CZ299506B6 - Modifikovaný nebo transformovaný kvasinkový kmen a zpusob oxidace in vivo substrátu - Google Patents
Modifikovaný nebo transformovaný kvasinkový kmen a zpusob oxidace in vivo substrátu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ299506B6 CZ299506B6 CZ0351299A CZ351299A CZ299506B6 CZ 299506 B6 CZ299506 B6 CZ 299506B6 CZ 0351299 A CZ0351299 A CZ 0351299A CZ 351299 A CZ351299 A CZ 351299A CZ 299506 B6 CZ299506 B6 CZ 299506B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- yeast strain
- atf2
- strain
- transformed
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 143
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 45
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims description 38
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 title claims description 24
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 title claims description 17
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 title claims description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 61
- ORNBQBCIOKFOEO-YQUGOWONSA-N Pregnenolone Natural products O=C(C)[C@@H]1[C@@]2(C)[C@H]([C@H]3[C@@H]([C@]4(C)C(=CC3)C[C@@H](O)CC4)CC2)CC1 ORNBQBCIOKFOEO-YQUGOWONSA-N 0.000 claims abstract description 59
- 229960000249 pregnenolone Drugs 0.000 claims abstract description 59
- ORNBQBCIOKFOEO-QGVNFLHTSA-N pregnenolone Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 ORNBQBCIOKFOEO-QGVNFLHTSA-N 0.000 claims abstract description 54
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 101150003525 atf-2 gene Proteins 0.000 claims description 62
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 claims description 36
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 33
- 101100010928 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tuf gene Proteins 0.000 claims description 29
- 101150001810 TEAD1 gene Proteins 0.000 claims description 29
- 101150074253 TEF1 gene Proteins 0.000 claims description 29
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 claims description 29
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 26
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 claims description 24
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 claims description 24
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 claims description 24
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 20
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 19
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 19
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 claims description 18
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 claims description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 101000974934 Homo sapiens Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-2 Proteins 0.000 claims description 15
- 101000997829 Homo sapiens Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 15
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims description 13
- JERGUCIJOXJXHF-TVWVXWENSA-N 17alpha-hydroxypregnenolone Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2 JERGUCIJOXJXHF-TVWVXWENSA-N 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 10
- JERGUCIJOXJXHF-UHFFFAOYSA-N 17alpha-Hydroxypregnenolone Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(=O)C)(O)C1(C)CC2 JERGUCIJOXJXHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- DBPWSSGDRRHUNT-UHFFFAOYSA-N 17alpha-hydroxy progesterone Natural products C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(=O)C)(O)C1(C)CC2 DBPWSSGDRRHUNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229950000801 hydroxyprogesterone caproate Drugs 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- MSEZLHAVPJYYIQ-UHFFFAOYSA-N 3-oxo delta(4)-steroid Chemical compound C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCCC1(C)CC2 MSEZLHAVPJYYIQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101100380511 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ATF2 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 5
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 5
- 125000003461 pregnenolone group Chemical group 0.000 claims description 5
- 108010084976 Cholesterol Side-Chain Cleavage Enzyme Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 4
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 102100023033 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-2 Human genes 0.000 claims 2
- GMVAAADTMXYSDE-XFNFOBRPSA-N 2-[(8R,9S,10S,13S,14S,17R)-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]ethenol Chemical compound OC=C[C@H]1CC[C@H]2[C@@H]3CCC4CCCC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C GMVAAADTMXYSDE-XFNFOBRPSA-N 0.000 claims 1
- DOMWKUIIPQCAJU-LJHIYBGHSA-N Hydroxyprogesterone caproate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(C)=O)(OC(=O)CCCCC)[C@@]1(C)CC2 DOMWKUIIPQCAJU-LJHIYBGHSA-N 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 75
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 42
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 29
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 28
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 27
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 27
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 21
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 20
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 20
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 20
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 101100026251 Caenorhabditis elegans atf-2 gene Proteins 0.000 description 13
- 102100033295 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- CRRKVZVYZQXICQ-RJJCNJEVSA-N Pregnenolone acetate Chemical compound C([C@@H]12)C[C@]3(C)[C@@H](C(C)=O)CC[C@H]3[C@@H]1CC=C1[C@]2(C)CC[C@H](OC(=O)C)C1 CRRKVZVYZQXICQ-RJJCNJEVSA-N 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 9
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- DBPWSSGDRRHUNT-CEGNMAFCSA-N 17α-hydroxyprogesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2 DBPWSSGDRRHUNT-CEGNMAFCSA-N 0.000 description 8
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 6
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical class CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 5
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 102100027516 Cholesterol side-chain cleavage enzyme, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000861327 Homo sapiens Cholesterol side-chain cleavage enzyme, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 3
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 3
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 3
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 3
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 2
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 2
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229940099352 cholate Drugs 0.000 description 2
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 2
- FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N dehydroepiandrosterone Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC=C21 FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M sodium cholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 2
- DNXHEGUUPJUMQT-UHFFFAOYSA-N (+)-estrone Natural products OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 DNXHEGUUPJUMQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZJWDPNRJALLNS-VPUBHVLGSA-N (-)-beta-Sitosterol Natural products O[C@@H]1CC=2[C@@](C)([C@@H]3[C@H]([C@H]4[C@@](C)([C@H]([C@H](CC[C@@H](C(C)C)CC)C)CC4)CC3)CC=2)CC1 KZJWDPNRJALLNS-VPUBHVLGSA-N 0.000 description 1
- CSVWWLUMXNHWSU-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-ethyl-5alpha-cholest-22-en-3beta-ol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 CSVWWLUMXNHWSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N (22E)-cholesta-5,7,22-trien-3beta-ol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- KLEXDBGYSOIREE-UHFFFAOYSA-N 24xi-n-propylcholesterol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CCC)C(C)C)C1(C)CC2 KLEXDBGYSOIREE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 5-fluoroorotic acid Chemical compound OC(=O)C=1NC(=O)NC(=O)C=1F SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710170920 62 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150096273 ADE2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150059830 ATF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150028385 ATG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 101100519159 Arabidopsis thaliana PCR3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000222128 Candida maltosa Species 0.000 description 1
- LPZCCMIISIBREI-MTFRKTCUSA-N Citrostadienol Natural products CC=C(CC[C@@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC[C@H]4[C@H](C)[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)C(C)C LPZCCMIISIBREI-MTFRKTCUSA-N 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102000003849 Cytochrome P450 Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- ARVGMISWLZPBCH-UHFFFAOYSA-N Dehydro-beta-sitosterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)CCC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 ARVGMISWLZPBCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FMGSKLZLMKYGDP-UHFFFAOYSA-N Dehydroepiandrosterone Natural products C1C(O)CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CC=C21 FMGSKLZLMKYGDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 1
- 101710082056 Ethanol acetyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 101150007280 LEU2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100115709 Mus musculus Stfa2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100313266 Mus musculus Tead1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100062121 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cyc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100311241 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) STF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 1
- 101710146343 Scaffold protein D13 Proteins 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- OILXMJHPFNGGTO-ZRUUVFCLSA-N UNPD197407 Natural products C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)C=C[C@H](C)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-ZRUUVFCLSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004404 adrenal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- MJVXAPPOFPTTCA-UHFFFAOYSA-N beta-Sistosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2C3CC=C4C(C)C(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(C)C MJVXAPPOFPTTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N beta-Sitostanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N beta-sitosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2(C)C3CC=C4CC(O)CCC4C3CCC12C)C(C)C NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- CRFNGMNYKDXRTN-CITAKDKDSA-N butyryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CRFNGMNYKDXRTN-CITAKDKDSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N ergosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H](CC[C@]3([C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- OEXFMSFODMQEPE-HDRQGHTBSA-N hexanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OEXFMSFODMQEPE-HDRQGHTBSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 101150085823 hsdR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002899 hydroxyprogesterone Drugs 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000006180 nutrition needs Nutrition 0.000 description 1
- XDUHQPOXLUAVEE-BPMMELMSSA-N oleoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 XDUHQPOXLUAVEE-BPMMELMSSA-N 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229960002847 prasterone Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N propionyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N sitosterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N 0.000 description 1
- 235000015500 sitosterol Nutrition 0.000 description 1
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 description 1
- NLQLSVXGSXCXFE-UHFFFAOYSA-N sitosterol Natural products CC=C(/CCC(C)C1CC2C3=CCC4C(C)C(O)CCC4(C)C3CCC2(C)C1)C(C)C NLQLSVXGSXCXFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 125000002328 sterol group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 229920001664 tyloxapol Polymers 0.000 description 1
- MDYZKJNTKZIUSK-UHFFFAOYSA-N tyloxapol Chemical compound O=C.C1CO1.CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 MDYZKJNTKZIUSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004224 tyloxapol Drugs 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Modifikovaný kvasinkový kmen, v kterém je acetyl-CoA pregne-nolonová acetyltransferázová (APAT) aktivita eliminovaná obmenou ATF2 genu S.cerevisiae nebo genu, který kóduje protein mající APAT aktivitu a vykazuje približne 60% nebo vyšší sekvencní identitu se sekvencí YGR177C proteinu. Transformovaný kvasinkový kmen, v kterém je APAT aktivita eliminovaná obmenou výše uvedeného genu, exprimující alespon jeden enzym z dráhy biosyntézy hydrokortizonu z cholesterolu zvolený ze souboru zahrnujícího enzym štepící cholesterolový vedlejší retezec (P.sub.450.n.SCC), systém 3.beta.-hydroxy-delta.sup.5.n.-steroidová dehydrogenáza/delta.sup.5.n.-delta.sup.4.n.-steroidizomeráza (3.beta.-HSD) a - 17.alfa.-steroidhydroxylázu (P.sub.450.n.17.alfa.). Zpusoboxidace in vivo substrátu ze souboru zahrnujícíhoendogenní sterol, exogenní sterol a exogenní steroid, pri kterém se používá transformovaný kvasinkový kmen, který se kultivuje bud samotný, pokud kmen produkuje endogenní sterol, nebo se inkubuje s exogenním sterolem nebo s exogenním steroidem a získaná oxidovaná sloucenina se prípadne izoluje.
Description
Modifikovaný kvasinkový kmen, v kterém je acetyl-CoA pregne-nolonová acetyltransferázová (APAT) aktivita eliminovaná obměnou ATF2 genu S.cerevisiae nebo genu, který kóduje protein mající APAT aktivitu a vykazuje přibližně 60% nebo vyšší sekvenční identitu se sekvencí YGR177C proteinu. Transformovaný kvasinkový kmen, v kterém je APAT aktivita eliminovaná obměnou výše uvedeného genu, exprimující alespoň jeden enzym z dráhy biosyntézy hydrokortizonu z cholesterolu zvolený ze souboru zahrnujícího enzym štěpící cholesteroíový vedlejší řetězec (P450SCC), systém 3P-hydroxy-delta5-steroidová dehydrogenáza/delta5-delta4-steroidizomeráza í3 β-1 ISDj a 17a-steroidhydroxylázu (P4501 7a). Způsob oxidace in vivo substrátu ze souboru zahrnujícího endogenní sterol, exogenní sterol a exogenní steroid, při kterém se používá transformovaný kvasinkový kmen, který se kultivuje buď samotný, pokud kmen produkuje endogenní sterol, nebo se inkubuje s exogenním sterolem nebo s exogenním steroidem a získaná oxidovaná sloučenina se případně izoluje.
Modifikovaný nebo transformovaný kvasinkový kmen a způsob oxidace in vivo substrátu
Oblast techniky
Vynález se týká kvasinkového kmene majícího přerušený ATF2 gen a jeho použití.
Dosavadní stav techniky
Vytváření 3-oxo-delta4-steroidů z 3 β-hydroxy-delta5 prekurzorů v biosyntéze všech tříd steroidových hormonů v organizmu savců je katalyzováno enzymem systémem 3P-hydroxy-delta5steroiddehydrogenáza (EC 1.1.1.145) a delta5-delta4-steroidizomeráza (EC 5.3.3.1) označovaným jako ββ-HSD. Například 3β-Ηδϋ katalyzuje transformaci pregnenolonu na progesteron,
17a-hydroxypregnenolonu na 17a-hydroxyprogesteron, dehydroepidiolu na testosteron (Simard
J., Durocher, F., Mébarki F., Turgeon C., Sanchez R., Labrie Y., Couet J., Trudel C., Rhéaume E., Morel Y., Luu-The V. a Labrie F., J. Endocrinol. 150, str. 5189 až 5207, 1996).
Proto je 3fi-HSD jedním z klíčových enzymů pro biosyntézu hydrokortizonu z cholesterolu v nadledvinkové kůře savců (obr. 1).
Použití rekombinantních mikroorganizmů, zvláště modifikovaných kvasinek, umožňující heterologní expresi jednoho nebo několika savčích enzymů této biosyntetické cesty pro produkci hydrokortizonu nebo meziproduktů této biosyntézy je popsáno v literatuře (například evropská zveřej25 něná přihláška vynálezu číslo EP 340878; americký patentový spis LS 5 137722; Dumas B., Cauet G., Degryse E., Spagnoli R. & Achstetter T., Cytochrome P450.8. Mezinárodní konference. Vydavatel M.C. Lechner. John Libbey Eurotext, Paris str. 527 až 530, 1994; Cauet G., Dumas B., Degryse E., Spagnoli R. a Achstetter T., Cytochrome P-450 biochemistry, biophysics and molecular biology, vydavatel Lechner M.C., str. 583 až 586, John Libbey Eurotext, 1994).
Jestliže se funkční 3β-Η8ϋ expresuje ve kvasinkách, transformované kvasinkové buňky nekonvertují úplně 3β-hydroxysteroidy na odpovídající 3-oxosteroidy, například pregnenolon na progesteron, nýbrž kumulují sloučeninu, která se také pozoruje v případě buněk netransformované kvasinky. Identifikace sloučeniny, akumulované jako 3fi-acetátester výchozího steroidu, a charakterizace enzymu majícího acyltransferázovou aktivitu, který je zodpovědný za tuto esterifikaci (označovaného nadále jako APAT - „acetyl-koenzym A pregnenolon acetyltransferáza), je zde popsán. Kromě toho akumulace pregnenolonacetátu je popsána v evropské zveřejněné přihlášce vynálezu číslo EP 727489. Na základě pozorování je možno konstatovat, že esterifikace 3fi-hydroxysteroidů, produkovaných kvasinkami, je nežádoucí jelikož je zodpovědná za sekun40 dámí reakce a za vedlejší produkty vedoucí k poklesu výtěžku akumulovaných 3fi-hydroxysteroidů, například pregnenolonu, nebo k poklesu výtěžku biokonverze 3fi-hydroxy-delta5steroidů na 3-oxo-delta4-steroidy, zvláště při produkci progesteronu nebo 17a-hydroxyprogesteronu vedoucí k poklesu následné produkce hydrokortizonu biosyntetickou cestou, shora zmíněnou.
Se zřetelem na zjištěné skutečnosti, shora zmíněné, se vynález týká konstrukce kvasinkových kmenů, které jsou prosty nežádoucí APAT aktivity obměnou genu kódujícího tuto aktivitu, vedoucí ke stabilizaci 3β-1ψάπ^8ίεΓθίάύ v jeho přítomnosti. Těchto kmenů se proto může použít jako výchozích kmenů pro konstrukci rekombinantních kmenů, které jsou schopny kon50 vertovat 3 β-hydroxysteroidy na další produkty se zlepšenými výtěžky.
Vynález také popisuje konstrukci kvasinkových kmenů, prostých APAT aktivity obměnou genu kódujícího tuto aktivitu a buď expresí 3fi-HSD, nebo cytochromu P45ol7a nebo koexpresí 3βHSD a cytochromu P45ol7a cestou biosyntézy hydrokortizonu z cholesterolu. Kmeny, expresující
- 1 CZ 299506 B6 například 3fi-HSD, umožňují zlepšení výtěžků biokonverze 3p-hydroxy-delta5-steroidů na 3oxo-delta4-steroidy a může se jich proto použít při způsobech zlepšené produkce hydrokortizonu nebo jeho meziproduktů v kvasinkách.
Podstata vynálezu
Podle prvního aspektu vynálezu je v hlavním provedení předmětem vynálezu a) modifikovaný kvasinkový kmen, v kterém je acetyl-CoA pregnelovaná acetyltransferázová (APAT) aktivita ío eliminovaná obměnou ATF2 genu S. cerevisiae nebo genu který kóduje protein mající APAT aktivitu a vykazuje přibližně 60% nebo vyšší sekvenční identitu se sekvencí YGR177C proteinu.
V přednostních provedeních prvního aspektu vynálezu je nárokovaný
- b) modifikovaný kvasinkový kmen podle hlavního provedení, v kterém je obměněným
ATF2 genem gen S. cerevisiae;
- c) modifikovaný kvasinkový kmen podle provedení b), v kterém je ATF2 gen obměněný vložením DNA sekvence, která má alespoň jeden nukleotid;
- d) modifikovaný kvasinkový kmen podle provedení c), v kterém je ATF2 gen obměněný vložením URA3 selekčního genu nebo kvasinkového expresního bloku skládajícího se zTEFl promotoru a PGK terminátoru;
- e) modifikovaný kvasinkový kmen podle provedení d), v kterém je ATF2 gen obměněný vložením URA 3 selekčního genu;
- f) modifikovaný kvasinkový kmen podle provedení e), označený jako TGY156 a uložený ve sbírce Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paříž Cedex 15 Francie, dne 2. února 1998 pod přírůstkovým číslem
1-1977;
- g) modifikovaný kvasinkový kmen podle provedení e), označený jako TGY158 a uložený ve sbírce Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paříž Cedex 15 Francie, dne 2. února 1998 pod přírůstkovým číslem
1-1976; a
- h) modifikovaný kvasinkový kmen podle provedení e), ve kterém je ATF2 gen obměněný vložením expresního bloku skládajícího se z TEF1 promotoru a PGK terminátoru.
Podle druhého aspektu vynálezu je v hlavním provedení předmětem vynálezu i) transformovaný kvasinkový kmen, v kterém je acetyl-CoA pregnenolonová acetyltransferázová (APAT) aktivita eliminovaná obměnou ATF2 genu S. cerevisiae nebo genu, který kóduje protein mající APAT aktivitu a vykazuje přibližně 60% nebo vyšší selekční identitu se sekvencí YGR177C proteinu a exprimující alespoň jeden enzym z dráhy biosyntézy hydrokortizonu z cholesterolu zvolený ze souboru zahrnujícího
- enzym štěpící cholesterolový vedlejší řetězec (P450SCC),
- systém 3fi-hydroxy-delta5-steroidová dehydrogenáza/delta5-delta4-steroidizomeráza (3β50 HSD) a
- 17 α-steroidhydroxylázu (P45o 17α).
-2CZ 299506 B6
V přednostních provedeních druhého aspektu vynálezu je nárokovaný
- j) transformovaný kvasinkový kmen podle provedení i), v kterém je obměněným ATF2 genem gen S. cerevisiae;
- k) transformovaný kvasinkový kmen podle provedení j), v kterém je ATF2 gen obměněný vložením DNA sekvence, která má alespoň jeden nukleotid;
- 1) transformovaný kvasinkový kmen podle provedení j), ve kterém je ATF2 gen obměio něný vložením URA3 selekčního genu;
- m) transformovaný kvasinkový kmen podle provedení 1), exprimují 3P-HSD;
- n) transformovaný kvasinkový kmen podle provedení 1), označený jako TGY158/15 pTG 10862 a uložený ve sbírce Collection Nationale du Cultures de Microorganismes (CNCM)
Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paříž Cedex 15 Francie, dne 2. února 1998 pod přírůstkovým číslem 1-1978.
- o) transformovaný kvasinkový kmen podle provedení j), v kterém je ATF2 gen obměněný vložením expresního bloku skládajícího se z TEF1 promotoru a PGK terminátoru;
- p) transformovaný kvasinkový kmen podle provedení o) exprimující P450l 7a;
- q) transformovaný kvasinkový kmen podle provedení p), označený jako TGY186/25 pTG10435 a uložený ve sbírce Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM)
Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paříž Cedex 15 Francie, dne 20. ledna 1999 pod přírůstkovým číslem 1-2119.
- r) transformovaný kvasinkový kmen podle provedení o) koexprimující 3P-HSD aP450 1 7a;
- s) transformovaný kvasinkový kmen podle provedení r), označený jako TGY186/pTG104147 a uložený ve sbírce Collection National de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paříž Cedex 15 Francie, dne 20. ledna 1999 pod přírůstkovým číslem 1-2118:
Podle třetího aspektu vynálezu je v hlavním provedení předmětem vynálezu t) Způsob oxidace vin vivo substrátu ze souboru zahrnujícího endogenní sterol, exogenní sterol a exogenní steroid, při kterém se používá transformovaný kvasinkový kmen podle provedení i) až s), který se kulti40 vuje buď samotný, pokud kmen produkuje endogenní sterol, nebo se inkubuje s exogenním sterolem nebo s exogenním steroidem a získaná oxidovaná sloučenina se případně izoluje.
V přednostních provedeních třetího aspektu vynálezu je nárokovaný
- u) Způsob oxidace in vivo podle provedení t), při kterém je substrát 3(3-hydroxysteroid a při kterém se používá transformovaný kvasinkový kmen podle provedení m), uvedeného výše, a získaný 3-oxo-delta4-steroid se případně izoluje;
- v) Způsob oxidace in vivo podle provedení u), při kterém je 3p-hydroxysteroidem pregne50 nolon nebo 17a-hydroxy-pregnenolon;
- x) Způsob oxidace in vivo podle provedení t), při kterém je substrátem steroid a při kterém se používá transformovaný kvasinkový kmen podle provedení p) a získaný 17a-hydroxysteroid se případně izoluje;
-3CZ 299506 B6
- y) Způsob oxidace in vivo podle provedení x), při kterém je steroidovým substrátem pregnenolon nebo progesteron;
- z) Způsob oxidace in vivo podle provedení t), při kterém je substrátem 3 β-hydroxysteroid a při kterém se používá transformovaný kvasinkový kmen podle provedení r) a získaný 17ahydroxyl-3-oxo-delta4-steroid se případně izoluje; a
- aa) Způsob oxidace in vivo podle provedení z), při kterém je steroidovým substrátem pregio nenolon.
Podstata vynálezu je modifikovaný kvasinkový kmen, v kterém je acetyl-CoA pregnenolonová acetyltransferázová (APAT) aktivita eliminovaná obměnou genu kódujícího tuto aktivitu, vedoucí k stabilizaci 3 β-hydroxysteroidů.
Podstatou vynálezu je tedy modifikovaný kvasinkový kmen, ve kterém je acetyl-CoA pregnenolonová acetyltransferázová (APAT) aktivita eliminována obměnou genu kódujícího tuto aktivitu vedoucí ke stabilizaci 3 β-hydroxysteroidů.
Obměna genu kódujícího APAT aktivitu je možná například včleněním, delecí nebo substitucí DNA sekvence ve funkčních elementech genu, například promotoru nebo sekvence kódující protein mající APAT aktivitu. Integrace DNA sekvence obměněné touto cestou v hostitelském kmenu kvasinky se pak může uskutečnit například způsobem homologní rekombinace a vede ke generaci chromozomálních mutantů kvasinky odpovídající modifikovaným kmenům podle vyná25 lezu, ve kterých je doloženo vymizení APAT aktivity a stabilizace 3 β-hydroxysteroidů například buněčnou kulturou v přítomnosti pregnenolonu a měřením obsahu pregnenolonu jako funkce času podle pracovních podmínek dále popsaných v příkladové části.
Jako hostitelské kvasinkové kmeny, používané podle vynálezu, se uvádějí: kmeny Saccharamy30 ces jako S. cerevisiae, kmeny Candida jako C. maltosa, kmeny Kluyveromyces jako K. lactis nebo kmeny Pichia jako P. pastoris.
Vynález se zvláště týká kvasinkového kmenu modifikovaného, jako shora uvedeno, ve kterém obměněným genem je ATF2 gen S. cerevisiae nebo jeho homolog.
Genem ATF2 se míní gen S. cerevisiae identifikovaný ve kvasinkovém genu v místě STF2 nebo YGR177c databáze „Saccharomyces Genome Database“ (SGD); (Cherry J. M„ Adler C., Bell C., Dwight S., Chervitz S„ Jia Y„ Juvik G., Roe R., Weng S. a Botstein D., „Saccharomyces Genome Database „http: //genome-www. standford.edu/Saccharomyces/), jehož otevřený čtecí rámec (ORF) označovaný jako YGR177c je translatován do aminokyselinové sekvence v Mips databázi, postupné pod objednacím číslem S64491 (Hebling U„ Hofmann B. a Delius H„ květen 1996), přičemž sekvence je na obr. 4. Tento gen kóduje protein mající APAT aktivitu, jak je objasněno v příkladové části.
Genem, který je homologem ATF2 genu se míní gen, který kóduje protein mající APAT aktivitu a mající sekvenční identitu přibližně 60% nebo větší se sekvencí proteinu YGR177C.
Vynález se ještě více týká modifikovaného kvasinkového kmene, shora uvedeného, přičemž obměněným genem je ATF2 gen kvasinky S. cerevisiae, označovaný zde atf2 mutantový kmen.
Vynález se zvláště týká modifikovaného kvasinového kmene, shora uvedeného, přičemž ATF2 gen je obměněn začleněním DNA sekvence, která má alespoň jeden nukleotid.
Sekvence DNA, která je začleněna do ATF2 genu, takže ztrácí svojí APAT aktivitu, může být například auxotropní selekční gen splňují nutriční požadavky hostitelského kmene, jako je gen
-4CZ 299506 B6
URA3, gen LEU2, gen TRPÍ, gen H1S3 nebo gen ADE2, například dominantní selekční gen, například gen resistence proti antibiotikům, jako je G418, pheomycinu nebo hygromycinu B nebo například reportérovy gen například fiGAL gen.
Sekvence DNA, která je začleněna do ATF2 genu může být také kvasinkovým expresním blokem promotoru a transkripčního terminátoru, například kvasinkový promotor, jako například PGK, THD3, CYC1 nebo TEF1, například kvasinkový terminátor, jako například CYC1, TDH3, TEF1 nebo PGK. Expresní blok může být kombinací shora uvedených prvků například bloku TEFlprom/PGKteim.
Obzvláště se vynález týká modifikovaného kvasinkového kmene, shora uvedeného, přičemž ATF2 gen je obměněn začleněním URA3 selekčního genu nebo expresního bloku TEFlprom/PGK,enn.
Obzvláště se vynález týká modifikovaného kvasinového kmene, shora uvedeného, přičemž ATF2 gen je obměněn začleněním URA3 selekčního genu.
Mutantové kmeny atf2 podle vynálezu zbavené APAT aktivity a se začleněním URA3 genem se zde označují jako atf2-A::URA3, by mohly být tedy selektovány prototroíyí s uracilem.
Zcela obzvláště se vynález týká modifikovaných kmenů S. cerevisiae, označovaných jako TGY156 a TGY158, jejichž detailní konstrukce je dále uvedena v příkladové části.
Vynález se zvláště také týká modifikovaného kvasinkového kmene, shora uvedeného, ve kterém je ATF2 gen obměněn včleněním expresního bloku TEFlprom/PGKterm· Mutantové kmeny atf2 podle vynálezu, zbavené APAT aktivity a se začleněným expresním blokem TEFlprom/PGKtemi, označované zde jako atf2-A::TEFlprom/PGK,erm, by se mohly selektovat pro absenci funkčního URA3 genu, nahrazeného expresním blokem jejich odolností proti působení 5-fluoritové kyseliny (5-FO).
Vynález se zvláště také týká modifikovaného kvasinkového kmene S. cerevisiae, označovaného jako TGY186, jehož detailní konstrukce je dále uvedena v příkladové části.
Vynález se také týká transformovaného kvasinkového kmene, ze kterého je eliminována acetyl35 CoA pregnenolonová acetyltransferázová (APAT) aktivita obměnou genu kódujícího tuto aktivitu a expresujícího alespoň jeden ze savčích enzymů cesty biosyntézy hydrokortizonu z cholesterolu voleného ze souboru zahrnujícího
- enzym štěpící cholesterolový vedlejší řetězec (P450SCC),
- systém 3fi-hydroxy-delta5-steroidová dehydrogenáza/delta5-delta4-steroidizomeráza (3 βHSD) a
- 17a-steroidhydroxylázu (P450 1 7α).
Transformované kvasinkové kmeny podle vynálezu se mohou získat například transformací atf2 mutantových kmenů podle vynálezu o sobě známými způsoby, například transformací expresním vektorem P450SCC, jehož také ADX a ADR expresním vektorem 3fi-HSD nebo expresním vektorem P450 1 7a. Mutantové kmeny af2 se mohou také popřípadě kotransformovat, například expresním vektorem P45ol7a nebo se mohou transformovat koexpresním vektorem 3fi-HSD aP450 1 7a a mohou se transformovat koexpresním vektorem 3fi-HSD a P450 1 7a a mohou se používat například při způsobu biokonverze pregnenolonu na 17a-hydroxyprogesteron.
-5CZ 299506 B6
Vektory, konstruované pro expresi P45ol7a hovězího nebo lidského původu v kvasinkových kmenech popsal například Dumas a kol., 1994 v evropské zveřejněné přihlášce vynálezu EP 340 878 nebo v americkém patentovém spise US 5 137 822.
Zvláště se vynález týká transformovaného kvasinkového kmene, jak shora uvedeno, ve kterém je obměněným genem ATF2 gen S. cerevisiae nebo jeho homolog. Ještě více se vynález týká transformovaného kvasinkového kmene, jak shora uvedeno, ve kterém je obměněným genem ATF2 gen S. cerevisiae, který odpovídá transformovanému atf2 genu.
Zvláště se vynález týká transformovaného kvasinkového kmene, jak shora uvedeno, přičemž ATF2 jen je obměněn včleněním DNA sekvence mající alespoň jeden nukleotid a zvláště transformovaného kvasinkového kmene, jehož ATF2 gen je obměněn včleněním URA3 selekčního genu a odpovídá modifikovanému atf2-A;;URA3 kmenu.
Obměna genu, například ke ztrátě APAT aktivity, ATF2 gen nebo jeho homolog, jakož také hostitelské kmeny mají shora uvedený význam.
Zvláště se vynález týká transformovaného kvasinkového kmene at£2-A::URA3 kmenu, jak shora uvedeno, expresuj ícího 3|3-HDS a zvláště transformovaného kmene S. cerevisiae označovaného jako TGY 158/pGTl 0862, jehož detailní konstrukce je dále uvedena v příkladové části.
Vynález se zvláště také týká modifikovaného kvasinkového kmene, shora uvedeného ve kterém je ATF2 gen obměněn včleněním expresního bloku TEFlprom/PGKtenn a odpovídajícího transformovanému kmenu atf2-,á'.;TEFlprom/PGKtem,.
Vynález se zvláště také týká transformovaného kmenu uvedeného atf2-A::TEFlprom/PGKtenn expresujícího P450 1 7a a zvláště transformovaného kmene S. cerevisiae, označovaného jako TGY 186/pTG 1043 5.
Vynález se zvláště také týká modifikovaného kvasinkového kmenu atf-A::TEFprom/PGKterm, shora uvedeného, koexpresujícího 3fí-HSD a P45ol7a a zvláště transformovaného kmene S. cerevisiae, označovaného jako TGY 186/pTG 10417.
Vynález se také týká způsobu oxidace in vivo substrátu ze souboru zahrnujícího endogenní sterol, exogenní sterol a exogenní steroid, při kterém se používá transformovaný kvasinkový kmen, podle vynálezu, který se kultivuje buď samotný, pokud kmen produkuje endogenní sterol, nebo se inkubuje se sterolem nebo s exogenním steroidem a získaná oxidovaná sloučenina se popřípadě izoluje.
Endogenním sterolem se míní sterol, který se kumuluje ve kvasinkovém kmeni a který je substrátem enzymu štěpícího vedlejší řetězec (P450SCC), když se kvasinka, po transformaci například expresním vektorem P450SCC, ADX a ADR, kultivuje v nepřítomnosti exogenního sterolu. Používané endogenní steroly pro způsob podle vynálezu mohou být například ergosta-5-en-3ol, ergosta-5,24(28)-dien-3-ol nebo ergosta-5,22-dien-3-ol. Zveřejněná evropská přihláška vynálezu číslo EP 727489 popisuje akumulaci těchto sterolů v kvasinkovém kmeni a štěpení jejich vedlejšího řetězce v kultuře kmene po transformaci expresním vektorem P450SCC, ADX a ADR. Takový kvasinkový kmen, který obsahuje také APAT aktivitu, se předem může modifikovat k získání atf2 mutantového kmene podle vynálezu a pak transformovat expresním vektorem P45oSCC, ADS a ADR k získání atf2 mutantového kmene transformovaného podle vynálezu.
Exogenním sterolem se míní sterol, který je substrátem P45oSCC štěpícího enzymu inkubací s kvasinkovým kmenem transformovaným expresním vektorem P450SCC, ADS a ADR, například cholesterol nebo sitosterol. Takovým kmenem může být například atf2 mutantový kmen transformovaný expresním vektorem P450SCC, ADS a ADR.
-6CZ 299506 B6 β-Hydroxy steroid, získaný odštěpením vedlejšího řetězce endogenního nebo exogenního sterolu, použitý jako substrát, je dokonale ve volné formě, to znamená, že není doprovázen odpovídajícím 3fi-acetátesterem v kultuře transformovaného aft2 kmene expresuj ícího P450SCC, ADS a ADR.
Steroidem se míní steroid, který je substrátem 3fi-HSD enzymy inkubací s kvasinkovým kmenem transformovaným například expresním vektorem 3p-HSD, jako je například pregnenolon, 17a-hydroxypregnenolon nebo dehydroepiandrosteron nebo steroid, který je substrátem enzymu
P450 1 7a inkubací s kvasinkovým kmenem transformovaným například expresním vektorem
P45ol7a, jako je progesteron nebo pregnenolon. Takovým kmenem může být například atf2 mutantový kmen transformovaný expresním vektorem 3fi-HSD nebo expresním vektorem P45ol7a podle vynálezu.
Vynález se zvláště týká způsobu in vivo oxidace, jak shora uvedeno, přičemž se substrátem 3 β-hydroxy steroid a jako transformovaného kvasinkového kmene se používá atf2-A::URA3, expresujícího 3fi-HSD a získaný 3-oxo-delta4-steroid se popřípadě izoluje a zvláště se týká způsobu, při kterém je 3fi-hydroxysteroidem pregnenolon nebo 17a-hydroxypregnenolonu.
Jako substrát používaný 3 β-hydroxy steroid je stabilní když se inkubuje s atf2-A::URA3 kmenem podle vynálezu, transformovaným expresním vektorem 3fi-HSD. Vynález se tak týká způsobu zlepšené produkce 3-oxo-delta4-steroidu v kvasince, jelikož veškerý 3β-hydroxysubstrát se může oxidovat na 3-oxo-delta4-steroid, jak je objasněno v příkladové části.
Vynález se zvláště týká také způsobu in vivo oxidace, jak shora uvedeno, přičemž je substrátem steroid a jako transformovaného kvasinkového kmene se používá atf2-A::TEFlprom/PGK,erm expresujícího P450 1 7a a získaný 17a-hydroxylsteroid se popřípadě izoluje a zvláště se týká způsobu, při kterém je steroidovým substrátem pregnenolon nebo progesteron.
Jako substrát používaný pregnenolon je stabilní když se inkubuje s kmenem atf2A::TEFlprom/PGKterm, transformovaným expresním vektorem P450 1 7a. Vynález se tak týká způsobu zlepšené produkce 17oc-hydroxysteroidu ze 3 β-hydroxysteroidu, jelikož veškerý 3 β-hydroxysubstrát se může 17a-hydroxylovat.
Vynález se zvláště týká také způsobu in vivo oxidace, jak shora uvedeno, přičemž je substrátem 3B-hydroxysteroid a jako transformovaného kvasinkového kmene se používá atf2A::TEFlprom/PGKterm koexpresujícího 3fi-HSD a P450 1 7a a získaný 17a-hydroxyl-3-oxodelta4-steroid se popřípadě izoluje a zvláště se týká způsobu, při kterém je steroidovým substrátem pregnenolon.
Transformované atf2 mutantové kvasinkové kmeny a způsob podle vynálezu je výhodný pro zlepšenou produkci hydrokortizonu nebo jeho meziproduktů ve kvasinkách.
Příklady konstrukce kmenů podle vynálezu a použití způsobu podle vynálezu jsou objasněny v příkladové části.
Obecné materiály a způsoby
1. Kmeny a prostředí
Kmeny S. cerevisiae, používané pro provádění způsobu podle vynálezu, jsou kmeny TGY73.4 (MAT a, URA3-A5, pral-1, prbl-1, prcl-1, pcsl-3, his) isogenní derivát Leu* C13ABYS86, které popsali Achstetter T., Nguyen-Juilleret M., Findeli A., Merkamm M. a Lemoine Y. (Gene
-7CZ 299506 B6
110, str. 25 až 31, 1992) a kmen Fyl679 (MATa, URA3-52, trpl-A63, Ieu2-Al, his3-A200, fenl, GAL) který popsali Thierry A., Fairhead C. a Dujin B. (Yeast, svazek 6, str. 521 až 524, 1990). Kmeny se nechávají růst na kompletním YPD prostředí (Difco Laboratories) obsahujícím 2 % glukózy, při teplotě 28 °C za podmínek, které popsal Sherman F. (Methods in Enzymology
1994, str. 3 až 21, 1991).
Pro transformaci S. cerevisiae se buňky učiněné kompetentními způsobem za použití acetátu lithia (Ito a kol., 1983). Kvasinky se kultivují o sobě známým způsobem na syntetickém minimálním prostředí SD obsahujícím 2 % glukózy (Sherman F., Methods in Enzymology 194, str. 3 až
21, 1991) s přísadou potřebných živin v koncentraci 100 pg/ml.
Kmen E. coli BJ5183 (D. Hanahan, 1983) se používá pro in vivo rekombinaci a kmen E. coli C600, hsdR (Hubaček J. a Glover S.W., J. Mol. Biol. 50, str. 111 až 127, 1970) se používá pro získání kmene pro klasické reakce ligace.
2. Manipulace DNA a rekombinace in vivo v E. coli
Používá se obecných způsobů molekulární biologie, které popsal (Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor University Press,
2. vydání, Cold Spring Harbor, 1989) Způsob rekombinace in vivo popsal Degryse E. (J. Biotech.
39, str. 181, až 187, 1995; a Gene 170, str. 45 až 50, 1996)
3. Test APAT enzymové aktivity
APAT acetyltransferázová aktivita se stanovuje měřením začleňování [3H]acetátu do pregnenolonu ze [3H]acetyl-CoA (New England Nuclear). Reakční prostředí (500 μΐ) obsahuje [3H]acetylCoA (20 μΜ, 25 Ci/mol) a pregnenolon (Sigma) (30 μΜ). Prenenolon se přidává v roztoku ve 2 μΐ systému tyloxapol (Sigma)/ethanol (1:1) v kaliumfosfátovém pufru (20 mM) při hodnotě pH 7,0. Inkubuje se po dobu 15 minut při teplotě 30 °C a reakce se zastaví přidáním 2 ml dichlor30 methanu.
Steroidy se extrahují dichlormethanem, oddělí se reverzní fázovou vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií (RP-HPLC) za izokratických podmínek eluce acetonitrilem na sloupci Ultrasphere ODS (Beckman) při teplotě 45 °C na chromatografu HP 1090 (Hewlett-Packard) připojeném na FLO-One 500 radiodetektor (Packard), který umožňuje naměření množství vytvořeného pregnenolon[3H]acetátu.
Jedna APAT jednotka je definována jako množství enzymu, které produkuje 1 nmol pregnenolonacetátu za minutu při teplotě 30 °C za shora uvedených podmínek
4. Stanovení koncentrace proteinu
Koncentrace proteinu se měří za použití „proteinového zkušebního kitu“ (Bio-Rad) s hovězím sérovým albuminem jako standardem.
Vynález objasňují připojené obrázky.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je cesta biosyntézy hydrokortizonu z cholesterolu u savců.
Na obr. 2A a 2B je biokonverze pregnenolonu na pregnenolonacetát v S. cerevisiae.
-8CZ 299506 B6
Analýza se provádí RP-HPLC při 205 nm:
Na obr. 2A je kinetika vytváření pregnenolonacetátu a mizení pregnenolonu v časových intervalech 12 hodin inkubace.
Na obr. 2B je profil steroidů při t = 0 a t = 10 hodin se zřetelem na profil pregnenolonu a pregnenolonacetátu jako standardů.
Na obr. 3 je objasnění čištění APAT chromatografií na MonoP HR 5/20 (A) ukazuje profil APAT aktivity obsažené ve frakcích 10 až 20.
(B) ukazuje SDS-PAGE analýzu frakcí 14, 15 a 16 kombinovanou a koncentrovanou zabarvením Coomassiovou modrá (čára 2) v přítomnosti molekulárních hmotností markérů (čára 1).
Šipka ukazuje pás zdánlivé molekulové hmotnosti 62 kDa.
Na obr. 4 je aminokyselinová sekvence v jednopísmenovém kódu proteinu YGR177c. Peptidy sekvencované na bázi APAT proteinu čištěného a digerovaného trypsinem jsou podtrženy.
Na obr. 5 je strategie přerušení ATF2 genu kombinací s URA3 genem dvojí fúzí PCR způsobem. Prázdné sloupce a plné sloupce představují sekvence ATF2 a URA3.
Na obr. 6 je vliv přerušení ATF2 genu v S. cerevisiae na acetylaci pregnenolonu. Přítomnost pregnenolonacetátu je zjištěna RP-HPLC při 205 nm na bázi 16-hodinových kultur mateřského kmene TGY73.4 (A) nebo mutantového kmene TGY158 (B).
Na obr. 7A, 7B a 7C je schéma konstrukce expresních plazmidů lidského 3f-HSD v kvasince, pTG10832 a pTG10862. Obr. 7A objasňuje produkci MscI-MluI fragmentu obsahujícího sekvenci kódující lidský 3ft-HSD. Obr. 7B objasňuje produkci fragmentu Notl obsahujícího
CYClp/33-HSD/PGK, expresní blok. Obr. 7C objasňuje produkci plazmidů pTG108Y32 a plazmidů pTG 10862.
Na obr. 8 je restrikční mapa plazmidů pTG10832.
Na obr. 9 je restrikční mapa plazmidů pTG 10862.
Na obr. 10 je schéma konstrukce expresního plazmidů pTG10435.
Na obr. 11 je schéma konstrukce plazmidů pTG 10058.
Na obr. 12 je restrikční mapa plazmidů pTG10058.
Na obr. 13 je restrikční mapa plazmidů pTG 10293.
Na obr. 14 je restrikční mapa plazmidů pTG10435.
Na obr. 15A a 15B je schéma konstrukce plazmidů pTG10274.
Na obr. 15A je objasněna produkce plazmidů pTG10214.
Na obr. 15B je objasněna produkce plazmidů pTG 10274.
Na obr. 16 je restrikční mapa plazmidů pTGl 0274.
Na obr. 17 je restrikční mapa plazmidů pTGl 0401.
-9CZ 299506 B6
Na obr. 18 je schéma konstrukce expresního vektoru pTG 10262.
Na obr. 19 je restrikcní mapa plazmidu pTG10262.
Na obr. 20 je restrikcní mapa plazmidu pTG10403.
Na obr. 21 je restrikční mapa plazmidu pTG10417.
ío (Zkratky restrikčních enzymů mají tento význam: S. Sáli; N, Notl; BII, BglII; M, Mlul, C, Clal; N°, ztráta Ncol místa; Xbal° , ztráta Xbal místa; E, EcoRI).
Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení. Procenta jsou míněna vždy hmotnostně, pokud není uvedeno jinak.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Identifikace APAT aktivity kvasinek
A. In vivo acetylace pregnenolonu kvasinkami
Kmen TGY73.4 se kultivuje při teplotě 28 °C v 10 ml YPD prostředí (Difco) naočkovaného při A600=0,l z 24 hodinové předkultury, do které se přidá 100 μΐ roztoku pregnenolonu ve množství 10 mg/ml systému tergitolu (Sigma)/ethanol (1:1). Vytvořené steroidy se identifikují na 250 μΐ podílech půdy odebíraných v časových intervalech po dobu 10 hodin. Extrahuje se 2 ml dichlor30 methanu, organické fáze se odpaří v prostředí dusíku a zbytek se znovu rozpustí v acetonitrilu. Steroidy se analyzují RP-HPLC na sloupci Ultrasphere ODS (Beckman) za použití jako elučních činidel následujících systémů: 60 % acetonitrilu ve vodě po dobu 10 minut, 60 až 80 % acetonitrilu ve vodě po dobu 5 minut, 80 % acetonitrilu ve vodě při průtokové rychlosti 1 ml/min při teplotě 45 °C a s detekcí při 205 nm.
Získané chromatogramy (obr. 2b) dokládají, že pregnenolon se metabolizoval na polárnější produkt, který má TR identické jako pregnenolonacetátový standard. Obr. 2A ukazuje, že se pregnenolon rychle konvertuje kvasinkami na svůj metabolit.
Po alkalickém zpracování (6 % hydroxidu draselného v methanolu) uvolňuje pozorovaný metabolit produkt, který má TR identické jako pregnenolon. Identifikace metabolitu jako pregnenolonacetátje potvrzena hmotovou spektrometrií.
B. Čištění enzymu majícího APAT aktivitu
Kmen TGY73.4 se kultivuje ve fermentoru o obsahu 10 litrů v prostředí Káppeli (Fiechter A., Fuhrmann G.F.a Káppeli O., Adv. Microb. Physiol. 22, str. 123 až 183, 1981), obohaceném glukózou v množství 160 g/1 při teplotě 30 °C až do A600=30. Buňky se oddělí odstředěním, promyjí se vodou a resuspendují se ve 4 1 pufru Tris-HCl 20 mM, hodnota pH 8,0 při teplotě 4 °C (pufr A) obsahujícím 1 mM PMSF. Buňky se rozruší v homogenizéru Manton Gaulin za tlaku 6900 kPa. Získaný buněčný lyzát se odstřeďuje při 12 000 xg po dobu 15 minut při teplotě 40 °C, přidá se chlorid zinečnatý do supematantu do konečné koncentrace 40 mM. Hodnota pH se nastaví na 5,5 IN kyselinou chlorovodíkovou a k vysrážení dojde během 30 minut při teplotě 4 °C. Po odstřeďování při 10 000 xg po dobu 10 minut při teplotě 4 °C se sraženina izoluje a resuspenduje se ve 3 litrech pufru A obsahujícího 100 mM EDTA a 1 mM PSFM. Po odstra-10CZ 299506 B6 nění EDTA diafiltrací na Y10S10 patroně (Amicon) proti 30 litrům pufru A se retentát vnáší rychlostí 30 ml/min a při teplotě 4 °C na sloupec obsahu 1,5 litrů DEAE-Sephacel (Pharmacia) předem vyvážený pufrem A. Po promytí sloupce pufrem A, pak pufrem A obsahujícím 0,15 M chloridu sodného, se APAT aktivita eluuje pufrem A, obsahujícím APAT aktivitu, měřenou způsobem popsaným v publikaci „General Materials and Methods“ se spojí, přidá se chlorid sodný do konečné koncentrace 2M, a rychlostí 15 ml/min se při teplotě 4 °C zavádí na sloupec 500 ml PhenylSepharose (Pharmacia), předem vyvážený v pufru A obsahujícím 2M chlorid sodný. Po promytí sloupce pufrem A, obsahujícím 0,5M chlorid sodný se APAT aktivita eluuje
1,5 litry lineárního gradientu cholátu sodného ve množství 0 až 1 % v pufru A. Frakce, obsahující
APAT aktivitu, se spojí, zkoncentrují se ultrafiltrací na YM10 membráně (Amicon) až do použití se uloží při teplotě -80 °C.
Celý postup se ještě jednou opakuje, takže se připraví materiál v dostatečném množství k čištění.
Materiál ze shora uvedených dvou příprav se nechá roztát a vnáší se rychlostí 4 ml/min a při teplotě 4 °C na sloupec 100 ml Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), předem vyvážený v pufru A. Po promytí sloupce tímtéž pufrem A se APAT aktivita eluuje 500 ml lineárního gradientu chloridu sodného v množství 0 až 1M v pufru A. Frakce Q-Sepharose, obsahující APAT aktivitu, se spojí a vnášejí se přímo rychlostí 2,5 ml/mi a při teplotě 4 °C na sloupec 7 ml cholátu sodného, imobilizovaného na kuličkách Sepharose (Pharmacia) předem vyvážený pufrem A obsahujícím 0,5M chlorid sodný. Po promytí sloupce tímtéž pufrem A se APAT aktivita eluuje 100 ml lineárního gradientu cholátu sodného v množství 0 až 1 % v pufru A. Frakce, obsahující APAT aktivitu, se spojí, zkoncentrují se ultrafiltrací na YM10 membráně (Amicon) až na koncentraci proteinu
1,8 mg/ml a uloží se při teplotě -80 °C.
APAT aktivita se tak čistí přibližně 500 krát na základě specifické aktivity a s výtěžkem přibližně 16 %, jak je zřejmé z následující tabulky I.
Tabulka I
| Stav | APAT aktivita j ednotky | Protein mg | Specifická aktivita jednotky/mg | Čiš- tění | Výtěžek |
| supernatant | 8,057 | 42,242 | 0,19 | 1,0 | 1OO |
| 12 000 g | |||||
| srážení | 10,453 | 28,040 | 0,37 | 1,9 | 129 |
| zinkem | |||||
| DEAE Sephacel | 6,399 | 5,009 | 1,28 | 6,7 | 79 |
| fenyl-Sepharose | 3,316 | 489,000 | 6,78 | 35,7 | 41 |
| Q-Sepharose | 1,712 | 39,000 | 43,90 | 231,0 | 21 |
| cholát-Sepharose | 1,300 | 13,000 | 100,00 | 526,0 | 16 |
Polovina semivyčištěného materiálu, shora získaného, (přibližně 6 mg proteinu) se nechá roztát, přidá se PEG 4000 (Prolabo) do konečné koncentrace 20 % (hmotnost/objem) k eliminaci cholátu a chloridu sodného. Míchá se po dobu 30 minut při teplotě 4 °C, sraženina se shromáždí odstře35 ďováním při 12 000 xg po dobu 30 minut při teplotě 4 °C a znova se rozpustí ve 4 ml pufru A. Takto získaný roztok se vnáší rychlostí 1 ml/min na sloupec MonoP HR5/20 (Pharmacia),
-11 CZ 299506 B6 předem vyvážený pufrem bis Tris 25 mM při hodnotě pH 6,3. APAT aktivita se eluuje pufrem Polybuffer 74 při hodnotě pH 4,0 (Pharmacia). Frakce o objemu 1 ml se shromažďují, každá v přítomnosti 50 μΐ pufru Tris-HCL 2M při hodnotě pH 8 k omezení inaktivaci enzymu při kyselé hodnotě pH. Frakce 14, 15 a 16 (obr. 3 (A)), obsahující nejvyšší APAT aktivitu měřenou jak shora uvedeno, se spojí, zkoncentrují se ultrafiltrací na YM10 membráně (Amicon) a uloží se při teplotě -80 °C až do použití. Takto získaná aktivní frakce se podrobí SDS-PAGE na gelu s 10 % polyakrylamidu. Několik pásů se vyvolá zabarvením modří Coomassie s hlavním pásem se zdánlivou molekulovou hmotností 62 kDA (obr. 3 (B)), identickou s molekulovou hmotností stanovenou filtrací na gelu Sepharose 6 (Pharmacia) a odpovídají APAT aktivitě.
C. Vlastnosti APAT
a) Specificita substrátu
Způsobem shora uvedeným pro acetyl-CoA a pregnenolon za použití různých acylových donorů nebo různých steroidových substrátů semičištěnými APAT transferuje acetát na 3β-ο1, delta4 nebo delta5 steroidy s porovnatelnou účinností, zatímco transfer je slabě zjistitelný na estrogeny a zjistitelný na steroly a s výraznou preferencí pro acetyl-CoA jakožto acylový donor. V tabulce II jsou uvedeny výsledky pro a) testy uskutečněné se 100 μΜ každého acylového donoru a 30 μΜ [3H]pregnenolonu.
Tabulka II
| Substrát a) Relativ/):/ aktivita. {%) | / ' , Substrát b) Relativa, aKtiviť^ (%) | ||
| Pregnenolon | 100 | acetyl-CoA | 100 |
| 17a-OH pregnenolon· | 89 | propionyl-CoA 33 | |
| DHEA | 104 | butyryl-CoA | 16 |
| 4-pregnen-3§ol-20-on·· | 70 | hexanoyl-CoA | 18 |
| 5P-pregnan-3Pol-20-on | 1.8 / | oleoyl-CoA | not detected |
| 17p-oestradiol | 5 | ||
| oestron | 2,5 | ||
| cholesterol | 0,6 | ||
| ergosterol | M |
b) Inhibice
APAT aktivita je silně inhibována reakčními činidly ze sulfhydrylových skupin, jako je NEM a DTNB. Inhibice je kompletní v přítomnosti chloridu zinečnatého (1 mM).
D. Parciální aminokyselinová sekvence
Parciální aminokyselinová sekvence se stanovuje po digesci s trypsinem na gelových selekcích způsobem, který popsal Rosenfeld J., Capdevielle J., Guillemot J. C. a Ferrara P. (Anal. Biochem. 203, str. 173 až 179, 1992).
Vychází se ze dvou třetin koncentrátu, shora získaného, separovaného SDS-PAGE, 62 kDa pás se vyřízne a inkubuje se s trypsinem (Promega). Generované peptidy se separují použitím RPHPLC na sloupci Vydac 218TP (1,5 x 125 mm) rychlostí 100 μΙ/min, za použití lineárního gradientu acetonitrilu v množství 0 až 60% po dobu 80 minut, potom 60 až 100 % po dobu 20 minut v 0,1% roztoku TFA ve vodě a podrobí se aminokyselinové sekvencování.
- 12CZ 299506 B6
N-Koncová sekvence se stanoví na proteinovém sekvenceru Model 477A, spojeném s HPLC analyzátorem PTH-aminokyselin (Appleid Biosystems).
Ze sekvencovaných vzorků dva píky x a Y poskytují jednoznačné vytvoření sekvence se zřetelem na následující 10 až 16 aminokyseliny: pro pík x: ISEQFKKDDF i o pro pík y: LIELISP VIIPLGNPK
Takto získané dvě peptidové sekvence se používají pro skrínování databáze genomu S. cerevisiae. Protein s 62 kDa, jehož sekvence obsahuje přesně sekvence shora uvedených dvou peptidů se identifikuje (Mips, objednací číslo S64491, Hebling a kol., květen 1996). Tento protein, jehož sekvence je na obr. 4, a jehož funkce nebyla popsána, se kóduje genem v místě YGR177c. Na základě identity přibližně 37 % aminokyselinové sekvence proteinu podle vynálezu majícího acyltransferázovou aktivitu a produktu ATF1 genu v S. cerevisiae (Fujii T., Nagasawa N., Iwamatsu A., Bogaki T., Tamai Y. a Hamachi M., Appl. Environ. Microbiol. 60, str. 2786 až 2792, 1994) a které se přisuzuje alkoholacetyltransferáza, se použilo označení ATF2 pro gen kódující protein zodpovědný za APAT aktivitu v S. cerevisiae.
Příklad 2
Konstrukce kvasinkových kmenů majících ATF2 gen přerušený URA3 genem a ztracenou APAT aktivitu alfa2-A::URA3
A. Cílení ATF2 genu
Gen URA3 S. cerevisiae se zavede substitucí vybrané části ATF2 genu S. cerevisiae umožňující následnou selekci mutantových kmenů prototrofyí s uracilem.
Selekční URA3 markér se kombinuje s ATF2 genem dvojí fúzí PCR způsobem, který popsali Amberg D. C., Botstein D. a Beasley E.M. (Yeast 11, str. 1275 až 1280, 1995). Strategie, objas35 něná na obr. 5, zahrnuje celkem čtyři PCT reakce. Prví dvě reakce (označené PCR1) umožňují zesílení 5' a 3' regionu lemováním vloženého místa markéru URA v ATF2 cílovém genu, který je přerušen a třetí reakce (označovaná jako PCR2) umožňuje zesílení URA3 markerového genu. Dvojí fúze (označená PCR3) konečně umožňuje kombinaci 5' a 3' regionů ATF2 cílového genu s URA3 markerovým genem (označené jako 5'ATF2-URA3-3'ATF2).
Napřed použitý vzorek nedotknutých buněk kmene Fy 1679 jakož zdroj DNA ATF2 cílového genu se zesílí v pufru PCR obsahujícím 2 mM dNTP (Pharmacia) za následujících podmínek: 25 cyklů; při teplotě 93 °C, 30 sekund; při teplotě 54 °C, 2 minuty; při teplotě 68 °C, 3 minuty následováno prodloužením na 5 minut při teplotě 72 °C; polymeráza Ampli Taq (Perkin Elmer).
Jednak se zesílí 5' region ATF2 genu použitím PCR jako přímých a nepřímých primerů, oligonukleotidy mají následující sekvence:
OTG10841: AAAAGTCGACAAAATGGAAGATATAGAAGGATACGAACCACATATCACTC (SEQ ID N°l) a:
OTG10844: ATCAATCTCCAATTAGGCCTCTTCGGATTACCC (SEQ ID N°2)
- 13CZ 299506 B6 které obsahují homologové regiony k 5' regionu sekvence ATF2 genu (SGD: AGR177c) a přidáním restrikčního místa Sáli pro OTG10841.
Na druhé straně se zesílí 3' region ATF2 genu použitím PCR jako přímých a nepřímých primerů, oligonukleotidy mají následující sekvence;
OTG10846: CATTCGACATTCCCGAAGGTGACAATGACAAG (SEQ ID N°3) a:
0TG10842: AAAAACGCGTAACTATTAAAGCGACGCAAATTCGCCGATGGTTTGG (SEQ ID N°4) které obsahují homologové regiony k 3' regionu sekvence ATF2 genu (SGD: YGR177c) za přidání restrikčního místa Mlul pro OTG10842.
Za druhé se zesílí URA3 gen S. cerevisiae použitím PCR za použití jako přímého primerů oligonukleotidu mající sekvenci:
OTG1O843:
GGGTAATCCGAAGAGGCCTAATTGGAGATTGATAAGCTTTTCAATTCAATTCATCATTTTT TTTTTATTCTTTTTTTTG (SEQ ID N°5) která obsahuje homologovou sekvenci k 5' regionu publikované sekvence URA3 genu (Rose M., Grisafi P. a Botstein D., Gene 29, str. 113 až 124, 1984; genová banka GenBank: YSCODCD objednací číslo: KO2207; SGD: YELO21 w) kombinovanou se sekvencí homologovou k 5' regionu ATF2 genu (komplementární k OTG 10844) a jako inzertní primer oligonukleotid mající sekvenci:
OTG10845:
CTTGTCATTGTCACCTTCGGGAATGTCGAATGGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAACTC (SEQ ID N°6) který obsahuje homologovou sekvenci k 3' regionu URA3 genu, kombinovanou se sekvencí homologovou k 3' regionu ATF2 genu (komplementární k OTG 10846). Vzorec 20 ng DNA URA3 genu izolovaný z pohyblivého vektoru („shuttle vector“) kvasinek E. coli pTG 10021 (Degryse E., Dumas B., Dietrich M., Laruelle L. a Achstetter T., Yeast 11, str. 629 až 640, 1995) digescí s restrikčním enzymem HindlII se zesílí za shora uvedených podmínek.
Případně získané PCR produkty se čistí za použití kitu „Geneclean kit“ (Bio 101 lne., La Jolla, USA), podrobuje se dvojí fúzní reakci za použití jako primerů shora uvedených oligonukleotidů OTG 10841 a OTG 10842 v podmínkách zesílení použitých pro předchozí PCR reakce s programem 20 cyklů.
Po čištění konečného fúzovaného produktu, který obsahuje regiony lemující ATF2 gen fúzovaný na funkční URA3 gen, se potvrdí přítomnost URA3 genu digescí s EcoRV restrikčním enzymem, který ukáže přítomnost tohoto místa v zesíleném materiálu.
B. Generace kvasinkových kmenů atf2-A::URA3
Fúzní produkt, shora získaný se transformuje přímo do kompetentních buněk kmene Fy 1679 nebo kmene TGY73.4 a transformanty se selektují růstem v prostředí SD (Sherman F., Methods
-14CZ 299506 B6 in Enzymology 194, str. 3 až 21, 1991) v přítomnosti nutričních potřeb kmene a v nepřítomnosti uracilu.
Vycházeje z izolovaných klonů se nové kombinace mezi 5' regionem ATF2 genu a URA3 genu (5'ATF2-URA3-3'ATF2) demonstrují PCR zesílením na nedotčených buňkách za použití shora uvedených primerů OTG10841 a OTG10845. Absence APAT aktivity se pak dokládá in vitro testem popsaných na bázi buněčného homogenátu ve srovnání s mateřským kmenem, který vykazuje značenou APAT aktivitu.
Kmeny, splňující tato kriteria, se tak charakterizují jak atf2 mutantové kmeny, označované atf2A::URA3. Mutantový kmen, takto získaný z mateřského kmene Fyl679 se označuje jako TGY156 a mutantový kmen, takto získaný z mateřského kmene TGY73.4 se označuje jako TGY158.
Vzorek kmene TGY15Y6 byl vložen ve sbírce Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, Rue de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15 France, 2. února 1998 pod číslem 1-1977.
Vzorek kmene TGY1578 byl uložen ve sbírce Collection Nationale de Culture de Microorganis20 mes (CNCM) Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15 Francie, 2. února 1998 pod číslem 1-1976.
C. Stabilizace pregnenolonu in vitro v kulturách kvasinkových kmenů atf2-A::URA3
Buňky kmene TGY158, shora získané, se naznačují při A600=0,l do APD prostředí (Difco) obsahujícího 100 pg/ml pregnenolonu. Inkubuje se po dobu 16 hodin při teplotě 28 °C, steroidy se extrahují dichlormethanem a analyzují se RP-HPLC, jak shora uvedeno. Obr. 6(B) ukazuje, že mutant TGY158 ztratil svoji schopnost esterifikovat pregnenolon, zatímco za těchže kultivačních podmínek mateřský kmen TGY73.4 konvertuje pregnenolon na pregnenolonacetát (obr. 6(A)).
Je tedy možno konstatovat na základě těchto výsledků, že produkt ATF2 genu je zodpovědný za esterifikaci pregnenolonu kvasinkami, zatímco přerušení ATF2 genu nevede ke zřejmým změnám buněčného růstu za normálních podmínek.
Příklad 3
Konstrukce kvasinkového kmene majícího ATF2 gen přerušený genem URA3 a expresujícího 3(3-HSD
Podle schéma na obr. 7A až 7C se konstruují 2 μ plazmidy mající cDNA sekvenci kódující lidský 3p-HSD za řízení CYC1 promotorem S. cerevisiae nebo promotorem TEF1 S. cerevisiae a mající G418 resistentní gen a transformují se do mutantových kvasinkových kmenů atf2-A::URA3.
Především se následujícím způsobem generuje transferový vektor pTG10095, obsahující cDNA sekvenci, kódující typ II lidského 3|3-HSD, jak popsali Rhéaume E., Fachance Y., Zhao H. F., Breton N., Dumont M., de Faunoit Y., Trudel C., Fuu-The V., Simard J. a Fabrie F. (Mol. Endocrinol, 5. str. 1147 až 1157, 1991) lemovaný Sáli a Mlul místy a umístěný ve směru kvasinkového promotoru GAL10/CYC1:
Sekvence kódující 3fí-HSD se subklónuje způsobem který popsali Rhéaume E., Lachance Y. Zhao H.-F., Breton N., Dumont M., de Launoit Y., Trudel C., Luu-The V., Simard J. a Labrie F., (Mol. Endocrinol. 5, str. 1147 až 1157, 1991) jako restrikční fragment Sall-Notl na stejných místech vektoru Bluescript II (Stratagěne). Získaný vektor, který popsali Rhéaume E., Fachence
- 15CZ 299506 B6
Y, Zhao H.-F. Breton N., Dumont M., de Launoit Y., Trudel C., Luu-The V., Simard J. a Labrie
F., (Mol. Endocrinol. 5, str. 1147 až 1157, 1991) obsahuje Notl místo na 3' zakončení sekvence kódující 3 β-HSD. Tento vektor se pak digeruje Notl restrikčním enzymem a zpracuje se Klenowovým fragmentem v přítomnosti dNTP, aby zaplnil kohezivní konce, potom se znovu váže v přítomnosti oligonukleotidů majícího následující sekvenci:
OTG4461: CACACGCGTGTG (SEQ ID N°7) předem fosforylovanou a hybridizovanou na sobě samé k zavedení místa Mlul. Vektor pTG 10082 (obr. 7A), takto získaný, obsahuje sekvenci kódující 3P-HSD, obsahující BglII místo, a zabraňuje se místy Sáli a Mlul, zatím co se místo Notl ztrácí. Tento vektor stále obsahuje ío přírodní nekódující region 5', identifikovaný přítomností BglII místa.
Aby se dopravilo místo Sall těsněji k iniciátoru ATG proti směru, kterým se hodlá zavést GAL10/CYC1 promotor, digeruje se vektor pTG10082 s MscI restrikčním enzymem, jehož místo je lokalizováno v nekódujícím 5' regionu a právě proti směru iniciátoru ATG a Mlul restrikčního enzymu. Fragment Mscl-Mlul z 1,8 kb obsahující sekvenci kódující 3p-HSD (obr. 7A) se izoluje a váže do pTG10033 plazmidu (Degryse E., Dumas B., Dietrich M., Laruelle L. a Achstetter T., Yeast 11, str. 629 až 640, 1995) obsahujícího GAL10/CYC1 promotor, předem digerovaný Sall restrikčním enzymem, posléze se digeruje Mlul restrikčním enzymem. Tak se získá vektor pTG 10095 (obr. 7B).
Za druhé se konstrukce rekombinantní vektor pTG10268 obsahující 1μ plazmid kvasinky, replikon E. coli CYClprOm-PGKtemi expresní kazetu a selekční markér LEU2 (obr. 7B). Tento vektor je identický s vektorem pTG10159, který popsali Degryse E., Dumas B., Dietrich M., Lauruelle L. a Achstetter T. (Yeast 11, str. 629 až 640, 1995) do místa Xbal, obsaženého v 2 μ regionu, který je nahrazen markérem Xbal0, získaným naplněném přírodního místa Xbal v přítomnosti Klenowova fragmentu a pak religací.
Expresní plazmid pTG 10268 se pak generuje homologovou rekombinaci zavedením expresního bloku, obsahujícího promotor GAL10/CYCLP, získaný vycházeje z plazmidu pTG10095, shora připraveného následnou digescí Notl restrikčním enzymem, v plazmidu pTG 10260 předběžně digerovaném restrikčním enzymem Sall a Mlul. Plazmid pTG10268 (obr. 7B) obsahuje sekvenci kódující typ II lidského 3P-HSD za řízení promotorem CYC1.
Expresní plazmid pTG10862, obsahující sekvenci kódující 3p-HSD za řízení promotorem TEF1 se konstruuje tímto způsobem (Obr. 7C):
Plazmid pTG10832 (obr. 8) se nejdříve konstruuje homologovou rekombinaci mezi Noll fragmentem, získaným z plazmidu pTG10268, připraveným jak shora popsáno, a posléze digerovaným Notl restrikčním enzymem, a mezi rekombinantním plazmidem pTG10164 (Degryse E.,
Dumas B., Dietrich M., Laruelle L. a Achstetter T., Yeast 11, str. 629 až 640, 1995), předběžně digerováným restrikčními enzymy Sall a Mlul.
Expresní plazmid pTG 10862 se pak získá zavedením promotoru TEF1, obsaženého v Clal-Sall fragmentu, izolovaném z plazmidu pTG10085 (Degryse E., Dumas B., Dietrich M., Laruelle L.
a Achstetter T., Yeast 11, str. 629 až 640, 1995) místo promotoru XYC1 vyříznutého digescí plazmidu pTG10832, konstruovaného jak shora uvedeno, restrikčními enzymy Clal a Sall.
Takto získaný plazmid pTG10862 (obr. 9) a obsahující cDNA sekvenci kódující typ II 3p~HSD a transformuje do mateřského kmene TGY73.4 nebo do jeho mutantu atf2-A::URA3 odpovídají50 čího kmeni TGY158, získaného způsobem, podle příkladu 2, jakož také do mateřského kmene FY1679 nebo do jeho mutantu atf2-A::URA3, odpovídajícího kmeni TGY156, získaného způso- 16CZ 299506 B6 bem podle příkladu 2. Transformanty se izolují jak shora uvedeno na YPD prostředí (Difco) obsahujícím G418 při 250 pg/ml.
Takto získané kandidující kolonie se překultivují na prostředí SD obsahujícím nutriční prvky 5 potřebné pro každý kmen (histidin a uráčil pro kmen TGY73.4; histidin pro kmen TGY158; tryptofan, histidin, leucin a uráčil pro kmen FY1679; tryptofan, histidin a leucin pro kmen TGY156; vždy v koncentraci 100 pg/ml), naočkují se v prostředí obsahující 100 pg/ml pregnenolonu.
Po 24 hodinách růstu a biokonverze při teplotě 28 °C se steroidy extrahují a provede se analýza RP-HPFC, jak shora uvedeno. Získané výsledky, měřené na třech klonech z každého kmene, io jsou uvedeny v tabulce III.
| Kmen | Plasmid | Pregnenolon, (gg/ml) | Progesteron. (gg/ml) |
| TGY73.4 | pTG10862 | 1 | 0 |
| TGY158 | 11 | 94 | 15;2 |
| FY1679 | II | 1 | fy3 |
| TGY156 | H | 100 | 13 |
Výsledky ukazují, že substrátový pregnenolon se získá většinou kvalitně v mutantovém kmeni TGY156 nebo TGY158, přičemž se pozoruje počátek biokonverze pregnenolonu na progesteron, zatím co zánik pregnenolonu je dokonalý v mateřském kmeni TGY73.4 nebo FY 1679, které produkují velmi málo progesteronu pokud ho vůbec produkují, avšak kumulují pregnenolonacetát, jakje uvedeno v příkladu 2.
Vzorek modifikovaného kmene TGY158/pTG10862 byl uložen ve sbírce Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux 75724 Paris
Cedex 15 France, 2. února 1998 pod číslem 1-1978.
Příklad 4
Konstrukce kvasinkového kmene majícího ATF2 gen přerušený TEFlprom/PGKtenn (atf2— A::TEF1/PGK)
Kmen TGY186, který je kmenem odvozeným od kmene TGY156 (atf2-A::URA3), popsaným v příkladu 2, ve kterém URA3 gen v místa ATF2 je nahrazen expresním blokem TEFlprom/30 PGKterm, se konstruuje tímto způsobem:
Především se kombinuje expresní blok TEFlprom/PGK,erm s ATF2 genem dvojí fúzí PCR za podmínek podle příkladu 2, avšak za použití expresního bloku TEFlprom/PGKterni S. cerevisiae způsobem, který popsali Degryse E., Dumas B., Dietrich M., Laruelle L. a Achstetter T. (Yeast 11, str. 629 až 640, 1995) místo URA3 selekčního markéru.
První dvě PCR reakce (PCR1), umožňující zesílení 5' a 3' kódující oblasti ATF2 genu lemující začleněné místo bloku TEFlprom/PGKterm vATF2 přerušením cílového genu se provádějí za použití jako přímých a nepřímých primerů pro 5' region oligonukleotidů majících sekvence:
- 17CZ 299506 B6
OTG11049:
CTCTCTGTCGACATGGAAGATATAGAAGGATACGAACCACATATCACTC (SEQ ID N°8) a
OTG10844: ATCAATCTCCAATTAGGCCTCTTCGGATTACCC (SEQ ID N°9) pro 3' region oligonukleotidů majících následující sekvence: OTG10846: CATTCGACATTCCCGAAGGTGACAATGACAAG. (SEQ ID N°10) a OTG11050: AACAACACGCGTAACTATTAAAGCGACGCAAATTCGCCGATGCTTTGG (SEQ ID N°ll) :
Primery OTG11049 a OTG11050 jsou určeny pro zavádění nebo pro restrikci míst Sáli a Mlul.
Třetí PCR reakce (PCR2) umožňují zesílení TEFlprom/PGKtemi bloku se uskutečňuje za použití přímých nebo nepřímých primerů oligonukleotidů majících následující sekvence:
OTG11052:
GGGTAATCCGAAGAGGCCTAATTGGAGATTGATATCGATCACACACCATAGCTTCAAAATG TTTCTAC (SEQ ID N°12) a.
OTG11053:
CTTGTCATTGTCACCTTCGGGAATGTCGAATCTTCGAAACGCAGAATTTTCGAGTTATTAA ACTTAA (SEQ ID N°13) které zavádějí restrikční místa Clal a HindlII.
Nakonec se uskutečňuje kombinace dvojí fúzí PCR produktů shora získaných za použití jako ío primerů oligonukleotidů majících sekvence OTG11049 (SEQ ID N° 11), které zavádějí restrikční místa Sáli a Mlul na ATF2 spojovacích místech.
Po čištění se konečný fúzní produkt rekombinuje s ATF2 genem, obsaženým v plazmidů pTG20885, konstruovaným jak dále uvedeno a předem digerovaným s restrikčními enzymy Bstl a Stul. Plazmid pTG10888, obsahující TEFlprom/PGKterm signál na místech Clal a HindlII zahraněných lomovými regiony ATF2 genu se tak získá.
Příprava plazmidů pTG20885 zahrnuje zesílení ATG2 genu při vycházení ze kmene FY 1679 za podmínek popsaných v příkladu 2 avšak za použití jako přímých a nepřímých primerů oligo20 nukleotidů majících sekvence OTG11049 (SEQ ID N° 8) a OTG11050 (SEQ ID NO° 11), které zavádějí restrikční místa Sáli a Mlul. V získaných PCR produktech tato místa se pak eliminují digescí s restrikčními enzymy Sall a Mlul, zpracováním Klenowovým fragmentem polymerázy I E. coli, takže se zaplní lepkavé konce. Získaný fragment se váže v expresním vektoru pTG 10031, který popsali Degryse E., Dumas B., Dietrich M., Laruelle L. a Achstetter T. (Yeast 11, str. 629 až 640, 1995), předběžně digerovaném s enzymy Clal a HindlII a zpracuje se Klenowovým fragmentem. Transformací v E. coli, plazmid pTG10885 takto získaný, rezultující z ligace Sall místa PCR produktu, vyplněný použitím Klenowova fragmentu k získání sekvence GTCGA s místem HindlII vektoru vyplněného použitím Klenowova fragmentu k získání sekvence AGCTT k rekonstrukci místa HindlII (GTCGAAGCTT) (SEQ ID N° 14), a ztrátou Clal místa.
Místo Clal vektoru, vyplněné použitím Klenowova fragmentu tak, aby se získala sekvence ATCG je ztraceno po ligaci na PCR produkt.
Signál TEFlprom/PGKterm se vyřízne z plazmidů pTG10888 ve formě Notl fragmentu 1,8 kg, vymění se s URA3 markérem v kmeni TGY156 (aft2— A::URA3).
-18CZ 299506 B6
Kmen TGY156, připravený způsobem m podle příkladu 2, použitý jako hostitelský kmen, se kotransformuje s DNA vyříznutou z plazmidu pTG 10888 a s kvasinkovým vektorem obsahujícím ARS počátek, označený jako YRp7, který popsali Struhl K., Stinchomb DT., Scherer S., a Davis RW. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, svazek 76, číslo 3, str. 1035 až 1039, 1997), umožňující doplnit tryptofanový požadavek kmene TGY156 a selektivní detekci kolonií podle jejich resistence k 5-fluororotové kyselině (5-FO).
Vyříznutých 2 až 5 pg DNA z plazmidu pTG 10888 digescí sNotl restrikčním enzymem a z plazmidu YRp7, se zavede do kmene TGY156 způsobem využívajícím acetátu lithia (Ito H., Fukuda Y., Murata K. a Kimura A., Journal of Bacteriology, str. 163 až 168, 1983). Selekce doplňků pro požadavky na tryptofan kmene se uskuteční po rozprostření na místu agaru v ANGB prostředí (Difco) obohaceném histidinem a leucinem (vždy 100 pg/ml). Kandidátské kolonie, shromážděné za použití párátka se umístí na prostředí obsahující 5-FO připravené způsobem, který popsali Boeke Jef D., Lacroute F. a Fink G.R. (Mol Gen Genet 197, str. 345 až 346, 1984) a resistence k 5-FO se potvrdí na témže prostředí; jakákoliv ztráta YRp7 vektoru v této resistenci k 5-FO se indikuje jako požadavek na tryptofan. Mezi takto selektovanými klony se kombinace ATF2 genu s TEFlprom a PGKteTm monitoruje použitím PCR. Tak se získá kmen TGY186.
Příklad 5
Konstrukce kvasinkového kmene majícího gen ATF2 přerušený TEFlprom/PGKterm a expresující P4sol7a
Plazmid (pTG10435) obsahující kvasinkový replikační původ ARSH4/CEN6, selekční markér URA3 a obsahující sekvenci cDNA kódující hovězí cytochrom P45ol7a pod kontrolou promotoru TEF1 S. cerevisiae se konstruuje podle schéma na obr. 10, pak se transformuje na mutantový kvasinkový kmen atf2-A::TEFl/PGK (TGY186). Napřed se vytvoří podle schéma na obr. 11 plazmid pTG10058 obsahující sekvenci cDNA kódující hovězí cytochrom P45ol7a, který popsali Zuber MX., Simpson ER. a Waterman MR. (Science 234, str. 1258 až 1261, 1986) lemovaný místy Sall a Mlul a umístěná za kvasinkovým promotorem CYC1. Plazmid pGB 17ot—5 popsaný v patentovém spise číslo WO 89/10963 a obsahující sekvenci kódující hovězí cytochrom P45ol7a byl otevřen digescí restrikčním enzymem Xhol a pak zpracován alkalickou fosfatázou. Pro fosforylaci a hybridizaci byly začleněny oligonukleotidy mající následující sekvence:
OTG4511: TCGACGGACGCGTGG (SEQ ID N°15)
OTG4512: TCGACCACGCGTCCG (SEQ ID N°16) do místa Xhol generujícího plazmid pTG10104. Plazmid pTG10104 se pak zpracuje restrikčními enzymy Sall a Mlul, pak se začlení plazmid pTG10031, který popsali Degryse E., Dumas B., Dietrich M., Laruelle L. a Achstetter T. (Yeast 11, str. 629 až 640, 1995), obsahující kvasinkový promotor CYC1, předem digerovaný restrikčními enzymy Sall a Mlul a zpracuje se alkalickou fosfatázou. Tak se získá vektor pTG10058 obsahující cDNA kódující hovězí cytochrom P45ocU7a (obr. 12). Plazmid pTG10058 se pak digeruje restrikčními enzymy Sall a Mlul a zpracuje se alkalickou fosfatázou. Fragment Sall a Mlul 1,7 kg obsahující sekvenci kódující hovězí cytochrom Ρ45οα17α se izoluje, pak se provede ligace na expresní vektor pTG10085, který popsali Degryse E., Dumas B., Dietrich M., Laruelle L. a Achstetter T. (Yeast 11, str. 629 až 640, 1995) a obsahující kvasinkový promotor TEF1 předem digerovaný enzymy Sall a Mlul. Získá se plazmid pTG10293 (obr. 13), ve kterém je sekvence kódující cytochrom Ρ45οα17α za řízení promotorem TEF1.
-19CZ 299506 B6
Za druhé se expresní plazmid pTG10435 generuje homologovou rekombinací mezi rekombinantním plazmidem pTG10434, který popsali Degryse E., Dumas B., Dietrich M., Laruelle L. a Achstetter T., (Yeast 11, str. 629 až 640, 1995) a obsahující sekvenci ARSH4/CEN6 předem digerovanou enzymy Sáli aMluI a fragmentem Notl 2,8 kb získaným ze shora připraveného plazmidů pTG 10293.
Takto získaný plazmid pTG10435 (obr. 14) a obsahující sekvenci kódující hovězí cytochrom
Ρ450α17α za řízení promotorem TEF1 se pak transformuje na mateřský kmen FY1679 nebo
TGY186 (atf2-A::TEFl/PGK) připravený podle příkladu 4. Výsledky transformace se pak izoluio jí, jak shora popsáno, na médium YNBG (Difco) obohacené tryptophanem, histidinem a leucinem (každého 100 pg/ml).
Takto získané kolonie se pak během 16 hodin předkultivují v prostředí YNB (Difco) obsahující % glukózy a 0,5 % casaminokyselin, zředí se v čerstvém prostředí na A600=0,2. Po 6 hodinách 15 růstu se přidá 100 pg/ml pregnenolonu nebo progesteronu. Po 48 hodinách růstu a biokonverzi při teplotě 28 °C, se steroidy extrahují a měří se RP-HPLC jak naznačeno v příkladu 1 za použití standardů pregnenolonu al7cc-hydroxypregnenolonu nebo progesteronu a 17a-hydroxyprogesteronu.
Získané výsledky v pg/ml jsou uvedeny v tabulce IV.
Tabulka IV
| Kmen | FY1679/pTG10435 | TGY186/pTG10435 |
| Substrát : Pregnenolon | ||
| Pregnenolon | 0 | 67fl |
| 17a-Hydroxypregnenolon | 0 | 42,0 |
| 1 Substrát : Progesteron | ||
| Progesteron | 46^5 | 41,4 |
| 17a-Hydroxyprogesteron | 29^3 | 33}1 |
Tyto výsledky naznačují, že kapacita pro biokonverzi cytochromu Ρ450α17α, expresovaného vektorem pTG10435, je téměř stejná jako ve kmeni divokého typu (FY) tohoto mutantu atf2 (TGY186) s progesteronem jako substrátem. Na druhé straně se s pregnenolonem jako substrátem získá stejná biokonverze ve srovnání s progesteronem ale pouze s mutantem atf2 (TGY186). U kmene divokého typu (FY) se jak substrát, tak produkt acetylují a volný hydroxyprogesteron se nezjišťuje.
Vzorek transformovaného kmene AGY/186/pTG10435 byl uložen ve sbírce Collection National de Culture de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15 France, 20. ledna 1999 pod číslem 1-2119.
-20CZ 299506 B6
Příklad 6
Konstrukce kvasinkového kmene majícího gen ATF2 přerušený TEFlprom/PGKtem) a koexpresující 3P-HSD a Ρ450α17α
Plazmid pTG10417 (obr. 21) obsahující kvasinkový replikon 2μ a dva expresní bloky, jeden kódující lidský 3|3-HSD, druhý kódující hovězí cytochrom P450 1 7a a oba řízené promotor CYC1 S. cerevisiae a obsahující selekční markér URA3-d, se konstruuje v dále popsaných stupních 1 až 3 (obr. 15A a B), a pak v dále popsaných stupních 4 až 6, načež se transformuje na i o mutantový kvasinkový kmen atf2-A: :TEF 1 prom/PGKterm (TGY186).
Stupeň 1: Konstrukce plazmidu pTG10210
Expresní vektor pTG 10033, který popsali Degryse E., Dumas B., Dietrich M., Laruelle L.
aAchstetter T. (Yeast 11, str. 629 až 640, 1995) a obsahující hybridní kvasinkový promotor GAL10/CYC1, předem digerovaný restrikčním enzymem Pvull, se zpracuje alkalickou fosfatázou, pak se provede religace v přítomnosti oligonukleotidu, který má následující sekvenci:
OTG1O50: CCCGAATTCGGG (SEQ ID N° 17) předběžně fosforylovaného a hybridizovaného na sebe sama k zavedení míst EcoRI na okraji expresního bloku obsahujícího promotor GAL 10/CYC1. Získá se tak vektor pTG 10210.
Stupeň 2: Konstrukce plazmidu pT10214
Expresní blok, obsahující promotor GAL10/CYC1, obsažený ve vektoru pTG10210 se pak začle25 ní do E. coli-kvasinkového pohyblivého vektoru pTGlOOl, který popsali Degryse E., Dumas B., Dietrich M., Laruelle L. a Acstetter T. (Yeast 11, str. 629 až 640, 1995) a obsahující selekční markér URA3-d. Vektor pTG10013, po digesci s restrikčním enzymem EcoRI a zpracování alkalickou fosfatázou se váže na vektor EcoRI a zpracování alkalickou fosfatázou se váže na vektor pTG10210, připravený ve stupni 1 předem digestovaný enzymem EcoRI. Takto získaný vektor pTG10214 obsahuje expresní blok obsahující promotor GAL10/CYC1 zaměřený na 2μ replikon.
Stupeň 3: Konstrukce plazmid pTG 10274
V plazmidu pTG10214 se promotor GAL 10/CYC 1 zamění za promotor CYC1 homologovou rekombinaci po excisi plazmidu zpracováním restrikčními enzymy Clal a Sall. Expresní vektor pTG10031, který popsali Degrys E., Dumas B., Dietrich M., Laruelle L. a Achstetter T. (Yeast
11. str. 629 až 640, 1995) a obsahující promotor CYC1 se digeruje restrikčními enzymy HindlII a Fsp I, pak se rekombinuje s plazmidem pTG10214, připraveným ve stupni 2 a předem digero40 váným restrikčními enzymy Clal a Sall, čímž se generuje plazmid pTG 10274 (obr. 16).
Stupeň 4: Konstrukce plazmidu PTG 10401
Vychází se z plazmidu pTG10274 obsahujícího promotor CYC1 a plazmid pTG10293 obsahující sekvenci kódující cytochrom kombinací nový plazmid pTG10401, obsahující sekvenci kódující cytochrom P450 1 7a za řízení promotorem TEF1, se generuje homologovou rekombinaci nový plazmid pTG10401, obsahující sekvenci kódující cytochrom P45ol7a za řízení promotorem TEF1.
Promotor CYC1 a část replikonu E. coli se vyříznou z plazmidu pTl0274, připraveného ve stupni 3, digesci restrikčními enzymy Mlul a Dral. Plazmid pTG10293, připravený v příkladu 5, se
-21 CZ 299506 B6 digeruje restrikčními enzymy HindlII a Pvu II, pak se rekombinuje s plazmidem pTG 10274 digerovaným restrikčními enzymy Mlul a Dral, čímž vznikne plazmid pTG 10401 (obr. 17).
Stupeň 5: Konstrukce plazmidů PTG 10403
Za řízení promotorem CYC1 se začlení do plazmidů pTG 10401 cDA kódující typ II lidského 3fl-HSD. Napřed se zkonstruuje expresní vektor pTG10262 obsahující cDNA kódující typ II lidského 3fl-HSD podle schéma na obr. 18, přičemž se vychází z transferového vektoru pTG 10095, připraveného v příkladu 3, a rekombinantního vektoru pTG 10257 obsahujícího kvasinkový repliio kon 2p u replikon E. coli, expresní kazetu kvasinek CYCprom/PGKtenn a selekční markér URA3-d.
Tento vektor pTG10257 je totožný s rekombinantním vektorem pTG10042, který popsali
Degryse E., Dumas B., Dietrich M., Laruelle L. a Achstetter T. (Yeast 11, str. 629 až 640, 1995) nehledě na místo Xbal obsažené b oblasti 2μ a které je nahraženo markérem Xbal° získaných vyplněním přírodního místa Xbal Klenowovým fragmentem a pak opětnou vazbou.
Expresní blok typu II lidského 3P-HSD se vyřízne z transferového vektoru pTG 10095 digescí restrikčním enzymem Notl, začlení se do rekombinačního vektoru pTG 10257 předem digerovaného restrikčního enzymy Sáli a Mlul, generujícími expresní vektor pTG10262 (obr. 19). Je třeba poznamenat, že rekombinace bloku GAL 10/CYC1-cDNA pocházející z plazmidů pTG10095 v rekombinantním vektoru pTG10257 obsahujícím promotor CYC1 vytváří expresní vektor obsahující blok CYCl-cDNA.
Za druhé se shora připravený expresní vektor pTG 10262 digeruje restrikčním enzymem XmnI.
Získaný fragment obsahující cDNA kódující 3fl-HSD se rekombinuje s fragmentem obsahující 25 cDNA kódující 3fl-HSD se rekombinuje s fragmentem plazmidů pTG10401 připraveným ve stupni 4 obsahujícím cDNA kódující cytochrom P45ol7a získaný digescí restrikčním enzymem
Sall. Takto získaný plazmid pTG10403 (obr. 20) obsahuje dva expresní bloky jeden kódující
3fl-HSDH za řízení promotorem CYC1, druhý kódující cytochrom P45017a za řízení promotorem
TEF1.
Stupeň 6: Konstrukce plazmidů pTG10417
Nakonec se v plazmidů pTG 10403 zamění promotor TEF1 za promotor CYC1.
Jednak se digeruje plazmid pTG 10058, popsaný v příkladu 5, restrikčním enzymem PvuII, který umožní uvolnit část sekvence kódující cytochrom P450 1 7a kombinované s promotorem CYC1 stejně jako většina replikonů E. coli. Jednak se část replikonů E. coli eliminuje z plazmidů pTG 10403, připraveného ve stupni 5, digescí a restrikčním enzymem Dral. Rekombinaci dvou tímto způsobem předběžně digerovaných plazmidů se získá nakonec plazmid pTG10417. Plaz40 mid pTG 10417 obsahuje kvasinkový replikon 2 μ, selekční markér URA3-d a dva expresní bloky, z nichž jeden kóduje lidskou 3|3-HSD, druhý kóduje cytochrom P450 1 7a hovězího původu, oba za řízení kvasinkovým promotorem CYC1 (obr. 21).
Plazmid pTG10417 se pak transformuje na mateřský kmen FA 1679 nebo kmen TGY196 (atf2- A::TEElprom/PGK,erm), připravený způsobem posle příkladu 4.
Transformanty se pak izolují na agarem ošetřovaném prostředí YNB (Difco), obsahujícím 0,5% glukózy, obohacené tryptofanem, histidinem a leucinem (každého 100 pg/ml).
Takto získané kolonie se pak během 24 hodin při teplotě 28 °C předpěstují v prostředí YNB (Difco) obsahujícím 0,5 % glukózy a 0,1 % casaminokyselin, zředěném na A600=0,l a doplněném pregnenolonem při 100 pg/ml, buď v tomtéž čerstvém prostředí (prostředí 1), nebo v prostředí YNB (Difco) obsahujícím 0,1 % glykolu, 2% glycerolu a 0,2% casaminokyselin (prostředí 2). Po 48 hodinách růst a biokonverze se steroidy extrahují a měří se RP-HPLC, jak popsá-22CZ 299506 B6 no v příkladu 1, za použití standardů pregnenolonu, 17ot-hydroxypregnenolonu, pregesteronu a 17a-hydroxyprogesteronu.
Získané výsledky vyjádřené v pg/ml jsou uvedeny v tabulce V (prostředí 1) a v tabulce VI 5 (prostředí 2).
Tabulka V
| Kmen | FY1679/pTG10417 | TGÝ186/pTG10417 |
| Pregnenolon | 0 | 58,1 |
| t Pregnenolon. acetat | 87,3 | 0 |
| 17a-hydroxypregnenolon· | 0 | 3,1 |
| 17a-hydroxypregnenolon — | 0 | 0 |
| / acetat | ||
| Progesteron | 10,6 | M |
| 17a-hydroxyproges teron. | 1,3 | 23,4 |
Tabulka VI
| Kmen | FY1679/pTG10417 | TGY186/pTG10417 |
| Pregnenolon | 0 | 54,0 |
| Pregnenolon acetat< | 52?1 | 0 |
| 17 a-hydroxypregnenolon | 0 | V |
| 17a-hydroxypregnenolon | 12 ,8 | 0 |
| acetat | ||
| Progesteron | 0 | 1,4 |
| 17 a-hydroxyproge s t eron i | 8,6 | _ |
Z tabulek vyplývá, že biokonverze v kmeni divokého typu (FY) transformovaném plazmidem pTG10417 vede k akumulaci pregenolonacetátu a 17a-hydroxypregnenolonacetátu, které nejsou následně transformovány enzymy 3p-HSDH nebo P450 1 7a, a že vyvážení biokonverze je nižší než pozorované u transformovaného mutantu atf2 (TGY186).
Vzorek transformovaného kmene AGY/186/pTG10417 byl uložen ve sbírce Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux 75724 Paris
Cedex 15 France, 20. ledna 1999 pod číslem 1-2118.
Průmyslová využitelnost
Konstrukce kvasinkových kmenů pro zlepšení výtěžků biokonverze 3 β-hydroxy-delta5-steroidů na 3-oxo-delta-ta4-steroidy a pro zlepšenou produkci hydrokortizonu nebo jeho meziproduktů v kvasinkách.
-23CZ 299506 B6
Seznam sekvencí o Hoechst Marion Roussel <120> Kvasinkové kmeny mající přerušený ATF2 gen a jejich použití <130> 2482 PCT sekvence v angličtině <140> ío <141>
<160> 17 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 50 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <4G0> 1 aaaagtcgac aaaatggaag atatagaagg atacgaacca catatcactc 50 <210>2 <211>33 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
3θ <223> OLIGONUCLEOTIDE <220>
<221> různé charakteristiky <222> komplement ((1)..(33)) <400> 2 atcaatctcc aattaggcct cttcggatta ccc 33 <210>3 <211> 32 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <400> 3 cattcgacat tcccgaaggt gacaatgaca ag 32
-24CZ 299506 B6 <210>4 <211> 46 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <220>
<221> různé charakteristiky ío <222> komplement ((1)..(46)) <400> 4 aaaaacgcgt aactattaaa gcgacgcaaa ttcgccgatg gtttgg 46 <210> 5 <211> 79 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <400> 5 gggtaatccg aagaggccta attggagatt gataagcttt tcaattcaat tcatcatttt 60 ttttttattc ttttttttg 79 <210> 6 <211> 63 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <220>
<221 > misc-featire <222> komplement ((1)..(63)) <400> 6 cttgtcattg tcaccttcgg gaatgtcgaa tggggtaata actgatataa ttaaattgaa 60 ctc 63 <210>7 <211> 12 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <400> 7 cacacgcgtg tg 12
-25CZ 299506 B6 <210>8 <211> 52 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <400> 8 ctctctgtcg acaaaatgga agatatagaa ggatacgaac cacatatcac tc 52 <210> 9 <211> 33 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <220>
<223> různé charakteristiky <222> komplement ((1)..(33)) <400> 9 atcaatctcc aattaggcct cttcggatta ccc 33 <210> 10 20 <211>32 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <400> 10 25 cattcgacat tcccgaaggt gacaatgaca ag 32 <210> 11 <211> 48 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <220>
<223> různé charakteristiky 35 <222> komplement ((1)..(48)) <400> 11 aacaacacgc gtaactatta aagcgacgca aattcgccga tgctttgg 48
-26CZ 299506 B6 <210> 12 <211> 68 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <400> 12 gggtaatccg aagaggccta attggagatt gatatcgatc acacaccata gcttcaaaat 60 gtttctac 68 <210> 13 <211> 67 ío <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <220>
<223> různé charakteristiky <222> komplement ((1)..(67)) <400> 13 cttgtcattg tcaccttcgg gaatgtcgaa gcttcgaaac gcagaatttt cgagttatta 60 aacttaa 67 <210> 14 20 <211>10 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <400> 14 25 gtcgaagctt 10 <210> 15 <211> 15 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <400> 15 tcgacggacg cgtgg 15 <210> 16 <211> 15
-27CZ 299506 B6 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
5 <223> OLIGONUCLEOTIDE <220>
<223> různé charakteristiky <222> komplement ((1)..(15)) <400> 16 tcgaccacgc gtccg 15 ío <210> 17 <211> 12 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDE <400> 17 cccgaattcg gg 12
Seznam použité literatury (Achstetter T., Nguyen-Juilleret M., Findeli A., Merkamm M. a Lemoine Y„ Gene 110, str. 25 až 31, 1992) (Amberg D.C., Botstein D. a Beasley E.M., Yeast 11, str. 1275 až 1280, 1995) (Boeke Jef D., Lacroute F. a Fink G.R., Mol Gen Genet 197, str. 345 až 346, 1984) (Cauet g., Dumas G., Degryse E. Spagnoli R. a Achstetter T., Cytochrome P^150 biochemistry, biophysics and molecular biology (vydavatel Lechner M.C.), str. 583 až 586, John Libbey Eurotext, 1994).
(Cherry J.M., Adler C., Balí C„ Dwight S., Chervitz S., Jia Y., Juvik G., Roe R., Weng S. a Botstein D., „Saccharomyces Genome Database „http://genome-www.standford.edu/Saccharomyces/) (Degryse E„ J. Biotech. 39, str. 181 až 187, 1995) (Degryse E„ Dumas B., Dietrich M„ Laruelle L. a Achstetter T., Yeast 11, str, 629 až 640, 1995) (Degryse E., Gene 170, str. 45 až 50, 1996) (Dumas B., Cauet G„ Degryse E., Spagnoli R. & Achstetter T., Cytochrome P450. 8. Mezinárodní konference. Vydavatel M.C. Lechner. John Libbey Eurotext, Paris str. 527 až 530, 1994) (Fiechter A., Fuhrmann G. F. a Káppeli O„ Adv. Microb. Physiol. 22, str. 123 až 183, 1981)
-28CZ 299506 B6 (Fujii T., NagasawaN., Iwamatsu A.. Bogaki T., Tamai Y. Hamachi M., Appl. Environ. Microbiol. 60, str. 2786 až 1994) (Hanahan D., J. Mol. Biol.. 166, str. 557 až 580, 1983) (Hubaček J. a Glover S.W., J. Mol. Biol. 50, str. 111 až 127, 1970).
(Ito H., Fukuda Y., Murata K. a Kimura A., Jomal of Bacteriology, str. 163 až 168, 1983) ío (Rhéaume E., Lachance Y, Zhao H.-F.., Breton N., Dumont M., de Launoit Y., Trudel C., LuuThe V., Simard J. a Labrie F., Mol. Endocrinol. 5, str.l 147 až 1157, 1991) (Rose M. Grisafi P. a Botstein, D., Gene 29, str. 113 až 124,1984) (Rosenfeld J., Capdevielle J., Guillemot J.C. a Ferrara P., Anal. Biochem. 23, str. 173 až 179, 1992) (Sambrook J., Fritsch E,.F. a Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor University Press, 2. vydání, Cold Spring Harbor, 1989) (Sherman F. Methods in Enzymology 194, str. 3 až 21, 1991) (Simard J., Durocher F., Mébarki F., Turgeon C., Sanchez R., Labrie Y., Couet J., Trudel C., Rhéaume E., Morel Y., Luu-The V. a Labrie F., J. Endocrinol. 150, str. 5189 až 5207, 1996) (Struhl K, Stinchomb DT., Scherer S. a Davis R.W., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, svazek 76, číslo 3, str. 1035 až 1039, 1997) (Thierry A., Fairhead C. a Dujin B., Yeast svazek 6, str. 521 až 524, 1990) (Zuber MX,., Simpson ER. a Waterman MR., Schience 234, str. 1258 až 1261, 1986a)
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (25)
1. Modifikovaný kvasinkový kmen, v kterém je acetyl-CoA pregnenolonová acetyltransferázo40 vá (APAT) aktivita eliminována obměnou ATF2 fenu S. cerevisiae nebo genu, který kóduje protein mající APAT aktivitu a vykazuje přibližně 60% nebo vyšší sekvenční identitu se sekvencí YGR177C proteinu.
2. Modifikovaný kvasinkový kmen podle nároku 1, ve kterém je obměněným ATF2 genem gen
45 S. cerevisiae.
3. Modifikovaný kvasinkový kmen podle nároku 2, ve kterém je ATF2 gen obměněný vložením DNA sekvence, která má alespoň jeden nukleotid.
50
4. Modifikovaný kvasinkový kmen podle nároku 3, ve kterém je ATF2 gen obměněný vložením URA3 selekčního genu nebo kvasinkového expresního bloku skládajícího se z TEF1 promotoru a PGK terminátoru.
5. Modifikovaný kvasinkový kmen podle nároku 4, ve kterém je ATF2 gen obměněný vlože55 ním URA3 selekčního genu.
-29CZ 299506 B6
6. Modifikovaný kmen S. cerevisiae podle nároku 5, označený jako TGY156 a uložený ve sbírce CNCM pod přírůstkovým číslem 1-1977.
5
7. Modifikovaný kmen S. cerevisiae podle nárok 5, označený jako TGY 158 a uložený ve sbírce pod přírůstkovým číslem 1-1976.
8. Modifikovaný kvasinkový kmen podle nároku 4, v kterém je ATF2 gen obměněný vložením expresního bloku skládajícího se z TEF1 promotoru a PGK terminátoru.
9. Transformovaný kvasinkový kmen, ve kterém je acetyl-CoA pregnenolová acetyltransferázová (APAT) aktivita eliminovaná obměnou ATF2 genu S. cerevisiae nebo genu, který kóduje protein mající APAT aktivitu a vykazuje přibližně 60% nebo vyšší sekvenční identitu se sekvencí YGR177C proteinu a exprimující alespoň jeden enzym z dráhy biosyntézy hydrokortizonu
15 z cholesterolu zvolený ze souboru zahrnujícího
- enzym štěpící cholesterolový vedlejší řetězec (P450SCC),
- systém 3p-hydroxy-delta5-steroidová dehydrogenáza/delta5-delta4-steroidizomeráza (3β20 HSD) a
- 17α-steroidhydroxy lázu (P450 1 7a).
10. Transformovaný kvasinkový kmen podle nároku 9, ve kterém je obměněným ATF2 genem 25 gen S. cerevisiae.
11. Transformovaný kvasinkový kmen podle nároku 10, ve kterém je ATF2 obměněný vložením DNA sekvence, která má alespoň jeden nukleotid.
30
12. Transformovaný kvasinkový kmen podle nároku 10, ve kterém je ATF2 gen obměněný vložením URA3 selekčního genu.
13. Transformovaný kvasinkový kmen podle nároku 12 a exprimující 3P-HSD.
35
14. Transformovaný kmen S. cerevisiae podle nároku 12, označený jako TGY158/pTG10862 a uložený ve sbírce CNCM pod přírůstkovým číslem 1-1978.
15. Transformovaný kvasinkový kmen podle nároku 10, ve kterém je ATF2 gen obměněný vložením expresního bloku skládajícího se z TEF1 promotoru a PGK terminátoru.
16. Transformovaný kvasinkový kmen podle nároku 15 a exprimující P45ol7a.
17. Transformovaný kmen S. cerevisiae podle nároku 16, označený jako TGY186/pTG 10435 a uložený ve sbírce CNCM pod přírůstkovým číslem 1-2119.
18. Transformovaný kvasinkový kmen podle nároku 15 a koexprimující 3β-Ηδϋ a P45ol7a.
19. Transformovaný kmen S. cerevisiae podle nároku 18, označený jako TGY 186/pTG 104147 a uložený ve sbírce CNCM pod přírůstkovým číslem 1-2118.
20. Způsob oxidace in vivo substrátu ze souboru zahrnujícího endogenní sterol, exogenní sterol a exogenní steroid, vyznačující se tím, že se používá transformovaný kvasinkový kmen podle nároku 9 až 19, který se kultivuje buď samotný, pokud kmen produkuje endogenní sterol, nebo se inkubuje s exogenním sterolem nebo s exogenním steroidem a získaná oxidovaná
55 sloučenina se případně izoluje.
-30CZ 299506 B6
21. Způsob oxidace in vivo podle nároku 20, vyznačující se tím, že substrátem je 3 β-hydroxysteroid a při kterém se používá transformovaný kvasinkový kmen podle nároku 13 a získaný 3-oxo-delta4-steroid se případně izoluje.
22. Způsob oxidace in vivo podle nároku 21, vyznačující se tím, že 3β-hydroxysteroidem je pregnenolon nebo 17a-hydroxypregnenolon.
23. Způsob oxidace in vivo podle nároku 20, vyznačující se tím, že substrátem je ío steroid a používá se transformovaný kvasinkový kmen podle nároku 16 a získaný 17a-hydroxylsteroid se případně izoluje.
24. Způsob oxidace in vivo podle nároku 23, vyznačující se tím, že steroidovým substrátem je pregnenolon nebo progesteron.
25. Způsob oxidace in vivo podle nároku 20, vyznačující se tím, že substrátem je 3 β-hydroxysteroid a používá se transformovaný kvasinkový kmen podle nároku 18 a získaný 17a-hydroxyl-3-oxo-delta4-steroid se případně izoluje.
20 26. Způsob oxidace in vivo podle nároku 25, vyznačující se tím, že steroidovým substrátem je pregnenolon.
25 výkresů
-31 CZ 299506 B6 cholesterol ,oh tertexolon
17α - hydroxy - progesteron ,oh hydrokortison
-32CZ 299506 B6
OBR. 2A
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9801329A FR2774393B1 (fr) | 1998-02-05 | 1998-02-05 | Souches de levure ayant le gene atf2 interrompu et leurs applications |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ351299A3 CZ351299A3 (cs) | 2000-03-15 |
| CZ299506B6 true CZ299506B6 (cs) | 2008-08-20 |
Family
ID=9522616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0351299A CZ299506B6 (cs) | 1998-02-05 | 1999-02-04 | Modifikovaný nebo transformovaný kvasinkový kmen a zpusob oxidace in vivo substrátu |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6218139B1 (cs) |
| EP (1) | EP0977868B1 (cs) |
| JP (1) | JP4443636B2 (cs) |
| KR (1) | KR100599346B1 (cs) |
| CN (1) | CN1201008C (cs) |
| AR (1) | AR015225A1 (cs) |
| AT (1) | ATE271610T1 (cs) |
| AU (1) | AU748129B2 (cs) |
| BR (1) | BR9904771A (cs) |
| CA (1) | CA2285686C (cs) |
| CZ (1) | CZ299506B6 (cs) |
| DE (1) | DE69918752T2 (cs) |
| DK (1) | DK0977868T3 (cs) |
| EA (1) | EA004629B1 (cs) |
| ES (1) | ES2221353T3 (cs) |
| FR (1) | FR2774393B1 (cs) |
| HR (1) | HRP990303B1 (cs) |
| HU (1) | HU226657B1 (cs) |
| ID (1) | ID22741A (cs) |
| IL (1) | IL132151A (cs) |
| ME (1) | ME00670B (cs) |
| PL (1) | PL198376B1 (cs) |
| PT (1) | PT977868E (cs) |
| RS (1) | RS49619B (cs) |
| SI (1) | SI0977868T1 (cs) |
| SK (1) | SK286279B6 (cs) |
| TR (1) | TR199902457T1 (cs) |
| UA (1) | UA72438C2 (cs) |
| WO (1) | WO1999040203A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA99676B (cs) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2799206A1 (fr) | 1999-10-05 | 2001-04-06 | Transgene Sa | Procede de production de steroides modifies par fermentation de levures |
| FR2812884B1 (fr) * | 2000-08-08 | 2002-11-08 | Aventis Pharma Sa | Levures modifiees et utilisations, notamment pour la production de derives steroidiens |
| FR2820145B1 (fr) * | 2001-01-31 | 2004-01-23 | Aventis Pharma Sa | Souche de levure produisant des steroides de facon autonome |
| EP1689348B1 (en) | 2003-12-05 | 2013-05-15 | Children's Hospital Medical Center | Oligosaccharide compositions and use thereof in the treatment of infection |
| FR2869914B1 (fr) | 2004-05-06 | 2012-11-09 | Aventis Pharma Sa | Souches de levure produisant du cholesterol et leurs applications |
| CN102604847B (zh) * | 2012-03-23 | 2013-05-15 | 天津科技大学 | 一株含有Lg-ATF1基因的酿酒酵母工程菌 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0340878A1 (en) * | 1988-05-06 | 1989-11-08 | Roussel Uclaf | Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor |
| EP0727489A1 (fr) * | 1995-02-15 | 1996-08-21 | Roussel Uclaf | Séquence d'ADN codant pour une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol, delta-7 réductase, protéine delta-7-Red, procédé de production, souches de levures transformées, applications |
| JPH08242851A (ja) * | 1995-03-14 | 1996-09-24 | Oozeki Kk | 新規なアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子 |
| EP0874941A1 (fr) * | 1996-01-19 | 1998-11-04 | Hydroplus | Hausse automatique pour ouvrage hydraulique tel que seuil en riviere, deversoir sur un barrage ou sur une digue de protection |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6447380A (en) * | 1987-08-19 | 1989-02-21 | Agency Ind Science Techn | Steroid-oxidizing yeast strain |
| FR2678611B1 (fr) | 1991-07-04 | 1995-01-20 | Roussel Uclaf | Nouveaux esters pyrethrinouides de l'alcool 1,3,4,5,6,7-hexahydro 1,3-dioxo-2h-isoindol-2-yl-methylique, leur procede de preparation et leur application comme pesticides. |
| JP3363197B2 (ja) * | 1992-06-18 | 2003-01-08 | 麒麟麦酒株式会社 | アルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子およびその利用 |
-
1998
- 1998-02-05 FR FR9801329A patent/FR2774393B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-01-28 ZA ZA9900676A patent/ZA99676B/xx unknown
- 1999-02-01 US US09/243,367 patent/US6218139B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 AT AT99901708T patent/ATE271610T1/de active
- 1999-02-04 HU HU0002858A patent/HU226657B1/hu unknown
- 1999-02-04 EP EP99901708A patent/EP0977868B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 WO PCT/FR1999/000237 patent/WO1999040203A1/fr active IP Right Grant
- 1999-02-04 DE DE69918752T patent/DE69918752T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 ME MEP-1999-497A patent/ME00670B/me unknown
- 1999-02-04 SI SI9930668T patent/SI0977868T1/xx unknown
- 1999-02-04 ES ES99901708T patent/ES2221353T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 AU AU21714/99A patent/AU748129B2/en not_active Expired
- 1999-02-04 PT PT99901708T patent/PT977868E/pt unknown
- 1999-02-04 RS YUP-497/99A patent/RS49619B/sr unknown
- 1999-02-04 EA EA199900903A patent/EA004629B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-02-04 SK SK1331-99A patent/SK286279B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-02-04 IL IL132151A patent/IL132151A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-02-04 TR TR1999/02457T patent/TR199902457T1/xx unknown
- 1999-02-04 CZ CZ0351299A patent/CZ299506B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-02-04 KR KR1019997009076A patent/KR100599346B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 PL PL336301A patent/PL198376B1/pl unknown
- 1999-02-04 HR HR990303A patent/HRP990303B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-02-04 JP JP54009599A patent/JP4443636B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 BR BR9904771A patent/BR9904771A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-02-04 CA CA002285686A patent/CA2285686C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 ID IDW991153A patent/ID22741A/id unknown
- 1999-02-04 DK DK99901708T patent/DK0977868T3/da active
- 1999-02-04 CN CNB998004634A patent/CN1201008C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-05 AR ARP990100487A patent/AR015225A1/es active IP Right Grant
- 1999-04-02 UA UA99116075A patent/UA72438C2/uk unknown
-
2001
- 2001-03-01 US US09/797,239 patent/US6503749B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0340878A1 (en) * | 1988-05-06 | 1989-11-08 | Roussel Uclaf | Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor |
| EP0727489A1 (fr) * | 1995-02-15 | 1996-08-21 | Roussel Uclaf | Séquence d'ADN codant pour une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol, delta-7 réductase, protéine delta-7-Red, procédé de production, souches de levures transformées, applications |
| JPH08242851A (ja) * | 1995-03-14 | 1996-09-24 | Oozeki Kk | 新規なアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子 |
| EP0874941A1 (fr) * | 1996-01-19 | 1998-11-04 | Hydroplus | Hausse automatique pour ouvrage hydraulique tel que seuil en riviere, deversoir sur un barrage ou sur une digue de protection |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7977065B2 (en) | Yeast strains autonomously producing steroids | |
| Duport et al. | Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast | |
| RU2242517C2 (ru) | Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью (варианты), белок из arabidopsis thaliana, обладающий указанной активностью (варианты), вектор экспрессии, способ клонирования нуклеиновой кислоты, диагностический зонд, способ получения белка, способы восстановления стерина (варианты), способ получения прегненолона (варианты), трансформированный дрожжевой штамм и способ выявления недостаточности дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы | |
| CZ299506B6 (cs) | Modifikovaný nebo transformovaný kvasinkový kmen a zpusob oxidace in vivo substrátu | |
| NO314267B1 (no) | Anvendelse av ekspresjonskassett i multigensystemer, ekspresjonskassett, rekombinant vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av enblanding av eksogeneproteiner, fremgangsmåte for selektiv biokjemisk oksydasjon, samtfremgangsmåtefor osydas | |
| US5869283A (en) | Expression cassette operable in a recombinant host | |
| US7033779B1 (en) | Method for preparing steroids modified by yeast fermentation | |
| AU707957B2 (en) | DNA sequence coding for a protein of A. thaliana having a delta-5,7sterol,delta-7 reductase activity, delta7-red protein, production process, strains of transformed yeasts, uses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20190204 |