attacatttg ttggaagaat cgaatagaaa ataaaaaaaa 480
gtgtattata tttgacattc aaa 503
<210> 2
<211> 734
<212> DNA
<213> 酿酒酵母 pCTR3
<400> 2
gtattccaat gagaatcgct agaaatgctt taccagaact agactacttg tcgcagatca 60
cttttgaact gtatgagagt acggatgctt ctggtcaaaa atcgcattcc attagactga 120
aaatgtctcc tgggtgtcat actcaagatc cgttagatgt tcaattagat gacaggcatt 180
atattagttg tattccaaag atttccctga cgaagcattt ggatatggac tacgttcaac 240
agaaattgag aaacaaattt accagggtca ttatgcctcc gaaatttaca ccagtaaaca 300
ttacgagccc caacttgagt ttccagaaac gcaaaaccag aagaaagtcg gtatctgttg 360
agaagttgaa gcttcctgcc tcgtccggat cttcatcatc tacctccgtt aacaagacat 420
tagattagtg atcacaccca atttttaatt tagcaaccca aaataaataa gtatttactc 480
aacttttttt taataaaaaa aaacttaatt gaattttgct cgcgatcttt aggtccgggg 540
ttttcgttga acccttagac gagcaaatta gcgccataag gatatacgtc agagcacatt 600
aattagtgac atatacctat ataaagagca accttctccg atagacttgt aatttatctt 660
atttcatttc ctaacacttt ggtcgaagaa gagggataag aacagacgaa aacacattta 720
agggctatac aaag 734
<210> 3
<211> 456
<212> DNA
<213> 酿酒酵母 pGAL4
<400> 3
ccggtttaaa cgaggatccc ttaagtttaa acaacaacag caagcaggtg tgcaagacac 60
tagagactcc taacatgatg tatgccaata aaacacaaga gataaacaac attgcatgga 120
ggccccagag gggcgattgg tttgggtgcg tgagcggcaa gaagtttcaa aacgtccgcg 180
tcctttgaga cagcattcgc ccagtatttt ttttattcta caaaccttct ataatttcaa 240
agtatttaca taattctgta tcagtttaat caccataata tcgttttctt tgtttagtgc 300
aattaatttt tcctattgtt acttcgggcc tttttctgtt ttatgagcta ttttttccgt 360
catccttccc cagattttca gcttcatctc cagattgtgt ctacgtaatg cacgccatca 420
ttttaagaga ggacagagaa gcaagcctcc tgaaag 456
<210> 4
<211> 459
<212> DNA
<213> 酿酒酵母 pCUP1
<400> 4
cgatcccatt accgacattt gggcgctata cgtgcatatg ttcatgtatg tatctgtatt 60
taaaacactt ttgtattatt tttcctcata tatgtgtata ggtttatacg gatgatttaa 120
ttattacttc accacccttt atttcaggct gatatcttag ccttgttact agttagaaaa 180
agacattttt gctgtcagtc actgtcaaga gattcttttg ctggcatttc ttctagaagc 240
aaaaagagcg atgcgtcttt tccgctgaac cgttccagca aaaaagacta ccaacgcaat 300
atggattgtc agaatcatat aaaagagaag caaataactc cttgtcttgt atcaattgca 360
ttataatatc ttcttgttag tgcaatatca tatagaagtc atcgaaatag atattaagaa 420
aaacaaactg tacaatcaat caatcaatca tcacataaa 459
<210> 5
<211> 426
<212> DNA
<213> 酿酒酵母 pGAL80
<400> 5
tgcaacaaag tgcaagcata gtggggcctt cttccaatgc taatccggtc actgccactg 60
ctgctacgga aaaccaacct aaaggtatta acttcttcac tataagaaaa tcacacgagc 120
gcccggacga tgtctctgtt taaatggcgc aagttttccg ctttgtaata tatatttata 180
cccctttctt ctctcccctg caatataata gtttaattct aatattaata atatcctata 240
ttttcttcat ttaccggcgc actctcgccc gaacgacctc aaaatgtctg ctacattcat 300
aataaccaaa agctcataac tttttttttt gaacctgaat atatatacat cacatatcac 360
tgctggtcct tgccgaccag cgtatacaat ctcgatagtt ggtttcccgt tctttccact 420
cccgtc 426
Claims (10)
1.一种酿酒酵母基因工程菌，其特征在于：在所述酿酒酵母基因工程菌的GAL基因调控系统中，GAL4的启动子包括pCTR1或者pCTR3中的任一种，GAL80的启动子包括为pCUP1；所述pCTR1的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；所述pCTR3的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；所述pCUP1的核苷酸序列如SEQ NO.3所示。
2.如权利要求1所述的一种酿酒酵母基因工程菌，其特征在于：所述pCTR1或者pCTR3替换的GAL4的启动子为GAL4基因起始密码子前456bp，核苷酸序列如SEQ NO.4所示；所述pCUP1替换的GAL80的启动子为GAL80基因起始密码子前426bp，核苷酸序列如SEQ NO.5所示。
3.如权利要求2所述的一种酿酒酵母基因工程菌，其特征在于：在一定铜离子浓度下，所述GAL基因调控系统中控制外源基因表达的启动子pGAL1，pGAL2，pGAL7或者pGAL10被抑制表达。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤
S1、构建含启动子pCTR1的GAL4模块重组质粒pCuZ100，或者构建含启动子pCTR3的GAL4模块重组质粒pCuZ101；
S2、构建含启动子pCUP1的GAL80模块重组质粒pCuZ102；
S3、将步骤S1和步骤S2所得的重组质粒转入宿主菌酿酒酵母中，依次经抗生素抗性筛选，然后通过菌落PCR获取GAL4的启动子为pCTR1和GAL80的启动子为pCUP1的阳性菌落；或者通过菌落PCR获取GAL4的启动子为pCTR3和GAL80的启动子为pCUP1的阳性菌落；即得到酿酒酵母基因工程菌。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：步骤S3中，所述宿主菌酿酒酵母包括酿酒酵母30000B、酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1D、酿酒酵母BY4741和酿酒酵母GS-A3中的任一种；所述GS-A3于2021年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为.CCTCC NO:M20211191。
6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：构建重组质粒pCuZ100的方法包括以下步骤：
S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用pGAL4-left-F和pGAL4-left-R、pCTR1-F和pCTR1-R、pGAL4-right-F和pGAL4-right-R引物进行PCR反应，获得DNA片段pGAL4-left、pCTR1和pGAL4-right；
S2、以质粒载体pFZ202为模板，用引物G418-1-F和G418-1-R进行PCR反应，获得G418表达盒G418-1；
S3、将步骤S1获得的DNA片段pGAL4-left、pCTR1和pGAL4-right和步骤S2获得的表达盒G418-1，通过用引物pGAL4left-F和pGAL4-right-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段G418_pCTR1；
S4、将步骤S4获得的DNA片段G418_pCTR1与质粒pMD19-T连接，获得重组质粒载体，记为pCuZ100。
7.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：构建重组质粒pCuZ101方法包括以下步骤：
S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用pGAL4-left-F和pGAL4-left-R、pCTR3-F和pCTR3-R、pGAL4-right-1-F和pGAL4-right-R引物进行PCR反应，获得DNA片段pGAL4-left、pCTR3和pGAL4-1-right；
S2、以质粒载体pFZ202为模板，用引物G418-1-F和G418-2-R进行PCR反应，获得G418表达盒G418-2；
S3、将步骤S1获得的DNA片段pGAL4-left、pCTR3和pGAL4-1-right和步骤S2获得的表达盒G418-2，通过用引物pGAL4-left-F和pGAL4-right-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段G418_pCTR3；
S4、将步骤S4获得的DNA片段G418_pCTR3与质粒pMD19-T连接，获得重组质粒载体，记为pCuZ101。
8.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：构建重组质粒pCuZ102的方法包括以下步骤：
S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用pGAL80-left-F和pGAL80-left-R、pCUP1-F和pCUP1-R、pGAL80-right-1-F和pGAL80-right-R引物进行PCR反应，获得DNA片段pGAL80-left、pCUP1和pGAL80-right；
S2、以质粒载体pFZ202为模板，用引物Hyg-1-F和Hyg-1-R进行PCR反应，获得潮霉素表达盒Hyg；
S3、将步骤S1获得的DNA片段pGAL80-left、pCUP1和pGAL80-right步骤S2获得的表达盒Hyg，通过用引物pGAL80-left-F和pGAL80-right-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段Hyg_pCUP1；
S4、将步骤S4获得的DNA片段Hyg_pCUP1与质粒pMD19-T连接，获得重组质粒载体，记为pCuZ102。
9.一种采用如权利要求1-3所述的酿酒酵母基因工程菌的应用，其特征在于：在所述酿酒酵母基因工程菌的种子培养基中添加在一定铜离子浓度，能够提高所述酿酒酵母基因工程菌传代稳定性。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述铜离子浓度范围为100～300μmol/L。
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