CN117448333B - 一种靶向DOCK6的siRNA与四面体框架核酸复合物及其应用 - Google Patents
一种靶向DOCK6的siRNA与四面体框架核酸复合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种靶向DOCK6的siRNA与四面体框架核酸复合物及其应用。所述复合物包括四面体框架核酸及搭载的靶向DOCK6的siRNA，siRNA的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～2所示。所述复合物可更加有效减少DOCK6的表达，抑制眼部新生血管的生成，改善视网膜无灌注区面积，可用于预防和/或治疗眼部新生血管性疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体地，涉及一种靶向抑制细胞分裂蛋白奉献因子6(DOCK6)基因的小干扰RNA与四面体框架核酸复合物及其在制备预防和/或治疗眼部新生血管性疾病药物中的应用。
背景技术
眼底新生血管是众多眼底疾病的共同病理过程，一般发生于缺血缺氧的视网膜脉络膜组织，常见于糖尿病性视网膜病变(PDR)、湿性老年相关性黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病变(ROP)、脉络膜新生血管(CNV)、视网膜中央/分支静脉阻塞(RVO)、高度近视视网膜病变、中心性浆液性视网膜病变等。有数据显示眼底新生血管性疾病患者人数在4000万以上，且随着人口老龄化程度加重，患者人数还在不断上升。该病患者视力普遍低下，严重影响患者的生活质量，造成巨大的家庭及社会经济负担。
在多种视网膜血管性疾病中，如血管壁的损害、血流阻滞、血管发育不全等不同因素均可引起的视网膜缺血缺氧，刺激血管内皮生长因子(VEGF)等血管生成因子的产生，导致异常的病理性血管形成，我们称之为“新生血管”。与发育过程中生理性血管不同，眼底新生血管的结构异常，包括血管壁结构薄弱，通透性高等；这些异常可导致新生血管发生渗漏、出血、组织水肿等一系列改变，最终严重影响视力。当前的治疗方法主要是通过经常性地眼内注射VEGF抑制剂来控制病情，但这种方法只是临时性地缓解问题，不能从根本上解决视网膜缺血缺氧的问题。
近期研究发现DNA纳米结构具有广泛的生物学功能，其已被开发及应用于生命科学各种领域。四面体框架核酸(Tetrahedral DNA Nanostructures，TDNs)是一种由4条单链DNA通过变性和复性进而通过链间碱基互补配对形成的一种四面体结构，具有易于合成，结构稳定，生物兼容性高等优点，已被广泛应用于各种生物领域。在先的专利对于TDNs在眼科疾病中的用途进行了公开，如专利CN109646450B中披露了TDNs在制备治疗角膜损伤的药物中的用途，专利CN112843085B中公开了TDNs-miR22复合物及其在制备治疗视神经损伤的药物中用途。这些均显示了TDNs在药物制备及眼科领域具有重大的探索价值，然而目前还鲜有关于siRNA与四面体框架核酸复合物在治疗眼部新生血管性疾病药物中的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种靶向DOCK6的siRNA与四面体框架核酸复合物。
本发明的第二个目的在于提供所述复合物的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供上述复合物在制备预防和/或治疗眼部新生血管性疾病的药物中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种靶向DOCK6的siRNA与四面体框架核酸复合物，包括四面体框架核酸(TDNs)及其搭载的靶向DOCK6的siRNA(siDOCK6)；所述靶向DOCK6的siRNA包括正义链和反义链，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～2所示。
DOCK6(Dedicator of cytokinesis 6)属于细胞有丝分裂奉献因子家族一员，能够催化小GTP酶的GDP与GTP之间的交换，促进小GTP酶激活。DOCK6主要与Rac1和Cdc42两种小GTP酶有关，这两者在细胞迁移、细胞黏附和细胞极性等过程中发挥重要作用。申请人团队发现在一些病理性新生血管组织中，如PDR的血管膜、脉络膜新生血管膜等，DOCK6的表达明显增加。本发明提供的由TDNs和针对DOCK6的siRNA构建的复合物(TDNs+siDOCK6)能有效抑制DOCK6的表达，从而减少血管内皮细胞的增殖和管腔生成，能在体内抑制眼部异常新生血管生成，改善视网膜无灌注区面积，可用于预防和/或治疗眼部新生血管性疾病。
优选地，所述四面体框架核酸的四条DNA单链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3～6所示。
本发明还提供所述复合物的制备方法，是将四面体框架核酸中的一条单链与靶向DOCK6的siRNA的正义链连接，再将连接后的序列与四面体框架核酸剩余的三条单链加入到TM缓冲液中，93～97℃维持8～12min，快速降温到3～5℃维持18～22min，即得。
优选地，是将反应液加热到95℃维持10min，然后快速降温到4℃维持20min合成。
本发明提供的TDNs+siDOCK6复合物具有明显的抑制血管内皮生长的能力；通过在培养液中加入该复合物的实验组与对照组相比，该复合物可有效的抑制缺氧状态下血管内皮细胞的增殖能力与成管能力。通过动物实验可知，玻璃体腔注射该复合物的实验组与对照组相比，该复合物组更加有效的抑制了视网膜新生血管的生成，改善视网膜无灌注区面积，因此可利用本发明的TDNs+siDOCK6复合物来抑制眼部病理性新生血管生成，从而可起到预防和/或治疗眼部新生血管性疾病的作用。
因此，本发明还提供上述任一所述TDNs+siDOCK6复合物在制备抑制眼部病理性新生血管生成的药物中的应用。
本发明还提供上述任一所述TDNs+siDOCK6复合物在制备预防和/或治疗眼部新生血管性疾病的药物中的应用。
进一步地，所述眼部新生血管性疾病包括但不限于视网膜新生血管相关疾病、角膜新生血管相关疾病、虹膜新生血管相关疾病或脉络膜新生血管相关疾病中的一种或多种。
进一步地，所述视网膜新生血管相关疾病包括但不限于为PDR、ROP、RVO、AMD。病理性视网膜新生血管在所有年龄段的常见和严重视网膜疾病中均可见。目前，对晚期ROP、PDR或RVO患者进行视网膜光凝治疗，或使用抗VEGF治疗以抑制新生血管。由于激光导致视网膜组织丢失，视网膜光凝可导致视力下降、夜间视力下降和持续视野狭窄等并发症。抗VEGF治疗临床上已用于治疗ROP、DR和RVO患者，但存在潜在的缺陷。首先，与阻断血管内皮生长因子信号有关的不良反应，包括对正常视网膜血管生长和视网膜功能的损害。其次，由于持续的缺血/无灌注状态，在玻璃体内注射抗VEGF抗体后，病理性新生血管的复发在早产儿或糖尿病患者中很常见。
进一步地，所述药物的制剂可以是任何适于眼部局部施用的剂型，包括但不限于注射剂、滴眼剂、脂质体或气雾剂中的一种或多种。
作为本发明所述应用的优选实施方式，在细胞给药时，TDNs+siDOCK6复合物优选剂量为100nM。在动物给药时，TDNs+siDOCK6复合物优选剂量为1μM1μL，。
本发明还提供一种预防和/或治疗眼部新生血管性疾病的药物，所述药物包括上述任一所述TDNs+siDOCK6复合物。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种靶向细胞分裂蛋白奉献因子6(DOCK6)基因，高效入胞、性质稳定、抑制DOCK6 mRNA翻译过程的siRNA与四面体框架核酸复合物，所述复合物可有效减少DOCK6的表达，抑制眼部新生血管的生成，改善视网膜无灌注区面积，可用于预防和/或治疗眼部新生血管性疾病。
附图说明
图1为各给药组施用后，脐静脉内皮细胞(HUVEC)DOCK6基因的沉默效果，其中包括对照组(TDNs+siCTRL)和四面体框架核酸-siRNA复合物组(TDNs+siDOCK6)两组的mRNA表达水平与蛋白表达水平。
图2为各给药组施用于血管内皮细胞低氧模型后，其细胞增殖水平实验结果图，包括TDNs+siCTRL和TDNs+siDOCK6。
图3为各给药组施用于血管内皮细胞低氧模型后，其成管水平实验结果图，包括TDNs+siCTRL和TDNs+siDOCK6。
图4为各给药组施用于正常小鼠及氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型后，各组小鼠视网膜新生血管面积及各组小鼠无血管区面积统计结果，包括TDNs+siCTRL和TDNs+siDOCK6。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1四面体框架核酸-siRNA复合物的合成
(1)siRNA的合成
根据DOCK6 mRNA设计并委托锐博生物公司合成siRNA：siDOCK6，序列(5’→3’)为siRNA：GUGGAACCGUACUUUGAUA(Forward，SEQ ID NO.1)，UAUCAAAGUACGGUUCCAC(Reverse，SEQ ID NO.2)。
(2)四面体框架核酸的合成
将四条单链(S1，S2，S3，S4)按照等摩尔比，分别取1μL浓度为100μM的单链母液，加入到含有96μL的TM buffer(10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH8.0)的200μLEP管中，将反应液加热到95℃维持10min，然后快速降温到4℃维持20min合成了TDNs。
4条单链的序列(5′→3′)如下：
S1:ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGA ACATTCCTAAGTCTGAA(SEQ ID NO.3)；
S2:ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTC AGACTTAGGAATGTTCG(SEQ ID NO.4)；
S3:ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGG GAAGAGCATGCCCATCC(SEQ ID NO.5)；
S4:ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGA TGGGCATGCTCTTCCCG(SEQ ID NO.6)。
(3)四面体框架核酸-siRNA复合物的合成
其中S2通过连接序列-TTTCG-与siDOCK6的正义链以化学键连接，将S2-siDOCK6、S1、S3、S4按照等摩尔比，分别取1μL浓度为100μM的单链母液，加入到含有96μL的TM buffer(10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH 8.0)的200μLEP管中，将反应液加热到95℃维持10min，然后快速降温到4℃维持20min合成了TDNs-siDOCK6。
注：关于说明书序列表中SEQ ID NO:1～6的说明：根据WIPO·Sequence软件的编辑规则，核苷酸序列必须只包含“WIPO·ST.26附件I第1部分”中列出的符号，碱基“t”在RNA序列中即为“u”，所以本发明上述SEQ ID NO:1～6与序列表中的SEQ ID NO:1～6实质相同。
实施例2细胞实验
(1)DOCK6基因抑制实验
细胞：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)；
实验分组：对照组TDNs+siCTRL和沉默组TDNs+siDOCK6。
实验方法：
1)复苏HUVEC，稳定培养传代1～2代，转染前一天，6孔板中每个孔内接种细胞，密度约30％，每孔加入2mL完全培养基；
每孔加入2mL新鲜的含血清的生长培养基，用培养基稀释各候选TDNs+siRNA(100nmol)加入到各待测细胞组中，在37℃的二氧化碳培养箱中继续培养细胞48小时后检测TDNs+siRNA沉默效果。
2)RNA检测：上述各组细胞接受处理后按照总RNA提取试剂盒步骤过柱提取，每组取等量RNA参照逆转录试剂盒步骤，进行逆转录合成为cDNA，根据试剂盒指示，以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，得到Ct值，以β-actin为内参，使用相对定量法计算。
3)蛋白检测：提取各组细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，每组上样量20ug蛋白，进行Western-Blot实验。
实验结果如图1所示，相比较与对照组，TDNs+siDOCK6可对细胞DOCK6mRNA水平进行有效敲减，其沉默效率高于90％；WB结果显示DOCK6蛋白表达明显下调，TDNs+siDOCK6组DOCK6蛋白表达约为对照组40％。
实施例3体外模型实验
(1)血管内皮细胞低氧模型
细胞：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)；
实验分组：对照组TDNs+siCTRL和沉默组TDNs+siDOCK6。
实验方法：用添加10％胎牛血清抗生素溶液的改良Eagle‘s培养液培养细胞，在含有95％空气和5％CO2的常氧环境中37℃培养24小时，然后加入各组药物，分别在低氧(37℃，1％O2，5％CO2)下再培养24小时。
(2)细胞增殖实验：将需要进行实验的细胞于预放细胞爬片的24孔板进行种板，24小时后将Edu(5-ethynyl-2'-deoxyuridine，C10337，ThermoFisher，United States)添加到培养基中，使其浓度为10微摩尔/升。将细胞在37℃，5％CO2的培养箱中培养3小时，取出细胞爬片，并进行固定处理，使用4％的多聚甲醛进行固定。加入试剂盒相应抗体(C10337)进行染色处理，进行显微镜观察和图像分析，计算细胞的增殖率。
(3)细胞成管实验：准备需要进行实验的细胞和基质胶Matrigel(356231，corning，United States)，基质胶及枪头放置于4℃过夜。次日采用96孔板，每孔吸取50μL基质胶平铺，避免气泡，随后将96孔板放入37℃的培养箱中，让基质胶凝固。将需要进行实验的细胞进行种板，每孔细胞量1*104，加入新的培养基，让细胞继续生长。6小时后在显微镜下进行拍照，观察，记录细胞的成管形态。
(4)细胞增殖实验结果如图2所示，与TDNs+siCTRL组相比，TDNs+siDOCK6可抑制内皮细胞增殖。细胞成管实验如图3所示，与TDNs+siCTRL组相比，TDNs+siDOCK6可抑制血管内皮细胞成管能力，包括毛细成管的长度与血管分支节点等。
实施例4体内模型实验
(1)氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型
1)小鼠出生后P7至P12置于氧气浓度75％的氧箱中，高浓度氧气会导致未成熟视网膜血管的丧失，并减慢正常视网膜血管系统的发育，导致视网膜中央无血管区形成；
2)P12回到正常室内空气中(氧气浓度约21％)，低氧环境诱导血管生成因子的表达，导致正常视网膜血管的再生，以及新生血管的病理性形成，模拟ROP的第二阶段；
3)P12玻璃体腔分组给药，给药方式如下：①正常对照组(正常小鼠/TDNs+siCTRL)：对正常小鼠玻璃体腔注射TDNs+siCTRL；②正常治疗组(正常小鼠/TDNs+siDOCK6)组：对正常小鼠玻璃体腔注射TDNs+siDOCK6；③OIR模型对照组(OIR小鼠/TDNs+siCTRL)：对OIR模型鼠玻璃体腔注射TDNs+siCTRL；④OIR模型治疗组(OIR小鼠/TDN+siDOCK6)：对OIR模型鼠玻璃体腔注射TDNs+siDOCK6；所有给药方式均为1μM TDNs+siRNA 1μL。
4)P17时取材铺片，观察视网膜并进行免疫荧光染色后拍照，ImageJ计算视网膜新生血管及无血管区面积。
实验结果如图4所示，与正常对照组相比，正常治疗组并不引起视网膜血管无灌注区增加；与OIR模型对照组相比，经过TDNs+siDOCK6治疗后的OIR小鼠无灌注区及新生血管面积均下调。
以上结果表明本发明提供的TDNs+siDOCK6复合物可有效减少DOCK6的表达，抑制眼部新生血管的生成，改善视网膜无灌注区面积，可用于预防和/或治疗眼部新生血管性疾病。
Claims (7)
1.一种靶向DOCK6的siRNA与四面体框架核酸复合物，其特征在于，包括四面体框架核酸及搭载的靶向DOCK6的siRNA；所述靶向DOCK6的siRNA包括正义链和反义链，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～2所示；所述四面体框架核酸的四条DNA单链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3～6所示。
2.权利要求1所述复合物的制备方法，其特征在于，将四面体框架核酸中的一条单链与靶向DOCK6的siRNA的正义链连接，再将连接后的序列与四面体框架核酸剩余的三条单链加入到TM缓冲液中，93～97℃维持8～12min，快速降温到3～5℃维持18～22min，即得。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，是将反应液加热到95℃维持10min，然后快速降温到4℃维持20min合成。
4.权利要求1所述复合物在制备预防和/或治疗视网膜新生血管相关疾病的药物中的应用；所述视网膜新生血管相关疾病为糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜静脉周围炎或年龄相关性黄斑变性中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述药物制剂为注射剂、滴眼剂、脂质体或气雾剂中的一种或多种。
6.一种预防和/或治疗眼部新生血管性疾病的药物，其特征在于，包括权利要求1所述复合物。
7.根据权利要求6所述药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
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