CN115969988A - 一种治疗新生血管性视网膜疾病的dna四面体药物复合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于治疗新生血管性视网膜疾病的DNA四面体药物复合物，其由TDNs携载Bevasiranib形成的复合物，所述复合物展现出优异的新生血管生成的抑制作用，并显著改善了眼底渗漏情况，具有十分突出的视网膜修复作用。

Description

一种治疗新生血管性视网膜疾病的DNA四面体药物复合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及针对新生血管性视网膜疾病的药物领域，具体而言，其涉及沉默VEGF的基因药物领域。
背景技术
新生血管性疾病是一类常见的致盲眼病，其包括年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)、糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema,DME)等。这类疾病共同特点均在于新生血管的产生，使得疾病的治疗变得非常棘手，严重影响了患者的生存质量，给患者家庭及社会带来沉重的负担。在成人人群中，AMD的总患病率为8.69％，随着人口老龄化加剧，预计到2040年，全球将有AMD患者2.88亿人。DME是糖尿病的常见并发症之一，世界糖尿病联盟(IDF)的资料显示，中国2019年糖尿病患者人数高达1.6亿，其中DME的患病率约为4.6％。
目前的研究认为，VEGF作为最主要的新生血管生成刺激因子，在视网膜新生血管生成中发挥了重要的作用。在眼内，新生的血管在形态上与正常血管不同，其管腔不规则，管壁多为渗漏。这种高通透性或渗漏的血管的异常增生常导致视网膜上产生疤痕，并进一步可发生脱落从而影响到视力。
基于VEGF在新生血管性视网膜病变中的病理作用，VEGF抑制剂一度成为研发热点，其能够起到阻断VEGF与内皮细胞上VEGF受体之间的相互作用，从而阻止由VEGF介导的信息传导，抑制由VEGF高表达而引起的新生血管的生长的作用，以达到预防和阻止视网膜出血的目的。这类VEGF抑制剂包括Macugen(pegaptanib sodium)，Lucentis，Aflibercept，Avastin(bevacizumab)和AdPEDF等。虽然上述VEGF抑制剂的出现，为眼底新生血管性疾病患者带来了希望，但当前的疗法不是普遍有效的，并且长期抑制VEGF可能导致组织萎缩和其他副作用，例如，每月注射抗VEGF药物与按需注射相比更易导致地图样萎缩，而注射次数增多与视网膜色素上皮萎缩的进展程度亦显著相关。因此，需要探索新的治疗方法和治疗药物来治疗异常血管生成，尽可能减轻患者和医生的负担，并且预防视网膜萎缩的发生，最大程度地改善患者的长期预后和生活质量。
RNA干扰是在许多真核生物中保守的转录后基因调控的方法。内源性或外源性dsRNA可被体内特定的核糖核酸酶(Dicer)切割成长度为21～23个碱基对的小双链片段。这些小的双链片段称为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。siRNA双链可与RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)连接在一起，并在与RISC结合后，靶向切割特定mRNA为10～11个碱基的小片段，从而中断特定mRNA的翻译过程，抑制和沉默目的基因的表达。该过程中，siRNA可被循环利用，与多次周转酶十分相似，1个siRNA分子能够诱导约1000个mRNA分子的切割，可见针对具体靶点开发有效的siRNA药物能够极大地提高用药效率，对于需要通过长期抑制相关靶点进行疾病治疗的患者是非常具有前景的。
Bevasiranib是全球首个进入临床试验的siRNA药物，其是由Opko Health开发的针对VEGF靶点的21聚体siRNA，用于治疗AMD。然而，Bevasiranib的研发之路并不顺利，其虽然在I期和II期临床中展现出生物活性，但其III临床试验最终由于降低视力丧失的效果不佳而终止，至此，siRNA药物的首个治疗尝试因给药障碍而宣告失败。鉴于此，开发出siRNA递送平台，实现siRNA药物在体内的有效递送是迫在眉睫的现实需求。
DNA四面体(Tetrahedral DNA Nanostructures,TDNs)是一种由4条单链DNA通过变性和复性进而通过链间碱基互补配对形成的一种四面体结构，它易于合成，生物相容性高，专利CN109646450B中披露了TDNs在制备治疗角膜损伤的药物中的用途，专利CN112007044B中公开了TDNs-miR155复合物及其在制备预防或治疗湿性黄斑病变的药物中的用途，专利CN112843085B中公开了TDNs-miR22复合物及其在制备治疗视神经损伤的药物中用途。目前尚未见TDNs携载siRNA进行眼科疾病的治疗。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于治疗新生血管性视网膜疾病的DNA四面体药物复合物，其由TDNs携载Bevasiranib形成的复合物，并进一步提供上述复合物在制备治疗新生血管性视网膜病变中的用途。
发明人惊喜地发现，虽然单独使用Bevasiranib的疗效有限，但在与TDNs形成复合物之后，无论是其入胞效率、蛋白沉默效果还是体内治疗活性均显著提升，展现出协同增效的作用，为弥补Bevasiranib的疗效缺憾提供了潜在的思路。
根据本发明的一方面，一种用于治疗新生血管性视网膜疾病的DNA四面体药物复合物，所述DNA四面体药物复合物包括：
(a)沉默VEGF基因的siRNA,所述siRNA包括如SEQ ID NO.5所示的核苷酸组成的有义链和如SEQ ID NO.6所示的核苷酸组成的反义链；和
(b)一DNA四面体，所述DNA四面体由四条单链DNA经碱基互补配对形成；所述四条单链DNA的核苷酸序列分别一对一地选自如SEQ ID NO.1～4的所示序列；
其中所述沉默VEGF基因的siRNA与DNA四面体的至少一条单链连接。
优选地，本发明所述的DNA四面体药物复合物，其中将所述沉默VEGF基因的siRNA的有义链以化学键与所述DNA四面体的至少一条单链连接。
更优选的是，本发明所述的DNA四面体药物复合物，其中在所述通过连接序列-TTTTT-将所述沉默VEGF基因的siRNA的有义链以化学键与所述DNA四面体的单链连接。
本发明所述的DNA四面体药物复合物，其中将形成所述DNA四面体的四条单链DNA以等摩尔比置于足以使其变性的温度下使其变性，然后将温度降低至使其退火进而通过链间碱基互补配对形成DNA四面体结构；再将所述四条单链DNA的至少一条连接所述沉默VEGF基因的siRNA。
根据本发明的另一方面，提供一种药物组合物，含有本发明所述的用于治疗新生血管性视网膜疾病的DNA四面体药物复合物。
根据本发明的再一方面，提供本发明所述的DNA四面体药物复合物或权本发明所述的药物组合物在制备治疗新生血管性视网膜疾病药物中的应用。
其中所述的新生血管性视网膜疾病包括年龄相关黄斑变性、糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视网膜静脉阻塞或由新生血管生长而引发的治疗失败。
DNA四面体
本发明所使用的DNA四面体，也即TDNs，是4条单链DNA经碱基互补配对形成；所述4条单链DNA的序列依次对应SEQ ID NO.1-4的所述序列，其可通过变性、退火过程组装形成目标产物TDNs。具体而言，将TDNs的4条单链DNA置于足以使其变性的温度下维持10min，再将温度降低至2-8℃维持20min以上。
优选地，所述DNA四面体是由所述4条DNA单链经90～98℃变性10～15min、2～8℃退火20～30min制备而成。
更优选地，所述DNA四面体是由所述4条DNA单链经95℃变性10min、4℃退火20min制备而成。
DNA四面体-Bevasiranib复合物
本发明的复合物是将DNA四面体和Bevasiranib(或称“沉默VEGF基因的siRNA”，在本发明中二者相互通用)按照1:(1-4)的摩尔比构成的复合物，其中Bevasiranib为siRNA双链体，其具有如SEQ ID NO:5所示的有义链和如SEQ ID NO:6所示的反义链，所述Bevasiranib通过化学键连接在DNA四面体结构中四条DNA单链中的一条、二条、三条和/或四条单链上，更进一步的，所述Bevasiranib和所连接DNA单链之间还含有连接序列，所述连接序列为核苷酸序列，优选为脱氧核糖核苷酸序列，更优选为-TTTTT-(即连续5个胸腺嘧啶脱氧核苷酸序列)。
具体地，上述复合物的制备方法，其通过将DNA四面体的4条单链DNA置于足以使其变性的温度下维持10min以上，再将温度降低到2～8℃维持20min以上；所述4条单链DNA的其中1条连接有Bevasiranib。
优选地，所述DNA四面体是由所述4条DNA单链经90～98℃变性10～15min、2～8℃退火20～30min制备而成，其中1条连接有Bevasiranib。
更优选地，所述DNA四面体是由所述4条DNA单链经95℃变性10min、4℃退火20min制备而成，其中1条连接有Bevasiranib。
制药用途与治疗方法
本发明提供上述复合物在制备新生血管性视网膜疾病的药物中的用途，包括但不限于年龄相关黄斑变性，糖尿病视网膜病变，糖尿病性黄斑水肿，视网膜静脉阻塞，由新生血管生长而引发的治疗失败。
本发明中，术语“新生血管性视网膜疾病”，指由于新生血管生长伴随出血、渗出、增生等病理性改变造成的致盲性玻璃体视网膜疾病。新生血管形成是很多重要眼部疾病的共同病理改变。
年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是黄斑区结构的病理性衰老改变。可分为干性(非渗出性)或湿性(渗出性或新生血管性)2种类型。湿性AMD以脉络膜新生血管为突出特征，其是在疾病发展中后期，病理改变不断加重后，引起Bruch膜断裂，脉络膜毛细血管通过破裂的Bruch膜进入RPE下或视网膜神经上皮下，形成脉络膜新生血管(CNV)，这也是对视力影响的最直接因素。由于新生血管管壁的结构异常，常发生血管的渗漏和出血，进而导致黄斑部出血、水肿等引发一系列的改变，加重视力的下降甚至是突然视力大幅下降，是AMD导致失明的主要原因。
糖尿病视网膜病变(DR)为一项比较严重的微血管并发症，其病理特征主要为新生血管形成以及视网膜血-视网膜屏障(BRB)被破坏等，糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是慢性进行性糖尿病导致的视网膜微血管渗漏和阻塞从而引起一系列的眼底病变，如微血管瘤、硬性渗出、棉絮斑、新生血管、玻璃体增殖、黄斑水肿甚至视网膜脱离。DR以是否有从视网膜发出的异常新生血管作为判断标准，可分为增殖性糖尿病视网膜病变和非增殖性糖尿病视网膜病变。
视网膜静脉阻塞是常见的眼底血管病，其病程长，视网膜长期缺血，缺血后诱发新生血管形成。
本发明中同时还介绍了相关疾病的治疗方法，上述复合物可以通过多种不同的给药途径施用于有需要的患者，其中包括但不限于静脉给药、玻璃体内注射、也可以通过其他眼部局部递送的方式基于一定剂型达到治疗眼疾的目的。
有益的效果
实验结果显示，本发明所提供的DNA四面体-Bevasiranib复合物通过DNA四面体携载siRNA，能够显著提高Bevasiranib的体外入胞效率，不仅在体外实现了优异的VEGF蛋白沉默效果，在体内的动物模型中，所述复合物展现出媲美甚至优于阳性对照阿柏西普的新生血管生成的抑制作用，并显著改善了眼底渗漏情况，具有十分突出的视网膜修复作用。
附图说明
图1为TDN以及TDN-Beva的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
其中泳道1为TDN样品、泳道2-6为TDN-Beva样品
图2为TDN以及TDN-Beva的毛细管电泳图；
图3为TDN以及TDN-Beva的透射电镜图；
图4为Bevasiranib、Bevasiranib-LipoRNAiMAX复合物、TDN、TDN-Bevasiranib复合物在不同细胞(HEK-293细胞、HUVEC细胞以及HREC细胞)中的入胞效率；
图5为各给药组施用后，不同细胞中VEGF基因沉默效果，其中包括空白组(control)、Bevasiranib组和Bevasiranib+Lipo组、不同浓度的TDN组(5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L)、不同浓度的TDN-Beva组(5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L)；
图6为各给药组施用后，不同细胞(HEK-293细胞、HUVEC细胞以及HREC细胞)中VEGF蛋白表达抑制水平统计，其中包括空白组(control)、Bevasiranib组、Bevasiranib+Lipo组、TDN组、TDN-BEVA组；
图7为各给药组施用于鸡胚绒毛尿囊膜模型后，其新生血管抑制水平，包括空白组(control)、Aflibercept(阳性对照)组、Bevasiranib组、Bevasiranib+Invivofectamine(转染试剂)、TDN组、TDN-Bevasiranib组；
图8为各给药组施用于小鼠OIR模型后，各组小鼠视网膜中VEGF蛋白表达量的水平，包括空白组(control)、Bevasiranib组、Bevasiranib+Invivofectamine组、TDN组、TDN-Bevasiranib组；
图9为各给药组施用于小鼠OIR模型后，各组小鼠视网膜中新生血管面积统计结果，包括空白组(control)、Aflibercept(阳性对照)组、Bevasiranib+Invivofectamine组、TDN组、TDN-Bevasiranib组；
图10为OIR模型中各给药组小鼠视网膜新生血管生成情况及无血管区恢复情况；
图11为TDN-Bevasiranib连接示意图。
具体实施方式
以下通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。
材料来源：如非特别说明，本发明所使用的材料均为市售购买。
HEK-293购自上海景泽生物技术有限公司；
HREC细胞购自angiopromie公司；
HUVEC细胞购自澳赛尔斯生物；
LipoRNAiMAX(Lipo)购自赛默飞；
Invivofectamine试剂购买自赛默飞；
阿柏西普注射液(Aflibercept)：购自拜耳医药保健有限公司，规格为40mg/ml/瓶；
C57/BL小鼠购买自斯贝福(北京)生物技术有限公司
实施例1合成方法
(1)TDNs的合成
将四条单链(S1，S2，S3，S4)按照等摩尔比(每条单链加入1μl浓度为100μM的储存液)加入到含有96μl的TM buffer(10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH 8.0)的200μl EP管中，将反应液加热到95℃维持10min，然后快速降温到4℃维持20min合成了TDNs。
4条单链的序列(5′→3′)如下：
S1:ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAA(SEQ ID NO.1)；
S2:ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG(SEQ ID NO.2)；
S3:ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC(SEQ ID NO.3)；
S4:ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG(SEQ ID NO.4)；
其中S1的5’端可选地连接一个Cy5荧光标记基团用于TDNs的示踪。
(2)TDNs-Bevasiranib复合物的合成
在实施例1的基础上，将S1序列替换为S1-Bevasiranib，其中S1通过连接序列-TTTTT-与Bevasiranib的有义链以化学键连接，将S1-Bevasiranib、S2、S3、S4按照等摩尔比(每条单链加入1μl浓度为100μM的储存液)加入到含有95μl的TM buffer(10mM Tris-HCl，50mMMgCl2，pH 8.0)的200μl EP管中，将反应液加热到95℃维持10min，然后快速降温到4℃维持20min合成了TDN-Bevasiranib(TDN-Beva)，其连接方式如示意图(图11)所示。
Bevasiranib的有义链(SEQ ID NO.5)：ACCUCACCAAGGCCAGCAC
Bevasiranib的反义链(SEQ ID NO.6)：GUGCUGGCCUUGGUGAGGU-dTdT
实施例2表征
(1)鉴定方法
使用毛细管电泳、PAGE电泳检测DNA单链与合成得到的TDN-Beva；使用透射电镜检测TDNs与TDN-Beva的外形；使用动态光散射检测TDNs与TDN-Beva的zeta电位及粒径。
(2)结果
如图1-2所示，电泳结果指示TDNs-Beva的条带分子量符合TDNs与Beva的复合情况，表示Bevasiranib已成功连接至TDNs。
如图3所示，透射电镜图中可观测到TDNs以及TDNs-Beva的四面体结构颗粒。
根据动态光散色检测结果，TDNs颗粒和TDNs-Beva颗粒的粒径约为10nm-15nm，其中前者的zeta电位为-6.41mV，后者的zeta电位为-18.9mV。
实施例3细胞实验
(1)荧光标记细胞摄取实验
细胞：人胚胎肾细胞293(HEK-293)、人视网膜内皮细胞(HREC细胞)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为实验细胞
实验分组：空白组、Bevasiranib(Cy5标记)组、Bevasiranib(Cy5标记)+LipoRNAiMAX(转染试剂)组、TDN(Cy5标记)组、TDN-Bevasiranib(Cy5标记)组。
实验方法：
1)在转染实验的前一天，在每个孔的2ml生长培养基中加入3x10^5个细胞(确保转染时细胞密度在60-80％)。
2)使用DMEM培养基稀释各组样品至终体积250μl。
3)将待测样品添加到细胞中：每孔加样250μl，其最终样品浓度为15nmol/L。
4)37℃静置培养细胞24h，之后收样使用流式细胞仪检测入胞情况。
其中转染试剂的使用方法为：给细胞换液，加3％血清的培养基1.7mL。然后用147μl的无血清培养基加3μlBevasiranib混匀，141μl的无血清培养基加9μl转染试剂混匀，把两管液体混合，孵育5min,滴加至细胞中。
实验结果：
如图4所示，各细胞的入胞结果类似，空白组未检测到明显荧光信号(未呈现)，Bevasiranib加转染试剂处理组的样本检测到明显的阳性荧光信号，入胞效率为90.0％左右，Bevasiranib无转染试剂处理组的样本则仅检测到微弱的荧光信号，入胞效率不超过2％，说明Bevasiranib自身的入胞能力不佳，在转染试剂的辅助下才能够有效入胞。TDN组与TDN-Beva处理组均检测到较强的阳性荧光信号，说明在不添加转染试剂的情况下TDN的携载能够实现Beva的高效入胞。
(2)VEGF基因沉默实验
细胞：人胚胎肾细胞293(HEK-293)、人视网膜内皮细胞(HREC细胞)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为实验细胞
实验分组：空白组、BEVA组、BEVA+Lipo组、5nmol/L TDN组、10nmol/L TDN组、15nmol/L TDN组、5nmol/L TDN-BEVA组、10nmol/L TDN-BEVA组和15nmol/L TDN-BEVA组
实验方法：
1)在转染实验的前一天，在每个孔的2ml生长培养基中加入3×10^5个细胞(确保转染时细胞密度在60-80％)。
2)使用DMEM培养基稀释各组样品至终体积250μl。
3)将待测样品添加到细胞中：每孔加样250μl，其中BEVA组、BEVA+Lipo组中siRNA的终浓度均为15nmol/L，其余给药组按照实验分组的浓度梯度为终浓度。
4)37℃静置培养细胞24h，之后收样进行qPCR实验检测基因沉默效果。
实验结果：
如图5所示，各细胞中基因沉默的作用趋势大致相同，其中不添加转染试剂处理的BEVA组与空白对照相比，并未展现出明显的差异性效果，而BEVA+Lipo组与空白组相比展现出一定的基因沉默作用。同时，TDN-BEVA组随浓度增大展现出明显的基因沉默作用，在相同浓度下与BEVA+Lipo组作用相当甚至更优。
(3)VEGF蛋白表达抑制实验
细胞：人胚胎肾细胞293(HEK-293)、人视网膜内皮细胞(HREC细胞)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为实验细胞
实验分组：空白组、Bevasiranib组、Bevasiranib+Lipo组、TDN组、TDN-Bevasiranib组
实验方法：
1)在转染实验的前一天，在每个孔的2ml生长培养基中加入3×10^5个细胞(确保转染时细胞密度在60-80％)。
2)使用0％FBS的培养基换液后，将各组样品添加到细胞中，六孔为一组，控制其终浓度为15nmol/L。
3)37℃静置培养细胞24h后收样，提取蛋白，检测蛋白浓度后进行WB实验，检测其VEGF的蛋白表达量。
实验结果：
如图6所示，蛋白定量的结果与前述基因沉默效果基本一致，其中TDN-Beva组展现出与Bevasiranib+Lipo组相当甚至更低的VEGF的表达量。
实施例4体内外模型实验
(1)鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管抑制实验
实验分组：空白组、Aflibercept(阳性对照)组(1nmol/L)、Bevasiranib组(1nmol/L)、Bevasiranib(1nmol/L)+Invivofectamine(转染试剂)、TDN组(1nmol/L)、TDN-Bevasiranib组(1nmol/L)
实验方法：
用1：1000新洁尔灭液擦拭鸡蛋，将购买的SPF种鸡蛋表面清洁，拭干后用照蛋器检查种蛋是否完好，用铅笔标记实验名称，之后将鸡蛋放入孵化箱中孵化，条件设定为37.0±0.5℃，相对湿度60％，仪器设定每两个小时转蛋一次，继续孵育4-5天。
等鸡蛋孵育5-6d的时候，将实验用的鸡胚随机分为6组，每组5只。在照蛋器下用马克笔标记气室，画出开窗位置，用75％酒精消毒后，用注射器针头轻轻将蛋壳钻出一个小孔，之后用眼科镊在蛋壳上慢慢撕出一个直径约1cm窗口(用砂轮在，然后用眼科镊轻轻揭掉蛋膜，暴露鸡胚绒毛尿囊膜，注意不要损伤血管。滴加待测样品药液于绒毛尿囊膜上，之后用透明封口膜封闭窗口，孵育48h后，用酒精消毒接种部位及四周，撕去封闭处卵壳，滴入10％福尔马林液固定10min，待CAM上的血管凝固后，剥离假气室周围的蛋壳，使CAM充分暴露，用眼科剪取3cm×3cm的CAM，脱水后用石蜡包埋，平行于CAM方向，连续切片，厚度8μm，0.5％甲苯胺蓝染色。取标本于250倍视野下计数微血管的横截面，分别随机6个不重复的高倍视野，取其平均值(四舍五入)作为该标本的单位面积下的MVD(微血管密度)，并计算器血管生成抑制率，计算方法如下：
血管生成抑制率＝(空白组MVD值-实验组MVD值)/空白组MVD值*100％
实验结果：
Figure BDA0003827800630000111
如图7所示，阿柏西普(Aflibercept)阳性对照组展现出明显的新生血管抑制作用，而Bevasiranib+Invivofectamine组展现出优于Bevasiranib组的新生血管抑制活性，指示bevasiranib在转染试剂的作用下能够有效进入细胞并通过对VEGF的沉默表达作用产生一定的新生血管抑制效果。令人惊讶的是，单独的TDN展现出几乎与阳性对照组相当的新生血管抑制活性，其具体作用原理还有待进一步探究。同时，TDN-Beva组展现出极其优异的新生血管抑制活性，不仅显著优于阳性对照组，也优于Bevasiranib+Invivofectamine组和TDN组。
(2)氧诱导的血管增殖性视网膜病变(OIR)小鼠模型
造模过程：
将出生后第7天(P7)的C57/BL小鼠与母鼠放入含氧体积分数为75％±3％的饲养箱内连续饲养5天，饲养温度维持在(25±2)℃，每天照明12h，用自动氧气分析仪监控箱内氧气含量。出生后第12天(P12)放回正常空气中饲养，这时小鼠视网膜处于相对缺氧状态，出生后第17天(P17)视网膜内有大量新生血管形成。
1)小鼠视网膜VEGF蛋白表达量检测
实验分组及给药方式：
于P12出氧箱时进行玻璃体腔注射，各分组如下：
空白组：不进行玻璃体腔给药
Bevasiranib组：双眼玻璃体腔注射1μL的75μmol/L的Bevasiranib
Bevasiranib+Invivofectamine组：双眼玻璃体腔注射1μLsiRNA-Invivofectamine复合物，其中Bevasiranib的浓度为75μmol/L
TDN组：双眼玻璃体腔注射1μL75μmol/L TDNs
TDN-Bevasiranib组：双眼玻璃体腔注射1μL 75μmol/L TDN-Bevasiranib复合物
实验方法：
给药48h后，取各组小鼠3只，麻醉处死后取出双眼眼球共6只放入250μL细胞裂解液中，超声粉碎，低温超速离心30min，收集上清液，置于低温冰箱中保存。采用ELISA试剂盒检测视网膜蛋白提取液中VEGF表达。
实验结果：
如图8所示，Bevasiranib-Invivofectamine组相较于空白组展现出明显的VEGF表达抑制作用，而TDN-Bevasiranib组展现出优于Bevasiranib-Invivofectamine组的VEGF蛋白表达抑制效果，说明采用TDN载体携载Bevasiranib能够有效促进其入胞并沉默VEGF基因表达进而降低其蛋白表达量。
2)小鼠视网膜新生血管生成抑制实验
实验分组及给药方式：
于P12出氧箱时进行玻璃体腔注射，各分组如下：
空白组(negative CTRL)：不进行玻璃体腔给药
Aflibercept(阳性对照)组：双眼玻璃体注射1μL 40mg/mL的阿柏西普
Bevasiranib+Invivofectamine组：双眼玻璃体腔注射1μLsiRNA-Invivofectamine复合物，其中Bevasiranib的浓度为75μmol/L
TDN组：双眼玻璃体腔注射1μL75μmol/L TDNs
TDN-Bevasiranib组：双眼玻璃体腔注射1μL 75μmol/L TDN-Bevasiranib复合物
实验方法：
于P17，取各组小鼠3只，麻醉处死后取出双眼眼球共6只，在10％的甲醛中室温固定半小时。显微镜下去除角膜、虹膜和晶体，小心完整地剥离视网膜，从视网膜锯齿缘到4个象限的赤道部做放射状切开，视网膜平铺在玻片上，水溶性封片剂封口，加盖玻片。用荧光显微镜检测平铺的视网膜，Image-Pro Plus(Media Cybernetics，美国)软件测量视网膜新生血管的面积。
实验结果：
如图9-10所示，空白组图片显示经过OIR造模的小鼠，其视网膜在P17产生了明显的病变，其视网膜在后极部形成无血管区(小圈内)，以及新生血管区(小圈和大圈之间)。Aflibercept(阳性对照)组给药之后能够在一定程度上抑制新生血管的生成，并促进无血管区的血管正常化。类似的，TDN组展现出与Aflibercept(阳性对照)组接近的新生血管生成抑制效果。值得注意的是，TDN-bevasiranib组展现出明显优于阳性对照组的新生血管抑制作用，并能够明显促进无血管区的正常化，展现出对病变视网膜优异的修复作用。
本发明不限于以上实施方式，本领域技术人员可以根据说明书的描述对本发明做出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均属于本发明的范围。
序列：
SEQ ID NO.1
ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAA；
SEQ ID NO.2
ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG；
SEQ ID NO.3
ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC；
SEQ ID NO.4
ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG；
SEQ ID NO.5
ACCUCACCAAGGCCAGCAC
SEQ ID NO.6
GUGCUGGCCUUGGUGAGGU-dTdT

Claims (10)

1.一种用于治疗新生血管性视网膜疾病的DNA四面体药物复合物，所述DNA四面体药物复合物包括：
(a)沉默VEGF基因的siRNA,所述siRNA包括如SEQ ID NO.5所示的核苷酸组成的有义链和如SEQ ID NO.6所示的核苷酸组成的反义链；和
(b)一DNA四面体，所述DNA四面体由四条单链DNA经碱基互补配对形成；所述四条单链DNA的核苷酸序列分别一对一地选自如SEQ ID NO.1～4的所示序列；
其中所述沉默VEGF基因的siRNA与DNA四面体的至少一条单链连接。
2.根据权利要求1所述的DNA四面体药物复合物，其中将所述沉默VEGF基因的siRNA的有义链通过化学键与所述DNA四面体的至少一条单链连接。
3.根据权利要求2所述的DNA四面体药物复合物，其中在所述沉默VEGF基因的siRNA的有义链与所述DNA四面体的至少一条单链之间还包含一接头。
4.根据权利要求3所述的DNA四面体药物复合物，其中所述接头为连接序列-TTTTT-。
5.根据权利要求1-4任一项所述的DNA四面体药物复合物，其中将形成所述DNA四面体的四条单链DNA以等摩尔比置于足以使其变性的温度下使其变性，然后将温度降低至使其退火进而通过链间碱基互补配对形成DNA四面体结构；将所述四条单链DNA的至少一条连接所述沉默VEGF基因的siRNA。
6.一种药物组合物，含有权利要求1所述的用于治疗新生血管性视网膜疾病的DNA四面体药物复合物。
7.权利要求1所述的DNA四面体药物复合物或权利要求6所述的药物组合物在制备治疗新生血管性视网膜疾病药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中所述的新生血管性视网膜疾病包括年龄相关黄斑变性、糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视网膜静脉阻塞或由新生血管生长而引发的治疗失败。
9.一种制备权利要求1所述的用于治疗新生血管性视网膜疾病的DNA四面体药物复合物的方法，包括将形成所述DNA四面体的四条单链DNA以等摩尔比置于足以使其变性的温度下使其变性，然后将温度降低至使其退火进而通过链间碱基互补配对形成DNA四面体结构；将所述四条单链DNA的至少一条连接所述沉默VEGF基因的siRNA。
10.根据权利要求9所述的方法，其中通过将所述DNA四面体的四条单链DNA置于足以使其变性的温度下维持10min以上，再将温度降低到2～8℃维持20min以上；在所述四条单链DNA的至少一条连接所述siRNA。
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