JP2012518419A - 糖操作酵母ピチア・パストリスにおけるガラクトース同化経路の代謝操作 - Google Patents

糖操作酵母ピチア・パストリスにおけるガラクトース同化経路の代謝操作 Download PDF

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Abstract

ガラクトースを炭素源として通常は利用し得ないが、ガラクトースを唯一の炭素源として利用するように本発明における方法に従い遺伝的に操作されている下等真核細胞、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を記載する。該細胞は、ルロアール経路を構成する酵素の幾つかを発現するように遺伝的に操作される。特に、該細胞は、ガラクトキナーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−Ｃ４−エピメラーゼおよびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼおよび場合によってはガラクトースパーミアーゼを発現するように遺伝的に操作される。また、ガラクトース残基を有するＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、ルロアール経路を構成する酵素を通常は欠く細胞において、ガラクトース末端Ｎ−グリカンまたはガラクトース含有Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質の収率を改善するための方法を提供する。該方法は、ガラクトキナーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−Ｃ４−エピメラーゼおよびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする１以上の核酸分子で該細胞を形質転換することを含む。記載されている方法および宿主細胞は、組換え細胞の製造のための選択方法として、ガラクトースを同化する能力の存在または欠如を可能にする。該方法および宿主細胞は、ガラクトース末端Ｎ−グリカンまたはガラクトース含有Ｎ−グリカンを有する免疫グロブリンなどを製造するのに特に有用であることが本明細書に示されている。

Description

（１）発明の分野
本発明は、通常は炭素源としてガラクトースを利用し得ないが、ルロアール経路を構成する酵素の幾つかを発現するように細胞を遺伝的に操作することにより唯一の炭素源としてガラクトースが利用可能となる下等真核細胞、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）に関する。特に、該細胞は、ガラクトキナーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−Ｃ４−エピマーゼおよびガラクトース−１−ホスファートウリジルトランスフェラーゼおよび場合によってはガラクトースパーミアーゼを発現するように遺伝的に操作される。また、本発明は更に、ガラクトキナーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−Ｃ４−エピメラーゼおよびガラクトース−１−ホスファートウリジルトランスフェラーゼをコードする１以上の核酸分子で下等真核生物を形質転換することを含む、ガラクトース残基を有するＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されているがルロアール経路を構成する酵素を通常は欠く該下等真核生物において、ガラクトース末端またはガラクトース含有Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質の収率を改善するための方法に関する。
（２）関連技術の説明
タンパク質に基づく治療剤は薬物発見の最も活発な領域の１つであり、今後１０年における新規治療用化合物の主要源になると予想されている（Ｗａｌｓｈ，Ｎａｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（８）：８３１−３（２０００））。天然状態でグリコシル化されていない治療用タンパク質は、グリコシル化装置を欠く宿主、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において発現されうる。しかし、ほとんどの治療用タンパク質は糖タンパク質であり、これは、適切なフォールディングおよびそれに続くヒト血清中での安定性を確保するためには該タンパク質の特異的アスパラギン残基へのグリカンの翻訳後付加を要する（ＨｅｌｅｎｉｕｓおよびＡｅｂｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３６４−９（２００１））。ある場合には、追加的なグリコシル化部位における操作により治療用タンパク質の効力が改善されている。一例はヒトエリスロポエチンであり、これは、２つの追加的グリコシル化部位の付加後に、３倍長いインビボ半減期を示すことが実証されている（Ｍａｃｄｏｕｇａｌｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０；２３９２−２３９５（１９９９））。ヒトにおける治療用途を意図したほとんどの糖タンパク質はＮ−グリコシル化を要し、したがって、ほとんどの場合、ヒト糖タンパク質のプロセッシングを模倣したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞系が治療用糖タンパク質の製造に使用される。しかし、これらの細胞系は、遺伝的な取扱いの難しさ、長い発酵時間、異種グリコシル化および持続的なウイルス汚染の問題を含む重大な欠点を有する（ＢｉｒｃｈおよびＲａｃｈｅｒ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８：６７１−８５（２００６）；Ｋａｌｙａｎｐｕｒ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８７−９８（２００２））。
多数の産業用タンパク質発現系は、既知組成培地内で高い細胞密度まで増殖可能な一般に前記制限を受けない酵母株に基づいている（ＣｅｒｅｇｈｉｎｏおよびＣｒｅｇｇ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２４：４５−６６（２０００）；ＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇおよびＧｅｌｌｉｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５５４−５６０（１９９７）；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙｅａｓｔ １４：１２６７−１２８３（１９９８））。インスリンのような非グリコシル化治療用タンパク質の製造には酵母が使用されているが、それらは糖タンパク質の製造には使用されていない。なぜなら、酵母は、非ヒト高マンノース型Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し（図１を参照されたい）、該Ｎ−グリカンは、インビボ半減期の短縮を伴う糖タンパク質を与え、高等哺乳動物において免疫原性となる可能性を有するからである（Ｔａｎｎｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９０６：８１−９９（１９８７））。
これらの問題に対処するために、本発明者らは、これらのタンパク質発現宿主からヒト様糖タンパク質を得るために種々の酵母および糸状菌におけるグリコシル化経路の再操作に焦点を合わせた。例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，米国公開出願第２００４／００１８５９０号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、酵母および糸状菌に典型的な高マンノース型Ｎ−グリカンの産生を排除するために、そして哺乳類細胞から産生される糖タンパク質に、より典型的なハイブリッドまたは複合Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するグリコシル化装置を有する宿主細胞を得るために遺伝的に操作された酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を記載している。
前記のＧｅｒｎｇｒｏｓｓらは、高い比率のＮ−グリカンがガラクトース残基を含有する、組換え糖タンパク質を産生しうる組換え酵母株、すなわち、主にオリゴ糖構造ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｇ１）またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｇ２）およびより少量のオリゴ糖構造ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｇ０）を有するＮ−グリカンを産生する酵母株を開示している。７０〜８５％のＧ２の収率が得られている。しかし、免疫グロブリンおよび免疫接着物質のような幾つかの糖タンパク質は、Ｇ０：Ｇ１／Ｇ２の比が約２：１に減少しているこれらの細胞において産生されることが判明している［例えば、Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照されたい。この場合、これらの細胞からのガラクトース末端Ｎ−グリカンの収率は、ガラクトースおよび可溶性形態のβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼで糖タンパク質をインビトロで処理することにより改善された］。これとは対照的に、ＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞において産生された免疫グロブリンは約１：１のＧ０：Ｇ１／Ｇ２比を有する。したがって、Ｇ０：Ｇ１／Ｇ２比が２：１未満である組換え糖タンパク質をインビボで産生しうる組換え酵母宿主細胞を得ることが望ましいであろう。
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、限られた数の炭素源しか生存のために利用できない。一般に、これらの炭素源はグリセロール、グルコース、メタノールならびに恐らくはラムノースおよびマンノースであり、ガラクトースではない。前記で挙げたもの以外のものを炭素源として利用しうるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を得ることが望ましいであろう。
米国公開出願第２００４／００１８５９０号
Ｗａｌｓｈ，Ｎａｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（８）：８３１−３（２０００） ＨｅｌｅｎｉｕｓおよびＡｅｂｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３６４−９（２００１） Ｍａｃｄｏｕｇａｌｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０；２３９２−２３９５（１９９９） ＢｉｒｃｈおよびＲａｃｈｅｒ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８：６７１−８５（２００６） Ｋａｌｙａｎｐｕｒ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８７−９８（２００２） ＣｅｒｅｇｈｉｎｏおよびＣｒｅｇｇ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２４：４５−６６（２０００） ＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇおよびＧｅｌｌｉｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５５４−５６０（１９９７） Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙｅａｓｔ １４：１２６７−１２８３（１９９８） Ｔａｎｎｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９０６：８１−９９（１９８７） Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０−２１５（２００６）
発明の簡潔な概要
本発明は前記で認められた問題点を解決するものである。本発明は、炭素源としてのガラクトースを同化する能力を欠く宿主細胞から、エネルギー源としてガラクトースを利用する能力を有する組換え宿主細胞を作製するための方法および材料を提供する。ガラクトース末端Ｎ−グリカンまたはガラクトース含有Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように該組換え宿主細胞を更に遺伝的に操作した場合、該宿主細胞は、Ｇ０：Ｇ１／Ｇ２比が２：１未満である又はＧ０：Ｇ１／Ｇ２比が約１：１以下である又はＧ０：Ｇ１／Ｇ２比が約１：２以下である組換え糖タンパク質（例えば、抗体）を産生しうる。一般に、該方法は、ルロアール（Ｌｅｌｏｉｒ）経路酵素、すなわち、ガラクトキナーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−Ｃ４−エピメラーゼおよびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼおよび場合によってはガラクトースパーミアーゼをコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入することを含む。したがって、本発明における方法および材料は、炭素源としてガラクトースを含有する培地上で細胞を単に増殖させることにより、形質転換された宿主細胞を特定するために使用されうる選択系を提供し、高レベルのガラクトース末端Ｎ−グリカンまたはガラクトース含有Ｎ−グリカンを有する免疫グロブリンのような糖タンパク質の製造方法を提供する。
ガラクトースを炭素源として利用する能力は、使用すべき発現系の選択に関する柔軟性および経済性をもたらす。例えば、末端ガラクトースまたは末端シアル酸化を有する組換え糖タンパク質の発現のために設計された系においては、培地にガラクトースが添加されることが可能であり、この場合、それは細胞により取り込まれ、エネルギー源として、そして組換え糖タンパク質上で合成されつつあるＮ−グリカン内への取込みのためのガラクトース残基の供給のための両方として、細胞により利用される。本発明の利点は、培地内にガラクトースを存在させることにより、あるいは発酵中および／または組換え糖タンパク質の誘導中にガラクトースを加えることにより、該組換えタンパク質の産生が、より高いレベルのガラクトシル化またはシアル酸化糖タンパク質を与えうることである。したがって、ルロアール経路を通常は欠く酵母種であるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で示されたとおり、本明細書に開示されている方法でのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の遺伝的操作は、唯一の炭素源としてガラクトースを利用しうる組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系を与える。また、ルロアール経路酵素を含めるための、およびガラクトース末端Ｎ−グリカンまたはガラクトース含有Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を該細胞が産生するのを可能にするのに必要な酵素を含めるためのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系の遺伝的操作は、ガラクトース末端Ｎ−グリカンまたはガラクトース含有Ｎ−グリカンの収率が、該細胞系がルロアール経路酵素を欠く場合より高い、組換え細胞系を与える。したがって、本発明は、ガラクトシル化またはシアル酸化糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系における生産性の増加をもたらす。
特に、本発明は、高レベルのガラクトースまたはシアル酸を有する抗体のインビボでの製造に有用な方法および材料を提供する。（ａ）糖源としてガラクトースを利用しうる宿主細胞の選択、（ｂ）該宿主細胞の増殖のための炭素源の供給、および（ｃ）Ｎ−グリカン内の末端ガラクトース残基としてのＮ−グリカン内への取り込みのためのガラクトース残基の源の供給、またはＮ−グリカンへの末端シアル酸残基の後続の付加のための基質の供給を含む複数の目的を達成するために、本発明の方法および材料を使用して、細胞増殖培地にガラクトースを加える。したがって、本発明は、精製されているが部分的にガラクトシル化されている組換え糖タンパク質を含有する培地または溶液に荷電ガラクトースおよび可溶性ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素を加える、より低い効率かつより高価なインビトロ反応を用いることなく、インビボ過程によりガラクトシル化のレベルを増加させうる方法および材料を提供する。
本発明の１つの実施形態は、唯一の炭素源としてガラクトースが存在する培地上で生存しうるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞の開発である。本発明の材料および方法を用いて、当業者は、形質転換宿主細胞を選択し維持するために炭素源としてガラクトースを使用して、本明細書に開示されている形質転換宿主細胞から組換え糖タンパク質を製造することが可能であろう。さらに、該細胞培養培地にガラクトースを供給することにより、本発明は、ガラクトシル化またはシアル酸化Ｎ−グリカンを産生するように宿主細胞が遺伝的に操作されている場合に該細胞から産生されるガラクトシル化またはシアル酸化糖タンパク質のレベルを増加させるために用いられうる。
したがって、ガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性を発現するように遺伝的に操作されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を提供し、ここで、該宿主細胞は唯一の炭素エネルギー源としてガラクトースを利用しうる。
特定の態様においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞は、ガラクトース残基を含むハイブリッドまたは複合Ｎ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を産生しうるように更に遺伝的に操作されている。特定の実施形態においては、該ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性は、ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインとＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼの触媒ドメインとを含む融合タンパク質において得られる。
一般に、該宿主細胞は、Ｇ０：Ｇ１／Ｇ２比が２：１未満である複合Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる。
特定の実施形態においては、前記細胞において産生される糖タンパク質は、主として、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるＮ−グリカンである。
更に詳細な実施形態においては、Ｎ−グリカンは、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるガラクトース末端Ｎ−グリカンである。他の実施形態においては、該Ｎ−グリカンはガラクトース末端ハイブリッドＮ−グリカンであり、更に詳細な実施形態においては、該Ｎ−グリカンは、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるシアル酸化Ｎ−グリカンである。
更に、ａ）（ｉ）ガラクトース残基を含むハイブリッドまたは複合Ｎ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を宿主細胞が産生することを可能にするグリコシル化経路、（ｉｉ）ガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性、ならびに（ｉｉｉ）組換え糖タンパク質を発現するように遺伝的に操作されている組換え宿主細胞を準備し、ｂ）ガラクトースを含有する培地内で該宿主細胞を培養して、ガラクトース残基を有する１以上のＮ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を産生させることを含む、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主における、ガラクトース残基を有するＮ−グリカンを有する組換え糖タンパク質の製造方法を提供する。
該方法の更に詳細な態様においては、該ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性は、ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインとＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼの触媒ドメインとを含む融合タンパク質において得られる。
本発明は更に、異種タンパク質を発現する組換え宿主細胞を選択するための方法を提供する。ルロアール経路酵素活性の全てではないが１つ又は２つを発現する組換え宿主細胞を、該異種タンパク質および該組換え宿主細胞に存在しないルロアール経路酵素をコードする１以上の核酸分子で形質転換する。該形質転換組換え宿主細胞は完全なルロアール経路を含有するため、該異種タンパク質を発現する形質転換組換え宿主細胞の、未形質転換細胞からの選択は、ガラクトースが唯一の炭素源である培地内で該形質転換組換え宿主細胞を培養することにより達成されうる。したがって、更に、（ａ）ガラクトキナーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼおよびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼからなる群から選択される１つ又は２つの酵素を発現するように遺伝的に操作されている宿主細胞を準備し、（ｂ）該異種タンパク質、および工程（ａ）の宿主細胞において発現されない、工程（ａ）における群からの酵素をコードする１以上の核酸分子で該宿主細胞を形質転換し、（ｃ）ガラクトースを唯一の炭素源として含有する培地内で該宿主細胞を培養して、異種タンパク質を発現する組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を得ることを含む、異種タンパク質を発現する組換え宿主細胞の製造方法を提供する。
該方法の更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、ガラクトースパーミアーゼを発現するように更に遺伝的に操作される。更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、ガラクトースを含む１以上のＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に修飾される。
更に、ａ）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を準備し、ｂ）ガラクトキナーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼおよび場合によってはガラクトースパーミアーゼをコードする１以上の核酸分子で該宿主細胞を形質転換し、ｃ）ガラクトースを唯一の炭素源として含有する培地上で該形質転換宿主細胞を培養し、ｄ）ガラクトースを唯一の炭素源として含有する培地上で増殖しうる宿主細胞を選択することを含む、ガラクトースを唯一の炭素源として利用しうるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を製造し選択する方法を提供する。
本発明における宿主細胞および方法は、Ｇ０：Ｇ１／Ｇ２グリコフォームの比が２：１未満である組換え糖タンパク質を医薬上許容される担体中に含む組成物の製造を可能にする。特定の実施形態においては、該組換え糖タンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンωならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；ＧＭ−ＣＳＦ；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；および尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；ならびにＩＬ−２受容体アゴニストからなる群から選択される。
更に詳細な実施形態においては、糖タンパク質は、抗体、特にヒト化、キメラまたはヒト抗体である。特定の実施形態においては、該抗体は、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３受容体抗体、抗ＣＤ４１ ７Ｅ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体および抗ＣＤ２０抗体ならびにそれらの変異体からなる群から選択される。抗体の具体例には、ムロモナブ−ＣＤ３、アブシキシマブ、リツキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセテン、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ−１３１Ｉ、エファリズマブ、セツキシマブ、ゴリムマブおよびベバシズマブが含まれる。
更に詳細な実施形態においては、該糖タンパク質はＦｃ融合体、例えばエタネルセプトである。
本明細書に開示されているとおりに修飾されうる宿主細胞の一例としてピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられているが、該方法および宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）には限定されない。本発明における方法は、ルロアール経路酵素を通常は発現せず従ってガラクトースを炭素源として利用し得ない他の下等真核生物種から組換え宿主細胞を製造するために使用されうる。したがって、更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、ルロアール経路酵素を通常は発現しない任意の下等真核生物種である。
定義
特に定められていない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、本発明に関連する技術分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意義を有する。更に、文脈に矛盾しない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関して用いる用語ならびにそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており一般に用いられているものである。一般に、本発明の方法および技術は、特に示さない限り、当技術分野でよく知られている通常の方法に従い、ならびに本明細書の全体にわたって引用され記載されている種々の全般的およびより具体的な参考文献に記載されているとおりに行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；ＴａｙｌｏｒおよびＤｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ Ｉ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ ＩＩ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。典型的な方法および材料を以下で説明するが、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料も本発明の実施において使用可能であり、当業者に明らかであろう。本明細書に記載の全ての刊行物および他の参考文献の全体を、それらが引用されている開示に関して、参照により本明細書に組み入れることとする。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先される。材料、方法および具体例は例示に過ぎず、何ら限定的なものではない。
以下の用語は、特に示さない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
本明細書中で用いる「ヒト化された」、「ヒト化」および「ヒト様」は互換的に用いられ、操作された細胞が、同じ種の未操作野生型非ヒト細胞により産生される糖タンパク質よりも哺乳類グリコシル化パターンに良く似たグリコシル化を有するタンパク質、特に糖タンパク質を産生する能力をもたらす様態で、非ヒト細胞、例えば下等真核宿主細胞を操作する方法を意味する。ヒト化は、Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化またはその両方に関して行われうる。例えば、野生型ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）および他の下等真核細胞は、典型的には、Ｎ−グリコシル化部位における高マンノシル化タンパク質を産生する。本発明の好ましい実施形態においては、本発明の「ヒト化」宿主細胞は、ハイブリッドおよび／または複合Ｎ−グリカン、すなわち、「ヒト様Ｎ−グリコシル化」を有する糖タンパク質を産生しうる。該ヒト化宿主細胞から産生される糖タンパク質上に主に存在する具体的な「ヒト様」グリカンは、行われる具体的なヒト化工程に左右されるであろう。
本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」および「グリコフォーム」なる語は互換的に用いられ、Ｎ−結合オリゴ糖を意味し、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合しているオリゴ糖を意味する。Ｎ−結合糖タンパク質は、該タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上で見出される主な糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））が挙げられる。Ｎ−結合糖タンパク質の場合、糖基のプロセシングは翻訳と共に小胞体の内腔（ＥＲルーメン）で生じ、ゴルジ装置内で継続する。
Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有する（「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する）。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「小マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）コア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される末梢糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分枝構成成分に従い分類される（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、「トリマンノース」コアの１，６マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、および１，３マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合Ｎ−グリカンはまた、場合によってはシアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」；ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されたガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、コア・フコース（「Ｆｕｃ」）および「二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換を有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノース・コア」上に複数のアンテナを有することが可能であり、これは、しばしば、「多アンテナグリカン」と称される。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、該トリマンノース・コアの１，３マンノース・アームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを、そして該トリマンノース・コアの１，６マンノース・アーム上に０個以上のマンノースを有する。これらの種々のＮ−グリカンは「グリコフォーム」とも称される。図２は、哺乳類様Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生された種々の高マンノース、ハイブリッドおよび複合Ｎ−グリカンを示す。
本明細書中で用いる「Ｏ−グリカン」および「グリコフォーム」なる語は互換的に用いられ、Ｏ結合オリゴ糖、例えば、セリンまたはトレオニン残基のヒドロキシル基を介してペプチド鎖に結合したグリカンを意味する。真菌細胞においては、天然Ｏ−グリコシル化は、小胞体内のタンパク質にドリコールモノホスファートマンノース（Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ）から転移された第１マンノシル残基の結合により生じ、ゴルジ装置におけるＧＰＤ−Ｍａｎからの転移により追加的なマンノシル残基が結合しうる。高等真核細胞、例えばヒトまたは哺乳類細胞は、セリンまたはトレオニン残基へのＮ−アセチル−ガラクトサミン（ＧｌｃＮａｃ）の共有結合によりＯ−グリコシル化を受ける。
本明細書中で用いる「ヒト様Ｏ−グリコシル化」なる語は、真菌特異的リン酸化マンノース構造が減少し又は除去されて、電荷およびベータ−マンノース構造の減少または除去がもたらされること、あるいは糖タンパク質上または糖タンパク質の組成物中に存在する主要Ｏ−グリカン種が、ＧｌｃＮａｃ、ＧａｌまたはＮＡＮＡ（またはＳｉａ）から選択される末端残基でキャップ化（ｃａｐｐｅｄ）されたグリカンを含むことを意味すると理解されるであろう。このように、主にヒト様Ｏ−グリコシル化を含有する組換え糖タンパク質は、それが天然産生糖タンパク質であるかのように、ヒトまたは哺乳類細胞により認識されうる。このことは該組換え糖タンパク質の治療特性の改善をもたらす。
本明細書中で用いる略語は、当技術分野で一般に用いられているものである。例えば、前記の糖の略語を参照されたい。他の一般的な略語には、「ＰＮＧアーゼ」または「グリカナーゼ」または「グルコシダーゼ」が含まれ、これらは全て、ペプチドであるＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を意味する。
本明細書中で用いる「抗体」、「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン分子」なる語は互換的に用いられる。各免疫グロブリン分子は、その特異的抗原にそれが結合するのを可能にする特有の構造を有するが、全ての免疫グロブリンは、本明細書に記載されているのと同じ全体構造を有する。基本的な免疫グロブリン構造単位はサブユニットの四量体を含むことが公知である。各四量体は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアを有し、各ペアは１つの「軽」鎖（ＬＣ）（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（ＨＣ）（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識をもたらす約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能をもたらす定常領域を定める。軽鎖（ＬＣ）はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖（ＨＣ）はガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンのいずれかとして分類され、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとしての抗体のイソタイプを定める。
軽鎖および重鎖は可変領域および定常領域に細分される（全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｈ．７を参照されたい）。各軽／重鎖ペアの可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、完全抗体は２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体の場合を除き、それらの２つの結合部位は同一である。該鎖は全て、相補性決定領域またはＣＤＲとも称される３つの超可変領域により連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の、同じ全体構造を示す。各ペアの２つの鎖からのＣＤＲは該フレームワーク領域により整列され、特異的エピトープへの結合を可能にする。これらの用語は、天然に存在する形態、ならびにフラグメント（断片）および誘導体を含む。該用語の範囲内には、免疫グロブリン（Ｉｇ）のクラス、すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤが含まれる。ＩｇＧのサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４も該用語の範囲内に含まれる。該用語は最も広い意味で用いられ、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）、および複数のエピトープまたは抗原に結合する抗体組成物を含む。該用語は、特に、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを含むが、この場合、それらはＣＨ２ドメインのＮ結合グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインの部分またはその変異体を含有するか又は少なくとも含有するよう修飾されている。Ｆｃ領域のみを含む分子、例えばイムノアドヘシン（米国公開特許出願第２００４０１３６９８６号）、Ｆｃ融合体および抗体様分子も該用語に含まれる。あるいは、これらの用語は、Ｎ結合グリコシル化部位を少なくとも含有する少なくともＦａｂ領域の抗体フラグメントを意味しうる。
「Ｆｃ」フラグメントなる語は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する、抗体のＣ末端領域「結晶性フラグメント」を意味する。「Ｆａｂ」フラグメントなる語は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬドメインを含有する、抗体の「抗原結合フラグメント」領域を意味する。
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）なる語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる可能な天然で生じる突然変異の場合を除き同一である。モノクローナル抗体は単一の抗原部位に対して高特異性である。さらに、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各ｍＡｂは該抗原上の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の免疫グロブリンの混入を伴わないハイブリドーマ培養により合成されうる点で好都合である。「モノクローナル」なる語は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特性を示すものであり、いずれかの特定の方法による該抗体の製造を要すると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に最初に記載されたハイブリドーマ法により製造されることが可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法により製造されうる（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。
「抗体」または「免疫グロブリン」なる語の範囲内の「フラグメント」なる語は、種々のプロテアーゼでの消化により製造されたもの、化学的切断および／または化学的解離により製造されたもの、ならびに組換え的に製造されたものを含むが、該フラグメントは尚も標的分子に特異的に結合しうるものでなければならない。そのようなフラグメントとしては、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２および一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントが挙げられる。以下、「免疫グロブリン」なる語は「フラグメント」なる語をも含む。
免疫グロブリンは更に、配列において修飾されているが尚も標的分子に特異的に結合しうる免疫グロブリンまたはフラグメント、例えば、種間キメラおよびヒト化抗体；抗体融合体；ヘテロマー抗体複合体および抗体融合体、例えばジアボディ（二重特異性抗体）、一本鎖ジアボディおよびイントラボディを含む（例えば、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｍａｒａｓｃｏ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．，１９９８）を参照されたい）。
「触媒抗体」なる語は、生化学反応を触媒しうる免疫グロブリン分子を意味する。触媒抗体は当技術分野でよく知られており、Ｓｃｈｏｃｈｅｔｍａｎらの米国特許第７，２０５，１３６号、第４，８８８，２８１号および第５，０３７，７５０号、Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩらの米国特許第５，７３３，７５７号、第５，９８５，６２６号および第６，３６８，８３９号に記載されている。
本明細書中で用いる「ベクター」なる語は、それに連結された別の核酸分子を運搬しうる核酸分子を意味すると意図される。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、追加的なＤＮＡ断片が連結されうる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。他のベクターには、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。もう１つのタイプのベクターは、追加的なＤＮＡ断片がウイルスゲノム内に連結されうるウイルスベクターである（後記において更に詳しく説明する）。あるベクターは、それが導入される宿主細胞において自律複製することが可能である（例えば、該宿主細胞内で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは宿主細胞内への導入の際に宿主細胞のゲノム内に組込まれることが可能であり、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある好ましいベクターは、それが機能的に連結されている遺伝子の発現を導きうる。そのようなベクターは本明細書中では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。
本明細書中で用いる「関心のある配列」または「関心のある遺伝子」なる語は、宿主細胞内で通常は産生されない、典型的にはタンパク質をコードする核酸配列を意味する。本明細書に開示されている方法は、宿主細胞ゲノム内に安定に組込まれた１以上の関心のある配列または関心のある遺伝子の効率的発現を可能にする。関心のある配列の非限定的な具体例には、酵素活性を有する１以上のポリペプチド、例えば、宿主におけるＮ−グリカン合成に影響を及ぼす酵素、例えばマンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼが含まれる。
「マーカー配列」または「マーカー遺伝子」なる語は、宿主細胞内の配列の存在または非存在に関する正または負の選択を可能にする活性を発現しうる核酸配列を意味する。例えば、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子はマーカー遺伝子である。なぜなら、該遺伝子を含有する細胞がウラシルの非存在下で増殖しうることにより、その存在が選択されうるからである。その存在は、該遺伝子を含有する細胞が５−ＦＯＡの存在下で増殖し得ないことによっても選択されうる。マーカー配列または遺伝子は、正および負の両方の選択性を示すことを必ずしも要しない。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のマーカー配列または遺伝子の非限定的な具体例には、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４およびＵＲＡ３が含まれる。抗生物質耐性マーカー遺伝子の場合、カナマイシン、ネオマイシン、ゲネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（またはＧ４１８）、パロモマイシンおよびヒグロマイシン耐性遺伝子が、これらの抗生物質の存在下での増殖を可能にするために一般に使用される。
「機能的に連結」された発現制御配列は、関心のある遺伝子を制御するように、関心のある遺伝子に隣接して連結された発現制御配列、ならびに関心のある遺伝子を制御するように、トランスで又は或る距離を隔てて作用する発現制御配列を意味する。
「発現制御配列」または「調節配列」なる語は互換的に用いられ、本明細書中で用いられる場合には、それが機能的に連結されているコード配列の発現に影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、適当な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増加させる配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望ましい場合には、タンパク質分泌を促進する配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物においては、そのような制御配列には、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列が含まれる。「制御配列」なる語は、少なくとも、発現のために存在が必須である全ての成分を含むと意図され、存在することが有利である追加的な成分、例えばリーダー配列および融合相手の配列をも含みうる。
本明細書中で用いる「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」）なる語は、組換えベクターが導入された細胞を意味すると意図される。そのような用語は、その特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代をも意味すると意図されると理解されるべきである。後の世代においては突然変異または環境の影響により或る修飾が生じうるため、そのような後代は実際には親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書中で用いる「宿主細胞」なる語の範囲内に尚も含まれる。組換え宿主細胞は、培養内で増殖した単離された細胞または細胞系であることが可能であり、あるいは、生きた組織または生物に存在する細胞でありうる。
「真核生物」なる語は有核細胞または生物を意味し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞および下等真核細胞を意味する。
「下等真核細胞」なる語は、酵母、真菌、カラー（ｃｏｌｌａｒ）有鞭毛類、微胞子虫類、胞状虫類（ａｌｖｅｏｌａｔｅ）（例えば、渦鞭毛虫類）、ストラメノピル（ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅ）（例えば、褐藻類、原虫類）、紅色植物（例えば、紅藻類）、植物（例えば、緑藻類、植物細胞、コケ）および他の原生生物を含む。酵母および糸状菌は、限定的なものではないが、以下のものを含む：ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）。
本明細書中で用いる「ペプチド」なる語は、短いポリペプチド、例えば、典型的には約５０アミノ酸長未満、より典型的には約３０アミノ酸長未満のポリペプチドを意味する。本明細書中で用いる該用語は、構造的な、ひいては生物学的な機能を模倣した類似体および模倣体を含む。
「ポリペプチド」なる語は、天然で生じるタンパク質および非天然で生じるタンパク質の両方、ならびにそれらの断片、突然変異体、誘導体および類似体を含む。ポリペプチドは単量体または重合体でありうる。さらに、ポリペプチドは、１以上の異なる活性をそれぞれが有する幾つかの異なるドメインを含みうる。
「単離（された）タンパク質」または「単離（された）ポリペプチド」なる語は、その由来または誘導の起源に基づいて、（１）その天然状態でそれに付随する天然で結合している成分に結合していない、（２）天然で見出されない純度（純度は他の細胞物質の存在に関して判断されうる）で存在する（例えば、同一種の他のタンパク質を含有しない）、（３）異なる種の細胞により発現される、または（４）天然に存在しない（例えば、それは、天然で見出されるポリペプチドの断片であるか、あるいはそれは、天然で見出されないアミノ酸類似体もしくは誘導体、または標準的なペプチド結合以外の連結を含む）タンパク質またはポリペプチドを意味する。したがって、化学合成されたポリペプチド、または天然における産生由来細胞とは異なる細胞系内で合成されたポリペプチドは、その天然で付随する成分から「単離」されている。ポリペプチドまたはタンパク質は、当技術分野でよく知られたタンパク質精製技術を用いる単離により、天然で付随する成分を実質的に含有しないものにされることが可能である。このような定義においては、「単離」は、そのように示されているタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドがその天然環境から物理的に取り出されていることを必ずしも要さない。
本明細書中で用いる「ポリペプチド断片」なる語は、完全長ポリペプチドと比較した場合に、欠失、例えばアミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを意味する。好ましい実施形態においては、ポリペプチド断片は、該断片のアミノ酸配列が、天然に存在する配列における対応位置と同一である、連続配列である。断片は、典型的には、少なくとも５、６、７、８、９または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６または１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５，３０、３５、４０または４５アミノ酸長、より一層好ましくは少なくとも５０または６０アミノ酸長、より一層好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。
「修飾誘導体」は、一次構造配列において実質的に相同であるが例えばインビボもしくはインビトロの化学的および生化学的修飾を含むか又は天然ポリペプチドにおいて見出されないアミノ酸を含むポリペプチドまたはその断片を意味する。当業者に容易に理解されるとおり、そのような修飾には、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、標識（例えば、放射性核種での標識）、および種々の酵素的修飾が含まれる。ポリペプチド標識するための種々の方法、およびそのような目的に有用な置換基または標識が、当技術分野でよく知られており、それらには、放射性同位元素、例えば１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓおよび３Ｈ、標識された抗リガンド（例えば、抗体）に結合するリガンド、発蛍光団、化学発光物質、酵素、ならびに標識リガンドに対する特異的結合ペアメンバーとして働きうる抗リガンドが含まれる。標識の選択は、要求される感度、プライマーとの結合の容易さ、安定性要件、および利用可能な装置に左右される。ポリペプチドを標識するための方法は当技術分野でよく知られている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，およびＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）（これを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
「キメラ遺伝子」または「キメラヌクレオチド配列」なる語は、異種ヌクレオチド配列に結合したヌクレオチド配列または断片を含むヌクレオチド配列を意味する。キメラ配列は融合タンパク質の発現に有用である。キメラ遺伝子またはキメラヌクレオチド配列は、異種組換えタンパク質の製造のための有益な特性を有しうる、意図される宿主細胞にとって異種である１以上の断片またはドメインをも含みうる。一般に、キメラヌクレオチド配列は、遺伝子からの少なくとも３０個の連続的ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６０個または９０個以上のヌクレオチドを含む。意図される宿主細胞にとって異種であるが意図される組換えタンパク質と相同である少なくとも１つの断片またはドメインを有するキメラヌクレオチド配列は本発明において特に有用である。例えば、組換えヒト糖タンパク質を発現させるためのピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を使用する発現系における使用で意図されるキメラ遺伝子は、好ましくは、ヒト由来の少なくとも１つの断片またはドメイン（例えば、潜在的治療価値を有するヒトタンパク質をコードする配列）であり、一方、該キメラ遺伝子の残部（例えば、宿主細胞がキメラ遺伝子をプロセシングし発現するのを可能にする調節配列）は、好ましくは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のものである。所望により、ヒト由来の断片はまた、宿主細胞における発現に関してコドン最適化されうる（例えば、参照により本明細書に組み入れる米国特許第６，８８４，６０２号を参照されたい）。
「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」なる語は、異種アミノ酸配列に結合したポリペプチドまたは断片を含むポリペプチドを意味する。融合タンパク質は、２以上の異なるタンパク質からの２以上の所望の機能要素を含有するように構築されうるため、有用である。融合タンパク質は、関心のあるポリペプチドからの少なくとも１０個の連続的アミノ酸、より好ましくは少なくとも２０または３０アミノ酸、より一層好ましくは少なくとも４０、５０または６０アミノ酸、より好ましくは少なくとも７５、１００または１２５アミノ酸を含む。本発明のタンパク質の全体を含む融合体が特に有用である。本発明の融合タンパク質内に含まれる異種ポリペプチドは少なくとも６アミノ酸長、しばしば、少なくとも８アミノ酸長、有用なものとしては、少なくとも１５、２０および２５アミノ酸長である。融合体は、より大きなポリペプチド、または更にはタンパク質全体、例えば、特定の有用性を有する緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）発色団含有タンパク質をも含む。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームで該ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を構築し、該融合タンパク質を発現させることにより、組換え的に製造されうる。あるいは、融合タンパク質は、該ポリペプチドまたはその断片を別のタンパク質に架橋することにより、化学的に製造されうる。
「非ペプチド類似体」なる語は、参照ポリペプチドの特性に類似した特性を有する化合物を意味する。非ペプチド化合物は「ペプチド模倣体」または「ペプチドミメティック」とも称されうる。例えば、Ｊｏｎｅｓ，Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｊｕｎｇ，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９９７）；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ‐ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９３）；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ，（Ｇｒａｎｔ編，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９９２）；Ｅｖａｎｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）；Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｌ，８：３９２−３９６（１９８５）；ならびに前記のそれぞれにおいて引用されている参考文献（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。そのような化合物は、しばしば、コンピューター化分子モデリングを用いて開発される。本発明の有用なペプチドに構造的に類似しているペプチド模倣体は、同等な効果を得るために使用可能であり、したがって本発明の一部であると想定される。
本明細書中で用いる「領域」なる語は、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分を意味する。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続的部分により定められる。
本明細書中で用いる「ドメイン」なる語は、生体分子の既知または推定機能に寄与する、該生体分子の構造を意味する。ドメインはその領域または部分と同じ位置に存在することが可能であり、ドメインは、生体分子の、異なる不連続領域を含むことも可能である。
本明細書中で用いる「分子」なる語は、小分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質など（これらに限定されるものではない）を含む任意の化合物を意味し、そのような化合物は天然物または合成物でありうる。
本明細書中で用いる「含む」なる語、またはその派生語、例えば「含んでなる」もしくは「含み」は、示されている整数または整数群の包含を示唆するが、いずれの他の整数または整数群の排除をも示唆するものではないと理解される。
本明細書中で用いる「主に」なる語、またはその派生語、例えば「主要」または「優勢」は、糖タンパク質を酵素で処理し、遊離グリカンを質量分析、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した後で特定されうる、全Ｏ−グリカンまたはＮ−グリカンに対する最高モル百分率（％）を有するグリカン種に関して用いられると理解される。言い換えると、「主要（主に）」なる語は、他のいずれの個々の実体より大きなモル％で特定の「主要」グリコフォームが存在するような個々の実体として定められる。例えば、ある組成物が、４０モル％の種Ａ、３５モル％の種Ｂおよび２５モル％の種Ｃからなる場合、該組成物は種Ａを「主に」含む。
発明の詳細な説明
酵母は細胞内および分泌性の両方の組換えタンパク質の製造に成功裏に使用されている（例えば、Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ Ｃｒｅｇｇ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４（１）：４５−６６（２０００）；Ｈａｒｋｋｉら，Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（６）：５９６（１９８９）；Ｂｅｒｋａら，Ａｂｓｔｒ．Ｐａｐｅｒｓ Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０３：１２１−ＢＩＯＴ（１９９２）；Ｓｖｅｔｉｎａら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６（２−３）：２４５−２５１（２０００）を参照されたい）。種々の酵母、例えばケイ・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）は、組換えタンパク質を製造するための真核生物発現系として特に重要な役割を果たしている。なぜなら、それらは高い細胞密度まで増殖可能であり、大量の組換えタンパク質を分泌可能だからである。しかし、これらの真核微生物のいずれで発現される糖タンパク質も、哺乳類において産生されたものとＮ−グリカン構造において相当に異なる。グリコシル化におけるこの相違は多数の治療用糖タンパク質の製造のための宿主としての酵母または糸状菌の使用を妨げている。
治療用糖タンパク質を製造するための酵母の使用を可能にするために、ハイブリッドまたは複合Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように酵母が遺伝的に操作されている。特定のハイブリッドまたは複合Ｎ−グリカンを含む組成物を産生しうる組換え酵母が、例えば米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号に開示されている。また、Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：１４４１−１４４３（２００６）および米国公開出願第２００６／０２８６６３７号は、酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるグリコシル化経路のヒト化、および末端シアル酸を含有する複合Ｎ−グリコシル化を伴う組換えヒト糖タンパク質の分泌を報告した。オリゴ糖構造Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｇ２）を有する末端シアル酸の前駆体Ｎ−グリカンは、ヒト血清から単離される幾つかのタンパク質、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、アシアロトランスフェリン上で、そして最も顕著には、種々の量でヒト免疫グロブリン（抗体）上で主要Ｎ−グリカンとして見出されている構造である。Ｄａｖｉｄｓｏｎらは、米国公開出願第２００６／００４０３５３において、ガラクトース末端Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作された酵母細胞を使用してガラクトシル化糖タンパク質を得るための効率的方法を教示している。これらの宿主細胞は、種々の量のＧ０オリゴ糖構造と共にＧ２またはＧ１（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）オリゴ糖構造の種々の混合物を含有する糖タンパク質組成物を産生しうる。Ｇ０はＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であり、これはガラクトシルトランスフェラーゼの基質である。しかし、ある糖タンパク質、特に抗体およびＦｃフラグメントでは、ガラクトース転移過程の効率が最適未満であることが判明している。抗体およびＦｃフラグメントの場合、細胞内プロセッシング中の抗体またはＦｃフラグメント上のグリコシル化部位の位置および接近性が抗体またはＦｃフラグメントのＮ−グリカン上へのガラクトース転移の効率を抑制すると考えられている。したがって、ガラクトースを含有するオリゴ糖構造の量は、クリングル３タンパク質のような他の糖タンパク質で観察されているものより少ない。この問題を克服するために、本発明は、抗体またはＦｃフラグメントのＮ−グリカン上へのガラクトース転移の量を増加させて、Ｇ０を含有する抗体またはＦｃフラグメントに比べて、Ｇ１およびＧ２を含有する抗体またはＦｃフラグメントの量を増加させるための手段を提供する。
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、限られた数の炭素源しか生存のために利用できない。これらの炭素源はグリセロール、グルコース、メタノールならびに恐らくはラムノースおよびマンノースであり、ガラクトースではないことが現在のところ公知である。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を使用する多数の工業的製造方法においては、組換えタンパク質の発現は、メタノールの存在下では活性であるがグリセロールの存在下では抑制されるＡＯＸプロモーターの制御下にある。したがって、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、通常、細胞の濃度が所望レベルに達するまでは、グリセロールまたはグリセロール／メタノールを含有する培地内で増殖され、所望レベルに達した時点で、炭素源としてメタノールのみを含有する培地と培地交換することにより該組換えタンパク質の発現が行われる。しかし、該細胞は低いエネルギー状態にある。なぜなら、メタノールは１個の炭素しか含有せず、したがってそれは乏しい炭素源だからである。したがって、より高いエネルギー源、例えばガラクトースをピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が利用しうる製造方法を得ることが望ましいであろう。本発明は、唯一の炭素源としてガラクトースを利用しうる遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を提供することにより、この問題も解決するものである。
したがって、本発明は、前記で認められた問題の両方を解決した。本発明は、抗体またはＦｃフラグメントのような糖タンパク質を産生するように糖操作された組換え下等真核細胞、特に酵母および真菌細胞を提供するものであり、ここで、そのＮ−グリカン上の末端ガラクトースのレベルは、本明細書に教示されているとおりに遺伝的に操作されていない細胞と比較して増加する。該遺伝的操作宿主細胞は、ガラクトースを含有するＮ−グリカンを有する糖タンパク質の製造方法において使用可能であり、ここで、該Ｎ−グリカンにおけるガラクトースの量は、本明細書に教示されているとおりに遺伝的に操作されていない宿主細胞において入手可能なものより多い。本発明はまた、唯一の炭素源としてガラクトースを通常は利用し得ない宿主細胞が、唯一の炭素源としてガラクトースを利用可能となるように、本明細書に教示されているとおりに遺伝的に操作されている、遺伝的に操作された宿主細胞を提供する。唯一の炭素源としてガラクトースを宿主細胞が利用することを可能にするための本発明における方法はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を１つのモデルとして使用した。本発明における方法は、通常は炭素源としてガラクトースを利用し得ない他の酵母または真菌種が炭素源としてガラクトースを利用することを可能にするために使用されうる。
両方の問題を解決するために、ガラクトース末端Ｎ−グリカンを産生しうるように遺伝的に操作された宿主細胞を、ルロアール経路酵素、すなわち、ガラクトキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．６）、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．２）およびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．７．７．１２）を発現するように更に遺伝的に操作する。場合によっては、該宿主細胞は更に、ガラクトースパーミアーゼを発現しうる。これは、該宿主細胞が炭素源としてガラクトースを利用しＵＤＰ−ガラクトースのプールを産生することを可能にし、そしてこれは、ガラクトース残基を含むＮ−グリカンの合成に関与するガラクトーストランスフェラーゼの基質として働く。したがって、本発明における宿主細胞および方法は、糖タンパク質組成物、特に抗体およびＦｃフラグメント組成物の製造を可能にし、ここで、ガラクトース末端Ｎ−グリカンの比率は、糖操作された下等真核細胞において入手可能なものより高い。該組換え宿主細胞は、例えば抗体およびＦｃ融合タンパク質のような組換え糖タンパク質を産生することが可能であり、ここで、Ｇ０：Ｇ１／Ｇ２比は２：１未満であり、あるいはＧ０：Ｇ１／Ｇ２比は約１：１またはそれ未満であり、あるいはＧ０：Ｇ１／Ｇ２比は約１：２またはそれ未満である。
本明細書に記載されている宿主細胞および方法は、ガラクトース残基を末端とするＮ−グリカンを有する抗体およびＦｃフラグメント含有タンパク質を製造するのに特に有用である。抗体または抗体フラグメントの重鎖のＡｓｎ−２９７におけるＮ−グリカンは抗体の構造および機能にとって重要である。これらの機能はＦｃガンマ受容体結合、補体を活性化する能力、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する能力（ＡＤＣＣ）および血清安定性を含む。しかし、酵母または哺乳類細胞における現在の抗体製造は、一般に、Ｎ−グリコシル化、特に、重鎖の定常またはＦｃ領域のＡｓｎ−２９７で生じるＮ−グリコシル化の制御を欠いており、特に、Ｎ−グリカン上の末端ガラクトースのレベルを制御する能力を欠いている。一般に、Ｎ−グリカンにガラクトース残基を含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された酵母細胞は、ガラクトースを含有するＮ−グリカンを有する多数の糖タンパク質を効率的に産生しうるが、ガラクトースを含有するＮ−グリカンを有する抗体を産生する該細胞の能力はそれほど効率的ではないことが判明している。本明細書に示されているとおり、本発明における宿主細胞および方法は、本明細書に記載されているとおりに遺伝的に操作されていない細胞の場合より高いレベルの抗体がガラクトース含有Ｎ−グリカンを有する、抗体を産生しうる宿主細胞を提供する。
末端ガラクトース残基を有さないＮ−グリカン上の末端ガラクトースレベルは、Ｎ−グリカンの末端に荷電ガラクトース残基を付加するために可溶性ガラクトシルトランスフェラーゼを使用する反応においてインビトロで増加されうるが、このインビトロ法は高い経費を要し、面倒であり、糖タンパク質の製造量を容易には規模変更できない。したがって、インビボで末端ガラクトースのレベルが増加したＮ−グリカンを有する抗体または抗体フラグメントを含む分泌性糖タンパク質を産生しうる本明細書に開示されている宿主細胞は、ガラクトース含有Ｎ−グリカンのレベルが増加した抗体組成物を製造するための、より望ましい手段を提供する。したがって、本発明は抗体製造における顕著な進歩性を有し、特定の抗体特性、例えば、Ｎ−グリカンにおけるガラクトースのレベルを制御可能にすること、特に、改善された機能特性を有する組換え糖タンパク質を製造可能にすることを、初めて提供するものである。
また、シアル酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された宿主細胞と共に本発明における方法を使用する場合。ガラクトース末端Ｎ−グリカンがシアリルトランスフェラーゼの基質である。したがって、シアル酸化Ｎ−グリカンの量は、部分的には、シアル酸化に利用可能なガラクトース末端Ｎ−グリカンの量の関数である。本発明における宿主細胞および方法は、ガラクトース末端Ｎ−グリカンまたはガラクトース含有Ｎ−グリカンの量を増加させるための手段を提供し、これが、シアル酸化Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作された宿主細胞において産生された場合、本明細書に教示されているとおりに遺伝的に操作されていない宿主細胞と比較して増加した量のシアル酸化Ｎ−グリカンを産生する宿主細胞が得られる。
本発明は、ガラクトース末端Ｎ−グリカンまたはガラクトース含有Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を製造するのに有用であるが、本発明はまた、糖タンパク質であるか否かにかかわらず任意のタイプの異種タンパク質を発現する組換え宿主細胞を選択するための選択方法として有用である。ルロアール経路酵素活性の全てではないが１つ又は２つを発現する組換え宿主細胞を、該異種タンパク質、および該組換え宿主細胞に存在しないルロアール経路酵素をコードする１以上の核酸分子で形質転換する。該形質転換組換え宿主細胞は完全なルロアール経路を含有するため、該異種タンパク質を発現する形質転換組換え宿主細胞の、未形質転換細胞からの選択は、ガラクトースが唯一の炭素源である培地内で該形質転換組換え宿主細胞を培養することにより達成されうる。したがって、以下の工程を含む、異種タンパク質を発現する組換え宿主細胞の製造方法を提供する。ガラクトキナーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼおよびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼからなる群から選択される１つ又は２つルロアール経路酵素を発現するように遺伝的に操作された宿主細胞を準備する。幾つかの実施形態においては、宿主細胞は、ヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生することが可能であり、他の実施形態においては、該宿主細胞において発現されるべき異種タンパク質はＮ−グリカンを有さないため、該宿主細胞は、ヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しない。該異種タンパク質および準備された組換え宿主細胞において発現されないルロアール経路酵素をコードする１以上の核酸分子で該宿主細胞を形質転換する。ガラクトースを唯一の炭素源として含有する培地内で該形質転換宿主細胞を培養して、該異種タンパク質を発現する組換え宿主細胞を得る。場合によっては、該宿主細胞は更に、ガラクトースパーミアーゼをコードする核酸分子を含む。特定の実施形態においては、該宿主細胞を、Ｏ−グリコシル化を制御するために遺伝的に操作し、またはＯ−グリコシル化を制御する条件下で増殖させ、またはそれらの両方を行う。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は更に、ホスホマンノシルトランスフェラーゼおよび／またはベータ−マンノシルトランスフェラーゼ活性を減少させるために修飾されている。
下等真核生物におけるグリコシル化経路の遺伝的操作
ほとんどの真核生物におけるＮ−グリコシル化は、新生ポリペプチドの特定のＡｓｎ残基への脂質結合Ｇｌｙ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖構造の転移と共に小胞体（ＥＲ）において開始する（ＬｅｈｌｅおよびＴａｎｎｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３９９：３６４−７４（１９７５）；ＫｏｒｎｆｅｌｄおよびＫｏｍｆｅｌｄ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：６３１−６４（１９８５）；ＢｕｒｄａおよびＡｅｂｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ−Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ １４２６：２３９−２５７（１９９９））。全３個のグルコース部分および単一の特定のマンノース糖の、該Ｎ結合オリゴ糖からの除去は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を与え（図１を参照されたい）、これは、更なるオリゴ糖プロセッシングが生じるゴルジ装置への該糖タンパク質のトランスロケーションを可能にする（Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４２６：２７５−２８５（１９９９）；Ｍｏｒｅｍｅｎら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ４：１１３−１２５（１９９４））。哺乳類Ｎ−グリカンのプロセッシングが酵母および多数の他の真核生物（植物および昆虫を含む）から分岐するのはゴルジ装置においてである。哺乳類は、該オリゴ糖からの３つの末端α−１，２−マンノース糖の除去、その後のＧｌｃＮＡｃの付加、それによるハイブリッド中間体Ｎ−グリカンＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の形成を含む特定の順序の反応で、Ｎ−グリカンをプロセッシングする（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１７：４６５−４８３（２０００））（図１を参照されたい）。このハイブリッド構造はマンノシダーゼＩＩの基質であり、該酵素は、該オリゴ糖上の末端α−１，３−およびα−１，６−マンノース糖を除去してＮ−グリカンＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を与える（Ｍｏｒｅｍｅｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５７３（３）：２２５−２３５（１９９４））。最後に、図１に示すとおり、少なくとも１以上のＧｌｃＮＡｃ残基の付加ならびにそれに続くガラクトースおよびシアル酸残基の付加により、複合Ｎ−グリカンが生じる（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，（２０００），前記）。尤も、シアル酸は、しばしば、ＩｇＧを含む或るヒトタンパク質上には存在しない（Ｋｅｕｓｃｈら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ２５２：１４７−１５８（１９９６）；Ｃｒｅｕｓら，Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（Ｏｘｆ）４４：１８１−１８９（１９９６））。
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、Ｎ−グリカンのプロセッシングは、オリゴ糖がゴルジ装置全体を通過するにつれて該オリゴ糖にマンノース糖が付加されることを含み、時には、これにより、１００個を超えるマンノース残基を有する高マンノシル化グリカンが生じる（ＴｒｉｍｂｌｅおよびＶｅｒｏｓｔｅｋ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：１−３０（１９９５）；Ｄｅａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ−Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ １４２６：３０９−３２２（１９９９））（図１を参照されたい）。α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｏｃｈ１ｐ）によるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２への最初のα−１，６−マンノースの付加の後、追加的なマンノシルトランスフェラーゼがα−１，２−、α−１，６−および末端α−１，３−結合マンノースならびにマンノシルホスファートでＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを伸長させる。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、異種タンパク質の発現にしばしば使用されるメチロトローフ酵母であり、これは、サッカルミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるものに類似したグリコシル化装置を有する（ＢｒｅｔｔｈａｕｅｒおよびＣａｓｔｅｌｌｉｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１９３−２００（１９９９）；ＣｅｒｅｇｈｉｎｏおよびＣｒｅｇｇ，Ｆｅｒｎｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２４：４５−６６（２０００）；ＶｅｒｏｓｔｅｋおよびＴｒｉｍｂｌｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．５：６７１−６８１（１９９５））。しかし、Ｎ−グリコシル化の複雑性に合致して、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるグリコシル化はサッカルミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるものとは異なる。すなわち、それは、末端α−１，３−結合マンノースを付加する能力を欠いており、その代わりに、ホスホマンノースおよびβ結合マンノースを含む他のマンノース残基を付加する（Ｍｉｕｒａら，Ｇｅｎｅ ３２４：１２９−１３７（２００４）；Ｂｌａｎｃｈａｒｄら，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｉ．Ｊ．２４：３３−４７（２００７）；Ｍｉｌｌｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−９７３６（２００８））。
これまでの研究において、本発明者らは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のｏｃｈ１突然変異体が、酵母型外鎖形成を開始する能力を欠いていおり、したがってＮ−グリカンを高マンノシル化できないことを示した（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５０２２−５０２７（２００３））。更に、本発明者らは、β−マンノース転移をもたらすゴルジ存在酵素をコードする新規遺伝子ファミリーを特定し、このファミリーの種々のメンバーの欠失が免疫原性β−マンノース転移を軽減または排除することを示した（米国公開出願第ＵＳ２００６／０２１１０８５号を参照されたい）。５つの別々のグリコシル化酵素の後続の導入は、分泌性モデルタンパク質上に複合ヒトＮ−グリカンを産生する株を与えた（図３Ａと図３Ｂとを比較参照されたい）（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５０２２−５０２７（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：１２４４−１２４６（２００３）；米国特許第７，０２９，８７２号；米国公開出願第２００４／００１８５９０号；米国公開出願第２００４／０２３００４号；米国公開出願第２００５／０２０８６１７；米国公開出願第２００４／０１７１８２６号；米国公開出願第２００５／０２０８６１７号；米国公開出願第２００５／０１７０４５２号；および米国公開出願第２００６／００４０３５３号）。その後、自身が産生する分泌性タンパク質上に完全シアル酸化Ｎ−グリカンを産生しうる組換え酵母株の構築が米国公開出願第２００５／０２６０７２９号および第２００６／０２８６６３７号ならびにＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：１４４１−１４４３（２００６）に記載された。
複合Ｎ−グリカンの成熟は、幾つかのガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）により触媒されうる反応である末端ＧｌｃＮＡｃ部分へのガラクトースの付加を含む。ヒトにおいては、ＧａｌＴ（Ｉ−ＶＩＩ）の７つのアイソフォームが存在し、それらのうちの少なくとも４つはインビトロでＵＤＰ−ガラクトースの存在下にガラクトースを末端ＧｌｃＮＡｃに転移することが示されている（Ｇｕｏら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ １１：８１３−８２０（２００１））。ＧａｌＴＩとして公知の特定された最初の酵素が、Ｎ−グリカンに作用する主要酵素として一般に認識されており、これはインビトロ実験、マウスノックアウト研究および組織分布分析により支持されている（ＢｅｒｇｅｒおよびＲｏｈｒｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８５：２６１−７４（２００３）；ＦｕｒｕｋａｗａおよびＳａｔｏ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４７３：５４−６６（１９９９））。本明細書に示されているとおり、ヒトＧａｌＴＩの発現は、宿主細胞のゴルジ装置内に適切に局在化された場合、末端ＧｌｃＮＡｃ含有前駆体を産生しうる糖操作酵母株においてガラクトースを複合Ｎ−グリカン上に転移する。更に、ＵＤＰ−ガラクトースのプールを与えるＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ、および該基質をゴルジ内に移動させるＵＤＰ−ガラクトース輸送体の発現は、末端ＧｌｃＮＡｃ前駆体を産生しうる株において、Ｎ−グリカン上へのβ−１，４−ガラクトースのほぼ定量的な転移をもたらす。局在化サブファミリーの反復スクリーニングは、ハイブリッドＮ−グリカン構造と比較して改善された複合Ｎ−グリカン構造の産生をもたらした。これは、おそらく、ＧｌｃＮＡｃおよびガラクトシルトランスフェラーゼの分離、および中間体Ｎ−グリカン基質に関するそれらにおける競合の軽減によるものであろう。
これまでに、成長中のＮ−グリカン前駆体分子にコアまたはポーシ（Ｐａｕｃｉ）マンノースを転移するＡｌｇ１ｐ酵素の突然変異体の産生を最初に要する優れた実験の組合せにおいて、ヒトＧａｌＴＩは、末端ＧｌｃＮＡｃへのβ−１，４−ガラクトースの転移において活性であることが示されている（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１：３３９８−３４０５（１９９６））。この突然変異はタンパク質へのＧｌｃＮＡｃ２トランケート化Ｎ−グリカンの部分的転移をもたらし、末端ＧｌｃＮＡｃを産生する。この後、該著者は、ヒトＧａｌＴＩがこの人工的末端ＧｌｃＮＡｃへβ−１，４−結合でガラクトースを転移しうることを示している。重要なことに、ヒトＧａｌＴＩは活性形態で酵母のゴルジにおいて発現されうることが示されている。
前記に基づいて、本発明は、宿主細胞のゴルジ装置に標的化されるヒトＧａｌＴＩ−リーダーペプチド融合タンパク質の発現を初めて試験した。ヒトＧａｌＴＩＩ、ＧａｌＴＩＩＩ、ＧａｌＴＶ、ウシＧａｌＴＩおよび一対の推定シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ＧａｌＴの後続のスクリーニングの後、ヒトＧａｌＴＩがこの異種系における複合二分枝Ｎ−グリカンへのガラクトースの転移における最も活性な酵素であるらしいことが判明した。これは、ｈＧａｌＴＩが、この基質（二分枝複合Ｎ−グリカン）へ転移するための最も有効な酵素であることを示している可能性があり、あるいは、それは単に、試験されたＧａｌＴ酵素または両者の組合せのなかで最も安定で活性である可能性もある。興味深いことに、マンノシダーゼＩＩおよびＧｎＴ ＩＩ触媒ドメイン−リーダー融合タンパク質をゴルジ装置に局在化するために使用したのと同じリーダーペプチドを使用してＧａｌＴをゴルジ装置に局在化した場合、末端ガラクトースがα−１，３アーム上に存在する有意な比率のハイブリッドＮ−グリカン構造（２０％まで）が生じた。マンノシダーゼＩＩまたはＧｎＴ ＩＩ活性の発現の増強はこの現象を有意に軽減した。しかし、酵母ＩＩ型分泌経路局在化リーダーペプチド（ＥＲ、ゴルジまたはトランスゴルジネットワークのような分泌経路の所望の細胞小器官へ局在化するペプチド）のライブラリーのスクリーニングは、宿主細胞内に形質転換された場合、ハイブリッドＮ−グリカン構造のレベルの有意な減少および複合Ｎ−グリカン構造の増加をもたらす幾つかの活性ＧａｌＴ−リーダーペプチド融合タンパク質を与えた。これまでに、二分岐ＧｌｃＮＡｃ転移は、フコースの転移の阻害を含むゴルジ内のＮ−グリカンの成熟における後続の糖転移のための停止シグナルであることが報告されている（Ｕｍａｎａら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。ここにおけるデータは、α−１，３アームへのガラクトースの転移が同様の停止シグナルを与えて、マンノシダーゼＩＩおよびＧｎＴ ＩＩによるα−１，６アームの成熟を妨げることを示唆している。
前記の結果は、組換え宿主細胞において産生されるガラクトース末端複合Ｎ−グリカンまたはガラクトース含有複合Ｎ−グリカンに対するガラクトース末端ハイブリッドＮ−グリカンまたはガラクトース含有ハイブリッドＮ−グリカンの比が、マンノシダーゼＩＩおよびＧｎＴ ＩＩが局在化する部位に対する、ゴルジ装置内のＧａｌＴＩが局在化する部位の関係によるものであること、およびそれらの３つの酵素が局在化する部位を操作することにより、複合Ｎ−グリカンに対するハイブリッドＮ−グリカンの比が操作されうることを示唆している。ガラクトース末端ハイブリッドＮ−グリカンまたはガラクトース含有ハイブリッドＮ−グリカンの収率を増加させるためには、例えば、３つ全ての酵素活性を標的化するために同一分泌経路標的化リーダーペプチドを使用することにより、３つ全ての酵素活性をゴルジ装置の同一領域に標的化すべきである。あるいは、残りの２つの酵素が作用しうる前にＮ−グリカン基質に作用する可能性がより高いゴルジ装置内位置にＧａｌＴ活性を配置する融合タンパク質を特定するために、ＧａｌＴ−リーダーペプチド融合タンパク質のライブラリーをスクリーニングする。これは、ガラクトース末端複合Ｎ−グリカンまたはガラクトース含有複合Ｎ−グリカンに比べてガラクトース末端ハイブリッドＮ−グリカンまたはガラクトース含有ハイブリッドＮ−グリカンの収率を増加させる。逆に、ガラクトース末端ハイブリッドＮ−グリカンまたはガラクトース含有ハイブリッドＮ−グリカンの収率を減少させるためには、残りの２つの酵素活性で使用する分泌経路標的化リーダーペプチドとは異なる分泌経路標的化リーダーペプチドを使用して、ＧａｌＴ活性を局在化すべきである。これは、ガラクトース末端ハイブリッドＮ−グリカンまたはガラクトース含有ハイブリッドＮ−グリカンの収率に比べてガラクトース末端複合Ｎ−グリカンまたはガラクトース含有複合Ｎ−グリカンの収率が増加する宿主細胞を与えるＧａｌＴ−リーダーペプチド融合タンパク質の組合せを特定するためにＧａｌＴ−リーダーペプチド融合タンパク質ライブラリーをスクリーニングすることにより達成されうる。
該結果は更に、異種宿主系においてキメラグリコシル化酵素を発現させる場合に触媒ドメインと分泌経路局在化リーダーペプチドとの両方のライブラリーをスクリーニングすることの重要性を高めるものであり、これは、Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５０２２−５０２７（２００３）に既に例示されており米国特許第７，０２９，８７２号および第７，４４９，３０８号に記載されている概念である。全ゲノム配列、より精巧なＰＣＲおよびクローニング技術、ならびに質量分析のような、より高いハイスループットの分析技術が利用可能であれば、数百個、更には数千個の組合せのスクリーニングが可能である。重要なことに、このタイプの組合せスクリーニングは酵素活性の検出と逐次反応（それぞれは完了のためには従前産物に依存する）の駆動との間で相違することが判明している。ここで、ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼの場合、スクリーニングされた幾つかの酵素は、ＵＤＰ−ガラクトースのプールを産生する比較的等しい能力を有するようであったが、驚くべきことに同類酵母（エス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））由来の１つの不活性輸送体を含むこの異種宿主において、試験された４つのＵＤＰ−ガラクトース輸送体のうちの１つだけが活性であることが判明した。更に、数十個の分泌経路局在化リーダーペプチド（そのうちの多数は活性酵素の組合せを与えた）のスクリーニングから、二分岐末端ガラクトース（Ｇ２）を有する高度な均一性の複合Ｎ−グリカン（＞８５％）を与える３つが見出されたに過ぎなかった。高マンノースおよびハイブリッド中間構造体の減少は、治療用糖タンパク質の製造におけるそのような異種発現系の使用に関する重要な結果を与える。なぜなら、高マンノース構造は強免疫原性であることが示されており、最近の証拠は、ハイブリッドＮ−グリカンの過剰存在から肝毒性が生じうることを示唆しているからである。
例えば、米国公開出願第２００６／０２８６６３７号は、ガラクトースを含有する糖タンパク質を通常は産生しない宿主細胞においてガラクトース転移を達成するためには、以下の３つの条件が満たされなければならないことを教示している（１）ゴルジにおける内因性ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）の非存在：（２）ゴルジ内への内因性ＵＤＰ−Ｇａｌ輸送の非存在、および（３）低い内因性細胞質ゾルＵＤＰ−Ｇａｌプール。ＵＤＰ−Ｇａｌ輸送体の非存在下、Ｎ−グリカン上の末端ＧｌｃＮＡｃ残基へのガラクトースの転移は約５５〜６０％であった。ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼの非存在下、Ｎ−グリカン上の末端ＧｌｃＮＡｃ残基へのガラクトースの転移は約１０〜１５％であった。
ガラクトシル化Ｎ−グリカンを産生しうる宿主細胞を得るための前記修飾の全ては、ヒトにおいて典型的にはシアル酸化されている露出したＮ−グリカンを有するレポータータンパク質（ヒトプラスミノーゲンのＫ３ドメイン）を使用して行われ、米国公開出願第２００６００４０３５３号に報告されている。しかし、哺乳類細胞と比較されうる様態では、これらの糖操作酵母株は、抗体のＦｃグリカン上への部分的なガラクトース転移をもたらしたに過ぎず、末端ＧｌｃＮＡｃを有する複合Ｎ−グリカンに有利な１０％未満のＧ２構造および２５％未満のＧ１構造を含有するＮ−グリカンのプールを与えた。これは、抗体（ＩｇＧ Ｆｃ Ａｓｎ２９７）Ｎ−グリカンが末端ガラクトースの量の減少を伴う哺乳類細胞系に類似している。
Ｎ−グリカン上へのガラクトース残基の転移は活性化ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）のプールを要する。下等真核生物において内因性レベルを超えるそのようなプールを産生させるための１つの方法は、前記および米国公開出願第２００６／００４０３５３号に示されているＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼの発現である。もう１つの方法は本発明であり、これは前記細胞を含み、ここで、この場合、該宿主細胞を、少なくとも以下の３つのルロアール経路酵素をコードする核酸分子で形質転換する：ガラクトキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．６）、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．７．７．１２）およびＵＤＰ−ガラクトース４エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．２）。ガラクトキナーゼは、ガラクトース代謝の第１工程、すなわち、ガラクトース−１−リン酸へのガラクトースのリン酸化を触媒する酵素である。ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−グルコースおよびガラクトース−１−リン酸からＵＤＰ−ガラクトースおよびグルコース−１−リン酸への変換である、ガラクトース代謝の第２工程を触媒する。場合によっては、細胞膜ガラクトースパーミアーゼをコードする核酸分子が更に含まれうる。ガラクトースパーミアーゼは細胞膜ヘキソース輸送体であり、これは外部源からガラクトースを輸入する。ルロアール経路を図４に示す。
本明細書に示されているとおり、酵母外因性ガラクトースの供給と共に前記酵母内へのガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性をコードする遺伝子を該細胞内に導入し、抗体発現を誘導すると、該抗体のＦｃ Ｎ−グリカン上の末端ガラクトースのレベルが実質的に増加して、産生されるＧ２ Ｎ−グリカンの量が増加する。すなわち、該Ｎ−グリカンの５０％以上がＧ２である、ヒトＦｃ上のＮ−グリカンが入手可能となろう。該パーミアーゼは随意的なものである。なぜなら、細胞内の内因性パーミアーゼはガラクトースを細胞内に輸入しうることが判明しているからである。したがって、該ガラクトースパーミアーゼは、使用される場合には、細胞膜を越えてガラクトースを輸送しうる任意の細胞膜ヘキソース輸送体、例えばエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＡＬ２ガラクトースパーミアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ８１８７９を参照されたい）でありうる。該ガラクトキナーゼは、ガラクトース−１−リン酸へのガラクトースのリン酸化を触媒しうる任意の酵素、例えばエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＡＬ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ７６０７８を参照されたい）でありうる。該ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−グルコースおよびガラクトース−１−リン酸からＵＤＰ−ガラクトースおよびグルコース−１−リン酸への変換を触媒する任意の酵素、例えばエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ７（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ１２３４８を参照されたい）でありうる。該ＵＤＰ−ガラクトース４エピメラーゼは、ＵＤＰ−グルコースからＵＤＰ−ガラクトースへの変換を触媒する任意の酵素、例えばエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ１０（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００１１３４）、エス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）のＧＡＬＥ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００３４２３）およびヒトのｈＧＡＬＥ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ０００４０３を参照されたい）でありうる。該エピメラーゼは、該エピメラーゼの触媒ドメインがガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインに融合している融合タンパク質としても提供されうる（米国公開出願第ＵＳ２００６／００４０３５３号を参照されたい）。
ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内への前記ルロアール経路酵素の導入は、環境に優しいガラクトースを同化しうる組換え細胞を与えた。更に、前記のルロアール経路酵素が、ガラクトースを含有するＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる細胞内に導入されると、生じた組換え細胞は、そのように操作されていない細胞において産生される糖タンパク質より高いレベルのβ−１，４−ガラクトースを複合Ｎ−グリカン上に有する糖タンパク質を産生することが可能であった。したがって、これらの操作工程の組合せは、抗体およびＦｃ−融合タンパク質のような糖タンパク質のＮ−グリカンのグリコシル化の制御の増強のために特異的に糖操作され代謝的に操作された宿主細胞を与えた。したがって、これらの糖操作酵母細胞系は、Ｎ−グリカンのプロセッシングの制御を可能にしつつ、組換え抗体およびＦｃ融合タンパク質の効率的産生を可能にする。
発現ベクター
一般に、ガラクトキナーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼおよびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（および場合によってはガラクトースパーミアーゼ）は発現ベクターから発現カセットの成分として発現される。更に詳細な態様においては、該宿主細胞内には、関心のある組換えタンパク質をコードする発現ベクターが更に含まれ、特定の実施形態においては、これは更に、該宿主細胞からの該組換えタンパク質の分泌を促進する配列を含む。各ルロアール経路酵素および関心のある組換えタンパク質に関しては、それをコードする発現ベクターは少なくとも、該ルロアール経路酵素または組換えタンパク質をコードする核酸配列の発現に影響を及ぼす配列を含有する。この配列は、ルロアール経路酵素または組換えタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結されている。そのような発現ベクターは、複製起点、選択マーカー、転写または終結シグナル、動原体、自律複製配列などのような追加的な要素をも含有しうる。
本発明においては、関心のある組換えタンパク質および前記ルロアール経路酵素をそれぞれコードする核酸分子は、関心のある過剰発現組換えタンパク質および前記ルロアール経路酵素の、調節された発現を可能にするように、発現ベクター内に配置されうる。該組換えタンパク質および前記ルロアール経路酵素は同一発現ベクターにおいてコードされうるが、前記ルロアール経路酵素は、好ましくは、該組換えタンパク質をコードするベクターとは別の発現ベクターにおいてコードされる。前記ルロアール経路酵素および該組換えタンパク質をコードする核酸分子の、別々の発現ベクター内の配置は、産生される組換えタンパク質の量を増加させうる。
本明細書中で用いる発現ベクターは、複製可能または複製不可能な発現ベクターでありうる。複製可能な発現ベクターは、宿主細胞染色体ＤＮＡから独立して、あるいはそのようなベクターが宿主細胞染色体ＤＮＡ内に組込まれて、複製されうる。そのような発現ベクターは、宿主細胞染色体ＤＮＡ内に組込まれると、幾つかの構造要素を喪失しうるが、該組換えタンパク質または前記ルロアール経路酵素をコードする核酸分子、および該組換えタンパク質または前記ルロアール経路酵素の発現をもたらしうるセグメントを保有する。したがって、本発明の発現ベクターは、染色体に組込まれる又は染色体に組込まれない発現ベクターでありうる。
前記ルロアール経路酵素および該組換えタンパク質をコードする核酸分子の導入の後、該組換えタンパク質をコードする核酸の発現を誘導することにより、該組換えタンパク質が過剰発現される。もう１つの実施形態においては、構成的に又は誘導可能な様態で前記ルロアール経路酵素を発現する細胞系を樹立する。過剰発現させる組換えタンパク質をコードする発現ベクターをそのような細胞系内に導入して、該組換えタンパク質の産生を増加させる。特定の実施形態においては、該ルロアール経路酵素をコードする核酸分子は構成的プロモーターに機能的に連結されている。
発現ベクターが前記ルロアール経路酵素の発現または組換えタンパク質の過剰発現を可能にして、選択された宿主細胞型におけるそのような組換えタンパク質の分泌を促進する限り、本発現ベクターは、１つの宿主細胞型、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においては複製可能でありうるが、別の宿主細胞型、例えば真核宿主細胞においてはほとんど又は全く複製を受けないことが可能である。
本明細書に記載されている発現ベクターは、所望の遺伝子、すなわち、前記ルロアール経路酵素または組換えタンパク質をコードする遺伝子の制御発現のために操作されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む。そのようなベクターは、前記ルロアール経路酵素または組換えタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された核酸分子セグメントをもコードする。この文脈における機能的に連結されたは、そのようなセグメントが、前記ルロアール経路酵素または組換えタンパク質をコードする核酸分子の発現をもたらしうることを意味する。これらの核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、上流制御要素、転写因子またはリプレッサー結合部位、終結シグナル、および意図される宿主細胞における遺伝子発現を制御しうる他の要素を含む。好ましくは、該ベクターは、ベクター、バクテリオファージ、コスミドまたはウイルスである。
本発明の発現ベクターは酵母または哺乳類細胞において機能する。酵母ベクターには、酵母２μサークルおよびその誘導体、酵母自律的複製配列をコードする酵母ベクター、酵母ミニ染色体、任意の酵母組込みベクターなどが含まれうる。多数のタイプの酵母ベクターの包括的一覧がＰａｒｅｎｔら（Ｙｅａｓｔ １：８３−１３８（１９８５））に記載されている。
遺伝子産物の発現をもたらしうる要素または核酸配列には、プロモーター、エンハンサー要素、上流活性化配列、転写終結シグナルおよびポリアデニル化部位が含まれる。全てのそのようなプロモーターおよび転写調節要素が、単独で又は組合されて、本発現ベクターにおいて使用されると想定される。更に、遺伝的に操作された及び突然変異した調節配列も本発明において想定される。
プロモーターは、遺伝子発現を制御するためのＤＮＡ配列要素である。特に、プロモーターは転写開始部位を特定し、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーター要素を含みうる。選択されるプロモーターは、選択された個々の宿主系において機能しうると予想されるものである。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母宿主細胞が使用される場合には、酵母プロモーターが本発現ベクターにおいて使用されるが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）またはトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のような宿主細胞においては真菌プロモーターが使用されるであろう。酵母プロモーターの具体例には、ＧＡＰＤＨ、ＡＯＸ１、ＳＥＣ４、ＨＨ１、ＰＭＡ１、ＯＣＨ１、ＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＧＡＰ、ＴＰＩ、ＣＹＣ１、ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、ＣＵＰ１、ＭＦα１、ＦＬＤ１、ＰＭＡ１、ＰＤＩ、ＴＥＦおよびＧＵＴ１プロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｒｏｍａｎｏｓら（Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８（１９９２））は酵母プロモーターおよび発現ベクターの総説を記載している。Ｈａｒｔｎｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３６：ｅ７６（ｐｕｂ ｏｎ−ｌｉｎｅ ６ Ｊｕｎｅ ２００８）は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における異種タンパク質の微調整発現のためのプロモーターのライブラリーを記載している。
本明細書に開示されている核酸分子に機能的に連結されるプロモーターは構成的プロモーターまたは誘導プロモーターでありうる。誘導プロモーターは、転写因子の結合に際して、増加または減少した速度での転写を導くプロモーターである。本明細書中で用いる転写因子には、プロモーターの調節または制御領域に結合して転写に影響を及ぼしうる任意の因子が含まれる。宿主細胞における転写因子のプロモーター結合能または合成は、該宿主を誘導因子にさらす又は宿主細胞培地から誘導因子を除去することにより制御されうる。したがって、誘導プロモーターの発現を調節するためには、誘導因子を宿主細胞の増殖培地に加えるか又は該増殖培地から除去する。そのような誘導因子には、糖、ホスファート、アルコール、金属イオン、ホルモン、熱、寒冷などが含まれうる。例えば、酵母において一般的に用いられる誘導因子はグルコース、ガラクトースなどである。
選択される転写終結配列は、選択された個々の宿主細胞において機能しうるものである。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母宿主細胞が使用される場合には、酵母転写終結配列が本発現ベクターにおいて使用されるが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）またはトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のような宿主細胞においては真菌転写終結配列が使用されるであろう。転写終結配列には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列（ＳｃＣＹＣ ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３転写終結配列（ＡＬＧ３ ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ６転写終結配列（ＡＬＧ６ ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ１２転写終結配列（ＡＬＧ１２ ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１転写終結配列（ＡＯＸ１ ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１転写終結配列（ＯＣＨ１ ＴＴ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列（ＰＭＡ１ ＴＴ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の発現ベクターは選択マーカーをもコードしうる。選択マーカーは、該選択マーカーを含有するベクターで形質転換された細胞が非形質転換細胞から識別されうるように、同定可能な形質を宿主細胞に付与する遺伝的機能体である。また、該マーカーに連結された遺伝的機能体が宿主細胞集団において保有されることを保証するために、ベクター内への選択マーカーの導入が用いられうる。そのような選択マーカーは、いずれかの容易に同定される優性形質、例えば薬物耐性、細胞栄養素などを合成または代謝する能力などを付与しうる。
酵母選択マーカーは、薬物耐性マーカー、および必須細胞栄養素（例えば、アミノ酸）を酵母宿主細胞が合成するのを可能にする遺伝的機能体を含む。酵母において一般に使用される薬物耐性マーカーには、クロラムフェニコール、カナマイシン、メトトレキセート、Ｇ４１８（ゲネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））、ゼオシンなどが含まれる。酵母宿主細胞が必須細胞栄養素を合成するのを可能にする遺伝的機能体が、対応ゲノム機能における栄養要求性突然変異を有する利用可能な酵母株と共に使用される。一般的な酵母選択マーカーは、ロイシン（ＬＥＵ２）、トリプトファン（ＴＲＰ１およびＴＲＰ２）、ウラシル（ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＵＲＡ６）、ヒスチジン（ＨＩＳ３）、リシン（ＬＹＳ２）、アデニン（ＡＤＥ１またはＡＤＥ２）などを合成するための遺伝的機能を付与する。他の酵母選択マーカーには、亜ヒ酸塩の存在下で増殖される酵母に亜ヒ酸塩耐性を付与するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＡＲＲ３遺伝子が含まれる（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｙｅａｓｔ，１３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−３００６６（１９９７））。幾つかの適当な組込み部位は、米国公開出願第２００７／００７２２６２号に列挙されているものを含み、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の酵母または真菌に関して公知の遺伝子座に対するホモログを含む。酵母内にベクターを組込むための方法はよく知られている。例えば、ＷＯ２００７１３６８６５を参照されたい。
したがって、本発現ベクターは、培養内に存在する細胞集団内のベクター含有宿主細胞を特定し維持するのに有用な選択マーカーをコードしうる。幾つかの場合においては、選択マーカーは、発現ベクターのコピー数を増幅するためにも使用されうる。過剰発現または組換えタンパク質またはルロアール経路酵素をコードするＲＮＡを産生させるために本発現ベクターから転写を誘導した後、該ＲＮＡは細胞因子により翻訳されて該組換えタンパク質またはルロアール経路酵素を与える。
酵母および他の真核生物においては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳は、該ｍＲＮＡの５’キャップへのリボソーム結合、およびポリペプチド合成が開始されうる最初のＡＵＧ開始コドンへの該ｍＲＮＡに沿った該リボソームの移動により開始される。酵母および哺乳類細胞における発現は、原核生物発現系において要求されることがあるような、リボソーム結合部位と開始コドンとの間の特定の数のヌクレオチドを一般には要しない。しかし、酵母または哺乳類宿主細胞における発現の場合、ｍＲＮＡにおける最初のＡＵＧコドンは、好ましくは、所望の翻訳開始コドンである。
更に、酵母宿主細胞において発現が行われる場合、長い（例えば、５０〜１００ヌクレオチドより長い）非翻訳リーダー配列の存在は、ｍＲＮＡの翻訳を低減しうる。酵母ｍＲＮＡリーダー配列は約５０ヌクレオチドの平均長を有し、アデニンに富み、二次構造をほとんど有さず、ほぼ常に最初のＡＵＧを開始に利用する。これらの特徴を有さないリーダー配列はタンパク質翻訳の効率を低減しうるため、好ましくは、酵母リーダー配列が酵母宿主細胞における過剰発現遺伝子産物またはシャペロンタンパク質の発現に使用される。多数の酵母リーダー配列の配列が公知であり、例えばＣｉｇａｎら（Ｇｅｎｅ ５９：１−１８（１９８７））を参照して当業者に利用可能である。
得られる発現のレベルに影響を及ぼしうる要因には、プロモーター、リボソーム結合部位および開始コドンの位置に加えて、複製可能な発現ベクターのコピー数が含まれる。ベクターのコピー数は、一般に、該ベクターの複製起点およびそれに関連したいずれかのシス作用性制御要素により決定される。例えば、調節性動原体をコードする酵母エピソームベクターのコピー数の増加は、該動原体に接近して配置されたプロモーターからの転写を誘導することにより達成されうる。更に、酵母ベクターにおける酵母ＦＬＰ機能のコード化も該ベクターのコピー数を増加させうる。
入手可能なベクターからのＤＮＡ断片を組合せることにより、またはそのような調節要素をコードする核酸分子を合成することにより、または新たな調節要素を本ベクター内にクローニングし配置することにより、前記配列を含む発現ベクターを、当業者は容易に設計し製造することが可能である。発現ベクターの製造方法はよく知られている。過剰発現ＤＮＡ法は遺伝的操作に関する多数の標準的な実験マニュアルのいずれかにおいて見出される。
本発明の発現ベクターは、プロモーターおよび遺伝子発現を制御するために使用される他の配列要素に対して適切な配向で前記ルロアール経路酵素および組換えタンパク質のコード領域を連結することにより製造されうる。本発現ベクターの構築の後、そのようなベクターを、該過剰発現遺伝子産物および該ルロアール経路酵素が発現されうる宿主細胞内に形質転換する。酵母および他の下等真核細胞を発現ベクターで形質転換するための方法はよく知られており、当業者に容易に利用可能である。例えば、発現ベクターは、酢酸リチウム、スフェロプラスト、エレクトロポレーションおよび類似方法を含む幾つかの方法のいずれかにより、酵母細胞内に形質転換されうる。
宿主細胞
酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）は細胞培養に有用である。なぜなら、それらは高い細胞密度まで増殖可能であり、大量の組換えタンパク質を分泌可能だからである。同様に、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などが本発明の糖タンパク質を工業的規模で製造するために使用されうる。一般に、本発明における方法を実施するのに有用な下等真核生物には、ガラクトースを炭素源として通常は利用し得ない酵母および真菌が含まれる。ガラクトースを炭素源として利用し得ない酵母の具体例には、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属のメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、およびエス・クドリアブゼビイ（Ｓ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、シー・グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、ケイ・ワルチィ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）およびイー・ゴシッピィ（Ｅ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ）のような酵母が含まれるが、これらに限定されるものではない。酵母は糖タンパク質の発現に有用である。なぜなら、それらは経済的に培養され、高収率を与え、適切に修飾されると適切にグリコシル化されうるからである。酵母は特に、確立された遺伝学的特徴を示し、迅速な形質転換、試験されるタンパク質局在化法、および簡便な遺伝子ノックアウト技術を可能にする。適当なベクターは、所望により、発現制御配列、例えば３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を含むプロモーター、複製起点、終結配列などを有する。したがって、ガラクトースを炭素源として通常は利用し得ない前記宿主細胞は、ガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性（これらは、該宿主細胞がガラクトースを炭素源として利用することを可能にする）を発現するように遺伝的に操作される。
下等真核生物、特に酵母は、該グリコシル化パターンがヒト様である又はヒト化されている糖タンパク質をそれらが発現するように、遺伝的に修飾されうる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，米国公開出願第２００４／００１８５９０に記載されているとおり、選択された内因性グリコシル化酵素を排除し、および／または外因性酵素を供給することにより、それは達成されうる。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加する１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が喪失するよう選択され又は操作されうる。
１つの実施形態においては、本明細書に記載されているとおりに環境に優しいガラクトースを炭素源として同化するように遺伝的に操作された宿主細胞はまた、後記のとおりに複合Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作される。そのような宿主細胞は更にα１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを含み、これは、該α１，２−マンノシダーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した組換え糖タンパク質の移動は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質組成物を与える。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号ならびに米国公開特許出願第２００４／００１８５９０号および第２００５／０１７０４５２号は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。これらの宿主細胞は、本明細書に教示されているとおりにガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性を発現するように更に遺伝的に操作されている場合、ガラクトースを炭素源として利用することが可能である。
直前の宿主細胞は更にＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ Ｉ）触媒ドメインを含み、これは、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質組成物を与える。米国特許第７，０２９，８７２号ならびに米国公開特許出願第２００４／００１８５９０号および第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を得ることが可能である。これらの宿主細胞は、本明細書に教示されているとおりにガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性を発現するように更に遺伝的に操作されている場合、ガラクトースを炭素源として利用することが可能である。
また、直前の宿主細胞は更にマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを含み、これは、マンノシダーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質組成物を与える。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００４／０２３００４２号は、主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを有する糖タンパク質を産生しうる、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現する下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を得ることが可能である。これらの宿主細胞は、本明細書に教示されているとおりにガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性を発現するように更に遺伝的に操作されている場合、ガラクトースを炭素源として利用することが可能である。
また、直前の宿主細胞は更にＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ ＩＩ）触媒ドメインを含み、これは、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｇ０）グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質組成物を与える。米国特許第７，０２９，８７２号ならびに米国公開特許出願第２００４／００１８５９０号および第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を得ることが可能である。これらの宿主細胞は、本明細書に教示されているとおりにガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性を発現するように更に遺伝的に操作されている場合、ガラクトースを炭素源として利用することが可能である。
最後に、直前の宿主細胞は更にガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、これは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｇ１）またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｇ２）グリコフォームまたはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｇ１）グリコフォームまたはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｇ２）グリコフォームまたはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質組成物を与える。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００６／００４０３５３号は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をガラクトシダーゼでインビトロで処理して、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質組成物を得ることが可能である。これらの宿主細胞は、本明細書に教示されているとおりにガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性を発現するように更に遺伝的に操作されている場合、ガラクトースを炭素源として利用することが可能であり、前記ルロアール経路酵素を含むように遺伝的に操作されていない宿主細胞におけるものよりガラクトース含有Ｎ−グリカンの比率が大きい糖タンパク質を産生することが可能である。
もう１つの実施形態においては、本明細書に開示されているとおりにガラクトースを炭素源として同化しうる、ガラクトースを末端とする複合Ｎ−グリカンを産生する直前宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含むことが可能であり、これは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、主にＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質を与える。酵母および糸状菌のような下等真核宿主細胞の場合、該宿主細胞が更に、Ｎ−グリカンへの転移のためのＣＭＰ−シアル酸を供給する手段を含むことが有用である。米国公開特許出願第２００５／０２６０７２９号は、ＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するよう下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示しており、米国公開特許出願第２００６／０２８６６３７号は、シアル酸化糖タンパク質を産生するように下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示している。これらの宿主細胞は、本明細書に教示されているとおりにガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性を発現するように更に遺伝的に操作されている場合、ガラクトースを炭素源として利用することが可能であり、前記ルロアール経路酵素を含むように遺伝的に操作されていない宿主細胞におけるものよりガラクトース含有Ｎ−グリカンの比率が大きい糖タンパク質を産生することが可能である。
もう１つの実施形態においては、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する宿主細胞は更にガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、これは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、主にＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を与える。これらの宿主細胞は、本明細書に教示されているとおりにガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性を発現するように更に遺伝的に操作されている場合、ガラクトースを炭素源として利用することが可能である。
もう１つの実施形態においては、本明細書に開示されているとおりに炭素源としてガラクトースを同化しうる、ガラクトースを末端とするハイブリッドＮ−グリカンを産生しうる直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含むことが可能であり、これは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を与える。これらの宿主細胞は、本明細書に教示されているとおりにガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性を発現するように更に遺伝的に操作されている場合、ガラクトースを炭素源として利用することが可能である。
種々の前宿主細胞は更に、１以上の糖輸送体、例えばＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体）、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（例えば、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体）およびＣＭＰ−シアル酸輸送体（例えば、ヒトシアル酸輸送体）を含む。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は前記輸送体を欠いているため、下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌を、前記輸送体を含むように遺伝的に操作することが好ましい。
宿主細胞は更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４）（米国公開特許出願第２００６／０２１１０８５号を参照されたい）の１以上を欠失させ又は破壊することにより、α−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を排除するように、ならびにホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｂ（米国特許第７，１９８，９２１号および第７，２５９，００７号を参照されたい）の一方または両方を欠失させ又は破壊することにより、ホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を排除するように、遺伝的に操作された細胞を含み、これは、更に詳細な実施形態においては、ＭＮＮ４Ａ遺伝子の欠失または破壊をも含みうる。破壊は、特定の酵素のコードするオープンリーディングフレームの破壊、あるいは該オープンリーディングフレームの発現の破壊、あるいは干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用する、β−マンノシルトランスフェラーゼおよび／またはホスホマンノシルトランスフェラーゼの１以上をコードするＲＮＡの翻訳の阻害を含む。該宿主細胞は更に、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された前記宿主細胞のいずれかを含みうる。
宿主細胞は更に、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子）（ＰＭＴ）（米国特許第５，７１４，３７７号を参照されたい）の１以上を欠失させ又は破壊することにより糖タンパク質のＯ−グリコシル化を制御するように遺伝的に修飾された、あるいは公開国際出願番号ＷＯ２００７０６１６３１に開示されているとおりにＰｍｔｐインヒビターおよび／またはアルファ−マンノシダーゼの存在下で増殖された、あるいはそれらの両方に付された下等真核細胞（例えば酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））を含む。破壊は、Ｐｍｔｐをコードするオープンリーディングフレームの破壊、あるいは該オープンリーディングフレームの発現の破壊、あるいは干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用する、Ｐｍｔｐの１以上をコードするＲＮＡの翻訳の阻害を含む。該宿主細胞は更に、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された前記宿主細胞のいずれかを含みうる。
Ｐｍｔｐインヒビターには、ベンジリデンチアゾリジンジオンが含まれるが、これに限定されるものではない。使用されうるベンジリジンチアゾリジンジオンの具体例としては、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸：５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸；および５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸が挙げられる。
特定の実施形態においては、少なくとも１つの内因性ＰＭＴの機能または発現を低下させ、破壊し、または欠失させる。例えば、特定の実施形態においては、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの内因性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現を低下させ、破壊し、または欠失させ、あるいは該宿主細胞を１以上のＰＭＴインヒビターの存在下で培養する。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は１以上のＰＭＴ遺伝子の欠失または破壊を含み、該宿主細胞を１以上のＰｍｔｐインヒビターの存在下で培養する。これらの実施形態の特定の態様においては、該宿主細胞は分泌性アルファ−１，２−マンノシダーゼをも発現する。
ＰＭＴの欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐインヒビターは、Ｏ−グリコシル化の占拠を低下させることにより、すなわち、グリコシル化される糖タンパク質上のＯ−グリコシル化部位の総数を減少させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。該細胞により分泌されるアルファ−１，２−マンノシダーゼの更なる添加は、該糖タンパク質上に存在するＯ−グリカンのマンノース鎖長を減少させることによりＯ−グリコシル化を制御する。したがって、ＰＭＴの欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐインヒビターを分泌性アルファ−１，２−マンノシダーゼの発現と組合せることは、占拠および鎖長を減少させることによりＯ−グリコシル化を制御する。個々の状況においては、ＰＭＴの欠失または破壊、Ｐｍｔｐインヒビターおよびアルファ−１，２−マンノシダーゼの個々の組合せは実験的に決定される。なぜなら、個々の異種糖タンパク質（例えば、Ｆａｂおよび抗体）は様々な度合の効率で発現され、ゴルジ装置を介して輸送され、したがって、ＰＭＴの欠失もしくは破壊、Ｐｍｔｐインヒビターおよびアルファ−１，２−マンノシダーゼの個々の組合せを要しうるからである。もう１つの態様においては、１以上の内因性マンノシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が欠失される。この欠失は、選択されたアルファ−１，２−マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴインヒビターの供給と組合されることが可能であり、あるいは選択されたアルファ−１，２−マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴインヒビターの供給の代わりに行われうる。
したがって、Ｏ−グリコシル化の制御は、より良好な通算収率または適切に構築された糖タンパク質の収率で本明細書に開示されている宿主細胞において特定の糖タンパク質を産生させるのに有用でありうる。Ｏ−グリコシル化の軽減または排除は、全抗体およびＦａｂフラグメントの構築および輸送に対して有益な効果を及ぼすらしい。なぜなら、それらは分泌経路を通過し、細胞表面に輸送されるからである。したがって、Ｏ−グリコシル化が制御された細胞においては、適切に構築された抗体またはＦａｂフラグメントの収率は、Ｏ−グリコシル化が制御されていない宿主細胞で得られる収率に比べて増加する。
したがって、糖タンパク質上の主要Ｎ−グリカンがＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（これらに限定されるものではない）を含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に修飾された宿主細胞が想定される。前記Ｎ−グリカンの特定の混合物を含有する糖タンパク質を産生する宿主細胞が更に含まれる。
本発明における宿主細胞および方法は、多種多様な組換えタンパク質および糖タンパク質を製造するのに有用である。本明細書に開示されている宿主細胞において産生されうる組換えタンパク質および糖タンパク質の具体例には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンωならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；ＧＭ−ＣＳＦ；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；および尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；ならびにＩＬ−２受容体アゴニストが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本明細書に開示されている本発明の組換え宿主細胞は、ガラクトース含有Ｎ−グリカンの比率が、本明細書に教示されているとおりに修飾される前の宿主細胞において入手可能なガラクトースの比率に比べて増加している抗体組成物を得ることが望ましい場合の抗体、Ｆｃ融合タンパク質などの製造に特に有用である。一般に、該宿主細胞は、Ｇ０：Ｇ１／Ｇ２グリコフォームの比が２：１未満である抗体組成物が製造されることを可能にする。２：１未満のＧ０：Ｇ１／Ｇ２の比を有する本発明における宿主細胞において製造されうる抗体の具体例には、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、重鎖抗体（例えば、ラクダまたはラマ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。具体的な抗体には、それらの一般名（標的）として列挙される以下の抗体が含まれるが、それらに限定されるものではない：ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体抗体）、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ４１ ７Ｅ３抗体）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２０抗体）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２５抗体）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２５抗体）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）（抗ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）抗体）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＴＮＦα抗体）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（抗Ｈｅｒ２抗体）、ゲムツズマブ オゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）（抗ＣＤ３３抗体）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ５２抗体）、イブリツモマブチウキセテン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔｅｎ）（抗ＣＤ２０抗体）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＮＦα抗体）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩｇＥ抗体）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）−１３１Ｉ（抗ＣＤ２０抗体のヨウ素化誘導体）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ１１ａ抗体）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＥＧＦ受容体抗体）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＮＦα抗体）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体）およびそれらの変異体。本明細書に開示されている宿主細胞において製造されうるＦｃ−融合タンパク質の具体例には、エタンセルセプト（ｅｔａｎｃｅｒｃｅｐｔ）（ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質）、ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質、ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質、ＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質、グルカゴン−Ｆｃ融合体、オキシントモジュリン（ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ）−Ｆｃ−融合体、ならびにそれらの類似体および変異体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本明細書に開示されている組換え細胞は、異種ペプチドまたは薬物分子に化学的にコンジュゲートするのに適した抗体およびＦｃフラグメントを製造するために使用されうる。例えば、ＷＯ２００５０４７３３４、ＷＯ２００５０４７３３６、ＷＯ２００５０４７３３７およびＷＯ２００６１０７１２４は、Ｆｃフラグメントにペプチドまたは薬物分子を化学的にコンジュゲートすることを開示している。ＥＰ １１８０１２１、ＥＰ １１０５４０９およびＵＳ６５９３２９５は、全抗体を含む血液成分にペプチドなどを化学的にコンジュゲートすることを開示している。
本明細書に教示されているとおりにルロアール経路酵素の種々の組合せをコードする宿主細胞および／またはプラスミドベクターは、異種タンパク質を発現する組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を製造するための選択系を提供するキットとして提供されうる。該ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞は、ガラクトキナーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼおよびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼからなる群から選択されるルロアール経路酵素を１以上を発現するように遺伝的に操作される。場合によっては、該宿主細胞はガラクトースパーミアーゼをも発現しうる。該クローニングベクターは、ルロアール経路酵素または提供される宿主細胞に存在しない酵素をコードする発現カセットおよび複数のクローニング部位を含む。該ベクターは更に、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において機能的なプロモーター、および前記の複数のクローニング部位に隣接した転写終結配列を含むことが可能であり、宿主細胞ゲノム内の特定の位置に該ベクターを標的化するための標的化配列を更に含むことが可能である。幾つかの実施形態においては、該キットは、全３個のルロアール経路酵素（ガラクトキナーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼおよびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ）をコードし複数のクローニング部位を含むベクター、およびそれらの３つのルロアール経路酵素を欠く宿主細胞を提供する。該キットは更に、説明、ベクター地図などを含むであろう。
図１はヒトおよびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＮ−グリコシル化経路を示す。同じコア構造Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ８Ｂ）を与える、グルコシダーゼＩおよびＩＩによる３つのグルコース残基の除去ならびにＥＲマンノシダーゼによる単一の特異的α−１，２−結合マンノース残基の除去を含むＥＲにおける初期事象は、高度に保存されている。しかし、プロセッシング事象はゴルジにおいて分岐する。Ｍｎｓ，α−１，２−マンノシダーゼ；ＭｎｓＩＩ，マンノシダーゼＩＩ；ＧｎＴ Ｉ，α−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ；ＧｎＴ ＩＩ，α−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ；ＭｎＴ，マンノシルトランスフェラーゼ。２つのコアＧｌｃＮＡｃ残基は、全ての場合において存在するものの、命名においては省略されている。 図２は、Ｎ−グリコシル化における鍵中間工程、ならびにそれぞれのグリカン構造（ＧＳ）を産生する遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を指す短縮された名称を示す。 図３はＮ−グリコシダーゼＦ遊離Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＭＳ）分析を示す。Ｋ３（ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン）をピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＧＳ１１５由来野生型対照（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＹＳＨ４４、ＹＳＨ７１、ＲＤＰ５２およびＲＤＰ８０において産生させ、Ｎｉ−アフィニティクロマトグラフィーにより培養上清から精製した。Ｎ−グリカンをＮ−グリコシダーゼＦ処理により遊離させ、ナトリウムまたはカリウム付加体として出現するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析（ネガティモードである図３Ｇ以外はポジティブモード）に付した。２つのコアＧｌｃＮＡｃ残基は、存在するものの、名称においては省略されている。ＧＮ，ＧｌｃＮＡｃ；Ｍ，マンノース。図３Ａ：ＧＳ１１５由来野生型対照株において産生されたＮ−グリカン。図３Ｂ：株ＹＳＨ４４におけるＫ３上で産生されたＮ−グリカン。図３Ｃ：株ＹＳＨ７１（ｈＧａｌＴＩを発現するＹＳＨ４４）におけるＫ３上で産生されたＮ−グリカン。図（３Ｄ）：株ＲＤＰ５２（ｈＧａｌＴＩおよびＳｐＧＡＬＥを発現するＹＳＨ４４）におけるＫ３上で産生されたＮ−グリカン。図（３Ｅ）：株ＲＤＰ８０（ｈＧａｌＴＩ、ＳｐＧＡＬＥおよびＤｍＵＧＴを発現するＹＳＨ４４）におけるＫ３上で産生されたＮ−グリカン。図（３Ｆ）；インビトロでのα−ガラクトシダーゼ処理後のＲＤＰ８０からのグリカン。図（３Ｇ）：α−２，６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼでの処理後のネガティブモードにおけるＲＤＰ８０からのグリカン。 図３はＮ−グリコシダーゼＦ遊離Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＭＳ）分析を示す。Ｋ３（ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン）をピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＧＳ１１５由来野生型対照（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＹＳＨ４４、ＹＳＨ７１、ＲＤＰ５２およびＲＤＰ８０において産生させ、Ｎｉ−アフィニティクロマトグラフィーにより培養上清から精製した。Ｎ−グリカンをＮ−グリコシダーゼＦ処理により遊離させ、ナトリウムまたはカリウム付加体として出現するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析（ネガティモードである図３Ｇ以外はポジティブモード）に付した。２つのコアＧｌｃＮＡｃ残基は、存在するものの、名称においては省略されている。ＧＮ，ＧｌｃＮＡｃ；Ｍ，マンノース。図３Ａ：ＧＳ１１５由来野生型対照株において産生されたＮ−グリカン。図３Ｂ：株ＹＳＨ４４におけるＫ３上で産生されたＮ−グリカン。図３Ｃ：株ＹＳＨ７１（ｈＧａｌＴＩを発現するＹＳＨ４４）におけるＫ３上で産生されたＮ−グリカン。図（３Ｄ）：株ＲＤＰ５２（ｈＧａｌＴＩおよびＳｐＧＡＬＥを発現するＹＳＨ４４）におけるＫ３上で産生されたＮ−グリカン。図（３Ｅ）：株ＲＤＰ８０（ｈＧａｌＴＩ、ＳｐＧＡＬＥおよびＤｍＵＧＴを発現するＹＳＨ４４）におけるＫ３上で産生されたＮ−グリカン。図（３Ｆ）；インビトロでのα−ガラクトシダーゼ処理後のＲＤＰ８０からのグリカン。図（３Ｇ）：α−２，６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼでの処理後のネガティブモードにおけるＲＤＰ８０からのグリカン。 図４はルロアール（Ｌｅｌｏｉｒ）ガラクトース利用経路を示す。細胞外ガラクトースはガラクトースパーミアーゼにより輸入される。酵素ガラクトキナーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼおよびＵＤＰ−ガラクトースＣ４−エピメラーゼの作用により、ガラクトースはグルコース−６−リン酸に変換される。エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のタンパク質名が括弧内に示されている。 図５はピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）糖操作株ＹＧＬＹ５７８−１の構築を示す。ゴルジグリコシルトランスフェラーゼをコードするピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）遺伝子ＯＣＨ１、ＭＮＮ４、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４Ｌ１およびＢＭＴ２をノックアウトし、ついで、分泌性ｈＫ３の発現カセットを含む１２個の異種遺伝子をノックインした。ＹＧＬＹ５７８−１は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる。ＣＳ：抗選択。 図６はプラスミドｐＲＣＤ９７７ｂの特性図を示す。このプラスミドは、選択マーカーとしてＰｐＨＩＳ１遺伝子を使用して、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子内に組込まれ該遺伝子を欠失させるａｒｇ１：：ＨＩＳ１ノックアウトプラスミドであり、完全長ディー・メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ゴルジＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＤｍＵＧＴ）、完全長エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＳｃＧＡＬ１）、完全長エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ＳｃＧＡＬ７）およびエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトースパーミアーゼ（ＳｃＧＡＬ２）をそれぞれＰｐＯＣＨ１、ＰｐＧＡＰＤＨ、ＰｐＰＭＡ１およびＰｐＴＥＦプロモーターの制御下でコードする発現カセットを含有する。ＴＴは転写終結配列を意味する。 図７は、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ１、ＧＡＬ２およびＧＡＬ７遺伝子を発現する糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株は唯一の炭素源としてのガラクトース上で増殖可能であり、一方、親株は増殖できないことを示す。ＳｃＧＡＬ１０およびｈＧａｌＴＩβを発現する糖操作株ＹＧＬＹ５７８−１を、ＳｃＧＡＬ１、ＳｃＧＡＬ７およびＳｃＧＡＬ２をコードする発現カセットを含有するプラスミドｐＲＣＤ９７７ｂで形質転換した。酵母窒素塩基、ビオチンを含有し、炭素源としての３％ ガラクトースまたは２％ グルコースを含有する又はそのいずれをも含有しない規定培地上で、株を培養した。 図８はピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）糖操作株ＹＧＬＹ３１７−３６の構築を示す。５つの酵母グリコシルトランスフェラーゼのノックアウトにより、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＹＧＬＹ１６−３を作製した。８つの異種遺伝子の、後続のノックインは、ヒトＮ−グリカンＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を分泌性タンパク質に転移しうる株であるＲＤＰ６９６−２を与えた。ＣＳＴＲ培養による強固（ｒｏｂｕｓｔ）なクローンの選択、および分泌性ヒトＦｃを発現するプラスミドの導入は、株ＹＧＬＹ３１７−３６を与えた。ＣＳ，抗選択。 図９はプラスミドｐＧＬＹ９５４の特性図を示す。このプラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ１遺伝子座内に、該遺伝子を欠失させることなく組込まれるＫＩＮＫＯプラスミドである。該プラスミドは、完全長エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＳｃＧＡＬ１）および完全長エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ＳｃＧＡＬ７）をそれぞれＰｐＨＨＴ１およびＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下でコードする発現カセットを含有する。該プラスミドはまた、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にヒトガラクトシルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインのＮ末端に融合したＳｃＭｎｔＩ（ＳｃＫｒｅ２）リーダーペプチド（３３）を含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＣＯｈＧａｌＴＩ）をコードする発現カセットを含有する。ＴＴは転写終結配列を意味する。 図１０は、ＢＭＭＹ培地のみにおいて又はグルコースもしくはガラクトースを含有する培地において誘導された株ＰＢＰ３１７−３６およびＲＤＰ７８３において産生されたヒトＦｃフラグメント上のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を示す。飽和種培養から株を１ＯＤまで接種し、８００ｍＬのＢＭＧＹ内で７２時間培養し、ついで分割し、培養ブロスの１００ｍＬアリコートを遠心分離し、２５ｍＬのＢＭＭＹ、２５ｍＬのＢＭＭＹ＋０．５％ グルコースまたは２５ｍＬのＢＭＭＹ＋０．５％ ガラクトースにおいて２４時間誘導した。プロテインＡ精製タンパク質をプロテインＮ−グリコシダーゼＦ消化に付し、遊離したＮ−グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。図Ａ〜Ｃ，株ＰＢＰ３１７−３６において産生されたヒトＦｃ上のＮ−グリカン；図Ｄ〜Ｅ，株ＲＤＰ７８３において産生されたヒトＦｃ上のＮ−グリカン。 図１１はピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）糖操作株ＹＤＸ４７７の構築を示す。５つの酵母グリコシルトランスフェラーゼのノックアウトにより、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ１６−３（Δｏｃｈ１、Δｐｎｏ１、Δｂｍｔ２、Δｍｎｎ４ａ、Δｍｎｎ４ｂ）を作製した。８つの異種遺伝子の、後続のノックインは、ヒトＮ−グリカンＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を分泌性タンパク質に転移しうる株であるＲＤＰ６９７−１を与えた。分泌性抗体を発現するプラスミド、およびトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＭＮＳ１の分泌形態を発現するプラスミドの導入は、株ＹＤＸ４７７を与えた。ＣＳ，抗選択。 図１２はプラスミドｐＧＬＹ１４１８の特性図を示す。このプラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ１遺伝子座内に、該遺伝子を欠失させることなく組込まれるＫＩＮＫＯプラスミドである。該プラスミドは、完全長ＳｃＧＡＬ１およびＳｃＧＡＬ７をそれぞれＰｐＨＨＴ１およびＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下でコードする発現カセットを含有する。該プラスミドはまた、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にヒトガラクトシルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインのＮ末端に融合したＳｃＭｎｔＩ（ＳｃＫｒｅ２）リーダーペプチドを含む分泌経路標的化融合タンパク質（ｈＧａｌＴＩ）をコードする発現カセットを含有する。ＴＴは転写終結配列を意味する。 図１３Ａ〜Ｆは、ＢＭＭＹ培地のみにおいて又はガラクトースを含有する培地において誘導された株ＹＤＸ４７７およびＲＤＰ９６８−１において産生された抗Ｈｅｒ２抗体上のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を示す。株を１５０ｍＬのＢＭＧＹ内で７２時間培養し、ついで分割し、培養ブロスの５０ｍＬアリコートを遠心分離し、２５ｍＬのＢＭＭＹ、２５ｍＬのＢＭＭＹ＋０．１％ ガラクトースまたは２５ｍＬのＢＭＭＹ＋０．５％ ガラクトースにおいて２４時間誘導した。プロテインＡ精製タンパク質をプロテインＮ−グリコシダーゼＦ消化に付し、遊離したＮ−グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。図１３Ａ〜Ｃ，株ＹＤＸ４７７において産生された抗体上のＮ−グリカン；図１３Ｄ〜Ｆ，株ＲＤＰ９６８−１において産生された抗体上のＮ−グリカン。 図１３Ａ〜Ｆは、ＢＭＭＹ培地のみにおいて又はガラクトースを含有する培地において誘導された株ＹＤＸ４７７およびＲＤＰ９６８−１において産生された抗Ｈｅｒ２抗体上のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を示す。株を１５０ｍＬのＢＭＧＹ内で７２時間培養し、ついで分割し、培養ブロスの５０ｍＬアリコートを遠心分離し、２５ｍＬのＢＭＭＹ、２５ｍＬのＢＭＭＹ＋０．１％ ガラクトースまたは２５ｍＬのＢＭＭＹ＋０．５％ ガラクトースにおいて２４時間誘導した。プロテインＡ精製タンパク質をプロテインＮ−グリコシダーゼＦ消化に付し、遊離したＮ−グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。図１３Ａ〜Ｃ，株ＹＤＸ４７７において産生された抗体上のＮ−グリカン；図１３Ｄ〜Ｆ，株ＲＤＰ９６８−１において産生された抗体上のＮ−グリカン。 図１３Ａ〜Ｆは、ＢＭＭＹ培地のみにおいて又はガラクトースを含有する培地において誘導された株ＹＤＸ４７７およびＲＤＰ９６８−１において産生された抗Ｈｅｒ２抗体上のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を示す。株を１５０ｍＬのＢＭＧＹ内で７２時間培養し、ついで分割し、培養ブロスの５０ｍＬアリコートを遠心分離し、２５ｍＬのＢＭＭＹ、２５ｍＬのＢＭＭＹ＋０．１％ ガラクトースまたは２５ｍＬのＢＭＭＹ＋０．５％ ガラクトースにおいて２４時間誘導した。プロテインＡ精製タンパク質をプロテインＮ−グリコシダーゼＦ消化に付し、遊離したＮ−グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。図１３Ａ〜Ｃ，株ＹＤＸ４７７において産生された抗体上のＮ−グリカン；図１３Ｄ〜Ｆ，株ＲＤＰ９６８−１において産生された抗体上のＮ−グリカン。 図１３Ａ〜Ｆは、ＢＭＭＹ培地のみにおいて又はガラクトースを含有する培地において誘導された株ＹＤＸ４７７およびＲＤＰ９６８−１において産生された抗Ｈｅｒ２抗体上のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を示す。株を１５０ｍＬのＢＭＧＹ内で７２時間培養し、ついで分割し、培養ブロスの５０ｍＬアリコートを遠心分離し、２５ｍＬのＢＭＭＹ、２５ｍＬのＢＭＭＹ＋０．１％ ガラクトースまたは２５ｍＬのＢＭＭＹ＋０．５％ ガラクトースにおいて２４時間誘導した。プロテインＡ精製タンパク質をプロテインＮ−グリコシダーゼＦ消化に付し、遊離したＮ−グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。図１３Ａ〜Ｃ，株ＹＤＸ４７７において産生された抗体上のＮ−グリカン；図１３Ｄ〜Ｆ，株ＲＤＰ９６８−１において産生された抗体上のＮ−グリカン。 図１４はプラスミドｐＡＳ２４の特性図を示す。このプラスミドは、ＰｐＵＲＡ３選択マーカーを含有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｂｍｔ２ノックアウトプラスミドであり、ＰｐＯＣＨ１プロモーターの制御下に完全長マウスゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（ＭｍＳＬＣ３５Ａ３）をコードする発現カセットを含有する。ＴＴは転写終結配列を意味する。 図１５はプラスミドｐＲＣＤ７４２ｂの特性図を示す。このプラスミドは、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にマウスマンノシダーゼＩ触媒ドメインにＮ末端に融合したＳｃＳｅｃ１２リーダーペプチドを含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＦＢ８ ＭａｎｎＩ）をコードする発現カセット、ＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下にヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ Ｉ）触媒ドメインのＮ末端に融合したＰｐＳｅｃ１２リーダーペプチドを含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＣＯＮＡ１０）をコードする発現カセットおよびＰｐＳＥＣ４プロモーターの制御下にマウスゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（ＭｍＳＬＣ３５Ａ３）をコードする完全長遺伝子ならびにＰｐＵＲＡ５選択マーカーを含有する。ＴＴは転写終結配列を意味する。 図１６はプラスミドｐＤＭＧ４７の特性図を示す。該プラスミドは、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩの触媒ドメインのＮ末端に融合したＳｃＭｎｎ２リーダーペプチドを含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＫＤ５３）をコードする発現カセットを含む。該プラスミドはまた、ＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下にラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ ＩＩ）の触媒ドメインのＮ末端に融合したＳｃＭｎｎ２リーダーペプチドを含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＴＣ５４）をコードする発現カセットを含有する。ＴＴは転写終結配列を意味する。 図１７はプラスミドｐＲＣＤ８２３ｂの特性図を示す。このプラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ４遺伝子座内に、該遺伝子を欠失させることなく組込まれるＫＩＮＫＯプラスミドであり、ＰｐＵＲＡ５選択マーカーを含有する。該プラスミドは、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ ＩＩ）触媒ドメインのＮ末端に融合したＳｃＭｎｎ２リーダーペプチドを含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＴＡ５４）をコードする発現カセット、ならびにそれぞれＰｐＯＣＨ１およびＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下に完全長ディー・マラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ゴルジＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＤｍＵＧＴ）およびエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＵＤＰ−ガラクトースＣ４−エピメラーゼ（ＳｃＧＡＬ１０）をコードする発現カセットを含む。ＴＴは転写終結配列を意味する。 図１８はプラスミドｐＧＬＹ８９３ａの特性図を示す。このプラスミドは、ＰｐＡＲＧ４選択マーカーを含有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｈｉｓ１ノックアウトプラスミドである。該プラスミドは、ＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下にドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインのＮ末端に融合したＰｐＳＥＣ１２リーダーペプチドを含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＫＤ１０）をコードする発現カセット、ＰｐＴＥＦプロモーターの制御下にラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ ＩＩ）触媒ドメインのＮ末端に融合したＳｃＭｎｔ１（ＳｃＫｒｅ２）リーダーペプチドを含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＴＡ３３）をコードする発現カセット、およびＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にヒトガラクトシルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインのＮ末端に融合したＳｃＭｎｎ２リーダーペプチドを含む分泌経路標的化融合タンパク質をコードする発現カセットを含有する。ＴＴは転写終結配列を意味する。 図１９はプラスミドｐＲＣＤ７４２ａの特性図を示す。このプラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ１遺伝子座内に、該遺伝子を欠失させることなく組込まれるＫＩＮＫＯプラスミドであり、ＰｐＵＲＡ５選択マーカーを含有する。該プラスミドは、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にマウスマンノシダーゼＩ触媒ドメインのＮ末端に融合したＳｃＳＥＣ１２リーダーペプチドを含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＦＢ８ ＭａｎｎＩ）をコードする発現カセット、ＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下にヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ Ｉ）触媒ドメインのＮ末端に融合したＰｐＳＥＣ１２リーダーペプチドを含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＣＯＮＡ１０）をコードする発現カセット、およびＰｐＳＥＣ４プロモーターの制御下に完全長マウスゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（ＭｍＳＬＣ３５Ａ３）をコードする発現カセットを含む。ＴＴは転写終結配列を意味する。 図２０はプラスミドｐＲＣＤ１００６の特性図を示す。このプラスミドは、選択マーカーとしてＰｐＵＲＡ５遺伝子を含有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｈｉｓ１ノックアウトプラスミドである。該プラスミドは、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にヒトガラクトシルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインのＮ末端に融合したＳｃＭｎｔ１（ＳｃＫｒｅ２）リーダーペプチドを含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＸＢ３３）をコードする発現カセット、ならびにそれぞれＰｐＯＣＨ１およびＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下に完全長ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ゴルジＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＤｍＵＧＴ）およびエス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ＵＤＰ−ガラクトースＣ４−エピメラーゼ（ＳｐＧＡＬＥ）をコードする発現カセットを含有する。ＴＴは転写終結配列を意味する。 図２１はプラスミドｐＧＬＹ１６７ｂの特性図を示す。該プラスミドは、ＰｐＵＲＡ３選択マーカーを含有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ａｒｇ１ノックアウトプラスミドであり、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインのＮ末端に融合したＳｃＭＮＮ２リーダーペプチドを含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＣＯ−ＫＤ５３）をコードする発現カセット、およびＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下にラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ ＩＩ）触媒ドメインのＮ末端に融合したＳｃＭｎｎ２リーダーペプチドを含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＣＯ−ＴＣ５４）をコードする発現カセットを含有する。ＴＴは転写終結配列を意味する。 図２２はプラスミドｐＢＫ１３８の特性図を示す。該プラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター内に、該プロモーターを重複させて組込まれるロールインプラスミドである。該プラスミドは、ヒトＦｃ抗体フラグメント（ヒトＩｇＧ１ Ｈ鎖のＣ末端の２３３アミノ酸）のＮ末端に融合したエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ交配因子プレシグナル配列を含む融合タンパク質をコードする発現カセットを含有する。ＴＴは転写終結配列を意味する。 図２３はプラスミドｐＧＬＹ５１０の特性図を示す。該プラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ２遺伝子内に、該遺伝子を重複させて組込まれるロールインプラスミドであり、ＡＯＸ１プロモーター−ＳｃＣＹＣ１ターミネーター発現カセットおよびＰｐＡＲＧ１選択マーカーを含有する。ＴＴは転写終結配列を意味する。 図２４はプラスミドｐＤＸ４５９−１の特性図である。該プラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ２プロモーターを標的化しそれに組込まれるロールインプラスミドであり、該プロモーターを重複させてＺｅｏＲを含有する。該プラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターの制御下、それぞれがＮ末端においてアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）アルファ−アミラーゼシグナル配列に融合している抗ＨＥＲ２抗体重鎖および抗ＨＥＲ２抗体軽鎖をコードする別々の発現カセットを含有する。ＴＴは転写終結配列を意味する。 図２５はプラスミドｐＧＬＹ１１３８の特性図を示す。このプラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ１遺伝子座内に、該遺伝子を重複して組込まれるロールインプラスミドであり、アルセニット耐性を付与するＳｃＡＲＲ３選択マーカー遺伝子、およびＰｐＡＯＸ１プロモーターの制御下にエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ交配因子プレシグナル配列にＮ末端において融合したＭＮＳ１触媒ドメインを含む分泌性トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＭＮＳ１をコードする発現カセットを含有する。ＴＴは転写終結配列を意味する。
以下の実施例は、本発明の更なる理解を促すことを意図したものである。
この実施例においては、Ｄａｖｉｄｓｏｎらの米国公開出願第２００６／００４０３５３号に開示されている方法に概ね従って、ガラクトース含有Ｎ−グリカンを産生しうるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を構築した。ここにおける方法は、炭素源としてガラクトースを通常は利用し得ない他の種の組換え宿主細胞を、唯一の炭素源としてガラクトースを利用しうる組換え宿主細胞にするために使用されうる。
ガラクトシルトランスフェラーゼＩキメラ酵素
ＰＣＲプライマーＲＣＤ１９２（５’−ＧＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣＣＡＡＣ−３’（配列番号１））およびＲＣＤ１８６（５’−ＣＴＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣＣＡＣＴＧＴ−３’（配列番号２））を使用して、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩ遺伝子（ｈＧａｌＴＩ、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００３５７５）をヒト腎ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、配列決定した。このクローンから、以下の３つの目的のためにＰＣＲオーバーラップ突然変異誘発を行った：１）野生型タンパク質配列を維持しながらオープンリーディングフレーム内のＮｏｔＩ部位を除去する；２）触媒ドメインのみを得るために内因性膜貫通ドメインの直下流のタンパク質をトランケート化する；ならびに３）モジュラークローニングのためにそれぞれ５’および３’末端にＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位を導入する。これを行うために、ＰＣＲプライマーＲＣＤ１９８（５’−ＣＴＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣ−３’（配列番号３））およびＲＣＤ２０１（５’−ＧＧＧＧＣＡＴＡＴＣＴＧＣＣＧＣＣＣＡＴＣ−３’（配列番号４））を使用して該ＮｏｔＩ部位までの該遺伝子の５’末端をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲプライマーＲＣＤ２００（５’−ＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＧＡＴＡＴＧＣＣＣＣ−３’（配列番号５））およびＲＣＤ１９９（５’−ＣＴＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣＣＡＣ−３’（配列番号６））で３’末端をＰＣＲ増幅した。ＮｏｔＩ部位を排除する一方で、野生型アミノ酸配列を有するガラクトシルトランスフェラーゼをコードするトランケート化オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を再合成するために、それらの産物をプライマーＲＣＤ１９８およびＲＣＤ１９９で互いにオーバーラップさせた。新たなｈＧａｌＴＩβ ＰＣＲ触媒ドメイン産物をｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローニングし、配列決定した。導入されたＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位をそれらの認識制限酵素で切断し、該ＤＮＡ断片をＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの下流のプラスミドｐＲＣＤ２５９内にサブクローニングしてｐＲＣＤ２６０を得た。ｈＧａｌＴＩ４３触媒ドメイン（最初の４３アミノ酸を欠く；配列番号５０）をコードするヌクレオチド配列を配列番号４９に示す。
ついで、ゴルジ内の種々の位置にタンパク質を標的化するエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピー・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびケイ・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）由来の酵母リーダー配列のライブラリーをこのベクター内のＮｏｔＩ部位とＡｓｃＩ部位との間に連結して、ｈＧａｌＴＩβ４３触媒ドメインをコードするオープンリーディングフレームにこれらのリーダーコード配列をインフレームで融合させた。ＧａｌＴ融合タンパク質の前記組合せライブラリーをＹＳＨ４４において発現させ、各形質転換体からの精製Ｋ３からＮ−グリカンを遊離させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによりそれらのそれぞれの分子量を決定することにより、得られた形質転換体を分析した。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＳＨ４４は、分枝末端ＧｌｃＮＡｃ残基を有する実質的に均一な複合グリコフォーム（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、図１を参照されたい）としてヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）を発現する。該活性構築物の１つはＭｎｎ２−ｈＧａｌＴＩβ４３であり、これは、ｈＧａｌＴＩβ４３触媒ドメイン（アミノ酸４４−３９８；配列番号５０）のＮ末端に融合したエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｍｎｎ２標的化ペプチド（アミノ酸１−３６（５３） 配列番号２０）のＮ末端を含む融合タンパク質をコードするものであった。該リーダー配列はエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２遺伝子の最初の１０８ｂｐを含有しており、プラスミドｐＸＢ５３を作製するためにｐＲＣＤ２６０のＮｏｔＩ部位とＡｓｃＩ部位との間に挿入されていたのはこの配列であった。プラスミドｐＸＢ５３をＸｂａＩで線状化し、酵母株ＹＳＨ４４内に形質転換して株ＹＳＨ７１を得た。株ＹＳＨ４４は米国公開出願第２００７００３７２４８号、第２００６００４０３５３号、第２００５０２０８６１７号および２００４０２３００４２号に記載されており、株ＹＳＨ７１は米国公開出願第２００６００４０３５３号に記載されている。
図３Ｃに示すとおり、株ＹＳＨ７１により産生されたＮ−グリカンの僅かな部分（約１０％）は、ＧｌｃＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｇ１）Ｎ−グリカンを得るためのＫ３上のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｇ０）Ｎ−グリカン基質への単一のガラクトース糖の付加に合致する質量のものであり、該Ｎ−グリカンの残部は、親株ＹＳＨ４４において産生されたＮ−グリカン（図３Ｂ）と同一である。図３Ａは、野生型酵母において産生されたＮ−グリカンを示す。
本発明者らは不完全なガラクトース転移に関する幾つかの説明を考えた。これらの説明は、不良なＵＤＰ−ガラクトース輸送、ＵＤＰ−ガラクトースの低い内因性レベルまたは最適未満のＧａｌＴ活性を含むものであった。Ｎ−グリカン上へのガラクトースの転移の度合が低い可能性があると思われる。なぜなら、該株は、ＵＤＰ−ガラクトースを細胞質ゾルからゴルジ装置へトランスロケートするために輸送体を要しうるからである（Ｉｓｈｉｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：１０７４−１０７８（１９９６）；Ｍｉｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１２０：２３６−２４１（１９９６）；Ｔａｂｕｃｈｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２３２：１２１−１２５（１９９７）；Ｓｅｇａｗａら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．４５１：２９５−２９８（１９９９））。輸送体は、異種宿主においては適切に局在化されない可能性のある複数の膜貫通ドメインを含有する複合タンパク質である。しかし、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体を含む幾つかの糖ヌクレオチド輸送体は異種系において活発に発現されている（Ｓｕｎ−Ｗａｄａら，Ｊ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２３：９１２−９１７（１９９８）；Ｓｅｇａｗａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：１２８−１３８（２００２）；Ｋａｉｎｕｍａら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．９：１３３−１４１（１９９９）；Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００（９）： ５０２２−５０２７（２００３））。ゴルジ内へのＵＤＰ−ガラクトースの効率的な輸送を確保するために、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体ＤｍＵＧＴをコードするドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０５５４９３）をクローニングし、該クローンを、ＭＮＮ２−ｈＧａｌＴＩβ４３構築物を発現する株ＹＳＨ７１内に形質転換した（以下のとおり）。
ＵＤＰ−ガラクトース輸送体のクローニング
ＰＣＲプライマーＤｍＵＧＴ−５’（５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＣＡＴＧＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＣＧ−３’（配列番号７））およびＤｍＵＧＴ−３’（５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＧＡＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＴＣＧ−３’（配列番号８））を使用して、ＵＤＰガラクトース輸送体をコードするドロソフィラ・メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ０５５４９３）（ＤｍＵＧＴと称される）をドロソフィラ・メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ｃＤＮＡライブラリー（ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ，卵巣λ−ＺＡＰライブラリーＧＭ）からＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローニングし、配列決定した。ついでＮｏｔＩおよびＰａｃＩ部位を使用して、このオープンリーディングフレームをＮｏｔＩ部位とＰａｃＩ部位との間のＰｐＯＣＨ１プロモーターの下流のプラスミドｐＲＣＤ３９３内にサブクローニングしてプラスミドｐＳＨ２６３を得た。ＤｍＵＧＴをコードするヌクレオチド配列を配列番号３７に示し、ＤｍＵＧＴのアミノ酸配列を配列番号３８に示す。このプラスミドをＡｇｅＩで線状化し、株ＹＳＨ７１内に形質転換して株ＹＳＨ８０を得た。しかし、ＤｍＵＧＴをコードするプラスミドをＹＳＨ７１内に形質転換した場合には、Ｋ３のＮ−グリカンのプロファイルにおける有意な変化は見出されなかった。したがって、本発明者らは、ＵＤＰ−ガラクトースの細胞内プールの増加に労力を集中させることに決定した。
ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）は炭素源としてガラクトースを同化し得ないため（Ｋｕｒｔｚｍａｎ Ｐｉｃｈｉａ．Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔｓ：Ａ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｓｔｕｄｙ．Ｃ．Ｐ，ａ．Ｆ．Ｋｕｒｔｚｍａｎ，Ｊ．Ｗ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌ．：２７３−３５２（１９９８））、本発明者らは、該株におけるＵＤＰ−ガラクトースのプールが十分ではない可能性があると推測した。酵素ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼは、細菌および哺乳類を含むガラクトース同化生物において保存されており、ルロアール経路の第３工程を触媒する。この酵素は典型的には真核生物の細胞質ゾルに局在化しており、ＵＤＰ−グルコースおよびＵＤＰ−ガラクトースの可逆的変換をもたらす（Ａｌｌａｒｄら，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５８：１６５０−１６６５（２００１））。本発明者らは、異種ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼの発現が、ゴルジ内への輸送に際してガラクトースをＮ−グリカン上にガラクトーストランスフェラーゼが転移することを可能にする細胞質ゾルＵＤＰ−ガラクトースプールを生成する推論した。
ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼのクローニング
公知ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼに対して有意な同一性を有するタンパク質をコードするこれまでに特徴づけられていない遺伝子を酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）から以下のとおりにクローニングした（ＳｐＧＡＬＥと称される）。ＰＣＲプライマーＧＡＬＥ２−Ｌ（５’−ＡＴＧＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＧ−３’（配列番号９））およびＧＡＬＥ２−Ｒ（５’−ＴＴＡＣＴＴＡＴＡＴＧＴＣＴＴＧＧＴＡＴＧ−３’（（配列番号１０））を使用して、推定ＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼをコードする１．１Ｋｂのシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００３４２３）（ＳｐＧＡＬＥと称される）をシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）（ＡＴＣＣ２４８４３）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。該ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローニングし、配列決定した。配列決定は＋６６位のイントロン（１７５ｂｐ）の存在を示した。該イントロンを除去するために、該イントロンの６６塩基上流のＮｏｔＩ部位、およびそれに続く、該イントロンの前の２０塩基を有する上流ＰＣＲプライマーＧＤ１（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡ ＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡ ＴＧＡＡＧＧＧＡＣＴ ＧＴＧＴＴＧＧＴＴＡ ＣＴＧＧＣＧＧＣＧＣ ＴＧＧＴＴＡＴＡＴＡ ＧＧＴＴＣＴＣＡＴＡ ＣＧＴＧＣＧＴＴＧＴ ＴＴＴＧＴＴＡＧＡＡ ＡＡ−３’（（配列番号１１））、ならびにＰａｃＩ部位を有する下流ＰＣＲプライマーＧＤ２（５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴ ＡＣＴＴＡＴＡＴＧＴ ＣＴＴＧＧＴＡＴＧ−３’（（配列番号１２））を設計した。プライマーＧＤ１およびＧＤ２を使用して、ｐＣＲ２．１からＳｐＧＡＬＥイントロン非含有遺伝子を増幅し、サブクローンし、該産物をｐＣＲ２．１内に再びクローニングし、配列決定した。ついでＳｐＧＡＬＥをプラスミドｐＲＣＤ４０２およびｐＲＣＤ４０３内のＮｏｔＩ部位とＰａｃＩ部位との間にサブクローニングして、それぞれプラスミドｐＲＣＤ４０６（ＰＯＣＨＩ−ＳｐＧＡＬＥ−ＣＹＣ１ＴＴ）およびｐＲＣＤ４０７（ＰＳＥＣ４−ＳｐＧＡＬＥ−ＣＹＣ１ＴＴ）を得た。これらのプラスミドは米国公開出願第２００６００４０３５３号に既に記載されている。イントロンを伴わないＳｐＧＡＬＥをコードするヌクレオチド配列を配列番号３５に示し、そのアミノ酸配列を配列番号３６に示す。
ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ（ｈＧａｌＥ）は、配列番号４８に示すアミノ酸配列を有し、これは、配列番号４７に示すヌクレオチド配列によりコードされる。ｈＧａｌＥはＳｐＧＡＬＥの代わりに使用されうる。
二重ＧａｌＴ／ガラクトース−４−エピメラーゼ構築物の構築
ＳｃＭＮＮ２−ｈＧａｌＴＩβ４３を含有するプラスミドｐＸＢ５３をＸｈｏＩで線状化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。ついで該ＰＰｐＯＣＨＩＳｐＧＡＬＥ−ＣＹＣ１ＴＴカセットを、ＸｈｏＩおよびＳｐｈＩを使用してプラスミドｐＲＣＤ４０６から除去し、それらの末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、該断片を前記ｐＸＢ５３プラスミド内に挿入してプラスミドｐＲＣＤ４２５を得た。このプラスミドをＸｂａＩで線状化し、株ＹＳＨ４４内に形質転換して株ＲＤＰ５２を得た。これは米国公開出願第２００６００４０３５３号に既に記載されている。該形質転換体の幾つかから単離された精製Ｋ３上のＮ−グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。図３Ｄに示すとおり、該Ｎ−グリカンの有意な比率が、Ｇ０（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）基質上への２つ（約２０％ Ｇ２：Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）または単一のガラクトース部分（約４０％ Ｇ１：Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）の付加に合致する質量を獲得し、該Ｎ−グリカンの残部は、ＹＳＨ４４親において見出されるもの（図３Ｂ）、すなわち、Ｇ０から不変のままであることが判明した。
三重ＧａｌＴ／ガラクトース−４−エピメラーゼ／ＵＤＰガラクトース輸送体構築物の構築
ＰＯＣＨＩ−ＤｍＵＧＴ−ＣＹＣ１ＴＴを含有するＧ４１８ＲプラスミドであるｐＳＨ２６３をＳａｃＩでの消化により線状化し、それらの末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。ＰＳＥＣ４−ＳｐＧＡＬＥ−ＣＹＣ１ＴＴカセットを、ｐＲＣＤ４０７から、ＸｈｏＩおよびＳｐｈＩでの消化により取り出し、それらの末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。ついで該平滑末端化ＳｐＧＡＬＥ断片を前記ｐＳＨ２６３内に挿入してプラスミドｐＲＣＤ４４６を得た。ＰＧＡＰＤＨＳｃＭＮＮ２−ｈＧａｌＴＩβ４３−ＣＹＣ１ＴＴカセットを、プラスミドｐＸＢ５３から、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩでの消化により遊離させ、それらの末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。ついで該平滑末端化ｈＧａｌＴＩ−５３をｐＲＣＤ４４６の平滑ＥｃｏＲＩ部位内に挿入してプラスミドｐＲＣＤ４６５を得た。これは、ｈＧａｌＴＩ−５３、ＳｐＧＡＬＥおよびＤｍＵＧＴを含有する三重Ｇ４１８Ｒプラスミドである。プラスミドｐＲＣＤ４６５をＡｇｅＩで線状化し、株ＹＳＨ４４内に形質転換して株ＲＤＰ８０を得た。これは米国公開出願第２００６００４０３５３号に記載されている。該株により産生された分泌性Ｋ３から遊離したＮ−グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。該Ｎ−グリカンは、ヒトガラクトシル化二分枝複合Ｎ−グリカンＧ２（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を与える、Ｇ０基質への２つのガラクトース残基の定量的付加に合致する質量のものであることが判明した（図３Ｅ）。このＮ−グリカンのインビトロでのβ−ガラクトシダーゼ消化は、Ｇ０（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を与える、２つのガラクトース残基の除去に対応する質量減少をもたらした（図３Ｆ）。
また、ＣＭＰ−シアル酸の存在下のラットα−２，６−Ｎ−シアリルトランスフェラーゼでの株ＲＤＰ８０からの精製Ｋ３のインビトロ処理はＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（図３Ｇ）へのほぼ均一な変換をもたらした。これらの結果は、（１）十分な細胞内ＵＤＰ−ガラクトースプールの代謝操作、（２）活性な且つ適切に局在化しているＧａｌＴの発現、および（３）能動的ＵＤＰ−ガラクトース輸送体によるゴルジ装置内へのＵＤＰ−ガラクトースのトランスロケーションにより、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生された複合Ｎ−グリカンの非常に効率的な伸長が達成されうることを示している。しかし、ガラクトース転移の効率は、実施例２に示されているとおり、ルロアール経路の酵素を該宿主細胞内に更に含めることにより改善された。
株および培地
組換えＤＮＡ実験のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１０またはＤＨ５αを使用した。株ＪＣ３０８（Ｊ．Ｃｒｅｇｇ，Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から誘導されたピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＳＨ４４（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：１２４４−１２４６（２００３））を種々の酵母株の作製のために使用した。既に報告されているとおりのエレクトロポレーション（Ｃｒｅｇｇら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２３−５２（２０００））により酵母株の形質転換を行った。１％ 酵母エキス、２％ ペプトン、１００ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）、１．３４％ 酵母窒素塩基、４×１０−５％ ビオチンおよび１％ グリセロールからなる、増殖培地としてのグリセロール−複合培地（ＢＭＧＹ）、ならびにＢＭＧＹにおけるグリセロールの代わりに１％ メタノールからなる、誘導培地としての緩衝化メタノール−複合培地（ＢＭＭＹ）を使用して、９６ウェルプレートフォーマット（バイオリアクター実験以外）において、室温でタンパク質発現を行った。ＹＰＤは１％ 酵母エキス、２％ ペプトン、２％ デキストロースおよび２％ 寒天である。
制限および修飾酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手した。オリゴヌクレオチドはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から入手した。β−ガラクトシダーゼ酵素はＱＡ ｂｉｏ（Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡ）から入手した。９６ウェルのライセート清浄化（ｃｌｅａｒｉｎｇ）プレートはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手した。タンパク質結合９６ウェルプレートはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手した。塩および緩衝剤はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。ＭＡＬＤＩマトリックスはＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手した。
タンパク質精製およびＮ−グリカン分析
Ｋ３の精製は既に記載されている（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：５０２２−５０２７（２００３））。既に記載されているとおりに（Ｃｈｏｉら，同誌）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手した酵素Ｎ−グリコシダーゼＦを使用して、Ｎ−グリカンをＫ３から遊離させた。既に記載されているとおりに（Ｃｈｏｉら，同誌）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＰＲＯリニアＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を使用して、グリカンの分子量を決定した。
バイオリアクター培養
１５０ｍＬのＢＭＧＹ培地を含有する５００ｍＬ しゃま板付きメスフラスコに１ｍＬの種培養（フラスコ培養を参照されたい）を播いた。該接種物を２４℃で４〜６のＯＤ６００まで（約１８時間）増殖させた。ついで該接種物培養からの細胞を遠心分離し、５０ｍＬの発酵培地（培地１リットル当たり；ＣａＳＯ４・−２Ｈ２Ｏ ０．３０ｇ，Ｋ２ＳＯ４ ６．００ｇ，ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ５．００ｇ，グリセロール ４０．０ｇ，ＰＴＭ１塩 ２．０ｍＬ，ビオチン ４×１０−３ｇ，Ｈ３ＰＯ４（８５％） ３０ｍＬ，ＰＴＭ１塩／リットル：ＣｕＳＯ４．Ｈ２Ｏ ６．００ｇ，ＮａＩ ０．０８ｇ，ＭｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ３．００ｇ，ＮａＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ ０．２０ｇ，Ｈ３ＢＯ３ ０．０２ｇ，ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ ０．５０ｇ，ＺｎＣｌ２ ２０．０ｇ，ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ６５．０ｇ，ビオチン ０．２０ｇ，Ｈ２ＳＯ４（９８％） ５．００ｍＬ）中に再懸濁させた。
３リットルの凹面底（１．５リットルの初期仕込み体積）Ａｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター内で発酵を行った。該発酵槽は、２４℃の温度でフェド・バッチ様態で運転し、３０％ 水酸化アンモニウムを使用してｐＨを４．５±０．１で制御した。攪拌速度（４５０〜９００ｒｐｍ）および純粋な酸素の供給を調節することにより、１ａｔｍの空気で、溶存酸素を飽和の４０％以上に維持した。気流速を１ｖｖｍに維持した。バッチ相における初期グリセロール（４０ｇ／Ｌ）が喪失したら（これはＤＯの増加により示される）、所望のバイオマス濃度に達するまで、１２ｍｌ／ＬのＰＴＭ１塩を含有する５０％ グリセロール溶液を１２ｍＬ／Ｌの供給速度で供給した。半時間の飢餓期の後、該メタノール供給（１２ｍＬ／Ｌ ＰＴＭ１を含有する１００％ メタノール）を開始する。該発酵槽におけるメタノール濃度が０．２〜０．５％に制御されるように該メタノール供給速度を用いる。該メタノール濃度は、該発酵槽からのオフガス中に位置するＴＧＳガスセンサー（Ｆｉｇａｒｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．のＴＧＳ ８２２）を使用してオンラインで測定される。該発酵槽を８時間ごとにサンプリングし、バイオマス（ＯＤ６００、湿潤細胞重量および細胞数）、残留炭素源レベル（Ａｍｉｎｅｘ ８７Ｈを使用するＨＰＬＣによるグリセロールおよびメタノール）および細胞外タンパク質含量（ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによる）に関して分析した。
インビトロβ−ガラクトシダーゼ消化
ＲＤＰ８０からのＮ−グリカンを、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ６．０）中、β１，４−ガラクトシダーゼ（ＱＡ ｂｉｏ，Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡ）と共に３７℃で１６〜２０時間インキュベートした。
インビトロシアル酸転移
株ＲＤＰ８０から精製されたＫ３をシアル酸転移の基質として使用した。このタンパク質のうちの２００μｇを、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ６．０）中、５０μｇのＣＭＰ−シアル酸および１５ｍＵ ラット組換えα−（２，６）−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，旧Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））と共に３７℃で１６〜２０時間インキュベートした。ついでＮ−グリカンをＰＮＧアーゼＦ消化により遊離させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより検出した。
酵素ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼはルロアール経路の第３工程を触媒する（図４）。実施例１に示されているとおり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の糖操作株におけるこの酵素をコードする遺伝子の異種発現は、この異種遺伝子を発現する株におけるガラクトース転移の劇的な増加により示されるとおり、ＵＤＰ−ガラクトースの細胞内プールの生成をもたらした。しかし、同様に示されているとおり、この酵素のみの添加は、唯一の炭素源としてのガラクトース上で増殖する能力をピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株に付与しなかった（図７の株ＲＤＰ５７８−１を参照されたい）。したがって、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるルロアール経路の残部を実施例１の種々の株内に導入した。したがって、この実施例においては、唯一の炭素源としてガラクトースを利用しうるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を構築した。本発明における方法は、ガラクトースを炭素源として通常は利用し得ない他の種の組換え宿主細胞を、ガラクトースを唯一の炭素源として利用しうる組換え宿主細胞にするために用いられうる。
エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ１のクローニング
ＰＣＲプラマーＰＢ１５８（５’−ＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＴＧＡＣＴＡＡＡＴＣＴＣＡＴＴＣＡ−３’（配列番号１３））およびＰＢ１５９（５’−ＡＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＴＣＡＴＡＴＡＧＡＣＡＧＣ−３’（配列番号１４））を使用して、ＳｃＧＡＬ１と称されるガラクトキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ ００９５７６）をコードするエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子をエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡ（株Ｗ３０３、標準的なスマッシュ・アンド・グラブ（ｓｍａｓｈ ａｎｄ ｇｒａｂ）ゲノムＤＮＡ調製物）からＰＣＲ増幅し、該ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローニングし、配列決定した。得られたプラスミドをｐＲＣＤ９１７と命名した。該ガラクトキナーゼをコードするＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで該プラスミドから遊離させ、該ＤＮＡ断片を、ＮｏｔＩ部位とＰａｃＩ部位との間のピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＨＴ１強力構成的プロモーターの下流のプラスミドｐＧＬＹ８９４内にサブクローニングしてプラスミドｐＧＬＹ９３９を得た。該ガラクトキナーゼは、配列番号４０に示すアミノ酸配列を有し、配列番号３９に示すヌクレオチド配列によりコードされている。
エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ２のクローニング
ＰＣＲプラマーＰＢ１５６（５’−ＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号１５））およびＰＢ１５７（５’−ＡＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡ−３’（配列番号１６））を使用して、ＳｃＧＡＬ２と称されるガラクトースパーミアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ ０１３１８２）をコードするエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子をエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡ（株Ｗ３０３、標準的なスマッシュ・アンド・グラブ（ｓｍａｓｈ ａｎｄ ｇｒａｂ）ゲノムＤＮＡ調製物）からＰＣＲ増幅し、該ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローニングし、配列決定した。得られたプラスミドをｐＰＢ２９０と命名した。該ガラクトースパーミアーゼをコードするＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで該プラスミドから遊離させ、該ＤＮＡ断片を、ＮｏｔＩ部位とＰａｃＩ部位との間のＰｐＰＭＡ１プロモーターの下流のプラスミドｐＪＮ６６４内にサブクローニングしてプラスミドｐＰＢ２９２を得た。該ガラクトースパーミアーゼは、配列番号４４に示すアミノ酸配列を有し、配列番号４３に示すヌクレオチド配列によりコードされている。
エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ７のクローニング
ＰＣＲプラマーＰＢ１６０（５’−ＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧ ＣＡＧＧＡＡＴＧＡＣ ＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡ ＴＴ−３’（配列番号１７））およびＰＢ１６１（５’−ＡＡＣＴＴＡＡＴＴＡ ＡＧＣＴＴＡＣＡＧＴ ＣＴＴＴＧＴＡＧＡＴ ＡＡＴＣ−３’（配列番号１８））を使用して、ＳｃＧＡＬ７と称されるガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ ００９５７４）をコードするエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子をエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡ（株Ｗ３０３、標準的なスマッシュ・アンド・グラブ（ｓｍａｓｈ ａｎｄ ｇｒａｂ）ゲノムＤＮＡ調製物）からＰＣＲ増幅し、該ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローニングし、配列決定した。得られたプラスミドをｐＲＣＤ９１８と命名した。該ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで該プラスミドから遊離させ、該ＤＮＡ断片を、ＮｏｔＩ／ＰａｃＩにおけるＰｐＰＭＡ１強力構成的プロモーターの下流のプラスミドｐＧＬＹ１４３内にサブクローニングしてプラスミドｐＧＬＹ９４０を得た。また、それとは別に、該ＮｏｔＩおよびＰａｃＩ部位を使用して、このＯＲＦをＮｏｔＩ／ＰａｃＩにおけるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ１強力構成的プロモーターの下流のプラスミドｐＲＣＤ８３０内にサブクローニングしてプラスミドｐＲＣＤ９２９を得た。該ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼは、配列番号４２に示すアミノ酸配列を有し、配列番号４１に示すヌクレオチド配列によりコードされている。
三重ＳｃＧＡＬ１／ＳｃＧＡＬ７／ＳｃＧＡＬ２構築物の構築
ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１選択マーカー（ｈｉｓ１：：ＡＲＧ１，米国特許第７，４７９，３８９号を参照されたい）を有しＰＧＡＰＤＨ−プロモーターカセットをも含有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｈｉｓ１ノックアウトベクターであるｐＪＮ７０２内にｐＧＬＹ９１７からのＳｃＧＡＬ１オープンリーディングフレームをサブクローニングし、ＰＧＡＰＤＨ−ＳｃＧＡＬ１融合体を含有するこの新たなベクターをｐＲＣＤ９２８と命名した。ｐＧＬＹ９２９からのＰＴＥＦ１−ＳｃＧＡＬ７カセットｐＧＬＹ９２８内にサブクローニングし、この新たなベクターをｐＧＬＹ９４６ａと命名した。次にｐＲＣＤ６３４からのＰＯＣＨ１−ＤｍＵＧＴ（ゴルジＵＤＰ−ガラクトース輸送体）カセットをｐＧＬＹ９６４ａ内にサブクローニングしてｐＧＬＹ９５６ｂを得た。最後に、ｐＰＢ２９２からのＰＧＡＰＤＨ−ＳｃＧＡＬ２カセットをｐＲＣＤ９５６ｂ内にサブクローニングしてプラスミドｐＲＣＤ９７７ｂを得た（図６を参照されたい）。プラスミドｐＲＣＤ９７７ｂはＡＲＧ１ドミナント選択マーカーカセットと共にＤｍＵＧＴ、ＳｃＧＡＬ１、ＳｃＧＡＬ７およびＳｃＧＡＬ２発現カセットを含有する。
二重ＳｃＧＡＬ１／ＳｃＧＡＬ７構築物の構築
ｐＧＬＹ９３９からのＰＴＥＦ１−ＳｃＧＡＬ１カセットを、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１選択マーカー、ＴＲＰ１遺伝子座ノックイン領域を有しＰＧＡＰＤＨ−ｈＧａｌＴＩβカセットをも含有するノックインベクターであるｐＧＬＹ９４１内にサブクローニングし、この新たなベクターをｐＧＬＹ９５２と命名した。ｐＧＬＹ９４０からのＰＰＭＡ１−ＳｃＧＡＬ７カセットをｐＧＬＹ９５２内にサブクローニングし、この新たなベクターをｐＧＬＹ９５５と命名した。最後に、ノウルセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性カセット（ＮＡＴＲ）をｐＧＬＹ５９７（元々はＥＲＯＳＣＡＲＦ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＧｍｂＨ（Ｄａｉｍｌｅｒｓｔｒａｓｓｅ １３ａ，Ｄ−６１３５２ Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のｐＡＧ２５；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，１９９９，Ｙｅａｓｔ １５：１５４１を参照されたい）からｐＧＬＹ９５２内にサブクローニングしてプラスミドｐＧＬＹ１４１８を得た（図１２を参照されたい）。これはＮＡＴＲドミナント選択マーカーカセットと共にｈＧａｌＴＩβ、ＳｃＧＡＬ１およびＳｃＧＡＬ７発現カセットを含有する。
全３個の遺伝子を含有する単一組込みプラスミドｐＲＣＤ９７７ｂ（図６）をピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＲＤＰ５７８−１内に形質転換して株ＲＤＰ６３５−１、−２および−３を得た。株ＲＤＰ５７８−１は、末端β−１，４−ガラクトース残基を含有するヒトＮ−グリカンを産生するための異種遺伝子および遺伝子ノックアウトを既に含有していた（構築に関しては図５および実施例３を参照されたい）。株ＲＤＰ５７８−１は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼコード化遺伝子ＳｃＧＡＬ１０をコードする発現カセットをも含み、試験タンパク質ヒトクリングル３を発現する。得られた株ＲＤＰ６３５−１、−２およびー３は、ＤｍＵＧＴガラクトース輸送体の、２つのコピーを有する。
親株ＲＤＰ５７８−１ならびにＳｃＧＡＬ１、ＳｃＧＡＬ２、ＳｃＧＡＬ７およびＳｃＧＡＬ１０遺伝子での形質転換体（ＲＤＰ６３５−１、−２および−３）を、グルコース、ガラクトースを含有する又は炭素源を含有しない最少培地上で５日間増殖させ、ついで写真撮影した。興味深いことに、ガラクトース末端Ｎ−グリカンを有するタンパク質を分泌する能力を有するにもかかわらず、ＲＤＰ５７８−１は、野生型ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）に関して予想されるとおりグルコース上で正常に増殖するもののガラクトースを同化する能力を示さなかった。しかし、ＳｃＧＡＬ１、ＳｃＧＡＬ２およびＳｃＧＡＬ７遺伝子を発現する形質転換体は、図７に示すとおりガラクトースを同化する能力を有していた。予想どおり、炭素源を欠くプレート上では最小の増殖が観察された。これらの結果は、ルロアールガラクトース同化経路の基本構造（しかし調節性ではない）要素で再構築された場合に炭素源としてのガラクトースを同化しうる組換えピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）が構築されうることを示している。
糖操作ピチア・パストリスにおいて発現されたＦｃのＡｓｎ残基２９７におけるＮ−グリカンの決定
ヒトＩｇＧのＦｃ部分は、他の分泌ヒトタンパク質のものとは異なるＮ−グリカンプロファイルを典型的に含有する重鎖二量体当たり１個のＮ−グリカン部位（Ａｓｎ２９７，Ｋａｂａｔの番号付け）を含有する。一般に、天然に存在するヒト抗体は、末端ＧｌｃＮＡｃおよびかなりの量の末端ガラクトース（これは種々の要因に基づいて異なりうる）を有するＮ−グリカンを含有し、有意な量の末端シアル酸をめったに含有しない。Ｎ−グリカンに対する末端β−１，４−ガラクトースの高いレベルを示した後、本発明者らは、そのような糖操作酵母株において産生される抗体上で観察されるＮ−グリカンのプロファイルを決定することを試みた。したがって、末端ガラクトースを有するＮ−グリカンを産生するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株（ＹＧＢ０２；図８および実施例４を参照されたい）を、ＡＯＸ１プロモーターの制御下でヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）重鎖のＦｃドメインまたはＣ−末端半分をコードするプラスミド（ｐＢＫ１３８）で形質転換した。ＰＣＲにより同定された選択された陽性クローンをＰＢＰ３１７−３６と命名した（図８および実施例４）。この株を振とうフラスコ内で増殖させ、唯一の炭素源としてのメタノールで誘導した。該上清を遠心分離により集め、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製に付した。精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、クーマシー染色した。予想サイズの標識バンドが観察された。ついで該精製タンパク質をＰＮＧアーゼ消化に付し、遊離したＮ−グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。得られたＮ−グリカン（図１０Ａ）は、末端ＧｌｃＮＡｃ（Ｇ０：ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を有する複合ヒトコア構造に合致した優勢（主要）な質量、単一末端ガラクトースを有する、より少量の種（Ｇ１：ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）、および複合種の両アームがガラクトースでキャップ化されている副次的な種（Ｇ２：Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を示した。これらの種の質量は、単一フコース残基の欠如のため、文献に報告されている正規レベルから予測可能に相違する。糖操作酵母株は内因性フコシルトランスフェラーゼを含有せず、したがって、コアヒトＮ−グリカン構造にフコースを付加する固有能力を欠く。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に合致するもう１つの副次的な種も観察された。
ついで、末端ガラクトースを有しＳｐＧＡＬＥ（ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ）をも発現するヒト様Ｎ−グリカンを構築するのに要求されるグリコシル化活性を発現する前記の株ＰＢＰ３１７−３６を、炭素源として外因性ガラクトースが利用可能となるように及び代謝的に操作された様態でＮ−グリコシル化が制御可能となるように遺伝的に操作した。構成的プロモーターの制御下でＳｃＧＡＬ１およびＳｃＧＡＬ７の両方を発現する組込みプラスミドｐＧＬＹ９５４を構築し（図９）、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＰＢＰ３１７−３６内に形質転換した。プラスミドｐＧＬＹ９５４は、唯一の炭素源としてのガラクトース上で増殖する能力を株ＰＢＰ３１７−３６（ＳｐＧＡＬＥ ＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼを既に含有していた；図８）に付与した。このＧｇａｌ＋株をＲＤＰ７８３と命名した。ガラクトースパーミアーゼを該細胞内に導入しなかった場合であっても該細胞は炭素源としてガラクトースを利用することが可能であったため、本発明者らは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）に内在する一般的なヘキソース輸送体がガラクトースを細胞膜越しに十分に輸送しうると結論づけた。
ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＰＢＰ３１７−３６およびＲＤＰ７８３は共に、メタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下で分泌レポータータンパク質としてのヒトＦｃドメインをコードする組込みプラスミド構築物を含有する。株ＰＢＰ３１７−３６およびＲＤＰ７８３を、グリセロールを含有する標準的な培地内で振とうフラスコ内で増殖させ、唯一の炭素源としてのメタノールまたは種々の濃度のグルコースもしくはガラクトースと組合されたメタノールの存在下で誘導した。集めた上清タンパク質をプロテインＡによりアフィニティ精製し、ＰＮＧアーゼ消化に付し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。株ＲＤＰ７８３からのヒトＦｃから遊離したＮ−グリカンは、メタノール誘導のみに際して、またはグルコースもしくはマンノースの存在下、主要グリコフォームＧ０（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を伴う、ＰＢＰ３１７−３６で観察されるプロファイルに類似したＮ−グリカンを与えた（図１０）。しかし、外因性ガラクトース供給を行った場合には、株ＲＤＰ７８３は、今度はＧ１（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）への主要グリコフォームにおける変化を伴うヒトＦｃ上のガラクトース含有Ｎ−グリカンにおける用量依存的増加、およびそれに付随する、完全β−１，４−ガラクトースキャップ化グリコフォームＧ２（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）の増加を示した（が親株ＰＢＰ３１７−３６は示さなかった）（図１０）。
最後に、ヒトＦｃで観察された、外因性ガラクトースを使用してグリコシル化を制御しうることが、完全長モノクローナル抗体に適用可能であることを実証するために、抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体を発現する糖操作酵母株ＹＤＸ４７７を作製した（図１１、実施例５）。また、分泌性糖タンパク質上の形態Ｇ２（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）のヒトＮ−グリカンを転移するように、この株を操作した。ｍＡｂ−Ａの発現後のＮ−グリカンの遊離は、Ｇ０（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）に合致する主要ピーク、およびそれに伴う、Ｇ１（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）に合致するそれほど優勢でないピーク、ならびにＧ２（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）およびＭ５（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）の小さなピークからなるＮ−グリカンパターン（図１３Ａ）を示した。このデータは、ヒトＩｇＧ１のトランケート化Ｆｃ部分に関して観察され予想されたものに類似している。なぜなら、どちらも、同じ残基（Ａｓｎ−２９７）においてＮ−グリコシル化されているからである。ＳｃＧＡＬ１およびＳｃＧＡＬ７を含有する組込みプラスミドｐＧＬＹ１４１８を構築し（図１２）、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＤＸ４７７内に形質転換して株ＲＤＰ９６８−１を得た。このプラスミドは、唯一の炭素源としてのガラクトース上で増殖する能力を株ＹＤＸ４７７（これはＳｐＧＡＬＥ ＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼを既に含有する；図１１）に付与した。
株ＹＤＸ４７７およびＲＤＰ９６８−１を、グリセロールを含有する標準的な培地内で振とうフラスコ内で増殖させ、唯一の炭素源としてのメタノールまたは種々の濃度のガラクトースと組合されたメタノールの存在下で誘導した。集めた上清タンパク質をプロテインＡによりアフィニティ精製し、ＰＮＧアーゼ消化に付し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。どちらの株も、メタノール誘導のみに際して、またはグルコースもしくはマンノースの存在下、主要グリコフォームＧ０（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を伴う、ＰＢＰ３１７−３６で観察されるプロファイルに類似したＮ−グリカンを与えた（図１０Ａと図１３Ａおよび１３Ｄとの比較）。しかし、外因性ガラクトース供給を行った場合には、株ＲＤＰ９６８−１は、今度はＧ１（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）への主要グリコフォームにおける変化を伴う該抗体上のガラクトース含有Ｎ−グリカンにおける用量依存的増加、およびそれに付随する、完全β−１，４−ガラクトースキャップ化グリコフォームＧ２（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）の増加を示した（が親株ＹＤＸ４７７は示さなかった）（図１３ＥおよびＦ）。
株ＲＤＰ５７８−１の構築を図５に示す。これは以下の工程を含むものであった。株ＪＣ３０８が出発株であった。この株はＣｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５０２２−５０２７（２００３）に記載されているが、簡潔に説明すると、該株はｕｒａ３，ａｄｅ１，ａｒｇ４，ｈｉｓ４である。プラスミドｐＪＮ３２９を使用し、Ｃｈｏｉら（同誌）および米国特許第７，４４９，３０８号に記載されている方法に従ってＯＣＨ１遺伝子を破壊することにより、この株をアルファ−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性において欠損させて、株ＹＪＮ１５３を得た。プラスミドｐＪＮ３２９はＰｐＵＲＡ３ドミナント選択マーカーを含有し、ｕｒａ−活性に関する対抗選択の後、得られた株をホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損させて株ＹＡＳ１８０−２を得た。これは、プラスミドベクターｐＪＮ５０３ｂおよびｐＡＳ１９を使用し、米国特許第７，２５９，００７号に記載されている方法に従ってＰＮＯ１、ＭＭＮ４ＡおよびＭＮＮ４Ｂ遺伝子を破壊することにより行った。本発明における融合タンパク質を含む分泌経路標的化リーダーペプチドは、それがＥＲ、ゴルジまたはトランスゴルジネットワークに融合された触媒ドメインを局在化する。
ｕｒａ−活性に関する対抗選択の後、得られた株ＹＡＳ１８７−２を、概ね米国特許第７，４６５，５７７号に記載されているとおりに、プラスミドｐＡ２４（図１４を参照されたい）を使用してベータ−マンノシルトランスフェラーゼ活性において欠失させて、株ＹＡＳ２１８−２を得た。プラスミドｐＡＳ２４は、ＰｐＯＣＨ１プロモーターの下流の完全長マウスゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（ＭｍＳＬＣ３５Ａ３）をコードする発現カセットを含有しＰｐＵＲＡ３選択マーカーを含有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ２ノックアウトプラスミドである。ＭｍＳＬＣ３５Ａ３は、配列番号３３に示すヌクレオチド配列によりコードされる配列番号３４に示すアミノ酸配列を有する。ｂｍｔ２ｐに起因しうるベータ−マンノシルトランスフェラーゼ活性を除去するための５’および３’ＢＭＴ２フランキング配列は、米国特許第７，４６５，５７７号に示されているとおりに入手されうる。株ＹＡＳ２１８−２をｕｒａ−活性に関して対抗選択した後、得られる株ＹＡＳ２６９−２はｕｒａ−であり、ＢＭＴ２遺伝子内に挿入されたマウスゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体を有する。
ついで株ＹＡＳ２６９−２をプラスミドｐＲＣＤ７４２ｂ（図１５を参照されたい）で形質転換した。該プラスミドは、キメラマウスアルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼＩ（ＦＢ８ ＭａｎｎＩ）、キメラヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＣＯＮＡ１０）をコードする発現カセット、およびマウスゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（ＭｍＳＬＣ３５Ａ３）をコードする完全長遺伝子を含み、それは該プラスミドをＡＤＥ１遺伝子座に標的化する（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／１３７１９を参照されたい）。プラスミドｐＲＣＤ７４２ｂはノックイン・ノックアウト（ＫＩＮＫＯ）プラスミドであり、これはＷＯ２００７／１３６８６５およびＷＯ２００７１３６７５２に記載されている。該プラスミドは、Ａｄｅ１ｐをコードするオープンリーディングフレームを欠失させることなくピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ１遺伝子内に組込まれる。該プラスミドはＰｐＵＲＡ５選択マーカーをも含有する。分泌経路標的化融合タンパク質（ＦＢ８ ＭａｎｎＩ）をコードする発現カセットは、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でマウスアルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（ＦＢ ＭａｎｎＩ：配列番号５４）のＮ末端に融合したＳｃＳｅｃ１２リーダーペプチド（ＳｃＳｅｃ１２（８）の最初の１０３アミノ酸：配列番号３２）を含む。分泌経路標的化融合タンパク質ＣＯＮＡ１０をコードする発現カセットは、ＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下でヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ Ｉ）触媒ドメイン（配列番号５２）のＮ末端に融合したＰｐＳｅｃ１２リーダーペプチド（ＰｐＳｅｃ１２（１０）の最初の２９アミノ酸：配列番号２８）を含む。該プラスミドは、ＰｐＳＥＣ４プロモーターの制御下で完全長マウスゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（ＭｍＳＬＣ３５Ａ３）をコードする発現カセットを更に含んでいた。株ＹＡＳ２６９−２内へのプラスミドｐＲＣＤ７４２ｂのトランスフェクションは株ＲＤＰ３０７を与えた。この株は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる。配列番号５３および５１は、それぞれマウスアルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼＩおよびヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ Ｉ）触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列である。ヒトＧｎＴ Ｉをコードするヌクレオチド配列をピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現のためにコドン最適化した。配列番号２７および３１は、それぞれＰｐＳＥＣ１２（１０）およびＳｃＳＥＣ１２（８）をコードするヌクレオチド配列である。
株ＲＤＰ３０７をプラスミドｐＤＭＧ４７で形質転換して株ＲＤＰ３６１を得ることにより、株ＲＤＰ３６１を構築した。プラスミドｐＤＭＧ４７（図１６を参照されたい）は、Ｔｒｐ１ｐをコードするオープンリーディングフレームを欠失させることなくピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ１遺伝子座内に組込まれるＫＩＮＫＯプラスミドである。該プラスミドは、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩの触媒ドメイン（配列番号６３）のＮ末端に融合したＳｃＭｎｎ２リーダー標的化ペプチド（ＳｃＭｎｎ２（５３）の最初の３６アミノ酸：配列番号１９）を含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＫＤ５３）をコードする発現カセットを含み、ＰｐＵＲＡ３選択マーカーをも含有する。該プラスミドは、ＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下でラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＴＣ：配列番号５８）の触媒ドメインのＮ末端に融合したＳｃＭｎｎ２リーダー標的化ペプチド（ＳｃＭｎｎ２（５４）の最初の９７アミノ酸：配列番号２２）を含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＴＣ５４）をコードする発現カセットを含有する。ＳｃＭｎｎ２リーダー５３および５４の核酸配列をそれぞれ配列番号１９および２１に示す。ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩおよびラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ ＩＩ）の触媒ドメインをコードする核酸配列を、それぞれ配列番号６２および５７に示す。
前記の株ＲＤＰ３６１をプラスミドｐＲＣＤ８２３ｂで形質転換して株ＲＤＰ４１５−１を得た。プラスミドｐＲＣＤ８２３ｂ（図１７を参照されたい）は、Ｈｉｓ４ｐをコードするオープンリーディングフレームを欠失させることなくピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ４遺伝子座内に組込まれるＫＩＮＫＯプラスミドであり（米国特許第７，４７９，３８９号を参照されたい）、ＰｐＵＲＡ５選択マーカー（米国公開出願第２００４０２２９３０６号を参照されたい）を含有し、また、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下であること以外は前記のとおりにＳｃＭｎｎ２（５４）の最初の９７アミノ酸にＮ末端において融合したラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（ＴＡ：配列番号６１）を含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＴＡ５４）をコードする発現カセットを含有する。該プラスミドはまた、ＰｐＯＣＨ１プロモーターの制御下の完全長ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ゴルジＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＤｍＵＧＴ）およびＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下の完全長エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＳｃＧＡＬ１０）をコードする発現カセットを含有する。ＳｃＧＡＬ１０は、配列番号４６に示すアミノ酸配列を有し、これは、配列番号４５に示すヌクレオチド配列によりコードされている。ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＴＡ）のヌクレオチド配列を配列番号６０に示す。
前記の株ＲＤＰ４１５−１をプラスミドｐＲＣＤ８９３ａで形質転換して株ＲＤＰ５２３−１を得た。プラスミドｐＧＬＹ８９３ａ（図１８を参照されたい）は、ＰｐＡＲＧ４選択マーカー（米国特許第７，４７９，３８９号）を含有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｈｉｓ１ノックアウトプラスミドである。該プラスミドは、ＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下でドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩの触媒ドメイン（ＫＤ：配列番号６３）の触媒ドメインのＮ末端に融合したＰｐＳＥＣ１２リーダー標的化ペプチド（ＰｐＳＥＣ１２（１０）の最初の２９アミノ酸：配列番号２８）を含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＫＤ１０）をコードする発現カセットを含む。該プラスミドはまた、ＰｐＴＥＦ１プロモーターの制御下でラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＴＡ：配列番号６１）の触媒ドメインのＮ末端に融合したＳｃＭｎｔＩｐ（ＳｃＫｒｅ２ｐ）リーダー標的化ペプチド（ＳｃＭｎｔＩｐ（ＳｃＫｒｅ２ｐ）（３３）の最初の５３アミノ酸：配列番号３０）を含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＴＡ３３）をコードする発現カセットを含有する。該プラスミドはまた、ヒトガラクトシルトランスフェラーゼＩの触媒ドメイン（ｈＧａｌＴＩβ４３；配列番号５０）のＮ末端に融合したＳｃＭｎｎ２ｐリーダーペプチド（５３）の最初の３６アミノ酸を含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＸＢ５３）をコードする発現カセットを含有する。ＰｐＳＥＣ１２およびＳｃＭＮＴＩ（ＳｃＫＲＥ２）リーダーの核酸配列を、それぞれ配列番号２７および２９に示す。ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ、ラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ ＩＩ）およびヒトＧａｌＴＩの触媒ドメインをコードする核酸配列を、それぞれ配列番号６２、６０および４９に示す。この株は、末端ガラクトース残基を有するＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる。該株は、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインの、２つのコピー、およびラットＧｎＴ ＩＩ触媒ドメインの、３つのコピーをコードしている。
最後に、前記の株ＲＤＰ５２３−１をプラスミドｐＢＫ６４で形質転換して株ＲＤＰ５７８−１を得た。プラスミドｐＢＫ６４はヒトクリングル３試験タンパク質をコードしており、Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５０２２−５０２７（２００３）に記載されている。
株ＰＢＰ３１７−３６の構築を図８に示す。出発株はＹＧＬＹ１６−３であった。これは、ＯＣＨ１、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４Ａ、Ｍｎｎ４ＢおよびＢＭＴ２遺伝子の欠失を伴うｕｒａ−株であり、実施例３において用いた方法に従い得られうる。株ＹＧＬＹ１６−３はＷＯ２００７１３６７５２にも開示されている。
株ＹＧＬＹ１６−３をプラスミドｐＲＣＤ７４２ａ（図１９を参照されたい）で形質転換して株ＲＤＰ６１６−２を得た。プラスミドｐＲＣＤ７４２ａ（図１９を参照されたい）は、Ａｄｅ１ｐをコードするオープンリーディングフレームを欠失させることなくピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ１遺伝子内に組込まれるＫＩＮＫＯプラスミドである。このプラスミドはまた、ＰｐＵＲＡ５選択マーカーを含有し、キメラマウスアルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ（ＦＢ８ ＭａｎｎＩ）、キメラヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＣＯＮＡ１０）および完全長マウスゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（ＭｍＳＬＣ３５Ａ３）をコードする発現カセットを含む。該プラスミドは、キメラヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩをコードする発現カセットの配向が反対の配向であること以外はプラスミドｐＲＣＤ７４２ｂと同じである。株ＹＧＬＹ１６−３内へのプラスミドｐＲＣＤ７４２ａのトランスフェクションは株ＲＤＰ６１６−２を与えた。この株は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる。
ついで、ｕｒａ−株ＲＤＰ６４１−３を得るために株ＲＤＰ６１６−２を対抗選択した後、プラスミドｐＲＣＤ１００６を該株内に形質転換して株ＲＤＰ６６６を得た。プラスミドｐＲＣＤ１００６（図２０を参照されたい）は、選択マーカーとしてのＰｐＵＲＡ５遺伝子を含有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｈｉｓ１ノックアウトプラスミドである。該プラスミドは、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でヒトガラクトシルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（ｈＧａｌＴＩβ４３）のＮ末端に融合したＳｃＭｎｔ１ｐ（ＳｃＫｒｅ２ｐ）（３３）の最初の５８アミノ酸を含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＸＢ３３）をコードする発現カセット；ＰｐＯＣＨ１プロモーターの制御下で完全長ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ゴルジＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＤｍＵＧＴ）をコードする発現カセット；およびＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下でエス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＳｐＧＡＬＥ）をコードする発現カセットを含有する。
株ＲＤＰ６６６をプラスミドｐＧＬＹ１６７ｂで形質転換して株ＲＤＰ６９６−２を得た。プラスミドｐＧＬＹ１６７ｂ（図２１を参照されたい）は、ＰｐＵＲＡ３選択マーカーを含有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ａｒｇ１ノックアウトプラスミドである。該プラスミドは、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン（ＫＤ）のＮ末端に融合したＳｃＭｎｎ２ｐ（５３）の最初の３６アミノ酸を含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＣＯ−ＫＤ５３）をコードする発現カセット、およびＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下でラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（ＴＣ）のＮ末端に融合したＳｃＭｎｎ２ｐ（５４）の最初の９７アミノ酸を含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＣＯ−ＴＣ５４）を発現する発現カセットを含有する。得られた株ＲＤＰ６９６−２をケモスタット選択に付した（ケモスタット選択の概説に関しては、ＤｙｋｈｕｉｚｅｎおよびＨａｒｔｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．４７：１５０−１６８（１９８３）を参照されたい）。ケモスタット選択は株ＹＧＢ０２を与えた。株ＹＧＢ０２は、末端ガラクトース残基を有するＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる。この株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現のためにコドン最適化された核酸分子（それぞれ配列番号６４および５９）によりマンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン（ＫＤ）およびＧｎＴ ＩＩ（ＴＣ）がコードされていた。
株ＹＧＢ０２をプラスミドｐＢＫ１３８でトランスフェクトして株ＰＢＰ３１７−３６を得た。プラスミドｐＢＫ１３８（図２２を参照されたい）は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター内に、該プロモーターを重複させて組込まれるロールインプラスミドである。該プラスミドは、ヒトＦｃ抗体フラグメント（ヒトＩｇＧ１重鎖のＣ末端の２３３アミノ酸；配列番号６６）のＮ末端に融合したエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子プレシグナル配列（配列番号２４）を含む融合タンパク質をコードする発現カセットを含有する。エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子プレシグナル配列をコードする核酸配列を配列番号２３に示し、ヒトＩｇＧ１重鎖のＣ末端の２３３アミノ酸をコードする核酸配列を配列番号６５に示す。
株ＹＤＸ４７７の構築を図１１に示す。出発株はＹＧＬＹ１６−３であった。株ＹＧＬＹ１６−３をプラスミドｐＲＣＤ７４２ａ（図１９を参照されたい）で形質転換して株ＲＤＰ６１６−２を得た。プラスミドｐＲＣＤ７４２ａ（図１９を参照されたい）は、ａｄｅ１ｐのオープンリーディングフレームを欠失させることなくピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ１遺伝子内に組込まれるＫＩＮＫＯプラスミドである。該プラスミドはＰｐＵＲＡ５選択マーカーをも含有し、キメラマウスアルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ（ＦＢ８ ＭａｎｎＩ）、キメラヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＣＯＮＡ１０）および完全長マウスゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（ＭｍＳＬＣ３５Ａ３）をコードする発現カセットを含む。該プラスミドは、キメラヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩをコードする発現カセットの配向が反対の配向であること以外はプラスミドｐＲＣＤ７４２ｂと同じである。株ＹＧＬＹ１６−３内へのプラスミドｐＲＣＤ７４２ａのトランスフェクションは株ＲＤＰ６１６−２を与えた。この株は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる。
ついで、ｕｒａ−株ＲＤＰ６４１−４を得るために株ＲＤＰ６１６−２を対抗選択した後、プラスミドｐＲＣＤ１００６を該株内に形質転換して株ＲＤＰ６６７−１を得た。プラスミドｐＲＣＤ１００６（図２０を参照されたい）は、選択マーカーとしてのＰｐＵＲＡ５遺伝子を含有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｈｉｓ１ノックアウトプラスミドである。該プラスミドは、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でヒトガラクトシルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（ｈＧａｌＴＩβ４３）のＮ末端に融合したＳｃＭｎｔ１ｐ（ＳｃＫｒｅ２ｐ）（３３）の最初の５８アミノ酸を含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＸＢ３３）をコードする発現カセット；ＰｐＯＣＨ１プロモーターの制御下で完全長ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ゴルジＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＤｍＵＧＴ）をコードする発現カセット；およびＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下で完全長エス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＳｐＧＡＬＥ）をコードする発現カセットを含有する。
株ＲＤＰ６６７−１をプラスミドｐＧＬＹ１６７ｂで形質転換して株ＲＤＰ６９７−１を得た。プラスミドｐＧＬＹ１６７ｂ（図２１を参照されたい）は、ＰｐＵＲＡ３選択マーカーを含有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ａｒｇ１ノックアウトプラスミドである。該プラスミドは、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン（ＫＤ）のＮ末端に融合したＳｃＭｎｎ２ｐ（５３）の最初の３６アミノ酸を含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＣＯ−ＫＤ５３）をコードする発現カセット、およびＰｐＰＭＡ１プロモーターの制御下でラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（ＴＣ）のＮ末端に融合したＳｃＭｎｎ２ｐ（５４）の最初の９７アミノ酸を含む分泌経路標的化融合タンパク質（ＣＯ−ＴＣ５４）を発現する発現カセットを含有する。マンノシダーゼＩＩおよびＧｎＴ ＩＩ触媒ドメインをコードする核酸分子をピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現のためにコドン最適化した（それぞれ配列番号６４および５９）。該株は、末端ガラクトース残基を有するＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる。
株ＲＤＰ６９７−１をプラスミドｐＧＬＹ５１０でトランスフェクトして株ＹＤＸ４１４を得た。プラスミドｐＧＬＹ５１０（図２３を参照されたい）は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ２遺伝子座内に、該遺伝子を重複させて組込まれるロールインプラスミドであり、ＡＯＸ１プロモーター−ＳｃＣＹＣ１ターミネーター発現カセットおよびＰｐＡＲＧ１選択マーカーを含有する。
株ＹＤＸ４１４をプラスミドｐＤＸ４５９−１（ｍＡｂ−Ａ）でトランスフェクトして株ＹＤＸ４５８を得た。プラスミドｐＤＸ４５９−１（図２４を参照されたい）は、ＺｅｏＲを含有する、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ２プロモーターを標的化し該プロモーター内に、該プロモーターを重複して組込まれるロールインプラスミドである。該プラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターにより制御される、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）アルファ−アミラーゼシグナル配列（配列番号２６）のＮ末端にそれぞれが融合した抗ＨＥＲ２抗体重鎖および抗ＨＥＲ２抗体軽鎖（それぞれ配列番号６８および７０）をコードする別々の発現カセットを含有する。重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を、それぞれ配列番号６７および６９に示し、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）アルファ−アミラーゼシグナル配列をコードする核酸配列を配列番号２５に示す。
株ＹＤＸ４５８をプラスミドｐＧＬＹ１１３８を形質転換して株ＹＤＸ４７７を得た。プラスミドｐＧＬＹ１１３８（図２５を参照されたい）は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ１遺伝子座内に、該遺伝子を重複させて組込まれるロールインプラスミドである。該プラスミドはＳｃＡＲＲ３選択マーカー遺伝子カセットを含有する。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＡＲＲ３遺伝子は、亜ヒ酸塩の存在下で増殖される酵母に亜ヒ酸塩耐性を付与する（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｙｅａｓｔ，１３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−３００６６（１９９７））。該プラスミドは、ＰｐＡＯＸ１プロモーターの制御下でトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（ＭＮＳ１）触媒ドメイン（配列番号５５におけるヌクレオチド配列によりコードされる配列番号５６）のＮ末端に融合したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ因子プレシグナル配列（配列番号２４）を含む分泌性融合タンパク質をコードする発現カセットを含有する。該融合タンパク質は培地内に分泌される。
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本発明は、例示されている実施形態に関して本明細書に記載されているが、本発明はそれらに限定されないと理解されるべきである。本明細書中の教示を利用できる当業者は、その範囲内の追加的な修飾および実施形態を認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付されている特許請求の範囲のみにより限定される。

Claims (26)

  1. ガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性を発現するように遺伝的に操作されており、唯一の炭素エネルギー源としてガラクトースを利用しうるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞。
  2. 該宿主細胞が、ガラクトース残基を含むハイブリッドまたは複合Ｎ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を産生しうるように更に遺伝的に操作されている、請求項１記載の宿主細胞。
  3. 該ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性が、ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインとＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼの触媒ドメインとを含む融合タンパク質において得られる、請求項２記載の宿主細胞。
  4. 該宿主細胞が、Ｇ０：Ｇ１／Ｇ２比が２：１未満である複合Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる、請求項２記載の宿主細胞。
  5. 該宿主細胞が、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるＮ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する、請求項２記載の宿主細胞。
  6. 該Ｎ−グリカンが、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるガラクトース末端Ｎ−グリカンである、請求項２記載の宿主細胞。
  7. 該Ｎ−グリカンがガラクトース末端ハイブリッドＮ−グリカンである、請求項２記載の宿主細胞。
  8. 該Ｎ−グリカンが、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるシアル酸化Ｎ−グリカンである、請求項２記載の宿主細胞。
  9. 該組換え糖タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω；ならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；ＧＭ−ＣＳＦ；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；および尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；ならびにＩＬ−２受容体アゴニストからなる群から選択される、請求項２記載の宿主細胞。
  10. ａ）（ｉ）ガラクトース残基を含むハイブリッドまたは複合Ｎ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を宿主細胞が産生することを可能にするグリコシル化経路、
    （ｉｉ）ガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性、ならびに
    （ｉｉｉ）組換え糖タンパク質
    を発現するように遺伝的に操作されている組換え宿主細胞を準備し、
    ｂ）ガラクトースを含有する培地内で該宿主細胞を培養して、ガラクトース残基を有する１以上のＮ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を産生させることを含む、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主における、ガラクトース残基を有するＮ−グリカンを有する組換え糖タンパク質の製造方法。
  11. 該ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性が、ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインとＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼの触媒ドメインとを含む融合タンパク質において得られる、請求項１０記載の製造方法。
  12. 該Ｎ−グリカンのＧ０：Ｇ１／Ｇ２比が２：１未満である、請求項１０記載の製造方法。
  13. 該組換え糖タンパク質が、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるＮ−グリカンを主に有する、請求項１０記載の製造方法。
  14. 該Ｎ−グリカンが、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるガラクトース末端Ｎ−グリカンである、請求項１０記載の製造方法。
  15. 該Ｎ−グリカンがガラクトース末端ハイブリッドＮ−グリカンである、請求項１０記載の製造方法。
  16. 該Ｎ−グリカンが、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるシアル酸化Ｎ−グリカンである、請求項１０記載の製造方法。
  17. 該組換え糖タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω；ならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；ＧＭ−ＣＳＦ；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；および尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；ならびにＩＬ−２受容体アゴニストからなる群から選択される、請求項１０記載の製造方法。
  18. 異種タンパク質を発現する組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞の製造方法であって、
    （ａ）ガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性およびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性からなる群から選択される１つ又は２つの酵素活性を発現するように遺伝的に操作されている宿主細胞を準備し、
    （ｂ）該異種タンパク質、および工程（ａ）の宿主細胞において発現されない、工程（ａ）における群からの酵素をコードする１以上の核酸分子で該宿主細胞を形質転換し、
    （ｃ）ガラクトースを唯一の炭素源として含有する培地内で該宿主細胞を培養して、異種タンパク質を発現する組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を得ることを含む、製造方法。
  19. 該宿主細胞を、ガラクトースパーミアーゼを発現するように更に遺伝的に操作する、請求項１８記載の製造方法。
  20. 該宿主細胞を、ガラクトースを含む１以上のＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に修飾する、請求項１８記載の製造方法。
  21. ａ）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を準備し、
    ｂ）ガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性をコードする１以上の核酸分子で該宿主細胞を形質転換し、
    ｃ）ガラクトースを唯一の炭素源として含有する培地上で該形質転換宿主細胞を培養し、
    ｄ）ガラクトースを唯一の炭素源として含有する培地上で増殖しうる宿主細胞を選択することを含む、ガラクトースを唯一の炭素源として利用しうるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を製造し選択する方法。
  22. Ｇ０：Ｇ１／Ｇ２グリコフォームの比が２：１未満である組換え糖タンパク質を医薬上許容される担体中に含む組成物。
  23. 該糖タンパク質が、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３受容体抗体、抗ＣＤ４１ ７Ｅ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体および抗ＣＤ２０抗体ならびにそれらの変異体からなる群から選択される抗体である、請求項２２記載の糖タンパク質組成物。
  24. 該糖タンパク質がＦｃ融合タンパク質である、請求項２２記載の糖タンパク質組成物。
  25. 該Ｆｃ融合タンパク質がエタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）である、請求項２４記載の糖タンパク質組成物。
  26. 組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＤＸ４７７の遺伝子型と同じ遺伝子型を有する組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞。
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