CN104736694B

CN104736694B - Crz1突变型真菌细胞

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Publication number: CN104736694B
Application number: CN201380054875.3A
Authority: CN
Inventors: B.蒋; J.庄
Original assignee: MERCK
Current assignee: MERCK
Priority date: 2012-10-22
Filing date: 2013-10-17
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2033-10-17
Also published as: KR102134936B1; US20150275222A1; US10100343B2; AU2013335065B2; CN104736694A; JP2015532120A; WO2014066134A1; EP2909306B1; AU2013335065A1; CA2884573A1; JP6383359B2; KR20150077412A; EP2909306A4; EP2909306A1; US20160355860A1

Abstract

本发明提供了CRZ1突变型真菌宿主细胞，例如巴斯德毕赤酵母。突变型真菌宿主细胞显示出温度抗性、增强的发酵稳健性和增加的异源多肽(例如免疫球蛋白)的表达。使用此类突变型真菌宿主细胞，生产异源多肽(例如免疫球蛋白)的方法在本发明的范围内。

Description

CRZ1突变型真菌细胞

本申请要求于2012年10月22日提交的美国临时专利申请号61/716,670的利益；所述美国临时专利申请整体通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及CRZ1突变体等位基因和包含此类等位基因的真菌宿主细胞，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，连同其使用方法。

发明背景

GlycoFi已将毕赤酵母工程化以产生具有人样糖基化的重组糖蛋白。然而，广泛遗传修饰也已引起细胞壁结构中的根本变化，使这些经糖工程化的菌株倾向于细胞裂解且降低发酵期间的细胞稳健性。这些不希望的性状已导致细胞活力的大幅降低以及细胞内蛋白酶泄露到发酵液内的显著增加，导致重组产物得率和质量两者的降低。已知缺乏功能性OCH1 (真菌糖基化途径中的多肽)的分离的真菌宿主细胞，例如白色假丝酵母(Candida albicans)；多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；巴斯德毕赤酵母，是温度敏感的。例如，白色假丝酵母och1敲除型在42℃下是温度敏感的(Bates等人，Outer Chain N-Glycans AreRequired for Cell Wall Integrity and Virulence of Candida albicans，TheJournal of Biological Chemistry 281: 90-98(2006)；多形汉逊酵母och1敲除型在45℃下是温度敏感的(Kim等人，Functional Characterization of the Hansenulapolymorpha HOC1，OCH1，and OCR1 Genes as Members of the Yeast OCH1Mannosyltransferase Family Involved in Protein Glycosylation，The Journal ofBiological Chemistry，281: 6261-6272(2006))；粟酒裂殖酵母och1敲除型在37℃下是温度敏感的(Yoko-o等人，Schizosaccharomyces pombe och1⁺ encodes alpha-1,6-mannosyltransferase that is involved in outer chain elongation of N-linkedoligosaccharides，FEBS Letters 489: 75-80(2001))；酿酒酵母och1敲除型在37℃下是温度敏感的(Nakayama等人，OCH1 encodes a novel membrane boundmannosyltransferase: outer chain elongation of asparagine-linkedoligosaccharides，EMBO J. 11(7):2511-9(1992))；并且巴斯德毕赤酵母och1敲除型在37℃下是温度敏感的(Choi等人，Use of combinatorial genetic libraries to humanizeN-linked glycosylation in the yeast Pichia pastoris，Proc Natl Acad Sci U S A.100(9):5022-7(2003))。制备在细胞培养中更稳健的och1 ^-真菌宿主细胞(例如毕赤酵母细胞)的另外遗传修饰是有价值的。

用于遗传修饰以增加毕赤酵母培养稳健性的不太可能的候选物是CRZ1，其为锌指转录因子。已知CRZ1调节许多酿酒酵母质膜和细胞壁调节基因(Cyert，Biochemical andBiophysical Research Communications 311:1143–1150(2003))。已预期由于CRZ1的突变而导致的质膜和细胞壁合成的干扰，将使得毕赤酵母细胞稳健性降低。公开的酿酒酵母CRZ1特征已导致本领域普通技术从业者预测，当置于高温胁迫下时，缺乏功能性CRZ1的毕赤酵母细胞的活力和稳健性将降低。(Matheos等人，Genes & Development 11:3445–3458(1997)；Stathopoulos等人，Genes & Development 11: 3432-3444(1997))。

发明概述

本发明提供了缺乏功能性CRZ1多肽的分离的真菌宿主细胞(例如毕赤酵母，例如巴斯德毕赤酵母)，例如相对于表达真菌CRZ1的细胞，其中细胞显示出增加的发酵稳健性和异源多肽(例如免疫球蛋白)的产生，例如其中内源CRZ1已突变、破坏或者部分或完全缺失；任选包含编码异源多肽(例如免疫球蛋白)的异源多核苷酸(例如可操作地连接至启动子例如甲醇诱导型启动子)。在本发明的实施方案中，(i) 内源CRZ1编码包含选自下述的一个或多个突变的多肽：L33→终止；Q214→终止；L294→终止；S298→终止；E403→G；F406→S；F406→L；C411→F；和K469→N，内源CRZ1的破坏，完全的内源CRZ1缺失，部分的内源CRZ1缺失(例如缺失CRZ1多肽的33aa-末端、214aa-末端、294-末端、298-末端)；或(ii) 内源CRZ1包含选自下述的一个或多个突变：a1407c；g1232t；t1216c；t1217c；a1208g；c893a；t881g；c640t；和t98a；或(iii) 内源CRZ1不编码功能性C末端锌指结构域。在本发明的一个实施方案中，分离的真菌宿主细胞还包含下述特征中的一个或多个(例如任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个)：(i) 其中一种或多种内源β-甘露糖基转移酶基因是突变、破坏、截短或者部分或完全缺失的；(ii) 包含编码α-1,2甘露糖苷酶、α-1,3甘露糖苷酶或α-1,6甘露糖苷酶的多核苷酸；(iii) 其中一种或多种内源磷酸甘露糖基转移酶基因是突变、破坏、截短或者部分或完全缺失的；(iv) 包含单亚基寡糖基转移酶(例如利什曼原虫属种(Leishmania sp.) STT3D)；(v) 其中内源多萜醇-P-Man依赖性α-1,3-甘露糖基转移酶(例如ALG3)是突变、破坏、截短或者部分或完全缺失的；(vi) 包含编码内切甘露糖苷酶(endomannosidase)的多核苷酸；(vii) 包含编码双功能UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶、或CMP-唾液酸合酶的一种或多种多核苷酸；(viii) 其中内源ATT1基因是突变、破坏、截短或者部分或完全缺失的；(ix) 其中α-1,6-甘露糖基转移酶(例如OCH1)是突变、破坏、截短或者部分或完全缺失的；(x) 包含半乳糖基转移酶，例如α 1,3-半乳糖基转移酶或β1,4-半乳糖基转移酶；(xi) 包含核苷酸糖转运蛋白，例如UDP-半乳糖转运蛋白(DmUGT)；(xii) 包含唾液酸转移酶，例如α-2,6-唾液酸转移酶(MmST6-33)；(xiii) 包含乙酰氨基葡萄糖转移酶，例如GNT1或GNT2或GNT4；和/或(xiv) 其中一种或多种内源蛋白酶基因(例如PEP4和PRB1)是突变、破坏、截短或者部分或完全缺失的。本发明还提供了用于制备本发明的分离的真菌宿主细胞的方法，其包括将异源多核苷酸引入细胞内，所述异源多核苷酸与内源CRZ1同源重组，并且部分或完全缺失内源CRZ1或者破坏内源CRZ1；连同通过此类方法产生的分离的真菌宿主细胞。

本发明还提供了分离的多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列的多肽，其包含选自下述的突变：L33→终止；Q214→终止；L294→终止；S298→终止；E403→G；F406→S；F406→L；C411→F；和K469→N；例如包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列，其包含选自下述的突变：a1407c；g1232t；t1216c；t1217c；a1208g；c893a；t881g；c640t；和t98a。包含此类多核苷酸的分离的载体也构成本发明的一部分。由此类多核苷酸编码的分离的多肽也是本发明的一部分。

本发明还提供了用于生产在高温下(例如32℃)具有改善活力的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞(例如毕赤酵母，例如巴斯德毕赤酵母)的方法，其包括将选自下述的编码多肽的突变引入真菌细胞中的内源CRZ1基因内：L33→终止；Q214→终止；L294→终止；S298→终止；E403→G；F406→S；F406→L；C411→F；和K469→N。

本发明还提供了用于生产一种或多种异源多肽(例如免疫球蛋白多肽)的方法，其包括：(i)将编码一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞(例如毕赤酵母，例如巴斯德毕赤酵母)(例如本文讨论的那些中的任一种)内；和(ii)在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下(例如在24℃下)培养宿主细胞，和；任选地，(iii)从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。在本发明的一个实施方案中，编码异源多肽的异源多核苷酸可操作地连接至甲醇诱导型启动子，并且其中分离的真菌宿主细胞在有利于所述异源多肽在甲醇的存在下表达的条件下进行培养。

附图简述

图1：展示改善的发酵稳健性和Fc滴度的温度抗性突变型。

图2(a-c)：诱变的巴斯德毕赤酵母菌株的谱系。

图3：温度抗性突变型的N-聚糖概况。G0=以GlcNac终止的N-聚糖；G1=单个半乳糖终止的N-聚糖；G1=双重半乳糖终止的N-聚糖；A1=单个唾液酸终止的N-聚糖；A1H= A1杂合体，具有杂合结构的单个唾液酸终止的N-聚糖；A2=双重唾液酸终止的N-聚糖；M5= Man₅；M6+=Man₆₊。

图4：温度抗性突变型的深入测序鉴定了Pp02g02120 (CRZ1)中的多重突变和Pp01g00680 (ATT1)中的两个突变，对应于带圆圈的"+"符号。

图5：突变蛋白质Pp02g02120与参与胁迫应答的酿酒酵母CRZ1锌指转录因子同源。显示了多种分离的突变型PpCRZ1等位基因。"*"显示所示突变的位置。

图6：质粒pGLY12829。

图7：质粒pGLY12832。

图8：为巴斯德毕赤酵母CRZ1缺失和截短而构建的DNA构建体。

图9：巴斯德毕赤酵母CRZ1缺失和截短突变型显示出在32℃下改善的发酵稳健性。

图10：巴斯德毕赤酵母CRZ1缺失进一步改善att1突变型菌株在34℃的发酵稳健性。

发明详述

与预期的相反，缺乏功能性CRZ1的巴斯德毕赤酵母细胞显示出增强的温度抗性和增加的稳健性。

为了广泛改善菌株质量，进行随机诱变，并且鉴定出具有显著改善的发酵稳健性的温度抗性突变型巴斯德毕赤酵母菌株。虽然未诱变的糖工程化的亲本菌株展示温度敏感表型(Choi等人2003)，并且在32℃下诱导后存活40-60小时，但突变型全部在32℃下诱导后持续90-110小时。该延伸的诱导期显著增加了由这些温度抗性菌株表达的重组蛋白质的得率和质量。为了揭示负责该增加的热耐受性和发酵稳健性的突变，对9种独立分离的突变型进行基因组测序，并且鉴定在每种突变型的不同开放读码框(ORF)内的非同义突变。值得注意的是，所有9种突变型均含有在一种基因(巴斯德毕赤酵母CRZ1)的编码区内的不同突变。更重要的是，巴斯德毕赤酵母CRZ1突变是在三种突变型YGLY29010、YGL29031和YGL29042中检测到的唯一非同义单核苷酸变化(SNV)。总之，这些基因组测序结果显示在巴斯德毕赤酵母CRZ1基因内的突变负责温度抗性和发酵稳健性表型。此外，其中内源CRZ1突变且因此缺乏功能性CRZ1蛋白质的未诱变的糖工程化的菌株，在32℃下诱导后类似地显示出90-110小时的活力。

"CRZ1^wt"真菌宿主细胞包含野生型CRZ1。

"PpCRZ1"是巴斯德毕赤酵母CRZ1。

"ScCRZ1"是酿酒酵母CRZ1。

就分离的真菌细胞例如毕赤酵母，例如巴斯德毕赤酵母而言的高温是超过28℃、29℃或30℃，例如32℃。

异源多核苷酸是已引入真菌宿主细胞内且编码异源多肽的多核苷酸。例如，异源多核苷酸可以编码免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链，例如包含轻或重链可变结构域和任选的例如来自抗体或其抗原结合片段的抗体恒定结构域，例如来自全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、抗体的抗原结合片段，例如Fab抗体片段、F(ab)₂抗体片段、Fv抗体片段、单链Fv抗体片段或dsFv抗体片段。任何此类抗体均可特异性结合任何表位，例如胰岛素样生长因子1受体、VEGF、白细胞介素-6 (IL6)、IL6受体、呼吸道合胞病毒(RSV)、CD20、肿瘤坏死因子α、受体活化的NFκB配体(RANKL)、或RANKL受体RANK、IgE、Her2、Her3或表皮生长因子受体。

“内源”基因是基因的染色体拷贝。

可以在本文中提及的基因名称词汇表如下：

ScSUC2 酿酒酵母转化酶

OCH1 α-1,6-甘露糖基转移酶

KlMNN2-2 乳酸克鲁维酵母(K. lactis)UDP-GlcNAc转运蛋白核苷酸糖转运蛋白

BMT1 β-甘露糖转移(β-甘露糖消除)β-甘露糖基转移酶

BMT2 β-甘露糖转移(β-甘露糖消除)

BMT3 β-甘露糖转移(β-甘露糖消除)

BMT4 β-甘露糖转移(β-甘露糖消除)

MNN4L1 MNN4-样1(电荷消除)

MmSLC35A3 UDP-GlcNAc转运蛋白的小鼠同源物

PNO1 N-联寡糖的磷酸甘露糖化(电荷消除)

MNN4 甘露糖基转移酶(电荷消除)

ScGAL10 UDP-葡萄糖4-差向异构酶

XB33 融合至ScKRE2前导区的截短的HsGalT1

DmUGT UDP-半乳糖转运蛋白

KD53 融合至ScMNN2前导区的截短的DmMNSII

TC54 融合至ScMNN2前导区的截短的RnGNTII

NA10 融合至PpSEC12前导区的截短的HsGNTI

FB8: 融合至ScSEC12前导区的截短的MmMNS1A

MmCST 小鼠CMP-唾液酸转运蛋白

HsGNE 人UDP-GlcNAc 2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶

HsCSS 人CMP-唾液酸合酶

HsSPS 人N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶

MmST6-33 融合至ScKRE2前导区的截短的小鼠α-2,6-唾液酸转移酶

TrMDS1 分泌的里氏木霉(T. reseei) MNS1

STE13 高尔基二肽基氨基肽酶

DAP2 液泡二肽基氨基肽酶

ALG3 多萜醇-P-Man依赖性α(1-3)甘露糖基转移酶

STT3D 寡糖基转移酶

CiMNS1 粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)甘露糖苷酶I。

分子生物学

依照本发明，可以采用在本领域技术内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。除非本文另有说明，与本发明结合使用的科学和技术术语应具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步地，除非上下文另有需要，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。一般地，与本文描述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名法和技术是本领域众所周知且通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知且如在本说明书全文各处引用且讨论的多种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来执行。参见例如James M. Cregg (Editor), Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology)，Humana Press (2010), Sambrook等人Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)；Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, Greene PublishingAssociates (1992, and Supplements to 2002)；Harlow和Lane, Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y. (1990)；Taylor和Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ.Press (2003)；Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp.,Freehold, N.J.；Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, 第I卷, CRC Press(1976)；Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, 第II卷, CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999), Animal Cell Culture (R.I. Freshney, 编辑(1986))；Immobilized Cells AndEnzymes (IRL Press,(1986))；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)。

“多核苷酸”或“核酸”包括单链形式、双链形式或其他形式的DNA和RNA。

“多核苷酸序列”或“核苷酸序列”是核酸例如DNA或RNA中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)，并且意指一系列的两个或更多个核苷酸。包含本文所示的核苷酸序列的任何多核苷酸(例如crz1 ^突变型)构成本发明的一部分。

“编码序列”或“编码”表达产物例如RNA或多肽的序列是核苷酸序列(例如异源多核苷酸)，当表达时，其导致产物(例如异源多肽，例如免疫球蛋白重链和/或轻链)的产生。

如本文使用的，术语“寡核苷酸”指一般具有不超过约100个核苷酸(例如30、40、50、60、70、80或90个)的核酸，其可以与多核苷酸分子杂交。寡核苷酸可以例如通过掺入³²P-核苷酸、³H-核苷酸、¹⁴C-核苷酸、³⁵S-核苷酸或已与标记例如生物素共价缀合的核苷酸而进行标记。

“蛋白质”、“肽”或“多肽”(例如异源多肽，例如免疫球蛋白重链和/或轻链)包括两个或更多个氨基酸的连续串。包含本文所示的氨基酸序列的任何多肽(例如crz1 ^突变型多肽)构成本发明的一部分。

“蛋白质序列”、“肽序列”或“多肽序列”或“氨基酸序列”指蛋白质、肽或多肽中的一系列的两个或更多个氨基酸。

术语“分离的多核苷酸”或“分离的多肽”分别包括多核苷酸或多肽，其与通常在细胞或重组DNA表达系统中所见的其他组分或任何其他组分部分或完全分离。这些组分包括但不限于细胞膜、细胞壁、核糖体、聚合酶、血清组分和无关的基因组序列。本发明的范围包括本文所示的分离的多核苷酸(例如crz1 ^突变型)和由此类多核苷酸编码的分离的多肽。

分离的多核苷酸或多肽优选是基本上同源组成的分子，但可以含有一些异质性。

如使用的DNA的“扩增”包括使用聚合酶链反应(PCR)，以增加DNA序列的混合物内的特定DNA序列的浓度。关于PCR的描述，参见Saiki等人，Science (1988)239:487。

一般地，“启动子”或“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶(例如直接结合或通过其他结合启动子的蛋白质或物质)，且起始与其可操作地连接的编码序列的转录的DNA调节区。可操作地连接至启动子的crz1 ^突变型多核苷酸构成本发明的一部分。另外，包含可操作地连接至启动子的异源多核苷酸(例如编码免疫球蛋白多肽)的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞也构成本发明的一部分。

当序列指导RNA聚合酶介导的编码序列至RNA，优选mRNA (其随后可以进行RNA剪接(如果它含有内含子)且任选翻译成由编码序列编码的蛋白质)的转录时，编码序列(例如异源多核苷酸，例如报道基因或免疫球蛋白重和/或轻链)“可操作地连接至”、“处于控制下”、“功能结合”或“可操作地结合”转录和翻译控制序列(例如本发明的启动子)。

本发明包括包含crz1 ^突变型多核苷酸的载体或盒。含有编码异源多肽的异源多核苷酸的载体也可以用于多种crz1 ^突变型真菌宿主细胞中，用于生产异源多肽(例如免疫球蛋白)。术语“载体”包括媒介物(例如质粒)，DNA或RNA序列可以通过其引入宿主细胞内，以转化宿主且任选促进所引入序列的表达和/或复制。用于本文的合适载体包括质粒、可整合的DNA片段及其他媒介物，其可以促进核酸引入宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)的基因组内。质粒是最常用的载体形式，但发挥相似功能且是或变得本领域已知的所有其他载体形式适用于本文。参见例如Pouwels等人，Cloning Vectors: A Laboratory Manual ，1985和Supplements，Elsevier，N.Y.和Rodriguez等人(编辑)，Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses ，1988，Buttersworth，Boston，MA。此类载体任选包括可操作地连接至异源多核苷酸的分泌信号(例如α-交配因子(α-MF)前原前导序列)。另外，包含载体的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞也构成本发明的一部分，所述载体包括例如可操作地连接至启动子的异源多核苷酸(例如编码免疫球蛋白多肽)。

可操作地连接至启动子的多核苷酸(例如异源多核苷酸，例如编码免疫球蛋白重链和/或轻链)可以在表达系统中表达。术语“表达系统”意指宿主细胞和相容载体，其在合适条件下，可以表达由载体携带且引入宿主细胞的蛋白质或核酸。常见表达系统包括真菌宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体、以及哺乳动物宿主细胞和载体。

术语“甲醇诱导”指通过使宿主细胞暴露于甲醇，增加在本发明的宿主细胞中可操作地连接至甲醇诱导型启动子的多核苷酸(例如异源多核苷酸)的表达。含有可操作地连接至甲醇诱导型启动子的多核苷酸的crz1 ^突变型构成本发明的一部分。通过使包含启动子构建体的crz1 ^突变型真菌细胞暴露于甲醇，并且在有利于所编码的异源多肽表达的条件下培养细胞，用于诱导融合至此类甲醇诱导型启动子的异源多核苷酸表达的方法构成本发明的一部分。

关于BLAST算法的下述参考文献引入本文作为参考：BLAST算法：Altschul, S.F.等人, J. Mol. Biol. (1990)215:403-410；Gish, W.等人, Nature Genet. (1993)3:266-272；Madden, T.L.等人, Meth. Enzymol. (1996)266:131-141；Altschul, S.F.等人, Nucleic Acids Res. (1997)25:3389-3402；Zhang, J.等人, Genome Res. (1997)7:649-656；Wootton, J.C.等人, Comput. Chem. (1993)17:149-163；Hancock, J.M.等人,Comput. Appl. Biosci. (1994)10:67-70；比对评分系统：Dayhoff, M.O.等人, "A modelof evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978)第5卷, suppl. 3. M.O. Dayhoff (编辑), 第345-352页, Natl.Biomed. Res. Found., Washington, DC；Schwartz, R.M.等人, "Matrices fordetecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)第5卷, suppl. 3." M.O. Dayhoff (编辑), 第353-358页, Natl. Biomed. Res.Found., Washington, DC；Altschul, S.F., J. Mol. Biol. (1991)219:555-565；States, D.J.等人, Methods(1991)3:66-70；Henikoff, S.等人, Proc. Natl. Acad.Sci. USA(1992)89:10915-10919；Altschul, S.F.等人, J. Mol. Evol.(1993)36:290-300；比对统计学：Karlin, S.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1990)87:2264-2268；Karlin, S.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993)90:5873-5877；Dembo, A.等人,Ann. Prob.(1994)22:2022-2039；和Altschul, S.F. "Evaluating the statisticalsignificance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, 编辑), (1997)第1-14页,Plenum, New York。

CRZ1

本发明包括包含突变的分离的CRZ1多核苷酸(crz1 ^突变型多核苷酸)和由此类多核苷酸编码的多肽(crz1 ^突变型多肽)，连同包含已以此类方式突变(例如通过突变、部分或完全缺失、或破坏)的内源CRZ1的分离的真菌宿主细胞。在巴斯德毕赤酵母CRZ1多核苷酸中的此类突变的具体实例是包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的多核苷酸，其具有下述突变中的一种或多种：a1407c；g1232t；t1216c；t1217c；a1208g；c893a；t881g；c640t；和t98a。这些CRZ1多核苷酸编码具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CRZ1多肽，其具有下述突变中的一种或多种：L33→终止；Q214→终止；L294→终止；S298→终止；E403→G；F406→S；F406→L；C411→F；和K469→N。此类突变型多核苷酸可以引入内源CRZ1染色体基因座内，以将野生型内源CRZ1替换为突变的CRZ1。

本发明涵盖包含突变的任何CRZ1多核苷酸，其编码缺乏功能性C末端锌指结构域(例如截短锌指结构域的无义突变或缺失)的CRZ1多肽。此类多肽也在本发明的范围内。

巴斯德毕赤酵母CRZ1多肽的锌指结构域包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 3的氨基酸376-471)。

在随机诱变筛选中鉴定的酿酒酵母CRZ1多肽(SEQ ID NO: 1)和巴斯德毕赤酵母CRZ1多肽(SEQ ID NO: 3)之间的BLASTP比较如下：

本发明包含突变型巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母CRZ1多肽以及编码此类多肽的多核苷酸。巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母CRZ1多肽的具体实例包含对SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的，在上文显示的BLASTP比较中用*或^指出的位置处的一种或多种变化。

CRZ1的身份是本领域已知的。CRZ1的具体实例在下文阐述。在本发明的一个实施方案中，酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母CRZ1多肽分别包含与SEQ ID NO: 1或3的至少约90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列相似性或同一性。在本发明的一个实施方案中，巴斯德毕赤酵母CRZ1多核苷酸包含与SEQ ID NO: 2的至少约90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性。

酿酒酵母CRZ1野生型多肽

巴斯德毕赤酵母CRZ1野生型开放读码框

巴斯德毕赤酵母CRZ1野生型多肽

宿主细胞

本发明包括分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞，其可以包括在其遗传背景下的另外突变。在“crz1 ^突变型”真菌宿主细胞(单倍体或二倍体)中，内源染色体CRZ1基因已突变、破坏或者部分或完全缺失，或者CRZ1蛋白质的表达已以任何方式降低(例如通过反义RNA、干扰RNA例如小干扰RNA (SiRNA))，或CRZ1多肽的活性已化学失活(例如通过小分子抑制剂)，并且因此相对于其中CRZ1未突变或干扰等等的分离的真菌宿主细胞，所述细胞部分或完全缺乏功能性CRZ1多肽水平和/或CRZ1活性至任何程度。在本发明的一个实施方案中，crz1 ^突变型真菌宿主细胞在高温下或在24℃下比包含完全水平的CRZ1的真菌宿主细胞更有活力(例如在发酵罐或生物反应器中)，例如在32℃下，例如在32℃下高达约90-110小时的诱导。在本发明的一个实施方案中，包含例如编码Fc多肽的异源多核苷酸的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞(例如在发酵罐或生物反应器中)，表达比包含编码Fc多肽的此类异源多核苷酸的CRZ1野生型真菌宿主细胞显著更多的异源多肽(例如多4倍或5倍)，例如Fc多肽(此类crz1 ^突变型真菌宿主细胞在本发明的范围内)。在本发明的一个实施方案中，包含例如编码异源Fc多肽的异源多核苷酸的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞(例如在发酵罐或生物反应器中)，表达异源多肽例如Fc多肽，其中N-聚糖概况基本上等同于CRZ1^wt真菌宿主细胞的那种，例如能够有效修饰其N-聚糖，例如Fc N-聚糖，具有高水平的末端唾液酸，和/或从77-84%的A2水平范围，和/或4-7%的A1水平范围(此类crz1 ^突变型真菌宿主细胞在本发明的范围内)。

在本发明的一个实施方案中，本发明的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞包含内源突变型CRZ1多肽，例如其包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，其具有下述突变中的一种或多种：L33→终止；Q214→终止；L294→终止；S298→终止；E403→G；F406→S；F406→L；C411→F；和K469→N；例如在本发明的一个实施方案中，分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞的突变型内源CRZ1多核苷酸包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列，其具有下述突变中的一种或多种：a1407c；g1232t；t1216c；t1217c；a1208g；c893a；t881g；c640t；和t98a。在本发明的一个实施方案中，在本发明的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞中，内源CRZ1是突变的，从而使其例如由于突变或截短，而缺乏功能性C末端锌指结构域。在本发明的一个实施方案中，真菌宿主细胞内源CRZ1已替换为突变型CRZ1，例如本文所述那些中的任一种，例如部分缺失突变型、完全缺失突变型或包含无义突变的突变型。

分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞中的内源CRZ1基因可以部分缺失，因此，在天然存在CRZ1的染色体基因座中仅留下CRZ1编码序列的一部分(例如其中CRZ1锌指结构域是部分或全部缺失的)；完全缺失，因此，在天然存在CRZ1的染色体基因座中没有保留CRZ1编码序列(例如其中CRZ1完全缺失且替换为另一种多核苷酸例如营养缺陷标记)；被破坏，因此将异源序列插入染色体CRZ1基因内；在染色体基因中的一个或多个点处突变；如此突变，以与其中CRZ1未如此突变的细胞相比较，降低细胞中的CRZ1表达水平或活性(例如其中将部分或完全失活突变引入CRZ1锌指结构域内)；或在其他方面以任何方式部分或完全失活。可替代地，此类内源CRZ1基因的调节区可以部分或完全缺失、破坏或突变，从而使得在细胞中不表达显著量的功能性CRZ1多肽。此外，CRZ1表达可以以任何方式降低或消除，例如通过使用反义CRZ1分子、SiRNA CRZ1分子干扰表达，或通过增强CRZ1蛋白质降解，或通过使用小分子抑制剂的化学抑制。此类分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞是本发明的一部分。

本发明的范围涵盖分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞，其在高温下是“存活的”，并且在发酵期间更稳健，以及如本文讨论的此类细胞的用途。在本发明的一个实施方案中，例如在高温例如32℃下，在生物反应器/发酵罐环境内，在液体细胞培养中的分离的真菌宿主细胞活力通过测量细胞培养物中的细胞裂解进行测定。在本发明的一个实施方案中，crz1 ^突变型真菌宿主细胞裂解用显微镜或通过测定培养基的双链DNA含量进行评估。进行显微镜评估，以对在培养基中观察到的细胞碎片的量进行评分。培养基中的细胞碎片是细胞裂解的结果，并且因此是细胞裂解的标记和测定培养物中的细胞活力的方式。给出1、2、3、4或5的评分；其中5表示最多裂解，即大于90%细胞裂解。对于在32℃下温育后90-110小时，crz1 ^突变型真菌宿主细胞显示出小于5的对于裂解的评分。在90-110小时之间，在32℃下诱导的包含crz1 ^突变型真菌宿主细胞的培养基具有30微克/微升或更少的双链DNA。当细胞裂解时，双链DNA释放到培养基内；因此，培养物的双链DNA含量是细胞裂解的标记和测定培养物中的细胞活力的方式。双链DNA可以使用本领域已知的几种方法中的任一种进行测定，包括通过测定结合至培养基中的双链DNA，对于双链DNA具有亲和力的荧光染料的量(例如双苯酰亚胺，吲哚衍生的着色剂，例如Hoechst 33342、Hoechst 33258或49,6-二脒基-2-苯基吲哚；菲啶鎓着色剂，例如溴化乙啶或碘化丙啶；或花青染料例如PicoGreen、YOYO-1碘化物、SYBR Green I或SYBR Gold；参见例如Cosa等人，Photochemistry and Photobiology 73(6):585–599(2001))。随后可以在这个基础上测定培养物中的双链DNA的数量。相应地，将具有小于5的显微镜裂解评分和/或30微克/微升或更少的双链DNA含量的培养细胞视为“存活的”。

在32℃下诱导(例如在生物反应器或发酵罐中)后存活约90-约110小时的分离的真菌宿主细胞在本文中可以被称为“温度抗性的”或“温度抗性”表型。

本发明包括包含编码异源多肽(例如报道物或免疫球蛋白重和/或轻链)的异源多核苷酸的此类宿主细胞，其中所述异源多核苷酸可以可操作地连接至启动子；以及其使用方法，例如用于在真菌宿主细胞中表达异源多肽的方法。例如，本发明包括用于在分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞(例如毕赤酵母)中制备一种或多种异源多肽的方法，所述异源多肽包括任选的一种或多种进一步变化(例如对内源基因的突变和/或一种或多种其他基因的表达；例如如本文讨论的，例如以产生所表达多肽的经修饰的糖基化)，所述方法包括(i)将编码异源多肽的多核苷酸引入crz1 ^突变型真菌宿主细胞内，和(ii) 在有利于异源多肽在细胞中表达的条件下培养所述crz1 ^突变型真菌宿主细胞，和任选地，(iii) 从所述crz1 ^突变型真菌宿主细胞中分离异源多肽。

在本发明的一个实施方案中，crz1 ^突变型真菌宿主细胞还包含ATT1中的突变。在本发明的一个实施方案中，crz1 ^突变型真菌宿主细胞不包含ATT1中的突变，例如内源ATT1是野生型的(例如细胞包含野生型、功能性ATT1多肽)-如本文讨论的，此类细胞及其用途是本发明的一部分。

本发明的分离的真菌宿主细胞是属于真菌界的细胞，例如在本发明的一个实施方案中，真菌宿主细胞是任何酵母例如芽殖酵母和/或裂殖酵母。在本发明的一个实施方案中，宿主细胞是任何甲基营养型酵母。甲基营养型酵母是能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的一小组酵母物种。甲基营养型酵母的实例包括巴斯德毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)(多形汉逊酵母)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)。在本发明的一个实施方案中，宿主细胞选自任何毕赤酵母细胞，例如巴斯德毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(多形汉逊酵母)、Pichia flnlandica、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(Pichia minuta) (Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、耐热毕赤氏酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)或甲醇毕赤酵母；酿酒酵母、酵母属种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母、克鲁维酵母属种(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母、白色假丝酵母、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、镰刀菌属种(Fusarium sp.)、禾谷镰刀菌(Fusarium gramineum)、Fusarium venenatum和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)。在本发明的一个具体实施方案中，分离的真菌宿主细胞如上文讨论的，但所述术语不包括酿酒酵母。

在本发明的一个实施方案中，分离的真菌宿主细胞是经过糖工程化的。在本发明的一个实施方案中，此类细胞已经过遗传工程化而产生糖蛋白，其中N-或O-联糖基化由其天然形式修饰，例如通过涉及N-糖基化的基因例如OCH1、ALG3、PNO1和/或BMT1、BMT2、BMT3、 BMT4，或涉及O-糖基化的基因例如PMT1、PMT2和/或PMT4的失活或缺失，或通过糖基转移酶例如GnTI、GnTII、GalT和/或SialT，或糖苷酶例如MNSI和/或MNSII的异源表达。例如，在本发明的一个实施方案中，经过糖工程化的分离的真菌宿主细胞包含下述特征中的一种或多种：

(i) 其中一种或多种内源β-甘露糖基转移酶基因是突变、破坏、截短或者部分或完全缺失的；

(ii) 包含编码α-1,2甘露糖苷酶的多核苷酸；

(iii) 其中一种或多种内源磷酸甘露糖基转移酶基因是突变、破坏、截短或者部分或完全缺失的；

(iv) 包含单亚基寡糖基转移酶(例如利什曼原虫属种STT3D)；

(v) 其中内源多萜醇-P-Man依赖性α-1,3-甘露糖基转移酶(例如Alg3)是突变、破坏、截短或者部分或完全缺失的；

(vi) 包含编码内切甘露糖苷酶的多核苷酸；

(vii) 包含编码双功能UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶、或CMP-唾液酸合酶的一种或多种多核苷酸；

(viii) 其中内源ATT1基因是突变、破坏、截短或者部分或完全缺失的；

(ix) 其中内源α-1,6-甘露糖基转移酶(例如OCH1)是突变、破坏、截短或者部分或完全缺失的；

(x) 包含编码半乳糖基转移酶的多核苷酸；

(xi) 包含编码核苷酸糖转运蛋白的多核苷酸；

(xii) 包含编码唾液酸转移酶的多核苷酸；

(xiii) 包含编码乙酰氨基葡萄糖转移酶的多核苷酸，和/或

(xiv) 其中一种或多种内源蛋白酶基因(例如PEP4和PRB1)是突变、破坏、截短或者部分或完全缺失的。在本文中已显示在糖工程化的分离的真菌宿主细胞中的CRZ1突变，以在此类细胞中至少部分逆转温度敏感性，增强发酵期间的细胞稳健性，且逆转异源多肽例如免疫球蛋白的不良生产，即增加生产。此类经过糖工程化的分离的真菌宿主细胞是本发明的一部分。通过使CRZ1突变或以其他方式减少CRZ1多肽表达，用于逆转经过糖工程化的分离的真菌宿主细胞的温度敏感性和/或增强发酵期间的细胞稳健性的方法也是本发明的一部分。

如本文使用的，术语“N-聚糖”和“糖形”可互换使用且指N-联寡糖，例如通过天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺键合连接至多肽的天冬酰胺残基的N-联寡糖。N-联糖蛋白含有连接至蛋白质中的天冬酰胺残基的酰胺态氮的N-乙酰葡糖胺残基。在糖蛋白上发现的占优势糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如N-乙酰-神经氨酸(NANA))。

N-聚糖具有Man₃GlcNAc₂("Man"指甘露糖；"Glc"指葡萄糖；并且"NAc"指N-乙酰基；GlcNAc指N-乙酰葡糖胺)的共同五糖核心。N-聚糖就分支(天线)数目而言不同，包含添加至Man₃GlcNAc₂ ("Man₃")核心结构的周围糖(例如GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)，所述核心结构也称为“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“寡甘露糖核心”。N-聚糖根据其分支组成成分进行分类(例如，高甘露糖、复合型或杂合型)。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。“复合”型N-聚糖典型地具有至少一个连接至“三甘露糖”核心的1,3甘露糖臂上的GlcNAc，和至少一个连接至“三甘露糖”核心的1,6甘露糖臂上的GlcNAc。复合型N-聚糖还可以具有任选地被唾液酸或衍生物(例如“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”指神经氨酸，“Ac”指乙酰基)修饰的半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)残基。复合型N-聚糖还可以具有链内置换(intrachain substitutions)，包含“二分(bisecting)”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)。复合型N-聚糖还可以具有在“三甘露糖核”上的多根天线，通常称为“多天线聚糖”。“杂合型”N-聚糖具有在三甘露糖核心的1,3甘露糖臂的末端上至少一个GlcNAc，在三甘露糖核心的1,6甘露糖臂上的零个或更多个甘露糖。多种N-聚糖也被称为“糖形”。"PNGase"或“聚糖酶”指肽N-糖苷酶F (EC 3.2.2.18)。

在本发明的一个实施方案中，分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞例如毕赤酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母)经过遗传工程化，而包括编码α-1,2-甘露糖苷酶的核酸，其具有指导其分泌的信号肽。例如，在本发明的一个实施方案中，crz1 ^突变型宿主细胞经过工程化，而表达外源α-1,2-甘露糖苷酶，具有5.1-8.0之间，优选5.9-7.5之间的最适pH。在本发明的一个实施方案中，外源酶靶向宿主细胞的内质网或高尔基体，其中它修整N-聚糖例如Man₈GlcNAc₂，以获得Man₅GlcNAc₂。参见美国专利号7,029,872。本发明包括用于生产一种或多种异源多肽的方法，其包括(i) 将编码所述一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类crz1 ^突变型、α-1,2-甘露糖苷酶⁺宿主细胞内，和(ii) 在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下培养宿主细胞，和任选地，(iii) 从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。本发明还涵盖用于在crz1 ^突变型真菌宿主细胞中产生包含N-聚糖结构的异源重组糖蛋白的方法，所述N-聚糖结构包含Man₅GlcNAc₂糖形，所述crz1 ^突变型真菌宿主细胞不展示对糖蛋白上的N-聚糖而言的α-1,6-甘露糖基转移酶(例如OCH1)活性，所述方法包括下述步骤：将编码异源重组糖蛋白的多核苷酸，和编码选择为在所述宿主细胞的ER或高尔基体中具有最佳活性的α-1,2-甘露糖苷酶的多核苷酸引入crz1 ^突变型och1^-真菌宿主细胞内，所述酶包含：(a) 在pH 5.1-8.0之间，在所述ER或高尔基体中具有最佳活性的α-1,2-甘露糖苷酶催化结构域；融合至(b) 通常不与催化结构域结合的细胞靶向信号肽，所述催化结构域选择为将甘露糖苷酶靶向宿主细胞的ER或高尔基体；并且在有利于异源重组糖蛋白表达的条件下培养真菌宿主细胞，由此在异源重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的表达和传递后，过量30摩尔%的与之连接的N-聚糖结构具有Man₅GlcNAc₂糖形，其可以充当体内GlcNAc转移酶I的底物。

在本发明的一个实施方案中，通过缺失或破坏β-甘露糖基转移酶基因(例如BMTl、BMT2、BMT3和/或BMT4)的一种或多种(参见美国专利号7,465,577)，或使用干扰RNA、反义RNA等等取消编码β-甘露糖基转移酶中的一种或多种的RNA翻译，本发明的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞例如毕赤酵母宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)，经过遗传工程化而消除具有α-甘露糖苷酶抗性N-聚糖的糖蛋白。本发明的范围包括用于生产一种或多种异源多肽的方法，其包括(i) 将编码所述一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类crz1 ^突变型、β-甘露糖基转移酶^- (例如bmt1 ^-、bmt2 ^-、bmt3 ^-和/或bmt4 ^-)宿主细胞内，和(ii) 在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下培养宿主细胞，和任选地，(iii) 从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。

本发明的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞(例如毕赤酵母，例如巴斯德毕赤酵母)还包括这样的宿主细胞，其经过遗传工程化，例如通过缺失或破坏磷酸甘露糖基转移酶基因PNO1和MNN4B之一或两者(参见例如美国专利号7,198,921和7,259,007)，而消除具有磷酸甘露糖残基的糖蛋白，其可以包括缺失或破坏磷酸甘露糖基转移酶中的一种或多种，或者使用干扰RNA、反义RNA等等取消编码磷酸甘露糖基转移酶中的一种或多种的RNA翻译。在本发明的一个实施方案中，此类真菌宿主细胞产生糖蛋白，其主要具有选自复合型N-聚糖、杂合型N-聚糖和高甘露糖N-聚糖的N-聚糖，其中在本发明的一个实施方案中，复合型N-聚糖选自Man₃GlcNAc₂、GlcNAC_(l-4)Man₃GlcNAc₂、NANA_(1-4)GlcNAc_(l-4)Man₃GlcNAc₂和NANA_(l-4)Gal_(1-4)Man₃GlcNAc₂；在本发明的一个实施方案中，杂合型N-聚糖选自Man₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂和NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂；并且在本发明的一个实施方案中，高甘露糖N-聚糖选自Man₆GlcNAc₂、Man₇GlcNAc₂、Mang₈1cNAc₂和Man₉GlcNAc₂。本发明的范围包括用于生产一种或多种异源多肽的方法，其包括(i) 将编码所述一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类crz1 ^突变型、磷酸甘露糖基转移酶^-(例如pno1 ^-和/或mnn4b ^-)宿主细胞内，和(ii) 在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下培养宿主细胞，和任选地，(iii) 从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。

本发明的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞例如毕赤酵母宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)包括遗传工程化为包括核酸的那些宿主细胞，所述核酸编码利什曼原虫属种单亚基寡糖基转移酶STT3A蛋白质、STT3B蛋白质、STT3C蛋白质、STT3D蛋白质或其组合，例如WO2011/06389中所述的那些。本发明的范围包括用于生产一种或多种异源多肽的方法，其包括(i) 将编码所述一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类crz1 ^突变型，(利什曼原虫STT3A ⁺、利什曼原虫STT3B ⁺、利什曼原虫STT3C ⁺和/或利什曼原虫STT3D ⁺)宿主细胞内，和(ii) 在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下培养宿主细胞，和任选地，(iii) 从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。

本发明的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母)还包括遗传工程化为消除核酸的那些宿主细胞，所述核酸编码多萜醇-P-Man依赖性α(1-3)甘露糖基转移酶，例如ALG3，例如美国专利公开号US2005/0170452中所述。本发明的范围包括用于生产一种或多种异源多肽的方法，其包括(i) 将编码所述一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类crz1 ^突变型、alg3 ^-宿主细胞内，和(ii) 在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下培养宿主细胞，和任选地，(iii) 从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。

表达具有靶向宿主细胞内的囊泡区室的内切甘露糖苷酶活性的多肽(例如，人(如，人肝脏)，大鼠或小鼠内切甘露糖苷酶)的本发明的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞例如毕赤酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母)是本发明的一部分。本发明的范围包括用于生产一种或多种异源多肽的方法，其包括(i) 将编码所述一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类crz1 ^突变型、内切甘露糖苷酶⁺宿主细胞内，和(ii) 在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下培养宿主细胞，和任选地，(iii) 从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。

在本发明的一个实施方案中，本发明的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞例如毕赤酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母)经过工程化用于在宿主细胞中产生重组唾液酸化糖蛋白，例如其中所述宿主细胞经过选择或工程化以产生包含选自Gal_(1-4)GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂的糖形的重组糖蛋白，例如通过包括下述的方法：(a) 将编码双功能UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶和CMP-唾液酸合酶的一种或多种多核苷酸转化到crz1 ^突变型真菌宿主细胞内；(b) 将编码CMP-唾液酸转运蛋白的多核苷酸转化到宿主细胞内；和(c)将编码融合至细胞靶向信号肽的2,6-唾液酸转移酶催化结构域的多核苷酸分子转化到宿主细胞内，所述细胞靶向信号肽例如由酿酒酵母Mnn2的核苷酸1-108编码；其中在重组糖蛋白通过宿主细胞的分泌途径传递后，产生包含选自NANA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂糖形的糖形的重组唾液酸化糖蛋白。本发明的范围包括用于生产一种或多种异源多肽的方法，其包括(i) 将编码所述一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类crz1 ^突变型、双功能UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶⁺、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶⁺、CMP-唾液酸合酶⁺、CMP-唾液酸转运蛋白⁺、2,6-唾液酸转移酶⁺真菌宿主细胞内，和(ii) 在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下培养宿主细胞，和任选地，(iii) 从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。

另外，在本发明的一个实施方案中，本发明的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞例如毕赤酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母)经过工程化而用于生成半乳糖基化蛋白质，例如具有末端半乳糖残基且基本上缺乏糖蛋白上的岩藻糖和唾液酸残基。在本发明的一个实施方案中，分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞包含编码β-半乳糖基转移酶活性的分离的核酸分子，和至少编码UDP-半乳糖转运蛋白活性、UDP-半乳糖C4差向异构酶活性、半乳糖激酶活性或半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的多核苷酸，例如其中所述宿主细胞经过遗传工程化而产生具有末端GlcNAc残基的N-联寡糖且包含编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白在宿主细胞中将半乳糖残基从UDP-半乳糖转移到糖蛋白的N-聚糖的N-联寡糖分支的末端GlcNAc残基上，其中所述N-联寡糖分支选自GlcNAcβ1,2-Manα1；GlcNAcβ1,4-Manα1,3，GlcNAcβ1,2-Manα1,6，GlcNAcβ1,4-Manα1,6和GlcNAcβ1,6-Manα1,6；其中所述宿主细胞的多萜醇基-P-Man:Man₅GlcNAc₂-PP-多萜醇基α-1,3-甘露糖基转移酶活性被缩小或耗尽，并且其中所述宿主细胞产生具有一个或多个半乳糖残基的糖蛋白。本发明的范围包括用于生产一种或多种异源多肽的方法，其包括(i) 将编码所述一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类宿主细胞内，和(ii) 在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下培养宿主细胞，和任选地，(iii) 从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。

在本发明的一个实施方案中，本发明的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞例如毕赤酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母)缺乏功能性OCH1蛋白质，例如其中内源OCH1是突变的。本发明的范围包括用于生产一种或多种异源多肽的方法，其包括(i) 将编码所述一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类crz1 ^突变型、och1 ^-宿主细胞内，和(ii) 在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下培养宿主细胞，和任选地，(iii) 从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。

表达半乳糖基转移酶例如α1，3-半乳糖基转移酶或β1,4-半乳糖基转移酶的，本发明的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞例如毕赤酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母)是本发明的一部分。本发明的范围包括用于生产一种或多种异源多肽的方法，其包括(i) 将编码所述一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类crz1 ^突变型、半乳糖基转移酶⁺宿主细胞内，和(ii) 在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下培养宿主细胞，和任选地，(iii)从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。

表达核苷酸糖转运蛋白的本发明的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞例如毕赤酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母)是本发明的一部分。本发明的范围包括用于生产一种或多种异源多肽的方法，其包括(i) 将编码所述一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类crz1 ^突变型、核苷酸糖转运蛋白⁺宿主细胞内，和(ii) 在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下培养宿主细胞，和任选地，(iii) 从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。

表达唾液酸转移酶的本发明的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞例如毕赤酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母)是本发明的一部分。本发明的范围包括用于生产一种或多种异源多肽的方法，其包括(i) 将编码所述一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类crz1 ^突变型、唾液酸转移酶⁺宿主细胞内，和(ii) 在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下培养宿主细胞，和任选地，(iii) 从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。

表达乙酰氨基葡萄糖转移酶，例如GNT1或GNT2或GNT4的本发明的分离的crz1 ^突变型真菌宿主细胞例如毕赤酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母)是本发明的一部分。本发明的范围包括用于生产一种或多种异源多肽的方法，其包括(i) 将编码所述一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类crz1 ^突变型、乙酰氨基葡萄糖转移酶⁺宿主细胞内，和(ii) 在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下培养宿主细胞，和任选地，(iii) 从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。

如本文使用的，当它涉及糖蛋白上特定糖残基例如岩藻糖或半乳糖等等的缺乏时，术语“基本上不含”用于指示糖蛋白组合物基本上没有含有此类残基的N-聚糖。以纯度表示，“基本上不含”意指含有此类糖残基的N-聚糖结构的量不超过10%，且优选低于5%，更优选低于1%，最优选低于0.5%，其中所述百分比是按重量计或按摩尔百分比计。

如本文使用的，当N-聚糖结构上不存在可检测量的此类糖残基时，糖蛋白组合物“缺乏("lacks"或"is lacking")”特定糖残基，例如岩藻糖或半乳糖。例如，在本发明的一个实施方案中，由本发明的宿主细胞产生的糖蛋白组合物“缺乏岩藻糖”，因为细胞不具有产生岩藻糖化N-聚糖结构所需的酶。因此，术语“基本上不含岩藻糖”涵盖术语“缺乏岩藻糖”。然而，即使如上所述组合物曾经含有岩藻糖化N-聚糖结构，或含有有限但可检测量的岩藻糖化N-聚糖结构，组合物也可以“基本上不含岩藻糖”。

本发明的范围涵盖二倍体的分离的真菌宿主细胞，其中仅一种内源染色体CRZ1基因已被突变、破坏、截短或者部分或完全缺失，并且另一种内源染色体CRZ1基因未被突变、破坏、截短或者部分或完全缺失，且编码功能性CRZ1多肽。例如因为CRZ1基因的两个内源染色体拷贝已被突变、破坏、截短或者部分或完全缺失，所以缺乏功能性CRZ1多肽的同源二倍体也是本发明的一部分。

蛋白质表达

本发明的范围包括用于生产一种或多种异源多肽的方法，其包括(i) 将编码所述一种或多种异源多肽的多核苷酸引入此类crz1 ^突变型宿主细胞(例如如本文讨论的)内，和(ii) 在有利于所述一种或多种异源多肽在细胞中表达的条件下培养宿主细胞，例如只要细胞存活(即进行培养)，和任选地，(iii) 从宿主细胞中分离所述一种或多种异源多肽。用于在真菌宿主细胞中表达异源多肽的方法是本领域一般已知和常规的。

本发明包含悬浮于液体培养基中的本文讨论的任何分离的真菌宿主细胞。本文讨论的分离的真菌宿主细胞的任何裂解产物也在本发明的范围内。

用于真菌宿主细胞表达系统的培养条件可以取决于临近的特定条件而改变。在本发明的一个实施方案中，真菌宿主细胞可以在摇瓶或发酵罐(例如1L、2L、5L、10L、20L、30L、50L、100L、200L、500L、1000L、10,000L体积)中的液体培养基中生长。多种生长培养基可以用于培养真菌宿主细胞。在本发明的一个实施方案中，培养基处于在pH 3-7 (例如3、4、5、6或7)之间的pH下；在本发明的一个实施方案中，用碱例如氢氧化铵增加pH。在本发明的一个实施方案中，温度维持在约24℃或26℃或28℃或30℃或32℃或34℃。在本发明的一个实施方案中，生长培养基中的溶解氧维持在约20%或30%。在本发明的一个实施方案中，生长培养基含有酵母氮碱(例如具有硫酸铵；含或不含必需氨基酸)、蛋白胨和/或酵母提取物。多种补充物可以加入生长培养基中，例如生物素、右旋糖、甲醇、甘油、酪蛋白氨基酸、L-精氨酸盐酸盐、铵离子(例如以磷酸铵的形式)。在本发明的一个实施方案中，生长培养基是含有酵母氮碱，水，碳源例如右旋糖、甲醇或甘油，生物素和组氨酸的基本培养基。在本发明的一个实施方案中，细胞培养物含有痕量矿物质/营养素，例如铜、碘、锰、钼、硼、钴、锌、铁、生物素和/或硫，例如CuSO₄、NaI、MnSO₄、Na₂MoO₄、H₃BO₃、CoCl₂、ZnCl₂、FeSO₄、生物素和/或H₂SO₄。在本发明的一个实施方案中，细胞培养物含有消泡剂(例如硅酮)。

本发明涵盖用于制备异源多肽(例如免疫球蛋白链或抗体或其抗原结合片段)的方法，其包括将编码所述多肽的异源多核苷酸引入分离的真菌crz1 ^突变型宿主细胞(例如毕赤酵母，例如巴斯德毕赤酵母)内，例如所述异源多核苷酸可操作地连接至启动子，例如甲醇诱导型启动子，且培养所述宿主细胞，

(i) 在分批期(例如甘油分批期)中，其中所述细胞用不可发酵的碳源例如甘油生长，例如直至不可发酵的碳源被耗尽；

(ii) 在分批补料期(例如甘油分批补料期)中，其中例如以生长限制速率补料另外的不可发酵的碳源(例如甘油)；和

(iii) 在甲醇补料分批期中，其中所述细胞在甲醇和任选的另外甘油的存在下生长。

在本发明的一个实施方案中，在甲醇补料分批期中，甲醇浓度设为约2克甲醇/升至约5克甲醇/升(例如2、2.5、3、3.5、4、4.5或5)。

在本发明的一个实施方案中，在分批期之前，初始种子培养物生长至高密度(例如约2或更高的OD₆₀₀)，并且在种子培养物中生长的细胞用于接种初始分批期培养基。

在本发明的一个实施方案中，在分批补料期之后和在甲醇补料分批期之前，宿主细胞在过渡期中生长，其中细胞在约2 ml甲醇/升培养物的存在下生长。例如，细胞可以在过渡期中生长直至甲醇浓度达到约零。

在本发明的一个实施方案中，从真菌宿主细胞中分离的异源多肽是纯化的。如果异源多肽从真菌宿主细胞分泌到液体生长培养基内，则多肽可以通过包括从生长培养基中去除真菌宿主细胞的过程进行纯化。从培养基中去除细胞可以使用离心，弃去细胞且保留液体培养基上清液来执行。如果异源多肽不是分泌的，则可以在与真菌宿主细胞分离后弃去液体培养基，保留所述真菌宿主细胞。其后，可以将真菌宿主细胞裂解，以产生可以进一步纯化出异源多肽的粗细胞裂解产物。

在本发明的一个实施方案中，异源多肽纯化通过层析例如柱层析执行。层析纯化可以包括使用离子交换，例如阴离子交换和/或阳离子交换、蛋白A层析、尺寸排阻层析和/或疏水相互作用层析。纯化还可以包括包含多肽的组合物的病毒灭活、沉淀和/或冻干。

实施例

这个部分用于进一步描述本发明，并且不应解释为进一步限制本发明。本文所述的任何组合物或方法构成本发明的一部分。

实施例1：CRZ1突变的鉴定。

实验方法

UV诱变、补料分批发酵、IgG纯化、N-聚糖表征以及其他分析测定如先前描述的(Barnard等人2010；Jiang等人2011；Potgieter等人2009；Winston F 2008)执行。除非另有说明，所有1L生物反应器发酵运行预定为在100-120小时的MeOH诱导后结束。然而，如果观察到过量细胞裂解，则发酵运行提早终止。细胞裂解通过显微镜检查，或通过测量释放到上清液内的核DNA的量进行测定(Barnard，2010)。过量细胞裂解通过经由显微镜检查大于90%细胞裂解，或通过Picogreen测定而测定的上清液中大于30微克/ml DNA浓度限定。

结果和讨论

温度抗性突变型展示大幅增强的发酵稳健性。为了鉴定发酵稳健性增加的毕赤酵母宿主菌株，我们对温度敏感的糖工程化的菌株(YGLY12905、YGLY22835和YGLY27890)进行UV诱变，且选择温度抗性突变型，原理是压制温度敏感缺陷的某些第2位点突变还可能补偿细胞稳健性缺陷。在证实其温度抗性表型后，使用标准MeOH补料分批运行在1L DasGip生物反应器中进行这些突变型的发酵。在广泛发酵筛选活动中，我们鉴定了在发酵过程期间展示大幅增强的细胞稳健性的9种突变型。如图1中所示，在32℃下诱导大约48小时，由于过量细胞裂解，未诱变的对照菌株的发酵过程不得不终止。相比之下，突变型均展示显著改善的发酵稳健性。YGLY29010、YGLY29030、YGLY29031和YGLY29012能够发酵大约90小时；YGLY28997、YGLY28998、YGLY17159、YGLY28999和YGLY29042均在32℃下持续超过100小时诱导。

温度抗性突变型的蛋白质生产力和N-聚糖质量评价。温度抗性突变型中的五种(YGLY29010、YGLY29030、YGLY29031、YGLY29042和YGLY29012)衍生自YGLY27890 (图2)，其表达人Fc片段。为了评估这些温度抗性突变对Fc生产力和N-聚糖质量具有何种影响，我们从32℃ 1L生物反应器中纯化Fc片段，定量培养液滴度(图1)，且分析四种温度抗性突变型以及其未诱变的亲本菌株YGLY27890的N-聚糖概况(图3)。与亲本对照相比较，四种突变型(YGLY29010、YGLY29030、YGLY29031和YGLY29042)展示产物滴度的大幅增加：事实上，YGLY29042和YGLY29010实际上分泌多大约4-5倍的Fc产物。相比之下，来自YGLY29012的产物滴度仅为对照菌株滴度的大约50%。对于衍生自Fc产物的N-聚糖，我们未观察到N-聚糖概况中的任何显著改变(图3)。正如对照菌株YGLY27890 (83% A2和4% A1)一样，所有五种突变型均能够有效修饰其Fc N-聚糖，具有高水平的末端唾液酸，A2水平范围为77-84%，和A1水平范围为4-7%。总之，这些结果证实由YGLY29010、YGLY29030、YGLY29031和YGLY29042获得的UV诱导的突变没有负面地影响其产生异源表达的人Fc片段的能力，突变也没有导致N-聚糖质量中值得注意的恶化。

鉴定负责增强的热耐受性和发酵稳健性的一种或多种成因突变的基因组测序。为了更好地理解涉及维持发酵期间的细胞稳健性的分子机制，我们测序了这9种温度抗性突变型，以及两种未诱变的空宿主菌株YGLY22812和YGLY22835的基因组。在突变型和未诱变菌株之间的全基因组比较后，我们在这9种突变型的每一个中鉴定了1-7个无义突变(由"+"指示，图4)。三种突变型，YGLY29010、YGLY29031和YGLY29042，含有在基因Pp02g02120内的单个突变，该基因显示与酿酒酵母的CRZ1基因的高水平序列同源性。值得注意的是，在YGLY28997、YGLY28998、YGLY17159、YGLY28999、YGLY29030和YGLY29012中也检测到在相同PpCRZ1基因中的不同突变。ScCRZ1是参与胁迫应答的响应钙调磷酸酶的锌指转录因子。锌指结构域在PpCRZ1和ScCRZ1之间是高度保守的，并且均定位于C末端处(参见上文序列比对)。如图5中图解说明的，见于温度抗性突变型中的四种无义终止密码子突变位于锌指上游，因此全部产生不含锌指结构域的截短的PpCRZ1片段。对于剩余5种突变型，它们含有错义氨基酸取代突变，其全部位于锌指结构域内，其中4种在25个核苷酸内聚簇。9种独立分离的温度抗性突变型含有在PpCRZ1基因内的不同无义或错义突变的发现强烈表明这些CRZ1突变对于温度抗性和增加的发酵稳健性表型是原因性的。此外，突变型中的2种(yGLY17159和yGLY28998)还具有在PpATT1中的另外突变，其是先前已知同样在温度耐受性和细胞稳健性中起关键作用的基因。yGLY17159和yGLY28998均在分离的最稳健的突变型中的事实表明ATT1和CRZ1突变的组合可能对于增加糖工程化的毕赤酵母菌株中的热耐受性和发酵稳健性具有累加或协同作用。

PpCRZ1序列

1. 巴斯德毕赤酵母CRZ1野生型开放读码框

2. 从yGLY28997中分离的巴斯德毕赤酵母突变型CRZ1 (编码突变：L33→终止，突变的核苷酸采取粗体字体)

(包含t98a突变的SEQ ID NO: 2)

3. 从yGLY29012中分离的巴斯德毕赤酵母突变型CRZ1 (编码突变：Q214→终止，突变的核苷酸采取粗体字体)

(包含c640t突变的SEQ ID NO: 2)

4. 从yGLY29010中分离的巴斯德毕赤酵母突变型CRZ1 (编码突变：L294→终止，突变的核苷酸采取粗体字体)

(包含t881g突变的SEQ ID NO: 2)

5. 从yGLY29042中分离的巴斯德毕赤酵母突变型CRZ1 (编码突变：S298→终止，突变的核苷酸采取粗体字体)

(包含c893a突变的SEQ ID NO: 2)

6. 从yGLY28998中分离的巴斯德毕赤酵母突变型CRZ1 (编码突变：E403→G，突变的核苷酸采取粗体字体)

(包含a1208g突变的SEQ ID NO: 2)

7. 从yGLY17159中分离的巴斯德毕赤酵母突变型CRZ1 (编码突变：F406→S，突变的核苷酸采取粗体字体)

(包含t1217c突变的SEQ ID NO: 2)

8. 从yGLY28999中分离的巴斯德毕赤酵母突变型CRZ1 (编码突变：F406→L，突变的核苷酸采取粗体字体)

(包含t1216c突变的SEQ ID NO: 2)

9. 从yGLY29030中分离的巴斯德毕赤酵母突变型CRZ1 (编码突变：C411→F，突变的核苷酸采取粗体字体)

(包含g1232t突变的SEQ ID NO: 2)

10. 从yGLY29031中分离的巴斯德毕赤酵母突变型CRZ1 (编码突变：K469→N，突变的核苷酸采取粗体字体)

(包含a1407c突变的SEQ ID NO: 2)。

实施例2：通过定向菌株工程化的表型证实

如本文讨论的，突变型的每一种中的相同CRZ1基因中的独立突变强烈指示该转录因子的失活负责观察到的温度抗性和发酵稳健性表型。为了证实该结论，在YGLY21203中，将CRZ1 ORF完全缺失，或将内源CRZ1基因替换为图8中所示的截短形式，YGLY21203为通过5-FOA反选择衍生自YGLY17108的未诱变的ura5营养缺陷型毕赤酵母菌株。

质粒pGLY12829 (图6)通过下述进行构建：将紧邻CRZ1 ORF上游的1.5 kb基因组DNA片段克隆到ALG3终止子之前，随后为lacZ-URA5-lacZ URAblaster，且随后连接至含有CRZ1 ORF的最后234 bp加上1.7 kb下游区的2 kb基因组DNA片段。在SfiI消化后，将该CRZ1-上游-URAblaster-CRZ1-下游DNA片段转化到未诱变的宿主菌株(例如YGLY17108)内。通过在CRZ1上游和下游区两者处的同源重组，该URAblaster盒替换内源CRZ1基因，缺失85%的CRZ1编码区，因此生成完全CRZ1敲除突变型。为了证实CRZ1 ORF的正确替换，使用下述寡核苷酸作为PCR引物进行基因组DNA聚合酶链反应(PCR)测定：GTATGCGATATAGTGTGGA (SEQID NO: 4，CRZ1起始上游1545 bp)和TGGGGAGAAGGTACCGAAG (SEQ ID NO: 5，在ALG3终止子内)，以证实基因替换的5'连接点；CACTACGCGTACTGTGAGCC (SEQ ID NO: 6，在lacZ内)和AGGATATCAAACCCGACCAG (SEQ ID NO: 7，CRZ1终止密码子下游2045 bp)，以证实基因替换的3'连接点；加上" GACACATGCGAAATGTCCTG " (SEQ ID NO:8，CRZ1终止密码子下游120bp)和"TTGAGTTGGCAGCTTCTCAG" (SEQ ID NO: 9，在CRZ1 ORF内，起始后1075 bp)，以证实野生型CRZ1 ORF的不存在。质粒pGLY12832 (图7)通过下述进行构建：将1.5 kb DNA片段(0.6 kb上游区，CRZ1 ORF的前879 bp，加上2个终止密码子)克隆到ALG3终止序列之前，随后为lacZ-URA5-lacZ URAblaster，且随后连接至含有CRZ1 ORF的最后234 bp加上1.7 kb下游区的2 kb基因组DNA片段。在pGLY12832 (图7)的SfiI片段和染色体CRZ1区域之间的同源重组介导的双重交换，将内源CRZ1 ORF替换为仅具有前294个氨基酸残基的截短形式的CRZ1。

在证实DNA构建体将内源CRZ1基因精确替换为相应缺失或截短物后，检查其在35℃下在固体培养基上和在32℃下在液体培养基中生长的能力。证实这些CRZ1∆截短和缺失突变型展示的温度抗性表型非常类似于由通过UV诱变分离的原始突变型观察到的那些。

接下来，对截短和缺失突变型实施标准DasGip MeOH补料分批发酵运行(Hopkins等人，2011)，以测定它们是否也在32℃下展示增加的发酵稳健性。如图9中所示，YGLY17108对照菌株展示严重裂解，且在32℃下65小时的MeOH诱导内不存活。相比之下，具有CRZ1基因的完全缺失和截短的菌株显示发酵稳健性的显著增加，并且成功完成超过130小时的MeOH诱导。这些结果证实通过完全或部分缺失CRZ1 ORF的CRZ1失活足以改善糖工程化的菌株的发酵稳健性。此外，由这些定向基因替换菌株显示出的表型紧密类似由相应的UV诱导突变型展示的那些，说明在CRZ1基因内的突变负责从UV诱导突变型观察到的改善的热耐受性和发酵稳健性。

ATT1基因的失活已导致菌株发酵稳健性的显著改善。因为CRZ1和ATT1的失活给出非常相似的表型(即温度抗性和增强的发酵稳健性)，所以我们希望检查CRZ1缺失是否进一步改善已含有ATT1缺失突变的菌株的发酵稳健性。为此，我们构建了crz1，att1双重缺失突变型，且通过在34℃下在1L DasGip生物反应器中进行标准MeOH补料分批发酵运行，测试其发酵稳健性。在这种非常严格的发酵条件下，att1单一缺失菌株YGLY29128保持存活75小时，而crz1，att1双重突变型保持存活超过115小时(图10)。这些结果明确证实衍生自att1缺失和crz1缺失的发酵稳健性改善是累加的，并且crz1，att1双重突变型展示比单一突变型高得多的发酵稳健性水平。

参考文献

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本发明的范围并不限于本文描述的具体实施方案。事实上，本发明的范围包括本文具体阐述的实施方案和本文未具体阐述的其他实施方案；本文具体阐述的实施方案未必期望是详尽的。根据前述说明书，除了本文所述那些之外的本发明的多种变型对于本领域技术人员将变得显而易见。此类变型预期落入权利要求的范围内。

本申请全文各处引用的专利、专利申请、出版物、产品说明书和方案，其公开内容为了所有目的整体通过引用并入本文。