TW201706412A - Fabry氏病基因療法 - Google Patents
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Abstract
描述一種核酸分子,其包含一編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核苷酸序列,其中該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少85%的同一性。亦描述一種包含該核酸分子之載體、宿主細胞或是基因轉殖動物;以及一種包含該核酸分子或是該載體之藥學組成物。再者,描述該核酸分子於治療Fabry氏病的藥物之方法。
Description
本發明係有關於一種新穎的用於治療Fabry氏病之基因療法。
Fabry氏病為一種罕見的X-性聯遺傳多系統溶體貯積障礙(X-linked inherited multisystem lysosomal storage disorder),估計的盛行率為大概1:40,000。其係由甲型半乳糖苷酶A酵素缺乏造成,導致中性醣原神經脂質(glycosphingolipids)蓄積於各種器官的溶體內,包括血管的內皮與平滑肌細胞。此蓄積導致器官功能的損害,引致末期腎臟病、心臟併發症及中風,與預期壽命縮短大概58年有關聯。
造血幹細胞移植業已證明於Fabry氏病方面為臨床上獲益的,但是與高發病率和死亡率相關聯。於2002年,歐洲藥品管理局許可二種重組型酵素:α半乳糖苷酶(agalsidase alfa)(Shire HGT,Boston MA,USA)和β半乳糖苷酶(agalsidase beta)(Genzyme Inc,Boston MA,USA),其等
代表了Fabry氏病目前唯一可用的特定治療。酵素取代療法(ERT)是一種合理且有希望的Fabry氏病治療,但是不代表治愈,其需要病人終身的每週靜脈投藥,NHS估計的成本為大概£200K/年。此外,顯著比例的病人(55-88%)發展出甲型半乳糖苷酶A之中和抗體,因而使得ERT無效。
相比之下,Fabry氏病之基因療法在轉移正常副本的甲型半乳糖苷酶A基因至受影響的病人以後,透過甲型半乳糖苷酶A之持續的、內源性的生產,而提供治癒的可能性。
本發明人已經發展出一種使用腺病毒相關病毒載體(AAV)之基因療法方法,以媒介甲型半乳糖苷酶A基因之轉移和表現。因Fabry氏病係源於一單一基因之缺損,相對低位準的酵素校正(enzyme correction)會減少儲存的醣原神經脂質。此外,小數目的細胞之校正可能也會由於代謝交叉校正機轉而校正遠端的細胞,其中經校正的細胞分泌甲型半乳糖苷酶A,其會校正旁觀者細胞。最終,本發明人的方法造成(entails)活體內AAV媒介的肝細胞之基因轉移之後肝臟媒介的甲型半乳糖苷酶A之表現,其導致對基因轉殖蛋白質的耐受性,從而降低發展甲型半乳糖苷酶A之中和抗體的風險。
於本發明的第一個態樣中,提供一種核酸分子,其包含一編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核苷酸序
列,其中該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少85%的同一性。
本發明人已經意外地發現新穎的序列辨識編號1之密碼子最佳化的序列,會導致甲型半乳糖苷酶A蛋白質於肝特異性啟動子的控制之下的AAV載體轉導的肝細胞內的表現增高,相對於含有野生型的甲型半乳糖苷酶A cDNA之完全相同的建構物。
該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少85%的同一性。於一些具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少86%的同一性。於其他的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少87%的同一性。於特別的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少88%的同一性。於另外的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少89%的同一性。於一些具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少90%的同一性。於其他的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少91%的同一性。於特別的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少92%的同一性。於另外的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少93%的同一性。於一些具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少94%的同一性。於其他的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少95%的同一性。於特別的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少96%的同一性。
於另外的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少97%的同一性。於一些具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少98%的同一性。於其他的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少99%的同一性。於特別的具體例中,該核苷酸序列具有序列辨識編號1的序列。
該核苷酸序列編碼一種功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質。一種功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質會從醣脂質及醣蛋白質水解末端的α半乳糖部分。適合用於分析甲型半乳糖苷酶A活性的方法為熟悉此藝者眾所皆知的。較佳地,該核苷酸序列編碼具有野生型胺基酸序列的甲型半乳糖苷酶A蛋白質。此序列為熟悉此藝者眾所皆知的。舉例而言,於Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)上、以登錄號CAA29232.1(GI:757912),可以找到此資訊。此蛋白質進一步的資訊可以以NCBI參考序列:NP_000160.1(GI:4504009)找到。野生型蛋白質序列具有429個胺基酸。
於本發明的第二個態樣中,提供一種用於表現甲型半乳糖苷酶A蛋白質之載體。
該載體包含以上所述的核酸分子。此係意指該載體包含一編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核苷酸序列,因此當此序列表現時,含有該載體的細胞會生產一種功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質。
序列辨識編號1的序列為一種密碼子最佳化的甲型半乳糖苷酶A核苷酸序列。此序列並未以一般的方式予以
密碼子最佳化。反而,已經根據肝臟中高位準表現的蛋白質所使用的密碼子來選擇密碼子。此係因為該載體通常表現於肝臟中。業已發現此特別的密碼子最佳化方法所生產的核苷酸序列,提供出人意外地高表現。
該編碼甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核苷酸序列的長度較佳介於1265和1315個核苷酸之間。於一些具體例中,該編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核苷酸序列的長度較佳介於1270和1310個核苷酸之間。於其他的具體例中,該編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核苷酸序列的長度較佳介於1275和1305個核苷酸之間。於特別的具體例中,該編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核苷酸序列的長度較佳介於1280和1300個核苷酸之間。
較佳地,該載體進一步包含一啟動子。該啟動子引致該編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核苷酸序列之表現。可以使用任何合適的啟動子,例如HLP、LP1、HCR-hAAT、ApoE-hAAT,以及LSP。此等啟動子係更詳細地描述於下列參考文獻中:HLP:Mclntosh J.等人,Blood 2013 Apr 25,121(17):3335-44;LP1:Nathwani等人,Blood.2006 April 1,107(7):2653-2661;HCR-hAAT:Miao等人,Mol Ther.2000;1:522-532;ApoE-hAAT:Okuyama等人,Human Gene Therapy,7,637-645(1996);以及LSP:Wang等人,Proc Natl Acad Sci U S A.1999 March 30,96(7):3906-3910。WO 2011/005968中也描述一種較佳的啟動子。另一種較佳的啟動子具有序列辨識編號2的序列,以及稱之
為HLP2。具有序列辨識編號2的序列之啟動子為一種肝特異性啟動子,業已發現其於肝臟中會提供特別好的表現。儘管會提供良好的表現,此啟動子也是相對地小而允許更有效率的載體包裝。較佳地,該啟動子為一種肝特異性啟動子。
序列辨識編號3為一種載體建構物的核苷酸序列,其包括一種啟動子以及一種編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核苷酸序列。因而,本發明的核酸分子可以包含一種核苷酸序列,該核苷酸序列與序列辨識編號3的序列具有至少90%的同一性。在其他的具體例之中,該核苷酸序列與序列辨識編號3的序列具有至少91%的同一性。於特別的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號3的序列具有至少92%的同一性。於另外的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號3的序列具有至少93%的同一性。於一些具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號3的序列具有至少94%的同一性。於其他的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號3的序列具有至少95%的同一性。於特別的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號3的序列具有至少96%的同一性。於另外的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號3的序列具有至少97%的同一性。於一些具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號3的序列具有至少98%的同一性。於其他的具體例中,該核苷酸序列與序列辨識編號3的序列具有至少99%的同一性。於特別的具體例中,該核苷酸序列具有序列辨識編號3的序列。
該載體可以是任何合適用於表現甲型半乳糖苷酶A蛋白質之載體,包括病毒及非病毒載體。病毒載體包括一種小病毒(parvovirus)、一種腺病毒(adenovirus)、一種反轉錄病毒(retrovirus)、一種慢病毒(lentivirus)或是一種單純疱疹(herpes simplex)病毒。小病毒可以為一種腺病毒相關病毒(adenovirus-associated virus)(AAV)。該載體較佳地為一種重組型腺病毒相關病毒(adeno-associated viral)(rAAV)載體或是一種慢病毒載體。更佳地,該載體為一種rAAV載體。
依據本發明的載體可以為一種基因遞送載體。此一種基因遞送載體可以為一種病毒基因遞送載體或一種非病毒基因遞送載體。
因而,本發明提供動物的小病毒為基之基因遞送載體,尤其是依賴病毒屬(dependoviruses),例如感染性人類或是猴(simian)AAV,以及其等之組分(舉例而言,一種動物的小病毒基因組)供用於作為導入及/或表現甲型半乳糖苷酶A蛋白質於一種哺乳動物細胞中的載體。當使用於本文中,術語“小病毒”因而包含依賴病毒屬,例如任一種的AAV。
小DNA病毒科(Parvoviridae family)的病毒是小的DNA動物的病毒。小DNA病毒科(Parvoviridae family)可以劃分二個亞科:感染脊椎動物的小病毒亞科(Parvovirinae),以及感染昆蟲的濃核癥病毒亞科(Densovirinae)。小病毒亞科(Parvovirinae)的成員於此稱為
小病毒,且包括依賴病毒屬(genus Dependovirus)。可以從其等之屬名推論出,依賴病毒屬的成員獨特在於其等通常需要與輔助病毒,例如腺病毒或疱疹病毒,共感染(coinfection)用於細胞培養物內之生產性感染。依賴病毒屬(genus Dependovirus)包括AAV,其通常感染人類(舉例而言,血清型1、2、3A、3B、4、5,及6)或是靈長類動物(舉例而言,血清型1和4),以及相關的病毒,其感染其他的溫血動物(舉例而言,牛、犬、馬,及綿羊腺病毒相關病毒)。有關小病毒另外的資訊以及其他的小病毒亞科(Parvovirinae)成員係描述於Kenneth I.Berns,Fields Virology(3d Ed.1996),第69章之"Parvoviridae:The Viruses and Their Replication"中。為了方便,本發明於此參照AAV予以進一步舉例及說明。然而,瞭解到本發明不限定於AAV,但是同時也可以應用於其他的小病毒。
全部已知的AAV血清型之基因組組成是非常相似的。AAV之基因組為線狀、單股的DNA分子,其之長度少於大約5,000個核苷酸(nt)。反向末端重複(Inverted terminal repeats)(ITRs)位於非結構複製(Rep)蛋白質及結構(VP)蛋白質,唯一的編碼核苷酸序列之側面。VP蛋白質(VP1、-2及-3)形成殼體(capsid)。末端的145nt為自互補的,以及予以組織以使得能形成積極穩定的分子內的雙聯體(duplex),其會形成一種T-型髮夾。此等髮夾的結構係作用為一種用於病毒DNA複製的起點,供使用作為細胞的DNA聚合酶複合物的引子。野生型(wt)AAV感染哺乳動物細胞之
後,Rep基因(亦即,編碼Rep78和Rep52蛋白質)分別由P5啟動子及P19啟動子表現,以及二種Rep蛋白質都於病毒基因組複製上有作用。一種Rep ORF之剪接品件(splicing event)引致實際上四種Rep蛋白質之表現(亦即,Rep78、Rep68、Rep52,以及Rep40)。然而,業已顯示編碼Rep78和Rep52蛋白質之未剪接的mRNA,於哺乳動物細胞中對於AAV的載體生產有充分能力。並且Rep78和Rep52蛋白質於昆蟲細胞中能滿足AAV載體生產的需要。
於一種適合使用作為一種基因遞送的載體之AAV方面,該載體基因組典型地包含一種待包裝遞送至一標靶細胞的核酸。根據此特別的具體例,異源性核苷酸序列係位處於該載體基因組的任一端之病毒ITRs之間。於另外較佳的具體例中,小病毒(舉例而言AAV)cap基因及小病毒(舉例而言AAV)rep基因係從模板基因組刪除(以及因而由此生產的病毒粒子DNA)。此組態使能被小病毒殼體攜帶的核酸序列的尺寸增加至最大。
根據此特別的具體例,該核酸係位處於基質的任一端的病毒ITRs之間。小病毒基因組僅用一個ITR來作用是有可能的。因而,於本發明以小病毒為基之基因療法的載體方面,該載體基因組的側面有至少一個ITR,但是更典型地,有二個AAV ITRs(一般而言,該載體基因組的任一端具有一個,亦即,一者在5’端以及一者在3’端)。於該載體基因組內的核酸及ITRs的一者或多者之間可能有介入序列。
較佳地,該編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質
的核苷酸序列(用於表現於哺乳動物細胞中)會被併入至小病毒基因組之內,位處於二個規則的ITRs之間或是位處於一種用二個D區域遺傳工程建造的ITR之任一邊上。
可以使用於本發明中用於生產AAV基因療法的載體之AAV序列,可以衍生自任一種AAV血清型之基因組。一般而言,AAV血清型於胺基酸及核酸位準上具有基因組的序列之顯著同源性,提供同一組的基因功能,生產實質上實體及功能均等的病毒粒子,以及藉由實際上完全相同的複製和組合的機制。關於各種各樣的AAV血清型之基因組的序列,以及基因組相似性之綜述,見,舉例而言,GenBank存取號碼U89790;GenBank存取號碼J01901;GenBank存取號碼AF043303;GenBank存取號碼AF085716;Chiorini等人,1997;Srivastava等人,1983;Chiorini等人,1999;Rutledge等人,1998;以及Wu等人,2000。AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8或9可以使用於本發明中。然而,AAV血清型1、5或8為供用於本發明的情境中之AAV序列較佳的來源。當使用於基因療法的載體生產時,源自AAV血清型之序列可以是突變的或是遺傳工程建造的。
較佳地,供用於本發明的情境中之AAV ITR序列係衍生自AAV1、AAV2、AAV4及/或AAV6。同樣地,Rep(Rep78和Rep52)編碼序列較佳衍生自AAV1、AAV2、AAV4及/或AAV6。然而編碼供用於本發明的情境中之VP1、VP2,和VP3殼體蛋白質的序列可以取自於已知的42種血清型中的任一種,更佳地取自於AAV1、AV2、AAV3、AAV4、
AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9或是藉由舉例而言,殼體混洗技術及AAV殼體庫,而獲得的新開發似AAV顆粒(AAV-like particles)。
於多數血清型中,AAV Rep及ITR序列為特別守恆的。各種各樣的AAV血清型之Rep78蛋白質,舉例而言為超過89%同一性的,以及AAV2、AAV3A、AAV3B,及AAV6之間的總核苷酸序列之同一性於基因組位準為大約82%(Bantel-Schaal等人,1999)。此外,已知許多AAV血清型的Rep序列和ITRs在哺乳動物細胞內於AAV顆粒的生產中會有效率地交叉互補(cross-complement)(亦即,功能性取代(functionally substitute))源自其他血清型的對應序列。US 2003148506報導AAV Rep及ITR序列亦會在昆蟲細胞內有效率地交叉互補其他的AAV Rep及序列。
AAV VP蛋白質已知會決定AAV病毒粒子之細胞向性(tropicity)。在不同的AAV血清型之中,編碼VP蛋白質的序列顯著地比Rep蛋白質和基因更不守恆。Rep和ITR序列交叉互補其他的血清型對應序列的能力,允許生產假性的(pseudotyped)AAV顆粒,其包含一種血清型(舉例而言,AAV1、5或8)的殼體蛋白質,以及另一種AAV血清型(舉例而言,AAV2)之Rep及/或ITR序列。此等假性的rAAV顆粒為本發明的一部份。
經修飾的"AAV"序列亦可以使用於本發明的情境中,舉例而言用於AAV基因療法的載體之生產。此等經修飾的序列,舉例而言包括的序列,對於一種AAV1、AV2、
AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9 ITR、Rep,或VP,具有至少大約70%,至少大約75%,至少大約80%,至少大約85%,至少大約90%,至少大約95%,或是更大的核苷酸及/或胺基酸序列同一性(sequence identity)(例如,一種序列具具有大約75-99%核苷酸序列同一性),可以使用來代替野生型AAV ITR、Rep,或是VP序列。
儘管於許多方面相似於其他的AAV血清型,但是AAV5與其他的人類和猴AAV血清型之差異,比其他已知的人類和猴血清型更多。有鑑於此,rAAV5之生產可能不同於其他的血清型於昆蟲細胞中之生產。利用本發明的方法來生產rAAV5的情況下,較佳為一種或多種建構物,於全體超過一種建構物的情況下,包含一種核苷酸序列,該核苷酸序列包含一種AAV5 ITR、一種核苷酸序列包含一種AAV5 Rep編碼序列(亦即,一種核苷酸序列包含一種AV5 Rep78)。此等ITR和Rep序列可以按需要予以修飾來獲得有效率的生產AAV5或是假性的AAV5載體。舉例而言,Rep序列的起始密碼子可以予以修飾,VP剪接位置可以予以修飾或消除,及/或VP1的起始密碼子和附近的核苷酸可以予以修飾以改良AAV5載體的生產。
因而,本發明中使用的病毒殼體可以來自任一種小病毒,如以上所述不是一種自發性小病毒就是依賴病毒屬。較佳地,病毒殼體為一種AAV殼體(例如,AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5或是AAV6之殼體)。一般說來,AAV1殼體或AAV6殼體為較佳的。小病毒殼體可以如同本技藝已
知的、根據一些考慮因素來選擇,舉例而言,標靶細胞的種類、所欲的表現位準、待表現的異源性核苷酸序列之本質、與病毒生產相關的問題,以及類似物。舉例而言,AAV1和AAV6之殼體可以有利地使用於骨骼肌;AAV1、AAV5及AAV8用於肝和中樞神經系統的細胞(例如,腦);AAV5用於在氣道和肺或腦中的細胞;AAV3用於骨髓細胞;以及AAV4用於腦中特定的細胞(舉例而言,可附加細胞(appendable cell))。
選擇最合適的病毒、病毒亞型或是病毒血清型是在熟習此藝者的專門技術範圍內。一些亞型或是血清型可能比其他者更適合於某種類型的組織。
舉例而言,本發明的一種核酸之肝特異性的表現可以有利地藉由AAV-媒介的肝細胞之轉導而被誘導。肝臟禁得起AAV-媒介的轉導,以及可以使用不同的血清型(舉例而言,AAV1、AAV5或是AAV8)。肌肉的轉導可以透過經由血流投藥一種編碼一核酸之AAV來完成。因而,可以應用靜脈內或是動脈內的投藥。
一種依據本發明製備的小病毒基因療法的載體可以為一種"混合種(hybrid)"顆粒,其中病毒TRs及病毒殼體係源自不同的小病毒。較佳地,病毒TRs及殼體係源自不同血清型的AAV。同樣地,小病毒可以具有一種"嵌合的"殼體(例如,包含源自不同的小病毒之序列,較佳為不同的AAV血清型)或是一種"靶定的"殼體(例如,一種定向向性(directed tropism))。
瞭解到於本發明的情境中,"至少一種小病毒ITR核苷酸序列"係意指一種迴文序列,其包含最互補、對稱性配置的序列,亦稱之為"A"、"B"以及"C"區域。ITR作用為一種複製的起點,於複製方面具有"順式"角色的位置,亦即,為反式作用(trans-acting)複製蛋白質的識別位置,例如舉例而言,Rep 78(或Rep68),其會識別迴文及迴文內部之特異性的序列。ITR序列的對稱性之一種例外是ITR之"D"區域。其是獨特的(於一種ITR內不具互補性)。單股DNA的缺口發生在A和D區域之間的接合處。其為新的DNA合成起始的區域。D區域通常位於迴文的一側,以及提供核酸複製步驟的方向性。一種小病毒於一種哺乳動物細胞中之複製作用典型具有二個ITR序列。然而,遺傳工程建造一種ITR是有可能的,以便A區域及D區域的二股上之結合位址係對稱性地設置,迴文的每側上有一者。於雙股環形的DNA模板(例如,一種質體)上,Rep78-或是Rep68-輔助的核酸複製接著於二個方向上繼續進行,以及一單一的ITR滿足一種環形載體之小病毒複製的需要。因而,於本發明的情境中可以使用一種ITR核苷酸序列。然而,使用二個或是另一種偶數的規則ITRs為較佳的。最佳地,使用二個ITR序列。一種較佳的小病毒ITR為一種AAV ITR。為了安全之故,可能希望建構一種小病毒(AAV)的載體,其在最初導入至一種細胞內以後不能進一步繁殖。此一種用於限制非所欲的載體於一接受者內繁殖之安全機制,可以透過使用AAV加上一種嵌合的ITR來提供,如同US 2003148506中所述。
熟習此藝者會明瞭,使用來生產本發明的AAV載體之病毒Rep蛋白質,可以考慮病毒ITRs的來源進行選擇。舉例而言,AAV5 ITR典型地會與AAV5 Rep蛋白質更有效率地互相作用,儘管ITR和Rep蛋白質的血清型之匹配並不是必要的。
本發明中使用的ITR(s)典型地為官能性的,亦即,其等可以是完全可解析的(resolvable),以及較佳地具有血清型1、2、3、4、5或是6之AAV序列為較佳的。依據本發明可解析的AAV ITRs不必要具有一野生型ITR的序列(例如,一種野生型的序列可以藉由插入、刪除、截斷或是誤義突變而改變),只要該ITR媒介所欲的功能就可以,例如,病毒包裝、整合,及/或原病毒拯救(provirus rescue),以及類似物。
有利地,與先前的方法比較,透過使用一種基因療法的載體來恢復蛋白質的合成,亦即甲型半乳糖苷酶A之合成,係轉導的細胞會永久獲取或是持續一段時間獲取的特徵,因而可避免對於連續的投藥來完成治療性效果之需要。
於是,本發明的載體因此代表了一種工具用於發展活體內遞送甲型半乳糖苷酶A核苷酸序列的策略,其係透過遺傳工程建造核酸於一種基因療法載體之內,該基因療法載體有效率地轉導一種合適的細胞類型,例如一種肝細胞。
該載體可以為一種單股載體或是自互補的載體。
在一些具體例中,該載體為一種單股載體。於其他的具體例中,該載體為一種自互補的載體。
該載體可以進一步包含一種多腺苷酸尾。較佳地,此係放置在編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核苷酸序列之下游。較佳地,該多腺苷酸尾為一種小牛生長激素多腺苷酸尾。較佳地,此載體之長度係介於250和270個核苷酸之間。
該載體可以包含其他的元素以允許該功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質被表現。此等元素為熟習此藝者眾所周知的。
較佳地,如以上所述的核酸係經單離的。
以上所述的核酸分子之生產會是在熟習此藝者的能力之內。此舉例而言,能利用化學合成給定的序列而完成。
再者,熟習此藝者能夠無困難地判定一種核酸是否表現功能性蛋白質。熟習此藝者會明瞭合適的方法。舉例而言,一種合適的活體外方法係涉及插入該核酸至一載體之內,例如一種慢病毒或是一種AAV載體,以該載體轉導宿主細胞,例如293T或是HeLa細胞,以及分析甲型半乳糖苷酶A的活性。任擇地,一種合適的活體內方法係涉及轉導一種包含該核酸的載體至有Fabry氏病的小鼠內,以及分析小鼠的血漿內之功能性甲型半乳糖苷酶A。以下更詳細地描述合適的方法。
該核酸可以為由核苷酸組成的任一種核酸。該核
酸應該能夠表現以便生產蛋白質。較佳地,該核酸為DNA或是RNA。
本發明亦提供一種宿主細胞,其包含以上所描述的核酸分子或是載體之任一者。較佳地,該載體能夠表現甲型半乳糖苷酶A核苷酸序列於宿主之內。宿主可以為任一種合適的宿主。
當使用於本文中,術語“宿主”係提及有機體及/或細胞,其懷有本發明的一種核酸分子或是一載體,以及合適供用於表現一種重組型基因或是蛋白質之有機體及/或細胞。本發明不打算限定於任一種特定類型的細胞或是有機體。更確切地,可以預期的是能於本發明找到作為宿主的用途之任一種合適的有機體及/或細胞。一種宿主細胞可以為一種單一細胞的形式,相似的或是不同的細胞族群,舉例而言一種培養物的形式(例如一種液體培養物或是一種於固體基質上的培養物),一種有機體或是其之一部分。
一種依據本發明的宿主細胞可以允許本發明的一種核酸分子之表現。因而,宿主細胞可以為,舉例而言,一種細菌、一種酵母、一種昆蟲或是一種哺乳動物細胞。
此外,本發明提供一種包含細胞之基因轉殖動物,該細胞含有如上所述之編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核酸分子或是如上所述之載體。較佳地,動物為一種非人類的哺乳動物,尤其是一種靈長類動物。任擇地,動物可以為一種囓齒類,尤其是小鼠;或者可以是犬、貓、綿羊或是豬。
於一個態樣中,本發明提供一種藥學組成物,其包含本發明之核酸分子或是載體,以及一種或更多種藥學上可接受的賦形劑。一種或更多種賦形劑包括載劑、稀釋劑及/或其他的藥劑、藥學劑或佐劑等等。
本發明亦提供一種治療Fabry氏病的方法,其包含投藥治療有效量之如上所述的載體至一罹患Fabry氏病的病人。較佳地,病人為人類。
當Fabry氏病於以上方法中予以“治療(treated)”時,此係意指Fabry氏病的一種或多種症狀被減輕。其並非意指Fabry氏病的症狀完全醫治(remedied)以使得其等不再存在於該病人體內,但於一些方法中,可能是這樣的情況。該治療方法會引致Fabry氏病之一種或多種症狀比治療之前不嚴重。
"治療有效量"係指對於達成所欲的治療結果,有效的劑量及必需的時間期間之數量,例如提升一主體體內功能性甲型半乳糖苷酶A之位準(以便導致功能性甲型半乳糖苷酶A生產達到足以減輕Fabry氏病症狀的位準)。
遞送本發明的核酸或載體至活體內的宿主細胞,可以引致宿主內功能性甲型半乳糖苷酶A增加至,舉例而言會減輕Fabry氏病之一種或多種症狀的位準。
一個罹患Fabry氏病的主體體內的天然存在的甲型半乳糖苷酶A之位準,端視Fabry氏病的嚴重性而變化。帶有嚴重形式疾病的病人之甲型半乳糖苷酶A之位準低於正常健康主體體內存在的位準(於此稱之為“正常位準”)之
大約1%。業已發現當使用本發明的治療方法時,其可造成功能性甲型半乳糖苷酶A位準增高至正常位準之至少大約1%。於一些具體例之中,本發明的治療方法造成功能性甲型半乳糖苷酶A的位準增高至正常位準之至少大約2%,至少大約3%,至少大約4%,至少大約10%,至少大約15%,至少大約20%或是至少大約25%。於一特別的具體例之中,本發明的治療方法造成功能性甲型半乳糖苷酶A的位準增高至正常位準之至少大約30%。
於一個具體例中,本發明的治療方法造成功能性甲型半乳糖苷酶A的位準增高至,最多為,正常的位準。
功能性甲型半乳糖苷酶A的活性可以相當容易地測量,以及測量甲型半乳糖苷酶A活性的方法為熟習此藝者眾所周知的。甲型半乳糖苷酶的活性可以方便地於血液內測量,其係使用如Clin.Biochem.45(15):1233-8(2012)中所述之血斑點。此方法的原理是於酸性pH下,甲型半乳糖苷酶會使基質,4-甲基繖形基-a-D-吡喃半乳糖苷(4-methylumbelliferyl-a-D-galactopyranoside),水解成4-甲基繖形酮及半乳糖。添加鹼性緩衝液來停止酵素反應且使4-甲基繖形酮於不同於未水解基質的波長下發出螢光,從而於未水解基質存在非常過量的情況下,能測量4-甲基繖形酮。於白血球中,通常超過95%之總甲型半乳糖苷酶的活性為甲型半乳糖苷酶A,反之於血漿及培養的細胞內,同功異構酶甲型半乳糖苷酶B對總甲型半乳糖苷酶的活性會有顯著地貢獻。甲型半乳糖苷酶A可以於甲型半乳糖苷酶B
存在的情況下測量,其係利用同功異構酶A增高的耐熱性(heat liability),以及於血漿內甲型半乳糖苷酶B可以透過添加a-NAc半乳胺糖而抑制。此方法主要的優勢是只需要濾紙上5ul乾掉的全血斑點。此提供即時測量甲型半乳糖苷酶位準的優勢,像是於載體投與之後進行的Fabry Ko小鼠的實驗。
任擇地,血漿內的甲型半乳糖苷酶A活性可以於小鼠基因轉移之後以末端的出血來進行評估。此方法係基於如上的事實,即於酸性pH下,甲型半乳糖苷酶會使基質,4-甲基繖形基-a-D-吡喃半乳糖苷(4-methylumbelliferyl-a-D-galactopyranoside),水解成4-甲基繖形酮及半乳糖。此外,甲型半乳糖苷酶也可以利用能顯示抗原位準之標準的西方墨點法或是標準的(ELISA型)免疫分析法來測量。
再者,本發明提供如上所述之編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核酸分子,或是如上所述之載體,供用於,舉例而言,治療Fabry氏病之療法。
此外,本發明提供如上所述之編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核酸分子或是如上所述之載體,於製造供用於治療Fabry氏病的藥物之用途。
本發明亦提供一種用於遞送編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核苷酸序列至一主體的方法,該方法包含投藥如上所述之編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核酸分子或是如上所述之載體至該主體。
於以上的說明中,術語“同一性(identity)”係用來提及二種序列的相似性。為了此發明的目的,於此定義俾以判定二種核苷酸序列之同一性百分率(percent identity),使該序列以最佳比較的目的而對準(舉例而言,可以將空格導入一種第一核酸之序列中用於與第二胺基酸或核酸序列)。繼而以核苷酸的位置來比較核苷酸殘基。當第一序列中的位置係如同第二序列中對應的位置相同的胺基酸或核苷酸殘基佔據時,那麼該分子於該位置是同一的。二個序列之間的同一性百分率為該序列共享的同一位置之數目的函數(亦即,同一性%=同一位置之數目/位置之總數目(亦即,重疊的位置)x 100)。較佳地,二個序列的長度相同。
序列的比較可以於待比較的二個序列全部的長度上進行,或是於二個序列的片段上進行。典型地,比較係於待比較的二個序列全部的長度上進行。然而,序列同一性可以於大約二十個、大約五十個、大約一百個、大約二百個、大約五百個、大約1000個或大約2000個或是更多個連續核酸殘基的區域上進行。
熟習此藝者會明瞭可利用幾種電腦程式來判定二個序列之間的同源性或是同一性。於較佳的具體例中,二個序列之間的同一性百分率之判定係使用軟體套件Clone Manager Professional版本9(較佳為版本9.4)來分析。此分析工具係由Sci-Ed軟體(Scientific & Educational Software,11010 Lake Grove Blvd,Ste 100,PMB 122,Morrisville,NC 27560,USA-http://www.scied.com/
index.htm)生產的。使用來比較序列的設定較佳如下:對準:整體DNA對準;參數:二股;計分矩陣:線性(失配2,OpenGap 4,ExtGap 1)。任擇地,也可以使用下列方法,例如Fast Scan-MaxScore以及Fast Scan MaxQual,加上使用局部設定的相同軟體。
也可以使用其他的方法來判定序列同一性。舉例而言,於二個胺基酸或核酸序列之間的同一性百分率可以使用Needleman和Wunsch(1970)演算法來判定,其業已被併入至Accelrys GCG的軟體套件中的GAP程式之內(可得自於http://www.accelrys.com/products/gcg/),其係使用一種Blosum 62矩陣或是PAM250矩陣,以及16、14、12、10、8、6,或是4的空格權重,以及1、2、3、4、5,或是6的長度權重。
本說明書中列舉的全部專利及參考文獻係以其等之全體併入於此以作為參考資料。
熟習此藝者會明瞭本發明的全部態樣,不管其等是相關於舉例而言,核酸、載體、宿主細胞還是用途,同時也可適用於本發明全部的其他態樣。尤其是,治療方法的態樣,舉例而言核酸或載體之投藥,可能已經比本發明一些其他的態樣,舉例而言有關於核酸或是載體用於治療Fabry氏病之用途,予以描述得更加詳細。然而,熟習此藝者會明瞭本發明的特定態樣中業已提供更詳細的資訊,此資訊一般同時也可適用於本發明的其他態樣。再者,熟習此藝者亦會明瞭有關於治療方法之說明同時也可適用於該
核酸或載體於治療Fabry氏病之用途。
本發明現在將參照附圖更詳盡地說明但僅作為舉例,其中:圖1顯示一種鹼性凝膠分析,其闡釋表現野生型(wt)甲型半乳糖苷酶A(在梯狀物旁的左邊通道)和密碼子最佳化的(codon optimized,codop)甲型半乳糖苷酶A(右邊通道)之scAAV8載體二者皆係完全封裝的,且無可偵側的部分基因組。此等載體係以血清型8殼體而成為假性的(pseudotyped),其中wt或密碼子最佳化的甲型半乳糖苷酶A基因係處於一種肝特異性HLP啟動子的控制之下。
圖2闡釋一種包含密碼子最佳化的甲型半乳糖苷酶A之scAAV載體(ScAAV-GLA-codop),當以1x107vg/細胞之感染的多樣性(multiplicity of infection)(MOI)予以轉導至HUH7肝癌細胞內時,不會影響內源性甲型半乳糖苷酶A轉錄本之位準(左上方組),但是會表現高位準的密碼子最佳化的甲型半乳糖苷酶A之mRNA(右上方組)。以增高的MOIs來轉導scAAV-GLA-codop至HUH7細胞內,會導致甲型半乳糖苷酶A轉錄本之增高及劑量特異性的表現(底部組)。
圖3闡釋表現野生型(WT-GLA)和密碼子最佳化的(codop-GLA)甲型半乳糖苷酶A(α-gal A)之scAAV載體,係以二重複使用來轉導HUH7細胞。GLA-codop載體顯示出媒介更高的GLA蛋白質的表現。
圖4顯示於單一推注尾靜脈注射4e10vg/小鼠
(=~2x1012vg/kg)或是4e11vg/小鼠(=~2x1013vg/kg)的AAV8假性的scAAV-GLA-codop後,成年Fabry小鼠(年紀3個月)或是1週大、2週大或3週大的新生小鼠體內之甲型半乳糖苷酶A的活性。於基因轉移三個月之後,當預期轉基因表現已經達到高峰之時,判定活性。於末端出血時收集資料(血漿位準)。
圖5顯示於單一推注尾靜脈注射4e10vg/小鼠(=~2x1012vg/kg)或是4e11vg/小鼠(=~2x1013vg/kg)的AAV8假性的scAAV-GLA-codop後,成年Fabry小鼠(年紀3個月)或是1週大、2週大或1個月大的新生小鼠體內之甲型半乳糖苷酶A的活性。於基因轉移三個月之後,當預期轉基因表現已經達到高峰之時,判定活性。資料係使用血斑點“即時”收集。
圖6顯示源自轉導動物的肝臟之西方墨點法分析。以4e11vg/小鼠的劑量轉導之後,表現高位準的甲型半乳糖苷酶A,但是以4e10vg/小鼠的劑量之後未表現高位準的甲型半乳糖苷酶A。
圖7顯示源自轉導動物的腎臟、白血球(WBC)及心臟內之甲型半乳糖苷酶A的西方墨點法分析。
圖8顯示α-GLA剔除小鼠,於早期i.p.注射載體之後,腎臟內醣原神經脂質沉着之電子顯微照片。A)未治療,B)於一週大時以低劑量(2e12vg/kg)AAV治療的小鼠,以及C)高劑量(2e13vg/kg)AAV治療的小鼠。於i.p.注射5個月之後,挑選出治療的小鼠(放大率:x5000以及x2000)。
圖9顯示α-GLA剔除小鼠,於中間期i.p.注射載體
之後,腎臟內醣原神經脂質沉着之電子顯微照片。A)未治療,B)於三週大時以低劑量(2e12vg/kg)AAV治療的小鼠,以及C)高劑量(2e13vg/kg)AAV治療的小鼠。於i.p.注射一個月之後,挑選出治療的小鼠(放大率:x5000以及x2000)。
圖10顯示α-GLA剔除小鼠,於中間期i.v.注射載體之後,腎臟內醣原神經脂質沉着之電子顯微照片。A)未治療,B)於一個月大時以低劑量(2e12vg/kg)AAV治療的小鼠,以及C)高劑量(2e13vg/kg)AAV治療的小鼠。於i.v.注射10個月之後,挑選出治療的小鼠(放大率:x5000、x2000以及x200)。
圖11顯示α-GLA剔除小鼠,於晚期i.v.注射載體之後,腎臟內醣原神經脂質沉着之電子顯微照片。A)未治療,B)於3個月大時以低劑量(2e12vg/kg)AAV治療的小鼠,以及C)高劑量(2e13vg/kg)AAV治療的小鼠。於i.v.注射13個月之後,挑選出治療的小鼠(放大率:x5000、x2000以及x200)。
本發明人的研究計畫最重要的目標是要建立一種安全、有效,以及可廣泛地利用的Fabry氏病之治癒法。為了追求這目標,本發明人已經發展出一種用獨特的密碼子最佳化的甲型半乳糖苷酶A序列之肝定向的基因轉移方法。
本發明的優點在於:
1.一種編碼甲型半乳糖苷酶A之AAV之單一的末梢靜脈輸注液,能導致有Fabry氏病的病人體內甲型半乳糖苷酶A長期的表現。於AAV媒介的基因轉移後甲型半乳糖苷酶A穩定的長期表現,將:a.發揮比酵素取代療法(ERT)可能的臨床益處更顯著的臨床益處,從而增進預防末端器官損害的可能性及改善有Fabry氏病病人的預期壽命;b.消除定期終身輸注甲型半乳糖苷酶A之需要,因而改善生活品質;以及c.由於降低/消除需要昂貴的ERT而導致NHS可能的節省
2.由於密碼子最佳化的表現匣更有力的表現,導致使用較低劑量AAV載體之治療益處
3.於AAV媒介的基因轉移後持續較高的甲型半乳糖苷酶A血漿位準,且因而改善矯正中樞神經系統內病理學的可能性,以及
4.肝臟表現甲型半乳糖苷酶A會使發展出此蛋白質之中和抗體的風險降低,此風險發生於介於55-88%的ERT後病人。
本發明人已經於成年(3個月大)以及新生(2天大)Fabry模式小鼠體內觀察到scAAV8媒介的基因轉移,其導致α-gal A的位準實質高於攝取此酵素相關的主要器官之生理位準,因而使有Fabry氏病的病人之Fabry氏病之疾病表
現型減輕之可能性升高。已經觀察到於肝臟媒介的轉基因表現後,包括於早期接受該載體的動物內,對該蛋白質沒有免疫反應,且因此有低位準的α-gal A表現,最有可能是反映了因肝臟持續生長至成年的尺寸,而喪失附加(episomally)維持的AAV載體基因組。
將表現野生型(WT-GLA)和密碼子最佳化的(codop-GLA)甲型半乳糖苷酶A之scAAV8載體轉導至一種肝癌細胞株,HUH7細胞之內,以評估效能。簡言之,HUH7細胞培養含10% FBS之DMEM之內,且以每個井5x104個細胞予以平盤培養於6井的培養平盤中,以OPTIMEM培養基清洗二次(Life Technologies),然後以AAV載體予以轉導。於72小時之後,收穫細胞用於萃取DNA、RNA或是蛋白質。DNA萃取係使用DNEasy血液及組織套組(Qiagen)來執行,以及基因組複本數及轉基因特異性引子以及細胞管家基因(小鼠或人類GAPDH或是β-肌動蛋白)係使用QPCR方法來計算。一種標準曲線係設定於QPCR期間,此允許能計算AAV載體之基因組複本數。藉由萃取後判定基因組DNA的濃度,以及假定各細胞的DNA含量為6.6pg來計算宿主的基因組複本數。透過此兩個數值相除,來計算每宿主細胞的載體基因組複本。RNA萃取之執行係使用Trizol(Life Technologies)且使用製造商的說明來進行,以及使用Superscript II(Life Technologies)來產生cDNA。QRTPCR係使用內源性或是密碼子最佳化形式的甲型半乳糖苷酶A之
特異性引子來執行。於西方墨點法方面,細胞係以添加蛋白酶及磷酸酶抑制劑(Sigma-Aldrich)之RIPA緩衝劑來萃取。
小鼠的腎實質之超微結構係於密碼子最佳化的甲型半乳糖苷酶A之基因轉移後的各種時間點,使用高解析度電子顯微鏡來評估。載體係以低劑量(2e12vg/kg)或是高劑量(2e13vg/kg)來投與。
於基因轉移後的各種時間點宰殺小鼠。移除腎臟且於10%中性緩衝的福馬林,甲基卡諾氏溶液(methyl Carnoy's solution)內固定,且小塊係用2.5%戊二醛及2%聚甲醛予以固定,接著以1%四氧化鋨進行後固定,以及使用標準程序包埋於Epon內。Epon包埋的小塊係用鑽石刀、切
割80nm。然後超薄切片係用乙酸氧鈾及檸檬酸鉛予以雙重染色供用於電子顯微鏡。相同的塊面(block faces)係用藍寶石刀代替鑽石刀、切割1μm。於一種H-7650電子顯微鏡下檢查切片。
初始的評估已經顯示出用一種編碼於一種肝特異性HLP啟動子的控制之下、密碼子最佳化的甲型半乳糖苷酶A之AAV載體進行的肝細胞轉導,會導致基因轉殖的甲型半乳糖苷酶A之表現位準,比用含有野生型的甲型半乳糖苷酶A cDNA之完全相同的建構物觀察到的表現位準高四倍,此基於先前技藝是意想不到的(圖2及3)。
Fabry模式小鼠係從Kulkarni(T.Ohshima等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94(1997),pp.2540-2544)獲得的C57BL/6半合子雄性小鼠(0/-)及同型合子雌性小鼠(-/-)配種者。成年Fabry小鼠(年紀3個月)接受單一推注尾靜脈注射4e10vg/小鼠(=~2x1012vg/kg)或是4e11vg/小鼠(=~2x1013vg/kg)的AAV8假性的scAAV-GLA-codop,根據驗證q-PCR分析法及凝膠為基的定量分析法。1週大、2週大或3週大的新生小鼠給予腹膜內注射之相同劑量的載體。之後每2週從尾靜脈採集血液樣本。甲型半乳糖苷酶A的活性係於末端出血時透過一種如上所述之功能性分析法來判定(血漿位準),末端出血係於基因轉移三個月之後,當預期轉基因表現已經達到高峰時(圖4)。甲型半乳糖苷酶A的活性位準亦使用血斑點法“即時”評估(圖5),因此方法需要較小
的樣本體積(通常為20μl的血)。
所有的小鼠定群(N=4隻動物/組)均觀察到高位準的功能性甲型半乳糖苷酶A活性物,不論該載體係投與至成年小鼠(3個月=3M)或是於第1-3週之間的產後早期(於1W、2W、3W單一推注注射)。於3個月接受2x1012vg/kg的載體的動物之活性位準是較高的,平均值±SD=544nmol/hr/ml。但是於出生後1週注射相同劑量的載體之動物內的位準為低7倍,以80nmol/hr/ml。此仍然比人類的正常位準高4倍,正常位準的範圍是4.0-21.9nmol/hr/ml。於同型合子Fabry小鼠方面,觀察到0-0.9nmol/hr/ml之活性位準,而異型合子動物之位準接近~7.4nmol/hr/ml。因而,基因轉移後,觀察到甲型半乳糖苷酶A活性介於4-26倍的增加。血斑點分析法觀察到的位準稍微低,但是此分析確認成年小鼠內甲型半乳糖苷酶A活性之劑量依賴性的增加,低及高劑量定群分別為118±6及176±4nmol/hr/ml。於1個月大接受載體的定群中觀察到相似的位準。於出生後2週轉導的動物,低及高劑量定群之甲型半乳糖苷酶A活性分別為10±2及117±7nmol/hr/ml。相比之下,1週大接受載體的動物,於分別腹膜投與2x1012或是2x1013vg/kg劑量位準後,最低的甲型半乳糖苷酶A活性位準為2±0.4及8±3nmol/hr/ml。
本發明人接下來評估主要器官內甲型半乳糖苷酶A的位準。源自以4e11vg/小鼠的劑量轉導之後的動物肝臟之西方墨點法分析,顯示高位準的內源性人類甲型半乳糖苷酶A表現(圖6),但是以4e10vg/小鼠轉導的動物沒有。
於4e11vg/小鼠(=2e13vg/kg)轉導的動物方面,白血球(WBC)顯示出人類甲型半乳糖苷酶A的存在,暗示著從血漿攝取。事實上,此係一致於其他組織的發現,包括腎臟及心臟(圖7)。基因轉移後,甲型半乳糖苷酶A的位準比得上野生型C57Bl6小鼠內可見的該等位準,暗示著接近100%的生理位準之表現位準。根據吾人酵素取代療法的經驗,此是意想不到的發現。因而,此暗示著於AAV媒介的基因轉移後,甲型半乳糖苷酶A的持續長期表現,促進了Fabry氏病的影響的危急器官攝取甲型半乳糖苷酶A。此等危急器官之衰竭是有Fabry氏病病人的預期壽命縮短,且呈現出酵素取代療法療效問題的原因。
Fabry氏病的突出特點為牽連到腎臟,起因於中性醣原神經脂質的蓄積,主要是糖鞘脂(globotriaosylceramide)(Gb3)。因而,小鼠的腎實質之超微結構係藉由高解析度電子顯微鏡來評估。於未治療的Fabry氏小鼠方面,足細胞形成了足突融合且發生Gb3蓄積之儲存過程,而濾過裂隙形成了多胞體且裂解,以及裂隙隔膜形成了複合體。當此現象發生時,會發展出蛋白尿及腎小球硬化。於產期的期間,於出生後1個月或出生後3個月時(當未治療的動物建立腎臟病理時),AAV8假性的scAAV-GLA-codop投與後,從整個腎實質觀察到劑量依賴性但是完全的移除脂質蓄積,導致正常的腎架構(圖8-11)。因此,2x1011及2×1012vg/kg的劑量位準二者均能耗盡蓄積的Gb3且預防其之再蓄積於小鼠內,如同於所有的治療小鼠
組之腎臟組織中,超微結構發現較少、較小或較不濃密的溶體所說明的。此等發現暗示α-Gal A容易被胞吞至胞內體之內供腎臟中含基質的溶體進行後續的加工。
序列辨識編號1:密碼子最佳化的甲型半乳糖苷酶A之核苷酸序列。
序列辨識編號2:啟動子HLP2之核苷酸序列。
序列辨識編號3:包括啟動子及密碼子最佳化的甲型半乳糖苷酶A序列之載體建構物的核苷酸序列(scAAV8-LP1-GLAco)。此序列包含LP1啟動子。密碼子最佳化的甲型半乳糖苷酶A序列係位為鹼基722-2011。
Claims (17)
- 一種核酸分子,其包含一編碼功能性甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核苷酸序列,其中該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少85%的同一性。
- 如請求項1之核酸分子,其中該核苷酸序列與序列辨識編號1的序列具有至少95%的同一性。
- 如請求項1或請求項2之核酸分子,其中該核苷酸序列具有序列辨識編號1的序列。
- 一種用於表現甲型半乳糖苷酶A蛋白質之載體,該載體包含如請求項1至3中任一項之核酸分子。
- 如請求項4之載體,其進一步包含一肝特異性啟動子。
- 如請求項4或請求項5之載體,其中該載體為腺病毒相關病毒(AAV)載體。
- 如請求項4-6中任一項之載體,其中該載體為一單股載體。
- 如請求項4-7中任一項之載體,其中該載體包含的核苷酸序列與序列辨識編號3的序列具有至少90%的同一性。
- 如請求項4-8中任一項之載體,其中該載體包含一核苷酸序列,其具有序列辨識編號3之序列。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項1-3中任一項之核酸分子或是如請求項4-9中任一項之載體。
- 一種基因轉殖動物,其包含的細胞含有如請求項1-3中 任一項之核酸分子或是如請求項4-9中任一項之載體。
- 一種藥學組成物,其包含如請求項1-3中任一項之核酸分子或是如請求項4-9中任一項之載體,以及一或更多藥學上可接受的賦形劑。
- 一種治療治療Fabry氏病的方法,其包含投藥治療有效量之如請求項4-9中任一項之載體至一罹患Fabry氏病的病人。
- 如請求項1-3中任一項之核酸分子或是如請求項4-9中任一項之載體,其係用於治療。
- 如請求項1-3中任一項之核酸分子或是如請求項4-9中任一項之載體,其係用於治療Fabry氏病。
- 一種如請求項1-3中任一項之核酸分子或是如請求項4-9中任一項之載體於製造一藥劑之用途,該藥劑係用於治療Fabry氏病。
- 一種用於遞送編碼甲型半乳糖苷酶A蛋白質的核苷酸序列至一主體的方法,該方法包含投藥如請求項1-3中任一項之核酸分子或是如請求項4-9中任一項之載體至該主體。
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