JP2009273474A - 哺乳動物型糖質構造を操作するための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、改変された脂質連結オリゴ糖を有する宿主細胞に関する。この脂質連結オリゴ糖は、グリコシルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼのセットの異種発現によってさらに改変されて、哺乳動物(例えば、ヒト)の治療用糖タンパク質の産生のための宿主系となり得る。このプロセスは、操作された宿主細胞を提供し、この宿主細胞を使用して、グリコシル化に関与する任意の望ましい遺伝子を発現させ得、標的化し得る。改変された脂質連結オリゴ糖を有する宿主細胞が、産生または選択される。
【選択図】なし
Description
本出願は、米国仮出願番号60/344,169(2001年12月27日)(本明細書中に参考としてその全体を援用する)に優先権を主張する。
本発明は、一般的に、真菌または他の低級真核生物において発現される組換えタンパク質のグリコシル化構造(より詳細には高等哺乳動物(特にヒト)のタンパク質のグリコシル化)の改変に関する。
DNAが転写されそしてタンパク質へと翻訳された後の、さらなる翻訳後プロセッシングは、リコシル化として公知のプロセスである糖残基の結合を含む。異なる生物は、異なるグリコシル化酵素(グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ)を生産し、そして利用可能な異なる基質(ヌクレオチド糖)を有し、その結果、個々のオリゴ糖のグリコシル化パターンならびに組成物は、1つでも同じタンパク質でさえも、特定のタンパク質が発現される宿主系に依存して異なる。細菌は、代表的に、タンパク質をグリコシル化せず、そうであれば、非常に非特異的な様式である(Moens,1997)。低級真核生物(例えば、糸状菌および酵母)は、主なマンノースおよびリン酸マンノシル(mannosylphosphate)糖を添加するのに対して、昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)は、さらなる別の方法でタンパク質をグリコシル化する。例えば、(Bretthauer,1999;Martinet,1998;Weikert,1999;Malissard,2000;Jarvis,1998;およびTakeuchi,1997)を参照のこと。
本発明の特定の興味深いことは、N−グリコシル化の初期段階である(図1および図2)。Glc3Man9GlcNAc2−PP−Dolの生合成が不完全であるalg(アスパラギン連結グリコシル化)変異体の研究は、N−グリコシル化の開始段階を明らかにすることを助ける。
証拠は、哺乳動物細胞において、グルコシル化脂質連結オリゴ糖のみが、新生タンパク質に移動される(Turco,1977)が、酵母alg5変異体、alg6変異体、およびdpg1変異体においては、非グルコシル化オリゴ糖が移動され得る(Ballou,1986;Runge,1984)ことを示唆する。Saccharomyces cerevisiae alg8変異体において、過小グリコシル化のGlcMan9GlcNAc2が移動される(Runge,1986)。Verostekおよび共同研究者らは、alg3変異体、secl8変異体、glsl変異体を研究し、そしてMan5GlcNAc2構造(構造I、上記)のグルコシル化は、脂質連結Man9構造のグルコシル化と比較して、比較的遅いことを提案する。さらに、このMan5GlcNAc2構造のタンパク質への移動は、Glc3Man5GlcNAc2へのグルコシル化よりも約5倍効率的であるようである。Man5GlcNAc2グルコシル化の減少した速度は、比較的早い速度のMan5構造と組み合わせて、alg3変異体酵母中で観察された非グルコシル化Man5構造の蓄積の原因であると考えられる新生タンパク質上に移動する(Verostek−a,1993;Verostek−b,1993)。
糖トランスフェラーゼおよびマンノシダーゼは、ERおよびゴルジ装置の内側(管腔)表面に並び、それによって糖タンパク質の連続的なプロセシングを可能にする「触媒」表面を提供する。なぜなら、糖タンパク質は、ERおよびゴルジのネットワークを介して進むからである。実際、これらのシス、中間、およびトランスのゴルジならびにトランス−ゴルジネットワーク(TGN)の複数の区画は、順番に並べられたグリコシル化反応が起こり得る、異なる局所性を提供する。糖タンパク質は、ER中の合成から、後期のゴルジまたはTGNにおける完全な成熟まで進められるので、異なるグリコシダーゼ、マンノシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼに順番に曝され、その結果、特異的糖質構造が合成され得る。多くの研究は、これらの酵素がそれぞれのオルガネラに保持およびアンカーされる、正確な機構を明らかにすることに奉げられていつ。画像を展開することは複雑であるが、証拠は、幹領域、膜貫通領域および細胞質テイルが、個々にかまたは協力して、個々のオルガネラの膜に酵素を指向し、それによって関連する触媒ドメインをその座に局在化する。
ヒトまたは動物から単離される有意な数のタンパク質は、最も有意な改変の1つであるグリコシル化によって翻訳後に改変される。全ての治療用タンパク質の推定で70%がグリコシル化され、従って、ヒトと類似の様式でグリコシル化し得る産生系(すなわち、宿主細胞)に依存している。現在、多くの糖タンパク質は、哺乳動物宿主系で作製される。いくつかの研究は、グリコシル化は、(1)免疫原性、(2)薬物動態学特性、(3)トラフィック、および(4)治療用タンパク質の効果を決定するのに重要な役割を果たすことが示されている。従って、製薬産業の実質的な労力は、可能であれば「ヒューマノイド」または「ヒト様」のようなプロセスを開発し、糖タンパク質を得ることに向けられている。これは、このような哺乳動物細胞を遺伝子操作して、細胞によって発現されたタンパク質のシアリル化(すなわち、シアル酸の末端付加)(これは、このようなタンパク質の薬物動態学特性を改善することが知られている)の程度を増加することを含み得る。あるいは、公知のグリコシルトランスフェラーゼおよびそれぞれのヌクレオチド糖(例えば、2,3シアリルトランスフェラーゼおよびCMP−シアル酸)を使用する、このような糖のインビトロでの付加によってシアリル化の程度を改善し得る。
1.高等真核生物(例えば、チャイニーズハムスターの卵細胞(CHO)、マウス線維芽細胞およびマウス骨髄腫細胞(Werner、1998);
2.トランスジェニック動物(例えば、ヤギ、ヒツジ、マウスおよその他(Dente、1988);(Cole、1994);(McGarvey、1995);(Bardor、1999);
3.植物(Arabidopsis、thaliana,tobaccoなど)(Staub、2000);(McGarvey、1995);(Bardor、1999);
4.昆虫細胞(組換えバキュロウイルス(例えば、鱗翅目細胞に感染するAutographa california多核ポリヒドローシスウイルス(Altmann,1999))との組み合わせで、Spodoptera frugiperda Sf9,Sf21,Trichoplusia niなど)。
本発明は、改変された脂質連結オリゴ糖を有する菌株のような宿主細胞に関し、この宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼのセット、糖輸送体、およびマンノシダーゼの異種発現によってされに改変され、哺乳動物の生成物(例えば、ヒト治療的糖タンパク質)についての宿主株とされ得る。タンパク質生成方法は、以下を用いて開発されている;(1)下等な真核生物宿主(例えば、単細胞真菌または繊維状真菌)または(2)ヒト由来の異なる糖化パターンを有する、あらゆる非ヒト真核生物(ヒトタンパク質中に見出される炭化水素構造により類似するように、宿主生物(「宿主細胞」)中で生成される糖化の組成およびタンパク質の構造が改変される。このプロセスは、科学文献およびタンパク質発現の当業者に公知の、十分確立された方法によって、糖化に関する任意の所望の遺伝子を発現および標的化するために使用され得る、操作された宿主細胞を得ることを可能にする。本明細書に記載のように、改変された脂質連結オリゴ糖を有する宿主細胞は、作成または選択される。操作された宿主細胞中のN−グリカンは、GlcNAcMan3GlcNAc2コア構造を有し、次いで、これは1つ以上の酵素(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、糖輸送体およびマンノシダーゼ)の異種発現によって、さらに改変され、ヒト様糖タンパク質を産生し得る。治療的タンパク質の生成のために、この方法が、あらゆる所望の糖化構造を得ることができる細胞株を操作するために適合され得る。
本明細書中で他に規定されない限り、本発明に関連して使用される科学的用語および技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈により他に必要とされなければ、単数形の用語は、複数形を含み、そして複数形の用語は、単数形を含む。本発明の方法および技術は、当該分野において周知の従来の方法に従って一般的に実施される。一般的に、本明細書中に記載される生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される名称、およびこれらの技術は、周知のものであり、そして当該分野で一般的に使用される。本発明の方法および技術は、他に示されなければ、一般的に、当該分野で周知の従来の方法に従って、そして本明細書の全体にわたって引用されそして考察される種々の一般的な参考文献およびより具体的な参考文献に記載されるとおりに実施される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989);Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992および2002までの補遺);Harlow and Lane Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990);Introduction to Glycobiology,Maureen E.Taylor,KurtDrickamer,Oxford Univ.Press (2003);Worthington Enzyme Manual,Worthington Biochemical Corp.Freehold,NJ;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins VolI 1976 CRC Press;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins Vol II 1976 CRC Press;Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)を参照のこと。本明細書中に記載される生化学および分子生物学に関連して使用される名称、ならびにこれらの研究室手順および技術は、当該分野で周知でありかつ一般的に使用されるものである。
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である。
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞において、ヒト様糖タンパク質を産生するための方法を提供する。本発明は、alg遺伝子活性(すなわち、alg活性(非真菌宿主細胞中の等価な酵素活性を含む))を低下するかまたは激減する非ヒト真核生物宿主細胞を作製する工程または使用する工程、および宿主細胞に少なくとも1つのグリコシダーゼ活性を導入する工程を包含する。好ましい実施例において、グリコオシダーゼ活性は、宿主細胞内の1つ以上のマンノシダーゼ活性の発現によって、例えば、マンノシダーゼ活性の活性化によって、または宿主細胞におけるマンノシダーゼ活性の核酸分子からの発現によって、導入される。
のこと)。
好ましい実施形態において、本発明の方法は、(a)alg遺伝子の活性またはMan3GlcNAc2(「Man3」)コア糖質構造上のα−1,6アームのN−グリカンをマンノシル化する1つ以上の活性が減退または減少しており、かつ(b)(Man3コア構造のα−1,3アーム上の)開始α−1,6−マンノシルトランスフェラーゼ(すなわち、外側鎖マンノシル化を開始する開始特異的酵素)の活性が減退または欠失している、宿主細胞を作製または使用することを包含する。S.cerevisiaeにおいて、この酵素は、OCH1遺伝子によってコードされる。S.cerevisiaeにおけるoch1遺伝子の破壊は、N連結糖がポリマンノース外側鎖を完全に欠く表現型を生じる。真菌株における哺乳動物型グリコシル化を得るための以前のアプローチは、OCH1の不活性化を必要とした(例えば、Chiba,1998を参照のこと)。しかし、Och1p酵素が、有効なマンノース外側鎖開始についてインタクトなMan8GlcNAcを必要とする場合、本発明の宿主細胞における開始α−1,6−マンノシルトランスフェラーゼ活性の破壊は、任意である(選択された宿主細胞に依存して)。従って、本発明に従って選択または生成された宿主細胞(これは、7個以下のマンノース残基を有する脂質連結オリゴ糖を蓄積する)は、移動の後、Och1pに対する乏しい基質の可能性のある低グリコシル化N−グリカンを生成する(例えば、Nakayama,1997を参照のこと)。
上記のように、グリコシル化オリゴ糖は、それらの非グリコシル化対応物よりもはるかに高い割合で新生ポリペプチド鎖に移動されると考えられる。オリゴ糖トランスフェラーゼ複合体による基質認識は、脂質連結オリゴ糖のアンテナへのグルコースの付加によって増大するようである。従って、脂質連結オリゴ糖を最適にグリコシル化し得る宿主細胞を作製または選択することが望まれる。このような宿主細胞において、過小グリコシル化(underglycosylation)は、グリコシル化Man5構造の新生ポリペプチド鎖上へのより速くより効率的な移動に起因して、実質的に減少されるかまたは消滅されさえする。
(a)1つ以上のalg遺伝子活性またはMan3GlcNAc2(「Man3」)コア糖質構造のα−1,6アームで、N−グリカンをマンノシル化する活性の活性が低下または激減し、かつ(b)ER中での脂質連結オリゴ糖のグリコシル化を担う1つ以上の酵素が活性を増加するように操作されるかまたは選択される宿主細胞を使用する。しかし、alg3変異型バックグラウンドにおいて見出される脂質連結Man5構造は、Alg6pに対する好ましい基質ではない。従って、当業者は、例えば、当業者に周知の分子生物学および遺伝子選択技術を使用して、基質特異性が増加した酵素をコードする核酸を、1以上のラウンドの遺伝子シャッフリング、誤りがちのPCR、またはインビトロ変異誘発アプローチに供することによって、そして目的の宿主細胞中で基質特異性の上昇について選択することによって、基質特異性が上昇したAlg6p、Alg8pおよびAlg10pを同定し得る(Gibbs,2001)。選択された宿主株において酵素基質特異性を改善するためのこのような技術が、本発明のこの特定の実施形態に限定されないが、非ヒト宿主細胞においてヒト様N−グリカンの産生をさらに最適化する任意の実施形態において使用され得ることは、当業者に理解される。
本発明の好ましい非ヒト宿主細胞は、下等真核生物細胞(例えば、単細胞真菌または線維状真菌)であり、これは、1つ以上のalg遺伝子活性(alg活性に対して相同であるか、または等価である酵素活性を含む)が減少しているか、または激減している。本発明の別の好ましい宿主細胞は、脂質連結オリゴ糖構造のα−1,6アームをマンノシル化する1つ以上の酵素の活性(alg活性以外)が低下されるか、または激減する。
改変された、新生N−グリカン構造に糖を連続的に添加することは、グルコシルトランスフェラーゼのゴルジ装置への首尾よい標的化および首尾よい発現を含む。このプロセスは、例えば、機能的発現(例えば、初期ゴルジ装置または中期ゴルジ装置におけるGnTIの機能的発現)を必要とし、UDP−GlcNAc(例えば、UDP−GlcNAc輸送体の発現による)の十分な供給を保証する。
多くの研究が、これらの酵素が、これらのそれぞれの細胞小器官に保持され、そして固定される正確な機構を示すために、提供されてきた。複雑ではあるが、証拠は、幹領域、膜貫通領域、および細胞質テイルが、個々にまたは一斉に、酵素を個々の細胞小器官の膜に指向し、それによって、結合する触媒領域が、その位置に局在化することを示唆する。
(A)分泌経路中の特定の位置(ER、ゴルジおよびトランスゴルジネットワーク)への局在化を媒介するタンパク質/ペプチドをコードすることが既知である領域のDNAライブラリーを確立すること。これらの酵素の限られた選択物およびこれらのそれぞれの位置を、表1に示す。これらの配列は、操作される宿主および他の関連する生物または関連しない生物から選択され得る。一般的に、このような配列は、以下の3つの範疇に分類される:
(1)細胞質テイル(ct)、膜貫通ドメイン(tmd)およびいくらかよりあいまいに規定された幹領域(sr)の一部をコードするN−末端配列。これらは、一緒にかまたは個々にタンパク質をゴルジの内(内腔)膜に固定する、
(2)一般的にC−末端で見出される回収シグナル(例えば、HDELまたはKDELテトラペプチド)、および
(3)膜貫通ヌクレオチド糖輸送体(これは、ゴルジに局在化することが公知である)。
第1の場合において、局在化領域が種々の要素(ct、tmdおよびsr)からなる場合、ライブラリーは、ct、tmdおよび幹領域の種々の部分が示されるように設計される。これは、細胞質領域をコードするDNAの5’末端に結合するPCRプライマーを使用すること、および幹領域の種々の部分に結合する対向する一連のプライマーを使用することによって達成され得る。さらに、糖ヌクレオチド輸送体および公知の回収シグナルをコードする融合タンパク質構築物を作製する。
(B)第2工程は、一連の融合タンパク質構築物の作製を包含し、この構築物は、上記の局在化配列およびこのような局在化配列にインフレームでクローン化された特定のグリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインをコードする(例えば、GnTI、GalT、フコシルトランスフェラーゼまたはST)。触媒ドメインに融合された糖ヌクレオチド輸送体の場合において、このような構築物を設計し、その結果、触媒ドメイン(例えば、GnTI)が、得られたポリペプチドのN−末端またはC−末端のいずれかに存在し得る。局在化配列と同様に、触媒ドメインは、種々の異なる供給源に由来し得る。このような触媒ドメインの選択は、触媒ドメインが活性である特定の環境の知見によって左右される。例えば、特定のグリコシルトランスフェラーゼが、後期ゴルジにおいて活性である場合、宿主生物の後期ゴルジ中の全ての公知の酵素が、7.0の最適pHを有する場合、または後期ゴルジが、特定のpHを有することが公知である場合、そのpHで最適の活性を有する触媒ドメインを選択することを試行する。特定の宿主において、このような酵素の活性に対する現存するインビボデータはまた、有用であり得る。例えば、Schwientekおよび共同研究者らは、GalT活性をS.cerevisiaeのゴルジに操作し得ることを示し、そしてこのような活性が、S.cerevisiaeのalg変異型において、いくつかのGalの存在するGlcNAc2への転位を示すことによって存在したことを示した。さらに、数ラウンドの遺伝子シャッフリングまたは誤りがちのPCRを実施し、融合構築物のプール内に大きな多様性を得る。なぜなら、単一アミノ酸変異は、糖タンパク質保有酵素の活性を劇的に変更し得ることが示されたからである(Romeroら、2000)。グリコシルトランスフェラーゼおよびこれらの内因性固定配列(anchoring sequence)の全長配列がまた、使用され得る。好ましい実施形態において、このような局在化/触媒ドメインライブラリーは、より高等な真核生物におけるグリコシル化反応の一連の性質に対する現存する情報を組込むように設計される。言い換えると、糖タンパク質のプロセシングの過程の初期に起こることが公知である反応は、このような反応を触媒する酵素の、ゴルジまたはERの初期部分への標的化を必要とする。例えば、Man8GlcNAc2からMan5GlcNAc2へのトリミングは、複合N−グリカンの形成における初期段階である。タンパク質プロセシングが、ERにおいて開始し、次いで、初期ゴルジ、中期ゴルジおよび後期ゴルジの間進行するので、ERまたは初期ゴルジにおいて起こるこのトリミング反応を有することが、所望される。マンノシダーゼI局在化についてのライブラリーを設計する場合、マンノシダーゼIの触媒ドメインを有するER標的化シグナルと初期ゴルジ標的化シグナルとを一致することを試行する。
この遺伝子操作の試みの1つの最終的な目的は、工業的発酵プロセスにおいて充分に実施可能である頑丈なタンパク質産生株であるので、宿主(例えば、真菌)染色体中に複数の遺伝子を組込むことは、注意深い計画を伴う。操作された株は、多分、一定範囲の異なる遺伝子で形質転換される必要があり、これらの遺伝子は、望ましい活性が発酵プロセス全体にわたり維持されるのを確保するために、安定な様式で形質転換される必要がある。以下の酵素活性の任意の組み合わせが、タンパク質発現真菌宿主中に操作される必要がある:シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、GlcNAcトランスフェラーゼ、ERおよびゴルジ特異的トランスポーター(例えば、UPD−ガラクトースおよび他の前駆体についての共輸送トランスポーターおよび対向輸送トランスポーター)、オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素、ならびに活性化オリゴ糖前駆体(例えば、UDP−ガラクトース、CMP−N−アセチルノイラミン酸)の合成に関与する酵素。同時に、非ヒトグリコシル化反応の特徴であることが公知である酵素をコードする多数の遺伝子が、欠失されなければならない。そのような遺伝子および対応するタンパク質は、多数の下等真核生物(例えば、S.cerevisiae、T.reesei、A.nidulansなど)において広範に特徴付けられており、それにより、下等真核生物における公知のグリコシルトランスフェラーゼ、その活性、およびその個々の遺伝子配列のリストが提供される。これらの遺伝子は、マンノシルトランスフェラーゼの群(例えば、1,3−マンノシルトランスフェラーゼ(例えば、S.cerevisiae中のMNN1)(Graham,1991)、1,2−マンノシルトランスフェラーゼ(例えば、S.cerevisiae由来のKTR/KREファミリー)、1,6−マンノシルトランスフェラーゼ(S.cerevisiae由来のOCH1)、マンノシルホスフェートトランスフェラーゼ(S.cerevisiae由来のMNN4およびMNN6)、および異所性(すなわち、非ヒト)グリコシル化反応に関与するさらなる酵素)から選択される。これらの遺伝子の多くは、実際に、欠失されており、変化したグリコシル化プロフィールを有する生存可能な表現型を個別に生じる。例が、表2に示される。
高等真核生物グリコシル化の特徴は、糖タンパク質におけるガラクトース、フコース、および高い程度の末端シアル酸の存在である。これらの糖は、酵母および繊維状真菌において生成される糖タンパク質においては一般的に見出されず、上記の方法により、望ましいオルガネラにおいてグリコシルトランスフェラーゼが局在化する株の操作が可能である。複合N−グリカン合成の形成は、特定の糖残基が除去されそしてコアオリゴ糖構造に結合される、連続的プロセスである。高等真核生物において、これは、基質を、種々の処理酵素に連続的に曝露させることによって達成される。これらの酵素は、処理カスケード全体における特定の位置に依存して、特定の反応を行う。この「アセンブリライン」は、ER、初期ゴルジ、中期ゴルジ、および後期ゴルジ、ならびにトランスゴルジネットワークすべてと、その特定の処理環境からなる。下等真核生物のゴルジおよびERにおいてヒト糖タンパク質の処理を再生するために、多数の酵素(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、ホスファターゼ、およびトランスポーター)が、発現され、これらのオルガネラに特異的に標的付けられなければならず、好ましくは、それらがその環境およびその経路中の他の酵素と関連して最も効率的に機能するような位置に、標的付けられなければならない。いくつかの個々のグリコシルトランスフェラーゼが、クローン化され、そしてS.cerevisiae(GalT、GnT I)、Aspergillus nidulans(GnT I)および他の真菌において発現されているが、その生物のグリコシル化パターンにおける望ましい「ヒト化」の結果は示さない(Yoshida,1995;Schwientek,1995;Kalsner,1995)。このようなグリコシルトランスフェラーゼの作用により糖を受容するのに必要な糖質構造は、充分な量存在しないと、推測された。このことは、おそらく、複合N−グリカン形成の欠如に寄与し、一方、Man5GlcNAc2構造を供給し、GnT I活性を有し、そして真菌注に操作されたUDP−Gnトランスポーター活性を有する真菌についての報告は現在存在しない。ハイブリッドな複合N−グリカン形成のために必要なのは、これらの3つの生化学的事象の組み合わせである。
(UDP−N−アセチル−グルコサミン)
ヒトUDP−N−アセチルグルコサミン輸送体のcDNA(これは、発現配列タグデータベース(dbEST)における相同性検索によって認識された)は、Ishidaおよび共同研究者(Ishida,1999)によってクローニングされた。Guillenおよび共同研究者は、上記ヌクレオチド糖のゴルジ輸送体において欠損した、最近特徴付けられたKluyveromyces lactis変異体のイヌ腎細胞(MDCK)由来のcDNAとの表現型相関によって、UDP−N−アセチルグルコサミンに対する哺乳動物ゴルジ膜輸送体をクローニングした(Guillen、1998)。それらの結果は、哺乳動物ゴルジ UDP−N−GlcNAc輸送体遺伝子が、このタンパク質が、発現しそして酵母のゴルジ装置に機能的に標的化されるのに必要な情報の全てを有すること、および非常に異なるアミノ酸配列を有する2つのタンパク質が、同じゴルジ膜内に同じ溶質を輸送し得ることを実証する。((Guillen、1998)。
ラット肝臓ゴルジ膜GDP−フコース輸送体が、Puglielli,L.およびC.B.Hirschberg(Puglielli,1999)によって同定および精製された。対応する遺伝子は、同定されていないが、N−末端配列決定を、対応する遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの設計のために使用し得る。これらのオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、GDP−フコース輸送体をコードする遺伝子をクローニングし得る。
2つの異種遺伝子(Schizosaccharomyces pombe由来のα1,2−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α1,2 GalT)をコードするgmal2(+)およびヒトUDP−ガラクトース(UDP−Gal)輸送体をコードする(hUGT2))は、ガラクトシル化に必要とされる細胞内条件を調べるために、S. cerevisiaeにおいて機能的に発現された。タンパク質ガラクトシル化とUDP−ガラクトース輸送体活性との間の相関は、α1,2−GalTよりも、UDP−Gal輸送体の外因的な供給が、S.cerevisiaeにおける効率的なガラクトシル化に重要な役割を果たすことを示した(Kainuma,1999)。同様に、S.pombe由来のUDP−ガラクトース輸送体は、クローニングされた(Aoki,1999;Segawa,1999)。
ヒトCMP−シアル酸輸送体(hCST)をクローニングし、そしてLec 8 CHO細胞において発現させた(Aoki,1999;Eckhardt,1997)。マウスCMP−シアル酸輸送体の機能的発現は、Saccharomyces cerevisiaeにおいて達成された(Berninsone,1997)。シアル酸は、いくらかの真菌において見出されたが、選択された宿主系が、十分なレベルのCMP−シアル酸を供給し得るか否かは、明確でない。シアル酸は、培地において供給され得るか、あるいは、シアル酸合成に関係する真菌経路がまた宿主ゲノム内に組み込まれ得るかのいずれかである。
糖が糖タンパク質上に輸送される場合、ヌクレオシドジホスフェートまたはヌクレオシドモノホスフェートのいずれかが、糖ヌクレオチド前駆体から放出される。モノホスフェートが交互輸送機構によるヌクレオシドトリホスフェート糖の交換において直接的に輸送され得るが、ジホスホノモノヌクレオシド(例えば、GDP)は、輸送される前に、ヌクレオシドモノホスフェートおよび無機ホスフェートを生じるために、ホスファターゼ(例えば、GDPase)によって切断されなければならない。この反応は、S.cerevisiae由来のGDPaseが、マンノシル化に必要であることが見出されているので、効率的なグリコシル化に重要であるようである。しかし、酵素のみが、UDPに対して10%の活性を有する(Berninsone,1994)。下等真核生物は、しばしば、ゴルジにおいてUDP特異的ジホスファターゼ活性を有さない。なぜなら、これらは、ゴルジにおける糖タンパク質合成のためにUDP−糖前駆体を利用しないからである。Schizosaccharomyces pombe(細胞壁多糖類へガラクトース残基を付加することが見出された酵母(UDP−ガラクトース由来))は、このような酵素に対する要件をさらに示唆する特異的なUDPase活性を有することを見出した(Beminsoneら、1994)。UDPは、グリコシルトランスフェラーゼの強力なインヒビターであることが公知であり、このグリコシル化副産物の除去は、ゴルジの内腔におけるグリコシルトランスフェラーゼ阻害を妨げるために重要である。(Khataraら,1974)。
(抗体機能をブーストするためのGnT−IIIの発現)
N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIおよびIIIによるGlcNAc1Man3GlcNAc2構造へのN−アセチルグルコサミンの付加は、いわゆる分岐したN−グリカンGlcNAc3Man3GlcNAc2を生じる(図3)。この構造は、より大きな抗体依存性の細胞性の細胞傷害(ADCC)に関係している(Umanaら、1999)。哺乳動物細胞によって発現される免疫グロブリンの糖形態を再操作することは、冗漫で厄介な作業である。特に、GnT III(この酵素の過剰発現は、増殖阻害に関係している)の場合、調節された(誘導性の)遺伝子の発現を含む方法が、分岐したN−グリカンを有する免疫グロブリンを作製するために使用されなければならい(Umanaら、1999a、1999b)。
複合体N−グリカンの全ての分枝構造を、N−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ(GnT)−I〜−VIにより、共通のコア五糖(Man3GlcNAc2またはManα−6(Man α1−3)Man β1−4 GlcNAc β1−4 GlcNAc β1−4またはMan3GlcNAc2)上に合成した(Schachter Hら(1989)Methods Enzyme;179:351−97)。より高度に分枝したN−グリカンの生合成ついての現在の理解は、GnT IIの作用(GlcNAc2Man3GlcNAc2構造の作製)の後に、GnTIVが、GlcNAcを、β1,4−連結のUDP−GlcNAcからGlcNAc2Man3GlcNAc2 N−グリカンのMan α1,3 Man β1,4アームに移動させ(Allen SDら(1984)J Biol C11em.Jun 10;259(11):6984−90;ならびにGleeson PAおよびSchachter H.J(1983);J.Biol Chem 25;258 (10):6162−73)、トリアンテナリアガラクト(triantennary agalacto)糖鎖を生じることを示唆する。このN−グリカン(GlcNAc β1−2 Man α1−6(GlcNAc β1−2 Man α1−3)Man β1−4 GlcNAc β1−4 GlcNAc β1,4 Asn)は、GnT−IIIおよびGnT−Vに対する共通の基質であり、分岐したトリアテナリー構造およびテトラアテナリー構造の合成を導く。GnT IIIの作用が、分岐したN−グリカンを生じる場合、およびGnTVが、β1−6GlcNAcのα1−6マンノシルコアへの付加を触媒する場合、β1−6分枝を生じる。ガラクトースおよびシアル酸のこれらの分枝への付加は、完全にシアル化された複合N−グリカンの生成を導く。
縮重プライマーを、S.cerevisiae、H.sapiens、およびD.melanogaster由来のAlg3タンパク質配列のアラインメントに基づいて作製し、P.pastorisゲノムDNA由来の83bp産物を増幅するために使用した:
5’−GGTGTTTTGTTTTCTAGATCTTTGCAYTAYCARTT−3
’および
5’−AGAATTTGGTGGGTAAGAATTCCARCACCAYTCRTG−3’。得られたPCR産物を、pCR2.1ベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA)にクローニングしたところ、配列分析により、公知のALG3/RHK1/NOT56ホモログ(Genbank NC_001134.2、AF309689、NC_003424.1)に対する相同性が示された。その後、始めのPCR産物の1929bp上流および2738bp下流を、以下の内部オリゴヌクレオチド:
S.cerevisiae、Drosophila melanogaster、Homo sapiensなどに由来するALG3p配列を、K.lactis配列(PENDANT ESTデータベース)と整列させた。共通ホモログ中に存在するが、それらのホモログにおいて正確な配列は異なる、高い相同性の領域を使用して、株MG1/2(Bianchiら,1987)に由来するゲノムDNAに対して指向する縮重プライマーの対を作製した。ALG3の場合において、プライマー:
P.pastoris OCH1遺伝子の1215bpオープンリーディングフレーム、ならびに2685bp上流および1175bp下流を、PCRによって増幅し(B.K.Choiら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002に投稿);WO02/00879もまた参照のこと;これらの各々は、本明細書中に参考として援用される)、pCR2.1−TOPOベクター(Invitrogen)にクローニングし、pBK9と名付けた。複数の栄養要求マーカーを含むoch1ノックアウト株を作製するために、100μgのpJN329(SfiI制限部位と隣接したoch1::URA3変異対立遺伝子を含むプラスミド)を、SfiIで消化し、これを使用して、P.pastoris株JC308(Cereghinoら、Gene 263(2001)159−169)をエレクトロポレーションにより形質転換した。ウラシルを欠く規定の培地上で10日間室温でインキュベートした後、1000個のコロニーを拾い上げ、再び画線した。37℃で増殖できないが、室温では増殖するURA+クローンを、コロニーPCRに供して、och1::URA3変異対立遺伝子の正確な組み込みについて試験した。予測されるPCRパターンを示した1つのクローンを、YJN153と名付けた。ヒトプラスミノゲンのKringle 3ドメイン(K3)を、モデルタンパク質として使用した。K3遺伝子を含むNeoRマーカーを挿入した(NeoR marked)プラスミドを、YJN153株に形質転換し、K3を発現する得られた株を、BK64−1と名付けた(B.K.Choiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002に投稿)。
MOPS(カコジル酸ナトリウム)、塩化マンガン、UDP−ガラクトースおよびCMP−N−アセチルノイラミン酸は、シグマ製であった。TFAは、Aldrich製であった。Spodoptera frugiperda由来の組換えラットα2,6−シアリルトランスフェラーゼおよびウシ乳汁由来のβ1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Calbiochem製であった。タンパク質N−グリコシダーゼF、マンノシダーゼ、およびオリゴ糖は、Glyko(San Rafael,CA)製であった。DEAE ToyoPearl樹脂は、TosoHaas製であった。金属キレート「HisBind」樹脂は、Novagen(Madison,WI)製であった。96ウェル溶解液除去プレートは、Promega(Madison,WI)製であった。タンパク質結合96ウェルプレートは、Millipore(Bedford,MA)製であった。塩および緩衝剤は、Sigma(St.Louis,MO)製であった。MALDIマトリクスは、Aldrich(Milwaukee,WI)製であった。
Kringle3を、Beckman BioMek 2000サンプル処理ロボット(Beckman/Coulter Ranch Cucamonga,CA)で、96ウェル形式を使用して精製した。Kringle3を、C末端ヘキサヒスチジンタグを使用して、発現培地から精製した。このロボット精製は、そのHisBind樹脂についてNovagenによって提供されたプロトコルの適応である。簡潔には、150uL(μL)の固定容積の樹脂を、96ウェルの溶解物結合プレートのウェル中に注ぎ、3容積の水で洗浄し、そして5容積の50mM NiSO4を充填し、そして3容積の結合緩衝液(5mMイミダゾール、0.5M NaCl、20mM Tris−HCL(pH7.9))で洗浄する。タンパク質発現培地を、培地/PBS(60mM PO4、16mM KC1、822mM NaCl(pH7.4))で3:2希釈し、そしてカラムに充填した。吸引後、カラムを10容積の結合緩衝液および6容積の洗浄緩衝液(30mMイミダゾール、0.5M NaCl、20mM Tris−HCl(pH7.9))で洗浄し、そしてタンパク質を、6容積の溶出緩衝液(1Mイミダゾール、0.5M NaCl、20mM Tris−HCl(pH7.9))で溶出する。溶出された糖タンパク質を、凍結乾燥によって、乾燥するまでエバポレートする。
グリカンを、以前に報告された方法(Papacら、A.J.S.(1998)Glycobiology 8,445−454)の改変によって、糖タンパク質から放出および分離する。96ウェルのMultiScreen IP(Immobilon−Pメンブレン)プレート(Millipore)のウェルを、100uLのメタノールで湿らせ、3×150uLの水および50uLのRCM緩衝液(8M尿素、360mM Tris、3.2mM EDTA(pH8.6))で洗浄し、各添加後に、穏やかな減圧で吸引する。乾燥したタンパク質サンプルを、30uLのRCM緩衝液中に溶解し、そして10uLのRCM緩衝液を含むウェルに移す。ウェルを吸引し、そしてRCM緩衝液で2回洗浄する。タンパク質を、60uLの、RCM緩衝液中の0.1M DTTを、37℃で1時間に亘って添加して、還元した。ウェルを、300uLの水で3回洗浄し、そして60uLの0.1Mヨード酢酸を、暗中での室温にて30分間で添加して、カルボキシメチル化する。ウェルを、水で再度3回洗浄し、そしてメンブレンを、100uLの水中1%PVP 360の、室温で1時間の添加によって、ブロッキングする。ウェルを吸引し、そして300uLの水で3回洗浄し、そして30uLの10mM NH4HCO3(pH8.3)(1ミリ単位のN−グリカナーゼ(glycanase)(Glyko)を含む)の添加によって、脱グリコシル化する。37℃16時間の後、グリカンを含む溶液を、遠心分離によって取り出し、そして乾燥するまで蒸発させる。
グリカンの分子量を、遅延抽出を使用して、Voyager DE PRO線形MALDI−TOF(Applied Biosciences)質量分析機を用いて決定した。各ウェル由来の乾燥グリカンを、15uLの水中に溶解し、そして0.5uLを、ステンレス鋼サンプルプレート上にスポットし、そして0.5uLのS−DHBマトリクス(9mg/mLのジヒドロキシ安息香酸、1mg/mLの5−メトキシサリチル酸(1:1の水/アセトニトリル 0.1% TFA中))と混合し、そして乾燥させた。
MOPS、カコジル酸ナトリウム、塩化マグネシウム、UDP−ガラクトースおよびCMP−N−アセチルノイラミン酸は、Sigma,Saint Louis,MO製であった。トリフルオロ酢酸(TFA)は、Sigma/Aldrich,Saint Louis,MO製であった。Spodoptera frugiperda由来の組換えラットα−2,6−シアリルトランスフェラーゼおよびウシ乳汁由来のβ−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Calbiochem,San Diego,CA製であった。
グリカンを、以前に報告された方法(Papacら、A.J.S.(1998)Glycobiology 8,445−454)の改変によって、糖タンパク質から放出および分離した。タンパク質を還元およびカルボキシメチル化し、そしてメンブレンをブロッキングした後、ウェルを、水で3回洗浄した。タンパク質を、30μlの10mM NH4HCO3(pH8.3)(1ミリ単位のN−グリカナーゼ(glycanase)(Glyko,Novato,CA)を含む)の添加によって、脱グリコシル化した。37℃16時間の後、グリカンを含む溶液を、遠心分離によって取り出し、そして乾燥するまでエバポレートした。次いで、グリカンを、SC210Aスピード減圧(Thermo Savant,Halbrook,NY)中で乾燥させた。乾燥したグリカンを、50mM NH4Ac(pH5.0)中に37℃で一晩置き、そして1mUのヘキソース(hexos)(Glyko,Novato,CA)を添加した。
約2mgのタンパク質(r−K3:hPg[PBP6−5])を、ニッケル親和性クロマトグラフィーによって精製し、0.1% TFAに対して広範に透析し、そして乾燥するまで凍結乾燥した。このタンパク質を、150μlの50mM MOPS、20mM MnC12(pH7.4)中に再溶解した。32.5μg(533nmol)のUDP−ガラクトースおよび4mUのβ 1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼの添加後、サンプルを、37℃で18時間インキュベートした。次いで、これらのサンプルを、MALDITOF質量分析による分析のために、0.1% TFAに対して透析した。
(ガラクトシルトランスフェラーゼ反応した)タンパク質を、10μlの50mM カコジル酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に再懸濁した後、15μLの同じ緩衝液中に溶解された300μg(488nmol)のCMP−N−アセチルノイラミン酸(CMP−NANA)および5μl(2mU)の組換えα−2,6 シアリルトランスフェラーゼを添加した。37℃で15時間のインキュベート後、さらに200μgのCMP−NANAおよび1mUのシアリルトランスフェラーゼを添加した。これらのタンパク質サンプルを、さらに8時間インキュベートし、次いで、透析し、上記のようにMALDI−TOF−MSによって分析した。
(P.pastorisにおけるALG9遺伝子およびALG12遺伝子の同定、クローニングおよび欠失)
実施例1と同様に、ALG9p配列およびALG12配列(それぞれ、S.cerevisiae、Drosophila melanogaster、Homo sapiensなどに由来する)を整列し、そして高い相同性の領域を、縮重プライマーを設計するために使用する。これらのプライマーを、P.pastoris由来のゲノムDNAに対するPCR反応において使用する。得られた最初のPCR産物をサブクローニングし、配列決定し、そして高いストリンジェンシーで、P.pastoris由来のゲノムDNAのサザンブロットをプローブするために使用した(Sambrookら、1989)。ハイブリダイゼーションを観察する。このサザンブロットを使用して、遺伝子座位のマッピングを行った。ゲノムフラグメントを、ゲノムDNAを消化し、そして適切なサイズ範囲のフラグメントをpUCl9に連結して、P.pastorisサブゲノムライブラリーを作製することによって、クローニングした。このサブゲノムライブラリーを、E.coli中に形質転換し、そして数百個のクローンを、最初のPCR産物の配列に基づいて設計されたプライマーを使用して、コロニーPCRによって試験する。予測された遺伝子を含むクローンを配列決定し、そしてオープンリーディングフレームを同定する。alg9::NAIR欠失対立遺伝子の構築のためのプライマーを、PCR重複法(Davidsonら、2002)を使用して設計する。得られた欠失対立遺伝子を、2つのP.pastoris株に形質転換し、そしてNAT耐性コロニーを選択する。これらのコロニーを、PCRによってスクリーニングし、そしてALG9 ORFがochl::NATR変異体対立遺伝子で置換された形質転換体を得る。一般に、以下を参照のこと:Cipolloら、Glycobiology 2002(12)11:749−762;Chantretら、J.Biol.Chem.Jul.12,2002(277)28:25815−25822;Cipolloら、J.Biol.Chem.Feb.11,2000(275)6:4267−4277;Burdaら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.July 1996(93):7160−7165;Karaogluら、Biochemistyy 2001,40,12193−12206;Grimmeら、J.Biol.Chem.July 20,2001(276)29:27731−27739;Verostekら、J.Biol.Chem.June 5,1993(268)16:12095−12103;Huffakerら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.Dec.1983(80):7466−7470。
(Xanthomonas Manihotis由来のα1,2−3マンノシダーゼの同定、クローニングおよび発現)
Xanthomonas Manihotis由来のα1,2−3マンノシダーゼは、2つの活性(α−1,2マンノシダーゼおよびα−1,3 マンノシダーゼ)を有する。本発明の方法はまた、これらの活性を有する2つの独立したマンノシダーゼを使用し得、これらは、選択された目的の生物から同様に同定およびクローニングされ得る。
(P.pastorisにおけるALG6遺伝子の同定、クローニング、および発現)
実施例1と同様に、S.cerevisiae、Drosophia melanogaster、Homo sapiensなどに由来するALG6p配列を整列し、、そして高い相同性の領域を変性プライマーを産生するために使用する。これらのプライマーは、P.pastoris由来のゲノムDNAにおけるPCR反応に用いられる。得られた初めのPCR産物をサブクローン化し、配列を決定して、そして高ストリンジェンシーを有するP.pastoris由来のゲノムDNAのサザンブロットのプローブとして使用する(Sambrookら、1989)。ハイブリダイゼーションが観察される。このサザンブロットを、ゲノム座位をマップするために使用する。ゲノムDNAを消化し、そしてそれらのフラグメントを、適切なサイズ範囲で、pUC19中にライゲーションして、ゲノムフラグメントをクローン化することで、P.pastorisサブゲノムライブラリーを産生する。このサブゲノムライブラリーを、E.coliに形質転換し、そして、初めのPCR産物の配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、コロニーPCRによって、数百クローンをテストする。予想した遺伝子を含むクローンの配列を決定し、そしてオープンリーディングフレームを同定する。PCR重複法(Davidsonら、2002)を用いて、alg6::NATR欠失アレルの構築のためのプライマーを設計し、その結果得られた欠失対立遺伝子を2つのP.pastoris株および選択されたNAT抵抗性コロニー中に形質転換した。これらのコロニーを、PCRによってスクリーニングし、ALG6 ORFが,och1::NATR変異対立遺伝子に置換される形質転換体を得る。例えば、Imbachら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA June 1999(96)6982−698を参照のこと。
(抗体機能性を高める分岐したGlcNAcsを産生するためのGnTIIIのクローニングおよび発現)
(A.背景)
N−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼIIIによるGlcNAc2Man3GlcNAc2構造へのN−アセチルグルコサミンの付加によって、いわゆる分岐したNグリカンを生じる(図3を参照のこと)。この構造は、より大きな抗体依存性細胞傷害性(ADCC)に関係する(Umanaら、1999)。
TMドメインを欠くマウスGnTIIIタンパク質の一部をコードするDNAフラグメントは、以下のプライマーを用いて、マウス(あるいは他の哺乳動物)のゲノムDNAからPCR増幅される:順方向 5’−TCCTGGCGCGCCTTCCCGAGAGAACTGGCCTCCCTC−3’および5’−AATTAATTAACCCTAGCCCTCCGCTGTATCCAACTTG−3’逆方向プライマー。それらのプライマーは、リーダーライブラリーとの融合に適したベクターへのクローニングに使用されるAscIおよびPacI制限部位を含む。マウスGnTIIIの核酸配列およびアミノ酸配列を。図32に示す。
抗体の可変領域(プライマー配列を含む)のクローニングのためのプロトコルは、以前公開されている。抗体およびコ−ド遺伝子の供給源は、とりわけ、インビトロ免疫化ヒトB細胞(例えば、Borreback,C.A.ら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,3995−3999、末梢血リンパ球細胞または単一ヒトB細胞(例えば、Lagerkvist,A.Cら(1995) Biotechniques 18,862−869;およびTerness,P.ら(1997) Hum. Immunol.56,17−27を参照のこと)またはハイブリドーマ細胞株の産生を可能にする、ヒト免疫グロブリン部位を含むトランスジェニックマウスであり得る。
GnT−IV(UDP−GlcNAc:α−1,3−D−マンノシドβ−1,4−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIV)およびGnT−V(β−1−6−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのクローニングおよび発現)
GnTIVをコードするcDNAを、ウシおよびヒト細胞から単離した(Minowa、M.T.ら(1998) J.Biol.Chem.273(19),11556−11562;)およびYoshida,A.ら(1999) Glycobiology 9(3),303−310)。TMドメインを欠くヒトGnT−IVタンパク質(図33)の全長および一部をコードするDNAフラグメントを、各々以下のプライマーを用いて、cDNAライブラリーからPCR増幅した:順方向 5’−AATGAGATGAGGCTCCGCAATGGAACTG−3’,5’−CTGATTGCTTATCAACGAGAATTCCTTG−3’,および逆方向5’−TGTTGGTTTCTCAGATGATCAGTTGGTG−3’プライマー。
その結果生じるPCR産物をクローン化し、配列を決定した。
(1)
非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を産生するための方法であって、該方法は、糖残基を脂質連結オリゴ糖構造の1,6アームに移動させる宿主細胞において、1種以上の酵素の活性を減退させるかまたは減少させる工程を包含する、方法。
(2)
前記宿主細胞に少なくとも1つのグリコシダーゼ活性を導入する工程をさらに包含する、(1)に記載の方法。
(3)
前記少なくとも1つのグリコシダーゼ活性は、マンノシダーゼ活性である、(2)に記載の方法。
(4)
N−グリカンを産生する工程をさらに包含する、(1)に記載の方法。
(5)
前記N−グリカンは、GlcNAcManxGlcNAc2構造を有し、ここでXは、3、4または5である、(4)に記載の方法。
(6)
(5)に記載の方法であって、前記宿主細胞内で1種以上の酵素活性を発現させて、GlcNAc2Man3GlcNAc2構造を作製する工程をさらに包含し、該酵素活性は、グリコシダーゼ活性およびグリコシルトランスフェラーゼ活性から選択される、方法。
(7)
前記活性は、α−1,2マンノシダーゼ活性、α−1,3マンノシダーゼ活性およびGnTII活性から選択される、(6)に記載の方法。
(8)
(1)に記載の方法であって、少なくとも1種の減退または減少された酵素は、ドリチル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリチルα−1,3マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素;ドリチル−P−Man:Man6GlcNAc2−PP−ドリチルα−1,2マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、およびドリチル−P−Man:Man7GlcNAc2−PP−ドリチルα−1,6マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素からなる群より選択される、方法。
(9)
(1)に記載の方法であって、前記減退または減少された酵素は、ドリチル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリチルα−1,3マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する、方法。
(10)
前記酵素は、該酵素活性をコードする宿主細胞遺伝子の変異によって減退されるかまたは減少される、(1)に記載の方法。
(11)
前記変異は、前記酵素活性をコードする宿主細胞遺伝子の部分的な欠損または全体的な欠損である、(10)に記載の方法。
(12)
前記糖タンパク質は、7個またはそれより少ないマンノース残基を有するN−グリカンを含む、(1)に記載の方法。
(13)
前記糖タンパク質は、3個またはそれより少ないマンノース残基を有するN−グリカンを含む、(1)に記載の方法。
(14)
前記糖タンパク質は、ガラクトース、GlcNAc、シアル酸、およびフコースからなる群より選択される1種以上の糖を含む、(1)に記載の方法。
(15)
前記糖タンパク質は、構造NeuNAc−Gal−GlcNAc−Manを含む少なくとも1つのオリゴ糖分枝を含む、(1)に記載の方法。
(16)
前記宿主は、下等真核生物細胞である、(1)に記載の方法。
(17)
(1)に記載の方法であって、前記宿主細胞は、以下:Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica、Pichia sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces sp.、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces sp.、Candida albicans、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、Chrysosporium lucknowense、Fusarium sp.、Fusarium gramineum、Fusarium venenatumおよびNeurospora crassaからなる群より選択される、方法。
(18)
前記宿主細胞は、開始α−1,6マンノシルトランスフェラーゼ活性の発現をさらに欠損している、(1)に記載の方法。
(19)
前記宿主細胞は、P.pastorisのOCH1変異体である、(18)に記載の方法。
(20)
前記宿主細胞は、GnTIおよびUDP−GlcNAcトランスポーター活性を発現する、(1)に記載の方法。
(21)
前記宿主細胞は、UDP特異的ジホスファターゼジホスファターゼ活性またはGDP特異的ジホスファターゼジホスファターゼ活性を発現する、(1)に記載の方法。
(22)
前記宿主から前記糖タンパク質を単離する工程をさらに包含する、(1)に記載の方法。
(23)’
(22)に記載の方法であって、宿主から糖タンパク質を単離した後に、インビトロにおいて、前記単離された糖タンパク質を、少なくとも1種のさらなるグリコシル化反応に供する工程をさらに包含する、方法。
(24)
(1)に記載の方法であって、GlcNAcMan3GlcNAc2またはGlcNAc2Man3GlcNAc2の産生に関与する1種以上の酵素をコードする核酸分子を、前記宿主に導入する工程をさらに包含する、方法。
(25)
前記少なくとも1種の酵素は、マンノシダーゼ活性を有する、(24)に記載の方法。
(26)
(25)に記載の方法であって、前記酵素は、α−1,2−マンノシダーゼ活性を有し、かつマウス、ヒト、Lepidoptera、Aspergillus nidulans、C.elegans、D.melanogaster、またはBacillus sp.に由来する、方法。
(27)
前記酵素は、α−1,3−マンノシダーゼ活性を有する、(25)に記載の方法。
(28)
前記少なくとも1種の酵素は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する、(24)に記載の方法。
(29)
前記グリコシルトランスフェラーゼ活性は、GnTIおよびGnTIIからなる群より選択される、(28)に記載の方法。
(30)
少なくとも1種の酵素は、該酵素の触媒ドメインと細胞標的シグナルペプチドとの間で融合ペプチドを形成することによって局在化される、(24)に記載の方法。
(31)
(30)に記載の方法であって、前記融合ペプチドは、少なくとも1つの遺伝子構築物によってコードされ、該遺伝子構築物は、細胞標的シグナルペプチドをコードするDNAフラグメントと、グリコシル化酵素またはその触媒活性フラグメントをコードするDNAフラグメントとのインフレームでの結合によって形成される、方法。
(32)
(31)に記載の方法であって、前記コードされた標的シグナルペプチドは、マンノシルトランスフェラーゼ、ジホスファターゼ、プロテアーゼ、GnT I、GnT II、GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VI、GalT、FT、およびSTからなる群のメンバーに由来する、方法。
(33)
(31)に記載の方法であって、前記触媒ドメインは、GnT I、GnT II、GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VI、GalT、FucosylトランスフェラーゼおよびSTからなる群のメンバーに由来する、グリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼをコードし、かつ該触媒ドメインは、小器官内の他の代表的な酵素の平均最適pHの、1.4pH単位内に最適pHを有し、該小器官おいて、該酵素は、局在化されるかまたは5.1と8.0との間のpHにて最適な活性を有する、方法。
(34)
(31)に記載の方法であって、前記核酸分子は、UDP−GlcNAcトランスフェラーゼ、UDP−ガラクトシルトランスフェラーゼ、GDP−フコシルトランスフェラーゼ、CMP−シアリルトランスフェラーゼ、UDP−GlcNAcトランスポーター、UDP−ガラクトーストランスポーター、GDP−フコーストランスポーター、CMP−シアル酸トランスポーター、およびヌクレオチドジホスファターゼからなる群より選択される1種以上の酵素をコードする、方法。
(35)
前記宿主は、GnTIおよびUDP−GlcNAcトランスポーター活性を発現する、(31)に記載の方法。
(36)
前記宿主は、UDP特異的ジホスファターゼ活性またはGDP特異的ジホスファターゼ活性を発現する、(31)に記載の方法。
(37)
(1)に記載の方法であって、ドリチル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリチルα−1,3マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損している宿主に、GlcNAcMan4GlcNAc2糖質構造を作製するための1種以上の酵素をコードする核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
(38)
(1)に記載の方法であって、ドリチル−P−Man:Man6GlcNAc2−PP−ドリチルα−1,2マンノシルトランスフェラーゼまたはドリチル−P−Man:Man7GlcNAc2−PP−ドリチルα−1,6マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損している宿主に、GlcNAcMan4GlcNAc2糖質構造を作製するための1種以上の酵素をコードする核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
(39)
前記核酸分子は、α−1,2マンノシダーゼ、UDP GlcNAcトランスポーターおよびGnTlからなる群より選択される少なくとも1種の酵素をコードする、(37)または(38)に記載の方法。
(40)
(39)に記載の方法であって、前記欠損している宿主細胞に、GlcNAclMan4GlcNAc2構造をGlcNAclMan3GlcNAc2構造に転換するためのα−1,3マンノシダーゼ活性またはα−1,2/α−1,3マンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
(41)
(1)に記載の方法であって、前記宿主に、GlcNAc2Man3GlcNAc2糖質構造を作製するための1種以上の酵素をコードする核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
(42)
前記少なくとも1種の酵素は、GnTIIである、(41)に記載の方法。
(43)
(1)に記載の方法であって、前記宿主細胞に、グリコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、N−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼおよびスルホトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1種の哺乳動物グリコシル化酵素をコードする少なくとも1種の核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
(44)
(1)に記載の方法であって、宿主細胞をDNAライブラリーで形質転換して、該ライブラリーから誘導された少なくとも1種のグルコシル化酵素を発現する、遺伝学的に混合された細胞集団を作製する工程をさらに包含し、該ライブラリーは、少なくとも2つの異なる遺伝子構築物を含み、該構築物のうちの少なくとも一方は、細胞標的シグナルペプチドをコードするDNAフラグメントを含み、該細胞標的シグナルペプチドは、グリコシル化酵素またはその触媒活性フラグメントをコードするDNAフラグメントと、インフレームで結合される、方法。
(45)
(1)または(44)に記載の方法によって産生される、宿主細胞。
(46)
(1)または(44)に記載の方法によって産生される、ヒト様糖タンパク質。
(47)
図6(P.pastoris ALG 3遺伝子)の少なくとも45個連続するヌクレオチド残基を含むかまたはそれらからなる、核酸分子。
(48)
(47)に記載の核酸分子を含む、ベクター。
(49)
(47)に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
(50)
P.pastoris細胞であって、ここで、図6(P.pastoris ALG 3遺伝子)の配列は変異しており、それによって、該細胞のグリコシル化が変更される、P.pastoris細胞。
(51)
脂質連結オリゴ糖のグリコシル化の程度を高めるための方法であって、該方法は、宿主細胞においてα−1,3グリコシルトランスフェラーゼ活性を増加させる工程を包含する、方法。
(52)
脂質連結オリゴ糖のグリコシル化の程度を高めるための方法であって、
該方法は、宿主細胞においてオリゴ糖トランスフェラーゼ活性の基質特異性を減退させる工程を包含する、方法。
(53)
非哺乳動物宿主細胞において、分岐したGlcNAcを含むN−グリカンを有する免疫グロブリンポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、該宿主細胞においてGnTIII活性を発現させる工程を包含する、方法。
(54)
分岐したGlcNAcを含むN−グリカンを有する免疫グロブリンを産生する、非哺乳動物宿主細胞。
(55)
(54)に記載の宿主細胞によって産生される、免疫グロブリン。
(56)
非哺乳動物宿主細胞において、分岐したGlcNAcを含むN−グリカンを有するポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、該宿主細胞においてGnTIII活性を発現させる工程を包含する、方法。
(57)
分岐したGlcNAcを含むN−グリカンを有するポリペプチドを産生する、非ヒト宿主細胞。
(58)
(57)に記載の宿主細胞によって産生される、ポリペプチド。
(59)
非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を産生するための方法であって、該方法は、該宿主細胞から、alg遺伝子活性を減退または減少させる工程、および該宿主細胞に少なくとも1種のグリコシダーゼ活性を導入する工程を包含する、方法。
(60)
トリマンノースコアに結合した少なくとも2つのGlcNAcを含むN−グリカンを有するヒト様糖タンパク質を産生するための、方法。
Claims (14)
- 図6(P.pastoris ALG 3遺伝子)の少なくとも45個連続するヌクレオチド残基を含むかまたはそれらからなる、核酸分子。
- 請求項1に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項1に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
- P.pastoris細胞であって、ここで、図6(P.pastoris ALG 3遺伝子)の配列は変異しており、それによって、該細胞のグリコシル化パターンが変更される、P.pastoris細胞。
- 脂質連結オリゴ糖のグリコシル化の程度を高めるための方法であって、該方法は、宿主細胞においてα−1,3グリコシルトランスフェラーゼ活性を増加させる工程を包含する、方法。
- 脂質連結オリゴ糖のグリコシル化の程度を高めるための方法であって、該方法は、宿主細胞においてオリゴ糖トランスフェラーゼ活性の基質特異性を減退させる工程を包含する、方法。
- 非哺乳動物宿主細胞において、分岐したGlcNAcを含むN−グリカンを有する免疫グロブリンポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、該宿主細胞においてGnTIII活性を発現させる工程を包含する、方法。
- 分岐したGlcNAcを含むN−グリカンを有する免疫グロブリンを産生する、非哺乳動物宿主細胞。
- 請求項8に記載の宿主細胞によって産生される、免疫グロブリン。
- 非ヒト宿主細胞において、分岐したGlcNAcを含むN−グリカンを有するポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、該宿主細胞においてGnTIII活性を発現させる工程を包含する、方法。
- 分岐したGlcNAcを含むN−グリカンを有するポリペプチドを産生する、非ヒト宿主細胞。
- 請求項11に記載の宿主細胞によって産生される、ポリペプチド。
- 非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を産生するための方法であって、該方法は、該宿主細胞から、alg遺伝子活性を減退または減少させる工程、および該宿主細胞に少なくとも1種のグリコシダーゼ活性を導入する工程を包含する、方法。
- トリマンノースコアに結合した少なくとも2つのGlcNAcを含むN−グリカンを有するヒト様糖タンパク質を産生するための、方法。
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