CN103068980A - 使用短干扰核酸（siNA）的RNA干扰介导的联蛋白（钙粘蛋白关联蛋白质），β1（CTNNB1）基因表达的抑制 - Google Patents

使用短干扰核酸（siNA）的RNA干扰介导的联蛋白（钙粘蛋白关联蛋白质），β1（CTNNB1）基因表达的抑制 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于研究、诊断和治疗响应CTNNB1基因表达和/或活性调节和/或调节β-连环蛋白基因表达途径的性状、疾病和病状的化合物、组合物和方法。具体而言，本发明涉及能够介导针对CTNNB1基因表达的RNA干扰（RNAi）或介导针对CTNNB1基因表达的RNA干扰（RNAi）的双链核酸分子，包括小核酸分子，例如短干扰核酸（siNA）、短干扰RNA（siRNA）、双链RNA（dsRNA）、微小RNA（miRNA）、和短发夹RNA（shRNA）分子。

Description

使用短干扰核酸（siNA）的RNA干扰介导的联蛋白（钙粘蛋白关联蛋白质），β1（CTNNB1）基因表达的抑制
序列表
按照37 CFR §1.52（e）（5）经由EFS提交的序列表引入本文作为参考。经由EFS提交的序列表文本文件含有于2011年7月25日创建的文件“SequenceListingSIRONC2”，其大小为2,173,912字节。
发明背景
β联蛋白（也称为钙粘蛋白关联蛋白质和β-联蛋白）是细胞溶质蛋白质的联蛋白家族成员。β-联蛋白（β-catenin）由CTNNB1基因编码。
β-联蛋白是Wnt/Wg信号传导途径中的关键性参与者，几个发育过程的介质。在不存在Wnt的情况下，糖原合酶激酶3（GSK-3β），丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶组成性磷酸化β-联蛋白蛋白质。当Wnt存在且结合卷曲受体（Fz）的任何家族成员时，称为散乱（dishevelled）（Dsh）的细胞内信号传导蛋白质召募至膜且磷酸化。GSK-3β通过Dsh的激活抑制。因此，β-联蛋白水平在细胞溶质中增加且易位到核内以执行多种功能。β-联蛋白连同转录因子TCF和LEF一起作用，以激活涉及不同过程的特异性靶基因。
β-联蛋白在生长因子刺激后经历磷酸化，导致减少的细胞粘附，从而充当粘着连接的组分，所述粘着连接是介导细胞粘附、细胞间通信和细胞支架锚定的多蛋白复合物。（Willert等人，1998，Curr. Opin. Genet. Dev. 8:95-102）。
Thompson等人提出β-联蛋白在肝生物学的多个方面起重要作用，包括肝发育（胚胎和出生后）、在部分肝切除术后的肝再生、肝细胞生长因子（HGF）诱导的肝肿大、肝区划（liver zonation）、和肝癌的发病机理。（Thompson MD.，2007，Hepatology May；45（5）:1298-305）。
Wang等人（2008）已显示β-联蛋白可以充当癌基因。（Wang等人，2008，Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 17（8）:2101–8）。在具有基底细胞癌的患者中，存在β-联蛋白中的增加水平，并且导致相关肿瘤的增殖中的增加。β-联蛋白基因中的突变是结肠直肠癌（CRC）、毛基质瘤（PTR）、成髓细胞瘤（MDB）、肝母细胞瘤和卵巢癌的原因。
β-联蛋白在结肠直肠癌发展中的作用已显示通过APC（结肠的腺瘤性息肉病）基因，肿瘤抑制基因的表达产物调节。（Korinek等人，Science，1997，275:1784-1787；Morin等人，Science，1997，275:1787-1790）。APC蛋白质通常结合与TCF/LEF结合的β-联蛋白，形成转录因子复合物。Morin等人（Morin等人，Science，1997，275:1787-1790）报道APC蛋白质在结肠癌中下调通过β-联蛋白和Tcf-4介导的转录激活。他们的结果指出β-联蛋白的调节对于APC的肿瘤抑制作用是关键的，并且这种调节可以通过APC或β-联蛋白中的突变回避。
β-联蛋白基因中的突变是导致β-联蛋白的N末端部分缺失的平截，或影响通过GSK3α/β或CKIα靶向的丝氨酸和苏氨酸残基的点突变。这些突变型β-联蛋白蛋白质对于磷酸化是抗拒性的并且因此逃避蛋白酶体降解。因此，β-联蛋白在受累细胞内累积。稳定和核局限性的β-联蛋白是结肠癌的几乎所有情况的标志。（Clevers，H.，2006，Cell 127:469-480）。Morin等人证实改变磷酸化位点的β-联蛋白突变致使细胞对于APC介导的β-联蛋白下调不敏感，并且这种破坏机制对于结肠直肠肿瘤发生是关键的。（Morin等人，1997，Science 275:1787-1790）。
其他研究也报道了在多个癌细胞系中的β-联蛋白中的突变检测（参见例如，Chan等人，1999，Nature Genet. 21:410-413；Blaker等人，1999，Genes Chromosomes Cancer 25:399-402；Sagae等人，1999，Jpn. J. Cancer Res. 90:510-515；Wang等人，2008，Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 17（8）:2101–8）。另外，异常高量的β-联蛋白也已在黑素瘤细胞系中发现（参见例如，Rubinfeld等人，1997，Science，275:1790-1792）。
如同其他癌症，例如肝细胞癌（HCC），也已与Wnt/β-联蛋白途径相关。HCC是负责全世界每年超过660,000个新病例的复杂和异质疾病。多个报道已显示Wnt信号传导组分在人HCC患者中是激活的。激活的Wnt信号传导和核β-联蛋白与疾病复发和预后不良相关（Takigawa等人2008，Curr Drug Targets Nov；9（11）:1013-24）。升高的核β-联蛋白染色已在17-66% HCC患者中得到证明（Zulehner等人2010，Am J Pathol. Jan；176（1）:472-81；Yu等人2009，J Hepatol. May；50（5）:948-57）。Merck与香港大学合作生成的关于~300个HCC患者肿瘤的内部数据集指示Wnt信号传导组分在50% HCC患者中激活。外部数据已显示在13-40% HCC患者中的激活β-联蛋白突变，而灭活Axin 1或2突变存在于~10% HCC患者中（Lee等人2006，Frontiers in Bioscience May 1:11:1901-1915）。
临床前研究提供Wnt/β-联蛋白途径的激活在HCC的生成和维持中是重要的证据。在小鼠中APC的肝靶向破坏激活β-联蛋白信号传导且导致HCC的形成（Colnot等人2004，Proc Natl Acad Sci U S A. Dec 7；101（49）:17216-21）。尽管单独的缺乏GSK-3β磷酸化位点的β-联蛋白突变型的过表达对于肝癌形成是不足够的（Harada等人2002，Cancer Res. Apr 1；62（7）:1971-7.），但致瘤突变型β-联蛋白的过表达已显示使得小鼠对于通过DEN（二乙基亚硝胺）诱导的HCC敏感，所述DEN是已知致癌物（Nejak-Bowen等人2010，Hepatology 2010 May；51（5）:1603-13。有利的是，在小鼠（Tre-Met转基因小鼠模型）中通过人Met受体的过表达起始的95% HCC肿瘤具有β-联蛋白激活突变（Tward等人2007，Proc Natl Acad Sci U S A. Sep 11；104（37）:14771-6）。这个发现反映人疾病且暗示Wnt途径在肝癌形成过程中与Met信号传导合作。高比率的β-联蛋白激活突变也在关于HCC的其他转基因小鼠模型中发现（在FGF19中的16% β-联蛋白突变，在c-Myc中55%和在H-Ras转基因小鼠中41%）（Nicholes等人2002，Am J Pathol. Jun；160（6）:2295-307 de la Coste等人1998，Proc Natl Acad Sci U S A. Jul 21；95（15）:8847-51）。
临床前研究也已显示β-联蛋白是关于HCC的有效靶。β-联蛋白siRNAs抑制人HCC细胞系的增殖和活力（Zeng等人2007）。类似地，用抗Wnt-1抗体或TCF4/β-联蛋白拮抗剂处理人HCC细胞系诱导细胞凋亡、c-Myc的减少、细胞周期蛋白D1和存活素表达，以及在体内抑制肿瘤生长（Wei等人2009，Mol Cancer Sep 24；8:76； Wei等人2010，Int J Cancer. May 15；126（10）:2426-36.2010）。
肝细胞癌（HCC）是对于其缺乏有效疗法的常见和侵略性癌症。Wnt/β-联蛋白途径在高比例的HCC病例（~50%）中是激活的，通常是由于β-联蛋白（即CTNNB1）或β-联蛋白破坏复合物（例如Axin1）中的突变。此外，Wnt途径作为靶已证明是挑战性的且目前无法通过小分子抑制剂给药，使得β-联蛋白成为关于基于RNAi的治疗方法的有吸引力靶（Llovet等人2008，Hepatology Oct：48：1312-1327）。
通过RNA干扰（下文称为“RNAi”）的基因表达特别是CTNNB1基因表达的改变是用于满足这个需要的一种方法。RNAi通过小单链RNA（“ssRNA”）或双链RNA（“dsRNA”）分子诱导。称为“短干扰核酸（“siNA”）”或“短干扰RNA”或“siRNA”或“RNAi抑制剂”的短dsRNA分子，沉默与siNA共享序列同源性的信使RNAs（“mRNAs”）的表达。这可以经由通过含有siNA的内切核酸酶复合物介导的mRNA切割发生，所述内切核酸酶复合物通常称为RNA诱导的沉默复合物（RISC）。靶RNA的切割一般在与siNA双链体的指导序列互补的区域中间发生（Elbashir等人，2001，Genes Dev. ，15:188）。此外，RNA干扰也可以涉及小RNA（例如微小RNA或miRNA）介导的基因沉默，推测是通过抑制翻译或调节染色质结构且从而阻止靶基因序列转录的细胞机制（参见例如Allshire，2002，Science ，297:1818-1819；Volpe等人，2002，Science ，297:1833-1837；Jenuwein，2002，Science ，297:2215-2218；和Hall等人，2002，Science ，297:2232-2237）。尽管在RNAi领域中的显著进展，但存在关于试剂的需要，所述试剂可以抑制CTNNB1基因表达，且可以治疗与CTNNB1表达相关的疾病例如癌症。
发明概述
本发明提供了使用新的短干扰核酸（siNA）分子调节CTNNB1表达，治疗响应CTNNB1基因表达调节的疾病的问题的解决方案。
本发明提供了化合物、组合物和方法，其用于调节CTNNB1基因特别是与癌症相关的那些CTNNB1基因的表达，且用于使用小核酸分子通过RNA干扰（RNAi）治疗此类状况。
特别地，本发明的特征在于小核酸分子，即短干扰核酸（siNA）分子，包括但不限于短干扰RNA（siRNA）、双链RNA（dsRNA）、微小RNA（miRNA）、短发夹RNA（shRNA）和环状RNA分子，和用于调节CTNNB1基因和/或涉及CTNNB1基因表达和/或活性途径的其他基因表达的方法。
在一个方面，本发明提供了抑制细胞或哺乳动物中的CTNNB1基因表达的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述双链siNAs包含有义和反义链。反义链包含与CTNNB1基因表达相关的RNA的至少部分互补的序列。有义链包含与反义链互补的序列。在多个实施方案中，至少一条链包含选自由SEQ ID NOS:1-6374组成的序列组的至少15个核苷酸序列。在特定实施方案中，反义链包含与表1a中所示的靶序列具有序列互补性的至少15、16、17、18或19个核苷酸。在其他和/或同一实施方案中，反义链包含表1b中所示的反义序列之一的至少15、16、17、18或19个核苷酸序列。在一些实施方案中，有义链包含如表1b中所示的有义链序列的至少15、16、17、18或19个核苷酸序列。
在本发明的这个方面的特定实施方案中，提供了双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述反义链包含如表1c中所示的修饰的序列，其与本发明的靶序列具有序列互补性。在一些实施方案中，有义链还包含如表1c中所示的修饰的序列。
在特定实施方案中，本发明提供了调节CTNNB1表达的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述siNA包含有义链和反义链；每条链独立地长度为15 - 30个核苷酸；并且反义链包含与下述中的任何具有序列互补的至少15、16、17、18或19个核苷酸：
Figure 2011800374998100002DEST_PATH_IMAGE001
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
在本发明的一些实施方案中，siNA分子的反义链包含下述的至少15、16、17、18或19个核苷酸序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
在一些实施方案中，本发明的siNA分子的有义链包含下述的至少15、16、17、18或19个核苷酸序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子包含下述中的任何：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE007
。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子包含SEQ ID NOS：6372和6374。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子包含SEQ ID NOS：6370和6369。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子包含SEQ ID NOS：2021和2068。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子包含SEQ ID NOS：6372和6373。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子包含SEQ ID NOS：2147和6368。
在一些实施方案中，本发明的特征在于包含下述的组合物：
（a）本发明的双链短干扰核酸（siNA）；
（b）具有化合物编号1-46中的任何或其任何组合的阳离子脂质化合物；
（c）胆固醇；
（d）DSPC；和
（e）PEG-DMG。
在一些实施方案中，本发明的特征在于包含下述的组合物：
（a）本发明的双链短干扰核酸（siNA）；
（b）（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺；
（c）胆固醇；
（d）DSPC；和
（e）PEG-DMG。
在一些实施方案中，本发明的特征在于包含下述的组合物：
（a）具有SEQ ID NOS：6372和6374的双链短干扰核酸（siNA）；
（b）（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺；
（c）胆固醇；
（d）DSPC；和
（e）PEG-DMG。
在一些实施方案中，本发明的特征在于包含下述的组合物：
（a）具有SEQ ID NOS：6370和6369的双链短干扰核酸（siNA）；
（b）（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺；
（c）胆固醇；
（d）DSPC；和
（e）PEG-DMG。
在一些实施方案中，本发明的特征在于包含下述的组合物：
（a）具有SEQ ID NOS：2021和2068的双链短干扰核酸（siNA）；
（b）（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺；
（c）胆固醇；
（d）DSPC；和
（e）PEG-DMG。
在一些实施方案中，本发明的特征在于包含下述的组合物：
（a）具有SEQ ID NOS：6372和6373的双链短干扰核酸（siNA）；
（b）（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺；
（c）胆固醇；
（d）DSPC；和
（e）PEG-DMG。
在一些实施方案中，本发明的特征在于包含下述的组合物：
（a）具有SEQ ID NOS：2147和6368的双链短干扰核酸（siNA）；
（b）（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺；
（c）胆固醇；
（d）DSPC；和
（e）PEG-DMG。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含具有以下述摩尔比的化合物编号1-46中的任何的任何阳离子脂质：
阳离子脂质 / 胆固醇 / PEG-DMG 56.6/38/5.4；
阳离子脂质 / 胆固醇 / PEG-DMG 60/38/2；
阳离子脂质/ 胆固醇 / PEG-DMG 67.3/29/3.7；
阳离子脂质 / 胆固醇 / PEG-DMG 49.3/47/3.7；
阳离子脂质 / 胆固醇 / PEG-DMG 50.3/44.3/5.4；
阳离子脂质 / 胆固醇 / PEG-C-DMA / DSPC 40/48/2/10；
阳离子脂质 / 胆固醇 / PEG-DMG / DSPC 40/48/2/10；和
阳离子脂质 / 胆固醇 / PEG-DMG / DSPC 58/30/2/10。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺、胆固醇、DSPC和PEG-DMG，分别具有50:30:10:2的摩尔比。
在一些实施方案中，本发明的组合物进一步包含冷冻保护剂。在一些实施方案中，冷冻保护剂是蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、麦芽三糖-庚糖、葡聚糖、羟乙基淀粉、胰岛素、山梨糖醇、甘油、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、二甲基亚砜或其任何组合。在一些实施方案中，冷冻保护剂是蔗糖。在一些实施方案中，冷冻保护剂是海藻糖。在一些实施方案中，冷冻保护剂是蔗糖和海藻糖的组合。
在本发明的一些实施方案中，本发明的siNAs的所有核苷酸都是未修饰的。在其他实施方案中，在siNA分子的一条或两条链中独立的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30）核苷酸位置是修饰的。修饰包括核酸糖修饰、碱基修饰、主链（核苷酸间键）修饰、非核苷酸修饰和/或其任何组合。在特定情况下，嘌呤和嘧啶核苷酸是差异修饰的。例如，嘌呤和嘧啶核苷酸可以是在2'-糖位置上差异修饰的（即至少一个嘌呤具有在2'-糖位置上与相同或不同链中的至少一个嘧啶不同的修饰）。在特定情况下，嘌呤是在一条或两条链中未修饰的，而在一条或两条链中的嘧啶是修饰的。在特定其他情况下，嘧啶在一条或两条链中未修饰的，而在一条或两条链中的嘌呤是修饰的。在一些情况下，至少一个修饰的核苷酸是2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-脱氧核苷酸或2'-O-烷基核苷酸。在一些情况下，在一条或两条链中的至少5个或更多个嘧啶核苷酸都是2'-脱氧-2'-氟或都是2'-O-甲基嘧啶核苷酸。在一些情况下，在一条或两条链中的至少5个或更多个嘌呤核苷酸都是2'-脱氧-2'-氟或都是2'-O-甲基嘌呤核苷酸。在其中siNA分子包含如本文描述的一种或多种修饰的特定情况下，在引导（反义）链的5'-末端处的位置1、2和3上的核苷酸是未修饰的。
在特定实施方案中，本发明的siNA分子具有在一条或两条链上的一、二、三或四个核苷酸的3'突出端。在其他实施方案中，siNA分子缺乏突出端（即具有平端）。优选地，siNA分子具有在有义和反义链上的两个核苷酸的3'突出端。突出端可以是修饰的或未修饰的。在突出端中修饰的核苷酸的例子包括但不限于2'-O-烷基核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核苷酸、锁定核酸（LNA）核苷酸或2'-脱氧核苷酸。在反义链中的突出端核苷酸可以包含与CTNNB1靶序列中的核苷酸互补的核苷酸。同样地，在有义链中的突出端可以包含在CTNNB1靶序列中的核苷酸。在特定情况下，本发明的siNA分子具有其为2'-O-烷基（例如2'-O-甲基）核苷酸的在反义链上的两个3'突出端核苷酸，和其为2'-脱氧核苷酸的在有义链上的两个3'突出端核苷酸。在其他情况下，本发明的siNA分子具有在反义链和有义链上的其为2'-O-烷基（例如2'-O-甲基）核苷酸的两个3'突出端核苷酸。在特定实施方案中，2'-O-烷基核苷酸是2'-O-甲基尿苷核苷酸。在特定情况下，突出端还包含在突出端的核苷酸之间的一个或多个硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子具有帽（在本文中也称为“末端帽”。 帽可以存在于5'-末端（5'帽）或3'-末端（3'帽）上，或可以存在于两个末端处，例如在siNA的有义链的5'和3'-末端处。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子是在反义链的5'-末端处磷酸化的。磷酸基可以是磷酸根、二磷酸根或三磷酸根。
当双链时，本发明的siNA分子可以是对称或不对称的。这些双链siNAs的每条链独立地可以在核苷酸长度中范围为3 – 30个核苷酸。一般地，本发明的siNA分子的每条链长度为约15 – 30（即约19、20、21、22、23或24）个核苷酸。
其为双链或具有双链体结构的本发明的siNA分子独立地包含约3 – 约30（例如约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30）个碱基对。一般地，本发明的siNAs的双链体结构长度是15 - 30、更一般是18 - 25、再更一般是19 - 24、且最一般是19 - 21个碱基对。
在特定实施方案中，提供了双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述分子具有有义链和反义链且包含式（A）：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
其中，上部链是双链核酸分子的有义链且下部链是反义链；其中所述反义链包含SEQ ID NO：4918、SEQ ID NO：5107、SEQ ID NO：5109或SEQ ID NO：5064的至少15、16、17、18或19个核苷酸序列，并且所述有义链包含与反义链具有互补性的序列；
每个N独立地是其为未修饰或化学修饰的核苷酸的核苷酸或非核苷酸；
每个B是存在或不存在的末端帽；
（N）代表其各自独立地是未修饰或化学修饰的突出端核苷酸；
[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；
X1和X2独立地是0 - 4的整数；
X3是15 - 30的整数；
X4是9 - 30的整数；和
X5是0 – 6的整数，前提是X4和X5的和为15 – 30。
在一个实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）；其中
（a）在NX4位置中的一个或多个嘧啶核苷酸独立地是2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-O-烷基核苷酸、2'-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；
（b）在NX4位置中的一个或多个嘌呤核苷酸独立地是2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-O-烷基核苷酸、2'-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；
（c）在NX3位置中的一个或多个嘧啶核苷酸独立地是2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-O-烷基核苷酸、2'-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；和
（d）在NX3位置中的一个或多个嘌呤核苷酸独立地是2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-O-烷基核苷酸、2'-脱氧核苷酸、核糖核苷酸。
本发明进一步提供了包含本文描述的双链核酸分子连同药学可接受的载体或稀释剂的组合物。
组合物的施用可以通过已知方法执行，其中在体外或体内将核酸引入所需靶细胞内。
用于将本发明的核酸分子引入细胞、组织和生物内的常用技术包括多种载体（carrier）系统、试剂和载体（vector）的使用。适合于在本发明中使用的此类载体系统的非限制性例子包括缀合物、核酸-脂质颗粒、脂质纳米颗粒（LNP）、脂质体、脂复合物、微团、病毒体、病毒样颗粒（VLP）、核酸复合物及其混合物。
本发明的组合物可以以气溶胶、分散体、溶液（例如可注射溶液）、乳膏、软膏、片剂、粉末、悬液等的形式。这些组合物可以以任何合适的方法例如经口、舌下、经颊、肠胃外、经鼻或局部施用。在一些实施方案中，组合物是气溶胶化的且经由吸入递送。
本发明的分子和组合物具有在广泛范围的治疗应用上的效用。相应地，本发明的另一个方面涉及本发明的化合物和组合物在治疗受试者中的用途。本发明因此提供了用于治疗患有状况的受试者例如人的方法，所述状况通过CTNNB1的作用或CTNNB1作用的丧失介导，其中所述方法包括给受试者施用有效量的本发明的双链短干扰核酸（siNA）分子。在特定实施方案中，状况是癌症。
本发明的这些及其他方面在参考下述详述和附图后将是显而易见的。此外，考虑本文描述的任何方法或组合物可以就本文描述的任何其他方法或组合物而言实现，并且不同实施方案可以组合。
此外，专利、专利申请和其他文件在说明书自始至终引用，以描述且更具体而言阐述本发明的多个方面。本文引用的这些参考文献包括附图各自在此整体引入作为参考。
附图简述
图1显示了代表涉及RNAi的靶RNA降解的非限制性的提议的机制。通过依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRP）由外来单链RNA产生的双链RNA（dsRNA）激活切酶（DICER），所述切酶进而产生siNA双链体，所述外来单链RNA例如病毒、转座子或其他外源RNA。可替代地，合成或表达的siNA可以通过合适的方法直接引入细胞内。形成识别靶RNA的活性siNA复合物，从而导致通过RISC内切核酸酶复合物降解靶RNA或导致通过依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRP）合成另外的RNA，其可以激活切酶且导致另外的siNA分子，从而扩大RNAi应答。
图2显示了使用代表性siNA双链体的一般化结构，本发明的化学修饰的siNA构建体的非限制性例子。该图中所示的具体修饰可以单独或与该图的其他修饰组合利用，加上在本文中就本发明的任何siNA分子而言描述的其他修饰和特征。在该图中，N代表如此处描述的任何核苷酸或任选的非核苷酸。具有B-NX3-（N）X2-B -3'的上部链是siNA的有义（或过客）链，而具有B（N）X1-NX4-[N]X5 -5'的下部链是siNA的反义（或引导）链。有义链的内部位置的核苷酸（或任选的非核苷酸）指定NX3，并且反义链的内部位置的核苷酸（或任选的非核苷酸）指定NX4。内部部分的核苷酸（或任选的非核苷酸）一般是在两条链之间碱基配对的，但在一些实施方案中可以任选缺乏碱基配对（例如具有错配或缺口）。突出端区域的核苷酸（或任选的非核苷酸）由圆括号（N）指定。反义链的5'-末端部分的核苷酸指定[N]。末端帽任选存在于有义链的5'和/或3'-末端处，并且进一步任选存在于反义链的3'-末端处。一般地，每条链可以独立地长度范围为约15 – 约30个核苷酸，但可以取决于任何突出端核苷酸的存在而改变。在特定实施方案中，X1和X2独立地是0 - 4的整数；X3是15 - 30的整数；X4是9 - 30的整数；X5是0 – 6的整数，前提是X4和X5的和为15 – 30。显示了关于siNA构建体的有义和反义链的核苷酸的各种修饰。（N）突出端核苷酸位置可以如本文所描述的进行化学修饰（例如，2'-O-甲基、2'-脱氧-2'-氟、2'-脱氧、LNA、通用碱基等），且可以衍生自或不衍生自相应的靶核酸序列。图中所示的构建体也可以包含如本文描述的硫代磷酸酯键。例如，硫代磷酸酯键可以存在于任何N、（N）和/或[N]位置之间。此类硫代硫酸酯掺入可以用于在嘌呤“R”和嘧啶“Y”位置之间，或用于稳定一般而言的嘧啶键。此外，尽管在该图上未描述，但该图中显示的构建体可以任选包括在来自有义链的5'-末端的第9位，或通过从引导链的5'-末端计数11个核苷酸位置基于引导链的5'-末端的第11位处的核糖核苷酸。类似地，反义链可以包括在来自5'-末端的第14位处的核糖核苷酸，或可替代地可以这样选择或设计，从而使得2'-O-烷基核苷酸（例如2'-O-甲基嘌呤）不存在于这个位置上。此外，尽管在该图中未描述，但反义链的5'-末端位置可以包含如本文描述的末端磷酸基。反义链一般包含与本发明的任何靶核酸序列互补的序列，例如本文表1a中所示的那些。
图3显示了应用于图2中所述的代表性siNA双链体的特定修饰组合的非限制性例子。下文显示代表性结构的表提供了（N）X1、（N）X2、NX3、NX4和/或[N]X5核苷酸（和任选的非核苷酸）位置的具体组合。例如，指定了5个或更多个（例如5、6、7、8、9或10个或更多个）NX3和5个或更多个（例如5、6、7、8、9或10个或更多个）NX4嘧啶“Y”和嘌呤“R”核苷酸的组合，其各自可以独立地具有如该图中所示的具体（N）X1和/或（N）X2置换，加上任选的硫代磷酸酯置换。5'-末端反义链[N[核苷酸一般是核糖核苷酸，但也可以是修饰或未修饰的，取决于它们是嘌呤“R”还是嘧啶“Y”核苷酸。
图4A - C显示了本发明的不同siNA构建体的非限制性例子。图2和3中所示的代表性结构的标准可以应用于图4A - C中所示的任何结构。
图4A中显示的例子（构建体1、2和3）具有19个代表性碱基对；然而，本发明的不同实施方案包括本文描述的任何数目的碱基对。括弧区域代表核苷酸突出端，例如，包含长度为约1、2、3或4个核苷酸，优选约2个核苷酸。构建体1和2可以独立地用于RNAi活性。构建体2可以包含多核苷酸或非核苷酸接头，其可以任选被设计为生物可降解的接头。在一个实施方案中，构建体2中显示的环结构可以包含生物可降解的接头，其导致在体内和/或体外形成构建体1。在另一个例子中，构建体3可以用于在相同原理下产生构建体2，其中接头用于在体内和/或体外产生活性siNA构建体2，其可以任选利用另一种生物可降解的接头以在体内和/或体外产生活性siNA构建体1。照这样，siNA构建体的稳定性和/或活性可以基于用于在体内或体外和/或体外使用的siNA构建体的设计进行调节。
图4B中显示的例子代表本发明的双链核酸分子的不同变化，例如微小RNA，其可以包括起因于部分互补性的突出端、凸起、环和茎-环。具有凸起、环和茎-环的此类基序一般是miRNA的特征。凸起、环和茎-环可以起因于任何程度的部分互补性，例如在本发明的双链核酸分子的1条或2条链中约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多核苷酸的错配或凸起。
图4C中显示的例子代表本发明的模型双链核酸分子，其包含具有2个21核苷酸序列、具有二核苷酸3'-突出端的19个碱基对双链体。顶部链（1）代表有义链（过客链），中间链（2）代表反义链（引导链），和下部链（3）代表靶多核苷酸序列。二核苷酸突出端（NN）可以包含衍生自靶多核苷酸的序列。例如，引导链中的3'-（NN）序列可以与靶多核苷酸的5'-[NN]序列互补。此外，过客链的5'-（NN）序列可以包含与靶多核苷酸序列的5'-[NN]序列相同的序列。在其他实施方案中，突出端（NN）不衍生自靶多核苷酸序列，例如其中引导链中的3'-（NN）序列与靶多核苷酸的5'-[NN]序列不互补，且过客链的5'-（NN）序列可以包含与靶多核苷酸序列的5'-[NN]序列不同的序列。在另外的实施方案中，任何（NN）核苷酸是化学修饰的，例如如2'-O-甲基、2'-脱氧-2'-氟和/或本文的其他修饰。此外，过客链可以包含过客链的核糖核苷酸位置N。对于显示的代表性19碱基对21聚体双链体，位置N可以是在来自过客链的3'末端中的9个核苷酸。然而，在具有不同长度的双链体中，位置N基于引导链的5'-末端进行确定，其通过从引导链的5'-末端计数11个核苷酸位置且挑选过客链中相应的碱基配对核苷酸实现。通过Ago2的切割在如箭标指出的位置10和11之间发生。在另外的实施方案中，在基于引导链的5'-末端的位置10和11处存在2个核糖核苷酸，NN，其通过从引导链的5'-末端计数10和11个核苷酸位置且挑选过客链中相应的碱基配对核苷酸实现。
图5显示了不同稳定化学物（1 - 10）的非限制性例子，所述稳定化学物可以例如用于稳定本发明的siNA序列的5'和/或3'-末端，包括（1）[3-3']-反向脱氧核糖；（2）脱氧核糖核苷酸；（3）[5'-3']-3'-脱氧核糖核苷酸；（4）[5'-3']-核糖核苷酸；（5）[5'-3']-3'-O-甲基核糖核苷酸；（6）3'-甘油基；（7）[3'-5']-3'-脱氧核糖核苷酸；（8）[3'-3']-脱氧核糖核苷酸；（9）[5'-2']-脱氧核糖核苷酸；和（10）[5-3']-二脱氧核糖核苷酸（当X = O时）。除了该图中指出的经修饰的和未修饰的主链化学外，这些化学物可以与如本文所描述的不同糖和碱基核苷酸修饰组合。
图6显示了用于鉴定本发明化学修饰的siNA构建体的策略的非限制性例子，所述siNA构建体是核酸酶抗性的同时保留介导RNAi活性的能力。基于教导的设计参数将化学修饰引入siNA构建体内（例如，引入2'-修饰、碱基修饰、主链修饰、末端帽修饰等）。经修饰的构建体在合适的系统中进行测试（例如，关于核酸酶抗性的人血清，显示，或关于PK/递送参数的动物模型）。平行地，siNA构建体就RNAi活性例如在细胞培养系统例如萤光素酶报道分子测定和/或针对内源mRNA）中进行测试。随后鉴定具有特定特征同时维持RNAi活性的引导siNA构建体，且其可以再一次进行进一步修饰和测定。相同方法可以用于鉴定具有改善的药物代谢动力学概况、递送和RNAi活性的siNA-缀合物分子。
图7显示了本发明的磷酸化siNA分子的非限制性例子，包括线性和双链体构建体及其不对称的衍生物。
图8显示了本发明的化学修饰的末端磷酸基的非限制性例子。
图9显示了胆固醇连接的亚磷酰胺的非限制性例子，其可以用于合成本发明的胆固醇缀合的siNA分子。显示了具有与siNA分子的有义链5'-末端连接的胆固醇部分的例子。
图10描述了与核酸链连接的5'和3'反向脱碱基帽的一个实施方案。
发明详述
A. 术语和定义
下述术语和定义如本申请中使用的应用。
如本文所使用的术语“脱碱基的”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指缺乏核碱基或具有氢原子（H）或其他非核碱基化学基团代替在糖部分的1'位置上的核碱基的糖部分，参见例如Adamic等人，美国专利号5,998,203。在一个实施方案中，本发明的脱碱基部分是核糖、脱氧核糖或双脱氧核糖。
如本文所使用的术语“无环核苷酸”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指具有无环核糖的任何核苷酸，例如其中核糖碳/碳或碳/氧键中的任何一个独立地或组合地在核苷酸中不存在。
如本文所使用的术语“烷基”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指饱和或不饱和烃，包括直链、支链、链烯基、炔基和环状基团，但排除芳族基团。尽管前述，烷基还指非芳族杂环基团。优选地，烷基具有1 – 12个碳。更优选地，它是1 – 7个碳、更优选1 - 4个碳的低级烷基。烷基可以是取代或未取代的。当取代时，取代基优选是羟基、卤素、氰基、C1-C4烷氧基、=O、=S、NO2 、SH、NH2或NR1R2，其中R1和R2独立地是H或C1-C4烷基。
短语“干扰细胞周期检查点的试剂”指抑制转导细胞周期检查点信号的蛋白质激酶的化合物，从而使癌细胞对DNA损伤试剂致敏。
短语“干扰受体酪氨酸激酶（RTKs）的试剂”指抑制RTKs且因此抑制涉及癌发生和肿瘤进展的机制的化合物。
短语“雄激素受体调节剂”指干扰或抑制雄激素与受体的结合的化合物，与机制无关。
短语“血管发生抑制剂”指抑制新血管形成的化合物，与机制无关。
如本文所使用的术语“芳基”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指芳族基团，其具有含共轭π电子系统的至少一个环且包括碳环芳基、杂环芳基和联芳基，所有这些可以是任选取代的。芳基的优选取代基是卤素、三卤甲基、羟基、SH、OH、氰基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4炔基、NH2和NR1R2基团，其中R1和R2独立地是H或C1-C4烷基。
如本文所使用的术语“烷芳基”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指与芳基（如上所述）共价连接的烷基（如上所述）。碳环芳基是其中芳族环上的环原子都是碳原子的基团。碳原子是任选取代的。杂环芳基是在芳族环中具有1个 - 3个杂原子作为环原子和剩余环原子是碳原子的基团。合适的杂原子包括氧、硫和氮，并且具有此类杂原子的杂环芳基的例子包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低级烷基吡咯并、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等，全部任选取代。优选地，烷基是C1-C4烷基。
如本文所使用的术语“酰胺”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指-C（O）-NH-R，其中R是烷基、芳基、烷芳基或氢。
如本文所使用的短语“反义区”指其如本领域一般公认的意义。就本发明的示例性核酸分子而言，该术语指与靶核酸序列具有互补性的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的反义区可以任选包含与siNA分子的有义区具有互补性的核酸序列。在一个实施方案中，siNA分子的反义区称为反义链或引导链。
短语“不对称发夹”指包含反义区、可以包含核苷酸或非核苷酸的环部分、和有义区的线性siNA分子，所述有义区包含比反义区更少的核苷酸，其程度至有义区具有足够的互补核苷酸以与反义区碱基配对且形成具有环的双链体。例如，本发明的不对称的发夹siNA分子可以包含具有足够的长度以在细胞或体外系统中介导RNAi的反义区（例如约15 - 约30个，或约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸）和包含约4 - 约12个（例如，约4、5、6、7、8、9、10、11或12个）核苷酸的环区域、和具有与反义区互补的约3 - 约25个（例如，约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个）核苷酸的有义区。不对称的发夹siNA分子还可以包含5'-末端磷酸基，其可以是化学修饰的。不对称的发夹siNA分子的环部分可以包含如本文所描述的核苷酸、非核苷酸、接头分子或缀合分子。
如本文所使用的术语“生物可降解的”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指生物系统中的降解，例如酶促降解或化学降解。
如本文所使用的术语“生物可降解的接头”指其如本领域一般公认的意义。就本发明的示例性核酸分子而言，该术语指这样的接头分子，其被设计为使一种分子与另一种分子连接，并且对于生物系统中的降解敏感。接头可以是基于核酸或非核酸的接头。例如，生物可降解的接头可以用于使配体或生物活性分子与本发明的siNA分子附着。可替代地，生物可降解的接头可以用于连接本发明的siNA分子的有义和反义链。生物可降解的接头被这样设计，使得它的稳定性可以就特定目的进行调节，例如递送给特定组织或细胞类型。基于核酸的生物可降解的接头分子的稳定性可以通过使用各种化学进行调节，例如核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和化学修饰的核苷酸的组合，所述化学修饰的核苷酸例如2'-O-甲基、2'-氟、2'-氨基、2'-O-氨基、2'-C-烯丙基、2'-O-烯丙基、和其他2'-修饰的或碱基修饰的核苷酸。生物可降解的核酸接头分子可以是二聚物、三聚物、四聚物或更长的核酸分子，例如长度为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19个或20个核苷酸的寡核苷酸，或可以包含具有基于磷的键例如氨基磷酸酯或磷酸二酯键的单个核苷酸。生物可降解的核酸接头分子还可以包含核酸主链、核酸糖、或核酸碱基修饰。
如本文所使用的短语“生物活性分子” 指其如本领域一般公认的意义。就本发明的示例性核酸分子而言，该术语指能够在系统中引发或修饰生物应答和/或能够调节其他生物活性分子的药物代谢动力学和/或药效学的化合物或分子。生物活性分子的例子包括单独或与其他分子组合的siNA分子，包括但不限于治疗活性分子，例如抗体、胆固醇、激素、抗病毒剂、肽、蛋白质、化疗剂、小分子、维生素、辅因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶促核酸、反义核酸、三链体形成寡核苷酸、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、其他聚醚、2-5A嵌合体、siNA、dsRNA、同种异型酶、适体、诱饵及其类似物。
如本文所使用的短语“生物系统”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指来自生物源的纯化或未纯化形式的材料，所述生物源包括但不限于人或动物，其中所述系统包括对RNAi活性所需的组分。因此，该短语包括例如，细胞、组织、受试者或生物、或其提取物。该术语还包括由生物源重构的材料。
如本文所使用的短语“平端” 指其如本领域一般公认的意义。就本发明的示例性核酸分子而言，该术语指无突出端核苷酸的双链siNA分子的末端。例如，具有平端的双链siNA分子的两条链在末端处不含突出端核苷酸彼此以匹配碱基对比对。本发明的siNA双链体分子可以包含在双链体的一个或两个末端处的平端，例如位于反义链的5'-末端、有义链的5'-末端或双链体的两个末端处的末端。
如本文所使用的术语“帽”在本文中也称为“末端帽” ，指其如本领域一般公认的意义。就本发明的示例性核酸分子而言，该术语指这样的部分，其可以是化学修饰的核苷酸或非核苷酸，其可以在本发明的一种或多种核酸分子的一个或多个末端处掺入。这些末端修饰保护核酸分子不受外切核酸酶降解，且可以帮助在细胞内的递送和/或定位。帽可以存在于5'-末端处（5'-帽）或3'-末端处（3'-帽），或可以存在于本发明的任何核酸分子的两个末端处。帽可以存在于本发明的核酸分子的有义链的5'-末端、3-末端和/或5'和3'-末端处。另外，帽可以任选存在于本发明的核酸分子的反义链的3'-末端处。在非限制性例子中，5'-帽包括但不限于，LNA；甘油基，反向脱氧脱碱基残基（部分）；4',5'-亚甲基核苷酸；1-（β-D-呋喃型赤藓糖基）核苷酸，4'-硫代核苷酸；碳环核苷酸；1,5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；经修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏糖型-呋喃型戊糖基核苷酸；无环3',4'-断裂核苷酸；无环3,4-二羟丁基核苷酸；无环3,5-二羟戊基核苷酸；3'-3'-反向核苷酸部分；3'-3'-反向脱碱基部分；3'-2'-反向核苷酸部分；3'-2'-反向脱碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；3'-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨己基磷酸酯；3'-磷酸酯；3'-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥连或非桥连甲基膦酸酯部分。3'-帽的非限制性例子包括但不限于，LNA；甘油基；反向脱氧脱碱基残基（部分）；4',5'-亚甲基核苷酸；1-（β-D-呋喃型赤藓糖基）核苷酸；4'-硫代核苷酸；碳环核苷酸；5'-氨基-烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨丙基磷酸酯；6-氨己基磷酸酯；1,2-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1,5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；经修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏糖型-呋喃型戊糖基核苷酸；无环3',4'-断裂核苷酸；3,4-二羟丁基核苷酸；3,5-二羟戊基核苷酸；5'-5'-反向核苷酸部分；5'-5'-反向脱碱基部分；5'-氨基磷酸酯；5'-硫代磷酸酯；1,4-丁二醇磷酸酯；5'-氨基；桥连或非桥连5'-氨基磷酸酯；硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯；桥连或非桥连甲基膦酸酯和5'-巯基部分（关于更多细节参见Beaucage和Iyer，1993，Tetrahedron 49，1925；引入本文作为参考）。图5显示了多种帽的一些非限制性例子。
如本文所使用的术语“细胞”指其如本领域一般公认的意义。就本发明的示例性核酸分子而言，该术语以其通常的生物学含义使用，并且不指完整多细胞生物，例如具体地不指人类。细胞可以存在于生物内，例如鸟类、植物和哺乳动物，例如人、牛、羊、猿、猴、猪、狗和猫。细胞可以是原核的（例如，细菌细胞）或真核的（例如，哺乳动物或植物细胞）。细胞可以具有体细胞或种系起源、全能或多能、分裂或非分裂。细胞还可以衍生自或可以包含配子或胚胎、干细胞、或完全分化的细胞。
如本文所使用的短语“化学修饰”指其如本领域一般公认的意义。就本发明的示例性核酸分子而言，该术语一般而言指与天然siRNA或RNA的核苷酸不同的核苷酸的化学结构的任何修饰。术语“化学修饰”包含如本文所描述的或如本领域其他方面已知的，在糖、碱基或核苷酸间键上天然siRNA或RNA的添加、置换或修饰。在特定实施方案中，术语“化学修饰”可以指在特定生物学系统中是天然存在的特定形式的RNA，例如2'-O-甲基修饰或肌苷修饰。
术语“CTNNB1”指联蛋白（联蛋白关联蛋白质），β1，其是编码CTNNB1蛋白质、CTNNB1肽、CTNNB1多肽的基因、CTNNB1调节多核苷酸（例如CTNNB1 miRNAs和siNAs）、突变型CTNNB1基因、和CTNNB1基因的剪接变体，以及涉及CTNNB1基因表达和/或活性途径的其他基因。因此，本文就术语“CTNNB1”而言描述的实施方案各自可应用于由术语“CTNNB1”涵盖的所有蛋白质、肽、多肽和/或多核苷酸分子，如那个术语在本文中定义的。总之，此类基因靶在本文中一般也称为“靶”序列（包括表1a中列出的靶序列）。
如本文所使用的“互补性”或“互补的” 指其如本领域一般公认的意义。就本发明的示例性核酸分子而言，该术语一般指通过传统沃森-克里克或如本文所描述的其他非传统类型的键合在一种核酸序列和另一种核酸序列之间一个或多个氢键的形成或存在。提及本发明的核酸分子，关于核酸分子与其互补序列的结合自由能足以允许核酸的相关功能得以进行，例如RNAi活性。关于核酸分子的结合自由能的测定是本领域众所周知的（参见，例如，Turner等人，1987，CSH Symp. Quant. Biol. LII pp.123-133；Frier等人，1986，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377；Turner等人，1987，J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785）。完全互补意指核酸序列的所有邻接残基将与第二种核酸序列中相同数目的邻接残基氢键合。部分互补性可以包括在核酸分子内的各种错配或非碱基配对的核苷酸（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个错配、非核苷酸接头或非碱基配对的核苷酸），其可以导致在核酸分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间或在核酸分子的反义链或反义区和相应的靶核酸分子之间产生的凸起、环或突出端。此类部分互补性可以由通过非碱基配对的核苷酸数目测定的%互补性代表，即约50%、60%、70%、80%、90%等，取决于涉及的核苷酸总数目。此类部分互补性允许至核酸分子（例如siNA）维持其功能的程度，例如介导序列特异性RNAi的能力。
如本文所使用的术语“组合物”或“制剂”指其如本领域一般公认的意义。这些术语一般指以适合于施用，例如全身或局部施用到细胞或受试者内的形式的组合物或制剂，例如在药学可接受的载体或稀释剂中，所述受试者包括例如人。合适的形式部分依赖使用或进入途径，例如经口、经皮、吸入或通过注射。此类形式不应阻止组合物或制剂达到靶细胞（即，需要给其递送带负电荷核酸的细胞）。例如，注射到血流内的组合物应当是可溶的。其他因素是本领域已知的，且包括考虑，如阻止组合物或制剂发挥其作用的毒性和形式。如本文所使用的，药物制剂包括用于人和兽医学用途的制剂。适合于与本发明的核酸分子一起配制的试剂的非限制性例子包括：脂质纳米颗粒（参见例如Semple等人，2010，Nat Biotechnol.，Feb；28（2）:172-6.）；P-糖蛋白抑制剂（例如Pluronic P85）；生物可降解聚合物，例如用于持续释放递送的DL-丙交酯-乙交酯共聚物小球体（Emerich，DF等人，1999，Cell Transplant，8，47-58）；和装载的纳米颗粒，例如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的那些。关于本发明的核酸分子的递送策略的其他非限制性例子包括在下述参考文献中描述的材料：Boado等人，1998，J. Pharm. Sci.，87，1308-1315；Tyler等人，1999，FEBS Lett. ，421，280-284；Pardridge等人，1995，PNAS USA. ，92，5592-5596；Boado，1995，Adv. Drug Delivery Rev. ，15，73-107；Aldrian-Herrada等人，1998，Nucleic Acids Res. ，26，4910-4916；和Tyler等人，1999，PNAS USA. ，96，7053-7058。“药学上可接受的组合物”或“药学上可接受的制剂”可以指允许本发明的核酸分子有效分布至最适合于其所需活性的物理位置的组合物或制剂。
短语“细胞毒素/细胞生长抑制剂”指主要通过直接干扰细胞的功能或抑制或干扰细胞有丝分裂而引起细胞死亡或抑制细胞增殖的化合物，包括烷化剂、肿瘤坏死因子、嵌入剂、低氧可激活化合物、微管抑制剂/微管稳定试剂、有丝分裂驱动蛋白的抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶的抑制剂、涉及有丝分裂进展的激酶的抑制剂、抗代谢药；生物应答调节剂；激素/抗激素治疗剂、造血生长因子、单克隆抗体靶向治疗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂和遍在蛋白连接酶抑制剂。
短语“雌激素受体调节剂”指干扰或抑制雌激素与受体结合的化合物，与机制无关。
如本文所使用的术语“基因”或“靶基因”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指核酸（例如DNA或RNA）序列，其包含多肽生产必需的部分长度或完整长度的编码序列。靶基因还可以包括核酸序列的UTR或非编码区。基因或靶基因还可以编码功能RNA（fRNA）或非编码RNA（ncRNA），例如小时序RNA（stRNA）、微小RNA（miRNA）、小核RNA（snRNA）、短干扰RNA（siRNA）、核仁小RNA（snRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）及其前体RNA。此类非编码RNA可以充当在调节涉及功能或调节性细胞过程的fRNA或ncRNA活性中siNA介导的RNA干扰的靶核酸分子。导致疾病的异常fRNA或ncRNA活性因此可以通过本发明的siNA分子进行调节。靶向fRNA和ncRNA的siNA分子也可以用于操作或改变受试者、生物或细胞的基因型或表型，其通过干预细胞过程例如遗传印记、转录、翻译或核酸加工（例如，转氨基作用、甲基化等）实现。靶基因可以是衍生自细胞、内源基因、转基因或外源基因的基因，所述外源基因例如在感染其后存在于细胞中的病原体例如病毒的基因。包含靶基因的细胞可以衍生自或包含在任何生物中，例如植物、动物、原生动物、病毒、细菌或真菌。植物的非限制性例子包括单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。动物的非限制性例子包括脊椎动物或无脊椎动物。真菌的非限制性例子包括霉菌或酵母。关于综述，参见例如Snyder和Gerstein，2003，Science，300，258-260。
短语“HMG-CoA还原酶抑制剂”指3-羟基-3-甲戊二酰-CoA还原酶的抑制剂。如本文所使用的术语HMG-CoA还原酶抑制剂包括所有药学可接受的内酯和开环酸形式（即，其中内酯环是打开的，以形成游离酸），以及具有HMG-CoA还原酶抑制剂活性的化合物的盐和酯形式，并且因此此类盐、酯、开环酸和内酯形式的使用包括在本发明的范围内。
如本文所使用的短语“同源序列”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指由一个或多个多核苷酸序列例如基因、基因转录物和/或非编码多核苷酸共享的核苷酸序列。例如，同源序列可以是由编码相关但不同的蛋白质的2个或更多基因共享的核苷酸序列，例如基因家族的不同成员，不同的蛋白质表位、不同的蛋白质同工型或完全趋异的基因。同源序列可以是由2种或更多非编码多核苷酸共享的核苷酸序列，例如非编码DNA或RNA、调节序列、内含子、和转录控制或调节位点。同源序列还可以包括由超过一种多核苷酸序列共享的序列区。同源性无需是完全同一性（100%），因为部分同源的序列也由本发明预期且在本发明的范围内（例如，至少95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%等）。百分比同源性是在两个序列之间的匹配核苷酸数目除以待比较的总长度，乘以100。
短语“改善的RNAi活性”指在体外和/或体内测量的RNAi活性中的增加，其中RNAi活性是siNA介导RNAi的能力和本发明siNA的稳定性的反映。在本发明中，与包含多个核糖核苷酸的全RNA siNA或siNA相比较，这些活性的产物可以在体外和/或体内得到增加。在一些情况下，siNA分子的活性或稳定性可以是减少的（即，小于10倍），但siNA分子的总体活性在体外和/或体内得到增强。
如本文所使用的术语“抑制”、“下调”或“减少”指其如本领域一般公认的意义。就本发明的示例性核酸分子而言，该术语指基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性中的减少低于在不存在本发明的核酸分子（例如，siNA）的情况下观察到的那种。下调还可以与转录后沉默相关，例如RNAi介导的切割或通过DNA甲基化模式或DNA染色质结构中的改变。应用siNA分子的抑制、下调或减少可以是关于失活分子、减弱分子、具有杂乱序列的siNA分子、或具有错配的siNA分子，或可替代地，它可以是关于在不存在核酸的情况下的系统。
短语“细胞增殖和存活信号传导途径的抑制剂”指抑制细胞表面受体和那些表面受体下游的信号转导级联的药物试剂。
术语“整联蛋白阻滞剂”指选择性拮抗、抑制或对抗生理学配体与
Figure DEST_PATH_IMAGE009
整联蛋白的结合的化合物，选择性拮抗、抑制或对抗生理学配体与
Figure DEST_PATH_IMAGE010
整联蛋白的结合的化合物，拮抗、抑制或对抗生理学配体与
Figure DEST_PATH_IMAGE011
整联蛋白和
Figure 689221DEST_PATH_IMAGE010
整联蛋白的结合的化合物，和拮抗、抑制或对抗在毛细血管内皮细胞上表达的一种或多种特定整联蛋白的活性的化合物。该术语还指
Figure DEST_PATH_IMAGE012
和整联蛋白的拮抗剂。该术语还指
Figure DEST_PATH_IMAGE014
和
Figure DEST_PATH_IMAGE015
整联蛋白的任何组合的拮抗剂。
如本文所使用的术语“间歇的”或“间歇地”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指以规律或不规律间隔的定期停止和开始。
术语“核苷间键”或“核苷间接头”或“核苷酸间键”或“核苷酸间接头”在本文中可互换使用，且指如本领域已知的在两个核苷单位之间的任何接头或键，包括例如但不限于磷酸盐、磷酸盐类似物、膦酸盐、胍基、羟胺、羟基肼基、酰胺、氨基甲酸盐、烷基和取代的烷基键。核苷间键构成核酸分子的主链。
如本文所使用的术语“哺乳动物的”或“哺乳动物”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指任何温血脊椎动物物种，例如人、小鼠、大鼠、犬、猫、仓鼠、豚鼠、兔、家畜等。
短语“定量吸入器”或MDI指包括罐、覆盖罐的安全盖和位于盖中的制剂计量阀门的单元。MDI系统包括合适的开缝装置。合适的开槽装置包括例如阀门传动装置和圆筒状或圆锥样通道，通过其药物可以从填满的滤毒罐经由计量阀门递送至患者的鼻或口例如口状物传动装置。
如本文所使用的术语“微小RNA”或“miRNA”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指通过mRNA切割、翻译阻抑/抑制或异染色质沉默调节靶信使RNA的表达的小双链RNA（参见例如Ambros，2004，Nature，431，350-355；Bartel，2004，Cell，116，281-297；Cullen，2004，Virus Research.，102，3-9；He等人，2004，Nat. Rev. Genet.，5，522-531；Ying等人，2004，Gene，342，25-28；和Sethupathy等人，2006，RNA，12:192-197）。
如本文所使用的术语“调节”指其如本领域一般公认的意义。就本发明的示例性核酸分子而言，该术语指当基因的表达、或一种或多种RNA分子（编码或非编码）的水平、或一种或多种RNA分子或蛋白质或蛋白质亚基的活性得到上调或下调时，从而使得表达、水平或活性大于或小于在不存在实现调节的分子的情况下观察到的那种。例如，术语“调节”在一些实施方案中可以指抑制，且在其他实施方案中可以指基因表达的增强或上调。
如本文所使用的短语“修饰核苷酸”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指这样的核苷酸，其含有在未修饰（或天然）核苷酸的碱基、糖和/或磷酸盐的化学结构中的修饰，如本领域一般已知的。修饰核苷酸的非限制性例子在本文和美国申请号12/064,014中描述。
短语“其为选择性COX-2抑制剂的NSAIDs”对于本文的目的指这样的NSAIDs，其如通过细胞或微粒体测定评估的通过关于COX-2的IC50超过关于COX-1的IC50的比值测量的，具有抑制COX-2超过COX-1至少100倍的特异性。
短语“非碱基配对”指在双链siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间不是碱基配对的核苷酸；并且可以包括例如但不限于错配、突出端、单链环等。
术语“非核苷酸”指任何基团或化合物，其可以掺入核酸链内代替一个或多个核苷酸单位，例如但不限于脱碱基部分或烷基链。基团或化合物是“脱碱基的”，因为它不包含通常公认的核苷酸碱基，例如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，并且因此缺乏在1'-位置处的核碱基。
术语“核苷酸”如本领域一般公认的使用。核苷酸一般包含核碱基、糖和核苷间键，例如磷酸盐。碱基可以是天然碱基（标准）、经修饰的碱基或如本领域众所周知的碱基类似物。此类碱基一般位于核苷酸糖部分的1’位置处。另外，核苷酸可以是未修饰的或在糖、核苷间键和/或碱基部分处修饰的（也可互换地称为核苷酸类似物、经修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸及其他；参见例如，美国申请号12/064,014。
如本文所使用的术语“突出端”指其如本领域一般公认的意义。就本发明的示例性双链核酸分子而言，该术语一般指在双链核酸分子的两条链之间不是碱基配对的核苷酸序列的末端部分（参见例如图4）。当存在时，突出端一般在siNA双链体的一条或两条链的3'-末端处。
如本文所使用的术语“肠胃外”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指以除了通过消化道外的方式施用分子、药物、试剂或化合物的方法或技术，并且包括表皮、皮下、血管内（例如，静脉内）、肌内、或鞘内注射或输注技术等。
短语“途径靶”指涉及基因表达或活性途径的任何靶。例如，任何给定靶都可以具有相关途径靶，其可以包括生物途径中的上游、下游或修饰基因。这些途径靶基因可以在本文的疾病、状况和性状治疗中提供附加或协同作用。
术语“硫代磷酸酯”指包含一个或多个硫原子代替氧原子的核苷酸间磷酸键。因此，术语硫代磷酸酯指硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键。
“异戊二烯蛋白质转移酶抑制剂”指抑制异戊二烯蛋白质转移酶中的任何一种或任何组合的化合物，包括法呢基蛋白质转移酶（FPT酶）、牻牛儿酰牻牛儿基蛋白质转移酶I型（GGPT酶-I）、和牻牛儿酰牻牛儿基蛋白质转移酶II型（GGPT酶-II，也称为Rab GGPT酶）。
短语“视黄醇类受体调节剂”指干扰或抑制视黄醇类与受体的结合的化合物，与机制无关。
如本文所使用的术语“核糖核苷酸”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指在β-D-呋喃核糖部分的2'位置处具有羟基的核苷酸。
如本文所使用的术语“RNA”指其如本领域一般公认的意义。一般地，术语RNA指包含至少一个呋喃核糖核苷部分的分子。该术语可以包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA、以及通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变不同于天然存在的RNA的改变的RNA。此类改变可以包括添加非核苷酸材料，例如向siNA的一个或多个末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。本发明的RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
短语“RNA干扰”或术语“RNAi”指如本领域一般已知的且由短干扰核酸分子介导的抑制或下调细胞中的基因表达的生物过程，参见例如Zamore和Haley，2005，Science，309，1519-1524；Vaughn和Martienssen，2005，Science，309，1525-1526；Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir等人，2001，Nature，411，494-498；和Kreutzer等人，国际PCT公开号WO 00/44895；Zernicka-Goetz等人，国际PCT公开号WO 01/36646；Fire，国际PCT公开号WO 99/32619；Plaetinck等人，国际PCT公开号WO 00/01846；Mello和Fire，国际PCT公开号WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，国际PCT公开号WO 99/07409；和Li等人，国际PCT公开号WO 00/44914；Allshire，2002，Science ，297，1818-1819；Volpe等人，2002，Science ，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science ，297，2215-2218；和Hall等人，2002，Science ，297，2232-2237；Hutvagner和Zamore，2002，Science，297，2056-60；McManus等人，2002，RNA，8，842-850；Reinhart等人，2002，Gene & Dev. ，16，1616-1626；和Reinhart & Bartel，2002，Science，297，1831）。此外，术语RNAi意欲等价于用于描述序列特异性RNA干扰的其他术语，例如转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或表观遗传学（epigenetics）。例如，本发明的siNA分子可以用于在转录后水平或转录前水平上表观遗传地沉默基因。在非限制性例子中，基因表达经由本发明的siNA分子的表观遗传调节可以起因于siNA介导的染色质结构的修饰或甲基化模式以改变基因表达（参见，例如，Verdel等人，2004，Science ，303，672-676；Pal-Bhadra等人，2004，Science ，303，669-672；Allshire，2002，Science ，297，1818-1819；Volpe等人，2002，Science ，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science ，297，2215-2218；和Hall等人，2002，Science ，297，2232-2237）。在另一个非限制性例子中，基因表达经由本发明的siNA分子的调节可以起因于siNA经由RISC介导的RNA（编码或非编码RNA）切割，或经由如本领域已知的翻译抑制，或调节可以起因于转录抑制（参见例如Janowski等人，2005，Nature Chemical Biology，1，216-222）。
短语“RNAi抑制剂”指可以在细胞或生物中下调、减少或抑制RNA干扰功能或活性的任何分子。RNAi抑制剂可以下调、减少或抑制RNAi（例如RNAi介导的靶多核苷酸的切割、翻译抑制或转录沉默），其通过与RNAi途径的任何组分相互作用或干扰RNAi途径的任何组分的功能实现，所述组分包括蛋白质组分例如RISC、或核酸组分例如miRNA或siRNA。RNAi抑制剂可以是siNA分子，反义分子，适体，或者与RISC、miRNA、或siRNA或细胞或生物中的RNAi途径的任何其他组分相互作用、或干扰RISC、miRNA、或siRNA或细胞或生物中的RNAi途径的任何其他组分的功能的小分子。通过抑制RNAi（例如RNAi介导的靶多核苷酸的切割、翻译抑制或转录沉默），本发明的RNAi抑制剂可以用于调节（例如上调或下调）靶基因的表达。
如本文所使用的短语“有义区”指其如本领域一般公认的意义。就本发明的示例性核酸分子而言，该术语指与siNA分子的反义区具有互补性的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的有义区可以包含与靶核酸序列具有同源性或序列同一性的核酸序列。在一个实施方案中，siNA分子的有义区也称为有义链或过客链。
短语 “短干扰核酸”、“siNA”、“短干扰RNA”、“siRNA”、“短干扰核酸分子”、“短干扰寡核苷酸分子”或“化学修饰的短干扰核酸分子”指能够通过介导RNA干扰（“RNAi”）或基因沉默以序列特异性方式抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子。这些术语可以指单个核酸分子、多个此类核酸分子、或此类核酸分子库。siNA可以是包含自互补的有义和反义链的双链核酸分子，其中所述反义链包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义链包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。siNA可以是具有双链体、不对称的双链体、发夹或不对称的发夹二级结构、具有自互补的有义和反义区的多核苷酸，其中所述反义区包含与分开的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义区包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。siNA可以是具有2个或更多环结构和包含自互补的有义和反义区的茎的环状单链多核苷酸，其中所述反义区包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义区包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，且其中环状多核苷酸可以在体内或体外进行加工以产生能够介导RNAi的活性siNA分子。siNA还可以包含具有与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列的单链多核苷酸（例如，其中此类siNA分子不需要在siNA分子内存在对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列），其中所述单链多核苷酸可以进一步包含末端磷酸基，例如5'-磷酸（参见例如Martinez等人，2002，Cell ，110，563-574和Schwarz等人，2002，Molecular Cell，10，537-568）或5’,3’-二磷酸。
如本文所使用的术语“受试者”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指本发明的核酸分子可以施用于其的生物。受试者可以是哺乳动物或哺乳动物细胞，包括人或人细胞。该术语还指其是外植细胞的供体或受体或细胞自身的生物。
如本文所使用的短语“全身施用”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指药物在血流中的体内全身性吸收或积累随后分布遍及整个身体。
当它指的是CTNNB1时，术语“靶”指例如由表5中所示的GenBank登记号编码的任何CTNNB1靶蛋白质、肽或多肽的核酸。该术语还指编码任何靶蛋白、肽或多肽的核酸序列或靶多核苷酸序列，例如由具有表5中显示的Genbank登记号的序列编码的蛋白质、肽或多肽。目的靶可以包括靶多核苷酸序列，例如靶DNA或靶RNA。术语“靶”还意欲包括其他序列，例如相异同工型、突变靶基因、靶多核苷酸的剪接变体、靶多态和非编码（例如，ncRNA、miRNA、stRNA、sRNA）或如本文所描述的其他调节多核苷酸序列。
如本文所使用的短语“靶位点”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指靶核酸分子（例如RNA）内对于由siNA构建体介导的切割“被靶向”的序列，所述siNA构建体在其反义区内包含与靶序列互补的序列。
如本文所使用的短语“治疗有效量”指其如本领域一般公认的意义。该术语一般指化合物或组合物的量，其将引发由研究者、兽医、医学医生或其他临床医生寻求的细胞、组织、系统、动物或人的生物或医学应答。例如，如果当存在与疾病或病症有关的可测量参数中的至少25%减少时，给定临床治疗视为有效的，那么用于治疗那种疾病或病症的药物的治疗有效量是实现那个参数中的至少25%减少所需的那种量。
如本文所使用的短语“通用碱基”指其如本领域一般公认的意义。术语通用碱基一般指与每个天然DNA/RNA碱基形成碱基对的核苷酸碱基类似物，而在它们之间只有很少的区别或无区别。通用碱基的非限制性例子包括C-苯基、C-萘基和其他芳族衍生物、肌苷、吡咯氨甲酰和硝基吡咯衍生物例如如本领域已知的3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚（参见例如Loakes，2001，Nucleic Acids Research ，29，2437-2447）。
如本文所使用的术语“上调”指其如本领域一般公认的意义。就本发明的示例性核酸分子而言，该术语指基因的表达，或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平，或一种或多种RNAs、蛋白质或蛋白质亚基的活性中的增加高于在不存在本发明的核酸分子（例如，siNA）的情况下观察到的那种。在特定情况下，由siNA分子上调或促进基因表达高于在无活性或减弱的分子的存在下观察到的那种水平。在其他情况下，由siNA分子上调或促进基因表达高于在例如具有杂乱序列或具有错配的siNA分子的存在下观察到的那种水平。在另外其他情况下，由本发明的核酸分子上调或促进基因表达在核酸分子的存在下大于在不存在其的情况下。在一些情况下，基因表达的上调或促进与RNA介导的基因沉默抑制相关，例如RNAi介导的编码或非编码RNA靶的切割或沉默，其下调、抑制或沉默待上调的目的基因的表达。基因表达的下调可以例如由编码RNA或其编码的蛋白质进行诱导，例如通过负反馈或拮抗作用。基因表达的下调可以例如由对目的基因具有调节控制的非编码RNA进行诱导，例如经由翻译抑制、染色质结构、甲基化、RISC介导的RNA切割或翻译抑制通过沉默基因表达。照这样，下调、抑制或沉默目的基因的靶的抑制或下调可以用于上调目的基因朝向治疗用途表达。
如本文所使用的术语“载体”指其如本领域一般公认的意义。术语载体一般指用于递送一种或多种核酸分子的任何基于核酸和/或病毒的表达系统或技术。
B. 本发明的siNA分子
本发明提供了包含靶向CTNNB1的siNAs的组合物和方法，其可以用于治疗与CTNNB1表达相关的疾病，例如恶性肿瘤和/或癌症。在本发明的特定方面和实施方案中，本发明的核酸分子包含表1a和表1b中所示序列的至少15个核苷酸序列。siNAs可以以几种形式提供。例如，siNA可以作为一种或多种siNA化合物分离，或它可以以DNA质粒中的转录盒的形式。siNA也可以是化学合成的且可以包括如例如但不限于表1c和表6中所示的修饰。因此，在多个实施方案中，本发明的核酸的至少一条链或区域包含选自由SEQ ID NOS:1-6374组成的序列组的至少15个核苷酸序列。siNAs可以单独施用或者与其他siNA分子或治疗CTNNB1有关疾病或状况的常规试剂一起共施用。
本发明的siNA分子可以用于经由与RNA转录物的相互作用或可替代地通过与特定基因序列的相互作用介导基因沉默，特别是CTNNB1，其中此类相互作用导致在转录水平或转录后水平的基因沉默，例如但不限于用靶的核苷酸序列的RNAi或通过调节靶的染色质结构或甲基化模式且阻止靶基因的转录的细胞过程，从而介导沉默。更具体而言，靶是CTNNB1 RNA、DNA或mRNA中的任何。
在一个方面，本发明提供了用于抑制细胞或哺乳动物中的CTNNB1基因表达的短干扰核酸（siNA）分子。siNA可以是单链或双链的。当双链时，siNA包含有义和反义链。反义链与在CTNNB1基因表达中形成的mRNA的至少部分互补。有义链包含与反义链互补的区域。在具体实施方案中，反义链包含表1b中列出的反义序列的至少15个核苷酸序列。一般地，双链siNA包含表1b中的有义链的至少15个核苷酸序列和表1b中的反义链的至少15个核苷酸序列。本发明的siNAs的一个或多个核苷酸是任选修饰的。在具有修饰的进一步的实施方案中，本发明的一些siNAs包含选自表1c中提供的序列组的至少一个核苷酸序列。在其他实施方案中，siNA包含选自表1c中提供的序列组的至少两个核苷酸序列，其中至少两个序列之一与至少两个序列中的另一个互补，其中至少两个序列之一与CTNNB1基因表达中生成的mRNA序列互补。本发明的特定修饰siNAs的例子在表1c中。
本发明的双链RNA分子可以包含两条不同且分开的链，其可以是对称或不对称的且是互补的，即两个单链RNA分子，或可以包含一个单链分子，其中两个互补部分例如有义区和反义区是碱基配对的，并且通过一个或多个单链“发夹”区域（即环）共价连接，导致例如单链短发夹多核苷酸或环状单链多核苷酸。
接头可以是多核苷酸接头或非核苷酸接头。在一些实施方案中，接头是非核苷酸接头。在一些实施方案中，本发明的发夹或环状siNA分子含有一个或多个环基序，其中siNA分子的环部分中的至少一个是生物可降解的。例如，本发明的单链发夹siNA分子被这样设计，从而使得siNA分子的环部分在体内降解可以生成具有3'-末端突出端的双链siNA分子，例如包含1、2、3或4个核苷酸的3'-末端核苷酸突出端。或可替代地，本发明的环状siNA分子被这样设计，从而使得siNA分子的环部分在体内降解可以生成具有3'-末端突出端的双链siNA分子，例如包含约2个核苷酸的3'-末端核苷酸突出端。
在本发明的对称siNA分子中，每条链，有义（过客）链和反义（引导）链独立地长度为约15 – 约30（例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30）个核苷酸。一般地，本发明的对称siNA分子的每条链长度为约19-24（例如约19、20、21、22、23或24）个核苷酸。
在不对称siNA分子中，分子的反义区或链长度为约15 – 约30（例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30）个核苷酸，其中有义区长度为约3 – 约25（例如约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25）个核苷酸。一般地，本发明的不对称siNA分子的每条链长度为约19-24（例如约19、20、21、22、23或24）个核苷酸。
在另外其他实施方案中，本发明的siNA分子包含单链发夹siNA分子，其中所述siNA分子长度为约25 – 约70（例如约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、40、45、50、55、60、65或70）个核苷酸。
在另外其他实施方案中，本发明的siNA分子包含单链环状siNA分子，其中所述siNA分子长度为约38 – 约70（例如约38、40、45、50、55、60、65或70）个核苷酸。
在另外其他实施方案中，本发明的siNA分子包含单链非环状siNA分子，其中所述siNA分子独立地长度为约15 – 约30（例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30）个核苷酸。
在多个对称实施方案中，本发明的siNA双链体独立地包含约15 – 约30（例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30）个碱基对。一般地，本发明的siNAs的双链体结构长度为15 - 30、更一般18 - 25、再更一般19 – 24且最一般19 - 21个碱基对。
在另外其他实施方案中，其中本发明的双链体siNA分子是不对称的，siNA分子包含约3 - 25（例如约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25）个碱基对。一般地，本发明的siNAs的双链体结构长度为15 - 25、更一般18 - 25、再更一般19 - 24且最一般19 - 21个碱基对。
在另外其他实施方案中，其中本发明的siNA分子是发夹或环状结构，siNA分子包含约15 – 约30（例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30）个碱基对。
本发明的siNA分子的有义链和反义链、或有义区和反义区可以是互补的。此外，反义链或反义区可以与CTNNB1靶RNA的核苷酸序列或其部分互补。siNA的有义链或有义区可以包含CTNNB1基因的核苷酸序列或其部分。在特定实施方案中，本发明siNA分子的有义链或有义区与siNA分子的反义区或反义链的那个部分互补，所述siNA分子的反义区或反义链与CTNNB1靶多核苷酸序列互补，例如但不限于由表5中所示的GENBANK登记号表示的那些序列。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子具有在siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间的完全互补性。在其他或相同实施方案中，本发明的siNA分子的反义链与相应靶核酸分子是完全互补的。
在另外其他实施方案中，本发明的siNA分子在siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间或在siNA分子的反义链或反义区和相应的靶核酸分子之间具有部分互补性（即，小于100%的互补性）。因此，在一些实施方案中，本发明的双链核酸分子具有在一条链中的约15 - 约30（例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30）个核苷酸，其与另一条链的核苷酸互补。在其他实施方案中，该分子具有在有义区中的约15 - 约30（例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30）个核苷酸，其与双链核酸分子的反义区的核苷酸互补。在特定实施方案中，本发明的双链核酸分子具有在反义链中的约15 - 约30（例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30）个核苷酸，其与其相应靶核酸分子的核苷酸序列互补。
在其他实施方案中，siNA分子可以含有一个或多个核苷酸缺失、置换、错配和/或添加；然而，前提是siNA分子维持其活性，例如以介导RNAi。在非限制性例子中，缺失、置换、错配和/或添加可以导致环或凸起，或可替代地摆动或其他可替代（非沃森克里克）碱基对。因此，在一些实施方案中，例如，本发明的双链核酸分子具有在一条链或区域中的1个或更多个（例如1、2、3、4、5或6个）核苷酸，其与另一条链或区域是错配或非碱基配对的。在其他实施方案中，本发明的双链核酸分子具有在每条链或区域中的1个或更多个（例如1、2、3、4、5或6个）核苷酸，其与另一条链或区域是错配或非碱基配对的。在优选实施方案中，本发明的siNA含有不超过3个错配。如果siNA的反义链含有与靶序列的错配，那么优选错配区域不位于互补性区域的中心。
在其他实施方案中，siNA分子可以含有对于表1b中的序列的一个或多个核苷酸缺失、置换、错配和/或添加；然而，前提是siNA分子维持其活性，例如以介导RNAi。在非限制性例子中，缺失、置换、错配和/或添加可以导致环或凸起，或可替代地摆动或其他可替代（非沃森克里克）碱基对。
本发明还包含如上文另外描述的双链核酸（siNA）分子，其中第一条链和第二条链彼此互补，并且其中至少一条链可在高严格条件下与表1b中的序列的多核苷酸序列杂交，并且其中核苷酸中的任何是未修饰或化学修饰的。
杂交技术是本领域技术人员众所周知的（参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.（1989））。优选严格杂交条件包括在包含下述的溶液中在42℃过夜温育：50%甲酰胺、5xSSC（150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠）、50 mM磷酸钠（pH 7.6）、5x Denhardt's溶液、10%硫酸葡聚糖、和20微克/ml变性剪切鲑精DNA；随后为在0.1x SSC中在约65℃洗涤滤器。
在一个具体实施方案中，第一条链具有与另一条链的核苷酸互补的约15、16、17、18、19、20或21个核苷酸，并且至少一条链可与表1b中的多核苷酸序列杂交。在更优选实施方案中，第一条链具有与另一条链的核苷酸互补的约15、16、17、18、19、20或21个核苷酸，并且至少一条链可在高严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1049、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：1091、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：1099、SEQ ID NO：53或SEQ ID NO:1101杂交，并且其中核苷酸中的任何是未修饰或化学修饰的。
在特定实施方案中，本发明的siNA分子包含约1 - 约4（例如约1、2、3或4）个核苷酸的突出端。突出端中的核苷酸可以是相同或不同的核苷酸。在一些实施方案中，突出端在双链核酸分子的一条或两条链的3'-末端处出现。例如，本发明的双链核酸分子可以包含在双链核酸分子的反义链/区的3'-末端、有义链/区的3'-末端、或反义链/区和有义链/区处的核苷酸或非核苷酸突出端。
在一些实施方案中，包含本发明的siNA分子的突出端部分的核苷酸包含基于CTNNB1靶多核苷酸序列的序列，其中包含本发明的siNA分子的反义链/区的突出端部分的核苷酸可以与CTNNB1靶多核苷酸序列中的核苷酸互补，和/或包含本发明的siNA分子的有义链/区的突出端部分的核苷酸可以包含CTNNB1靶多核苷酸序列中的核苷酸。因此，在一些实施方案中，突出端包含与CTNNB1靶多核苷酸序列的部分互补的二核苷酸突出端。然而，在其他实施方案中，突出端包含与CTNNB1靶多核苷酸序列的部分不互补的二核苷酸突出端。在特定实施方案中，突出端包含不与CTNNB1靶多核苷酸序列的部分互补的3'-UU突出端。在其他实施方案中，突出端包含在反义链的3'末端处的UU突出端和在有义链的3'末端处的TT突出端。在其他实施方案中，突出端包含如本文实施例、表和图中所述的核苷酸。
在具有3'-末端核苷酸突出端的本文描述的siNA分子的任何实施方案中，突出端是任选在一个或多个核酸糖、碱基或主链位置处化学修饰的。在本发明的双链核酸（siNA）分子的突出端部分中修饰核苷酸的代表性但非限制性例子包括：2'-O-烷基（例如2'-O-甲基）、2'-脱氧、2'-脱氧-2'-氟、2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖基（FANA）、4'-硫代、2'-O-三氟甲基、2'-O-乙基-三氟甲氧基、2'-O-二氟甲氧基-乙氧基、通用碱基、无环或5-C-甲基核苷酸。在更优选实施方案中，突出端核苷酸各自独立地是2'-O-烷基核苷酸、2'-O-甲基核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核苷酸、或2'-脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，突出端核苷酸由一个或多个硫代磷酸酯键连接。
在另外其他实施方案中，本发明的siNA分子包含具有平端（即，不含核苷酸突出端）的双链体核酸分子，其中两个末端是平头的，或可替代地其中末端之一是平头的。在一些实施方案中，本发明的siNA分子可以包含一个平端，例如其中反义链的5'-末端和有义链的3'-末端不具有任何突出端核苷酸。在另一个例子中，siNA分子包含一个平端，例如其中反义链的3'-末端和有义链的5'-末端不具有任何突出端核苷酸。在其他实施方案中，本发明的siNA分子包含两个平端，例如其中反义链的3'-末端和有义链的5'-末端以及反义链的5'-末端和有义链的3'-末端不具有任何突出端核苷酸。
在本发明的siNA分子的任何实施方案或方面，有义链和/或反义链可以进一步具有在有义链和/或反义链的3'-末端、5'-末端、或3'和5'-末端处的例如本文描述或如本领域已知的帽。或如在发夹siNA分子的情况下，帽可以在多核苷酸的末端核苷酸中的一个或两个上。在一些实施方案中，帽在双链siNA分子的有义链的一个或两个末端处。在其他实施方案中，帽在反义（引导）链的3'-末端处。在优选实施方案中，帽在有义链的3'-末端和有义链的5'-末端处。
此类末端帽的代表性、但非限制性例子包括反向脱碱基核苷酸、反向脱氧脱碱基核苷酸、反向核苷酸部分、图5中显示的基团、甘油基修饰、烷基或环烷基、杂环、或如本领域一般已知的任何其他帽。
本发明的siNA分子的任何实施方案可以具有5'磷酸盐末端。在一些实施方案中，siNA分子缺乏末端磷酸盐。
本发明的任何siNA分子或构建体可以包含一种或多种化学修饰。修饰可以用于改善体外或体内特征，例如稳定性、活性、毒性、免疫应答（例如预防干扰素应答、炎症或促炎细胞因子应答或Toll样受体（TlF）应答的刺激）和/或生物利用率。
申请人在本文中描述了与相应的未修饰的siNA分子相比较，具有改善的RNAi活性和/或稳定性的化学修饰的siNA分子。本文公开的多种化学修饰的siNA基序提供了维持基本上类似于未修饰的或最低限度修饰的活性siNA 的RNAi活性（参见例如Elbashir等人，2001，EMBO J.，20：6877-6888），同时提供适合于在治疗应用中使用的核酸酶抗性和药物代谢动力学性质的能力。
在多个实施方案中，本发明的siNA分子包含修饰，其中有义和/或反义链中存在的任何（例如一个或多个或所有）核苷酸是修饰的核苷酸（例如其中一个核苷酸是修饰的，一些核苷酸（即多个或超过一个）是修饰的，或所有核苷酸都是修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本发明的siNA分子是用化学修饰部分修饰的（例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、50、55或59个核苷酸是修饰的）。在一些实施方案中，本发明的siNA分子包含至少约8、10、12、 14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或60个核苷酸，其是修饰的核苷酸。在其他实施方案中，本发明的siNA分子是用化学修饰完全修饰的（例如100%修饰的），即siNA分子不含任何核糖核苷酸。在一些实施方案中，在本发明的siNA分子的有义链中的一个或多个核苷酸是修饰的。在相同或其他实施方案中，在本发明的siNA分子的反义链中的一个或多个核苷酸是修饰的。
在单个siNA分子内的化学修饰可以是相同或不同的。在一些实施方案中，至少一条链具有至少一种化学修饰。在其他实施方案中，每条链具有至少一种化学修饰，其可以是相同或不同的，例如糖、碱基或主链（即核苷酸间键）修饰。在其他实施方案中，本发明的siNA分子含有至少2、3、4、5种或更多种不同的化学修饰。
适合于在本发明中使用的化学修饰的非限制性例子公开于美国专利申请号10/444,853；10/981,966；12/064,014和其中引用的参考文献中，并且包括糖、碱基和磷酸盐、非核苷酸修饰和/或其任何组合。
在本发明的特定具体实施方案中，至少一个修饰核苷酸是如本领域一般公认的2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-脱氧核苷酸、2'-O-烷基（例如2'-O-甲基）核苷酸、或锁定核酸（LNA）核苷酸。
在本发明的另外其他实施方案中，至少一个核苷酸具有核糖样、Northern或A型螺旋构型（参见例如，Saenger，Principles of Nucleic Acid Structure，Springer-Verlag编辑，1984）。具有Northern构型的核苷酸的非限制性例子包括锁定核酸（LNA）核苷酸（例如2´-O，4´-C-亚甲基-（D-呋喃核糖基）核苷酸）；2'-甲氧基乙氧基（MOE）核苷酸；2'-甲基-硫代-乙基核苷酸，2'-脱氧-2'-氟核苷酸；2'-脱氧-2'-氯核苷酸；2'-叠氮核苷酸；2'-O-三氟甲基核苷酸；2'-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸；2'-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸；4'-硫代核苷酸和2'-O-甲基核苷酸。
在多个实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数（例如超过50%）嘧啶核苷酸包含糖修饰。在一些相同和/或其他实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数（例如超过50%）嘌呤核苷酸包含糖修饰。
在一些实施方案中，反义链中的嘧啶核苷酸是2'-O-甲基或2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸，并且反义链中存在的嘌呤核苷酸是2'-O-甲基核苷酸或2'-脱氧核苷酸。在其他实施方案中，有义链中的嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸，并且有义链中存在的嘌呤核苷酸是2'-O-甲基或2'-脱氧嘌呤核苷酸。
在本发明的特定实施方案中，有义链上的互补区中的所有嘧啶核苷酸都是2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸。在特定实施方案中，反义链的互补区中的所有嘧啶核苷酸都是2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸。在特定实施方案中，有义链上的互补区中的所有嘌呤核苷酸都是2'-脱氧嘌呤核苷酸。在特定实施方案中，反义链上的互补区中的所有嘌呤都是2'-O-甲基嘌呤核苷酸。在特定实施方案中，有义链上的互补区中的所有嘧啶核苷酸都是2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸；反义链的互补区中的所有嘧啶核苷酸都是2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸；有义链上的互补区中的所有嘌呤核苷酸都是2'-脱氧嘌呤核苷酸，并且反义链上的互补区中的所有嘌呤都是2'-O-甲基嘌呤核苷酸。
在一些实施方案中，在一条或两条链中的至少5个或更多个嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，在一条或两条链中的至少5个或更多个嘧啶核苷酸是2'-O-甲基嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，在一条或两条链中的至少5个或更多个嘌呤核苷酸是2'-脱氧-2'-氟嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，在一条或两条链中的至少5个或更多个嘌呤核苷酸是2'-O-甲基嘌呤核苷酸。
在特定实施方案中，嘌呤和嘧啶在2'-糖位置处是不同修饰的（即至少一个嘌呤具有与在2'-糖位置处相同或不同链中的至少一个嘧啶不同的修饰）。例如，在一些情况下，在一条或两条链中的至少5个或更多个嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸，并且在一条或两条链中的至少5个或更多个嘌呤核苷酸是2'-O-甲基嘌呤核苷酸。在其他情况下，在一条或两条链中的至少5个或更多个嘧啶核苷酸是2'-O-甲基嘧啶核苷酸，并且在一条或两条链中的至少5个或更多个嘌呤核苷酸是2'-脱氧-2'-氟嘌呤核苷酸。
具有多个修饰和修饰模式的此类siNA分子的有义和反义链的进一步非限制性例子显示于图2和3中。
上文描述的修饰中的任何或其组合，包括引用的参考文献中的那些，可以应用于本发明的任何siNA分子。
本发明的修饰的siNA分子可以包含在siNA分子内的多个位置处的修饰。在一些实施方案中，本发明的双链siNA分子包含在siNA双链体内的内部碱基配对位置处的修饰核苷酸。在其他实施方案中，本发明的双链siNA分子包含在siNA分子的非碱基配对或突出端区域处的修饰核苷酸。在另外其他实施方案中，本发明的双链siNA分子包含在siNA分子的末端位置处的修饰核苷酸。例如，此类末端区域包括siNA分子的有义和/或反义链或区域的3'-位置和/或5'-位置。另外，本发明的任何修饰的siNA分子可以具有在siNA双链体的一条或两条寡核苷酸链中，例如在有义链、反义链或两条链中的修饰。此外，就本发明的siNA分子的化学修饰而言，本发明的双链siNA分子的每条链可以具有一种或多种化学修饰，从而使得每条链包含不同模式的化学修饰。
在特定实施方案中，本发明的双链siNA分子的每条链包含不同模式的化学修饰，例如本文描述的任何Stab修饰化学（参见表9）或其任何组合，即确定的稳定化学（Stab）有义和反义链的不同组合。进一步地，可以引起不同模式的修饰的修饰方案的非限制性例子显示于表9中。表9中称为Stab的稳定化学可以以有义/反义化学的任何组合进行组合，例如Stab 7/8、Stab 7/11、Stab 8/8、Stab 18/8、Stab 18/11、Stab 12/13、Stab 7/13、Stab 18/13、Stab 7/19、Stab 8/19、Stab 18/19、Stab 7/20、Stab 8/20、Stab 18/20、Stab 7/32、Stab 8/32或Stab 18/32 或稳定化学的任何其他组合。
在本发明的任何siNAs中，在siNA分子的引导链或引导区（也称为反义链或反义区）的5'-末端处的一个或多个（例如1、2、3、4或5个）核苷酸是核糖核苷酸。
在特定实施方案中，本发明提供了调节CTNNB1表达的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述siNA包含有义链和反义链；每条链独立地长度为15 – 30个核苷酸；并且反义链包含与下述中的任何具有序列互补的至少15、16、17、18或19个核苷酸：
Figure DEST_PATH_IMAGE016
Figure DEST_PATH_IMAGE017
。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子的反义链包含下述的至少15、16、17、18或19个核苷酸序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE018
。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子的有义链包含下述的至少15、16、17、18或19个核苷酸序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE020
。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子包含下述中的任何：
Figure DEST_PATH_IMAGE022
Figure DEST_PATH_IMAGE023
。
上文描述的修饰中的任何或其组合，包括引用的参考文献中的那些，可以应用于这些实施方案中的任何。
在特定实施方案中，SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4918、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：5107、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：5109、SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：5064的至少15、16、17、18或19个核苷酸序列的核苷酸构成核苷酸的连续段。
在一些实施方案中，siNA分子可以含有对于SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4918、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：5107、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：5109、SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：5064的至少15、16、17、18或19个核苷酸序列的一个或多个核苷酸缺失、置换、错配和/或添加；然而，前提是siNA分子维持其活性，例如以介导RNAi。在非限制性例子中，缺失、置换、错配和/或添加可以导致环或凸起，或可替代地摆动或其他可替代（非沃森克里克）碱基对。
在本发明的特定实施方案中，提供了双链siNA分子，其中所述分子具有有义链和反义链且包含下式（A）：
Figure DEST_PATH_IMAGE024
其中，上部链是双链核酸分子的有义链且下部链是反义链；其中所述反义链包含SEQ ID NO：4918、SEQ ID NO：5107、SEQ ID NO：5109或SEQ ID NO：5064的至少15、16、17、18或19个核苷酸序列，并且所述有义链包含与反义链具有互补性的序列；
每个N独立地是其为未修饰或化学修饰的核苷酸或非核苷酸；
每个B是存在或不存在的末端帽；
（N）代表其各自独立地是未修饰或化学修饰的突出端核苷酸；
[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；
X1和X2独立地是0 - 4的整数；
X3是15 - 30的整数；
X4是9 - 30的整数；和
X5是0 – 6的整数，前提是X4和X5的和为15 – 30。
在特定实施方案中，SEQ ID NO：4918、SEQ ID NO：5107、SEQ ID NO：5109或SEQ ID NO：5064的至少15、16、17、18或19个核苷酸序列的核苷酸构成核苷酸的连续段。
在一些实施方案中，式A的siNA分子可以含有对于SEQ ID NO：4918、SEQ ID NO：5107、SEQ ID NO：5109或SEQ ID NO：5064的至少15、16、17、18或19个核苷酸序列的一个或多个核苷酸缺失、置换、错配和/或添加；然而，前提是siNA分子维持其活性，例如以介导RNAi。在非限制性例子中，缺失、置换、错配和/或添加可以导致环或凸起，或可替代地摆动或其他可替代（非沃森克里克）碱基对。
在一个实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）；其中
（a）在NX4位置中的一个或多个嘧啶核苷酸独立地是2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-O-烷基核苷酸、2'-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；
（b）在NX4位置中的一个或多个嘌呤核苷酸独立地是2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-O-烷基核苷酸、2'-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；
（c）在NX3位置中的一个或多个嘧啶核苷酸独立地是2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-O-烷基核苷酸、2'-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；和
（d）在NX3位置中的一个或多个嘌呤核苷酸独立地是2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-O-烷基核苷酸、2'-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合。
在特定实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）分子；其中
（a）在NX4位置中的1、2、3、4、5个或更多个嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟核苷酸；
（b）在NX4位置中的1、2、3、4、5个或更多个嘌呤核苷酸是2'-O-烷基核苷酸；
（c）在NX3位置中的1、2、3、4、5个或更多个嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟核苷酸；和
（d）在NX3位置中的1、2、3、4、5个或更多个嘌呤核苷酸是2'-脱氧核苷酸。
在特定实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）分子；其中
（a）在NX4位置中的1、2、3、4、5个或更多个嘧啶核苷酸是2'-O-烷基核苷酸；
（b）在NX4位置中的1、2、3、4、5个或更多个嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；
（c）在NX3位置中的1、2、3、4、5个或更多个嘧啶核苷酸是2'-O-烷基核苷酸；和
（d）在NX3位置中的1、2、3、4、5个或更多个嘌呤核苷酸是核糖核苷酸。
在特定实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）分子；其中
（a）在NX4位置中的1、2、3、4、5个或更多个嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟核苷酸；
（b）在NX4位置中的1、2、3、4、5个或更多个嘌呤核苷酸是2'-O-烷基核苷酸；
（c）在NX3位置中的1、2、3、4、5个或更多个嘧啶核苷酸是2'-O-烷基核苷酸；和
（d）在NX3位置中的1、2、3、4、5个或更多个嘌呤核苷酸是2'-脱氧-2'-氟核苷酸。
在特定实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）分子，其进一步包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施方案中，具有式A的siNA分子具有在核酸分子的反义链或反义区的5'-末端处的末端磷酸基。
在多个实施方案中，具有式A的siNA分子包含X5 = 0、1、2或3；每个X1和X2 = 1或2；X3 = 18、19、20、21、22或23，并且X4 = 17、18、19、20、21、22或23。
在特定实施方案中，具有式A的siNA分子包含X5 = 3。在其他实施方案中，具有式A的siNA分子包含X5 = 0。
在特定实施方案中，具有式A的siNA分子包含X1 = 2和X2 = 2。
在多个实施方案中，具有式A的siNA分子包含X5 = 0， X1 = 2，和X2 = 2。在其他实施方案中，具有式A的siNA分子包含X5 = 3， X1 = 2，和X2 = 2。
在一个具体实施方案中，具有式A的siNA分子包含X5 = 3；每个X1和X2 = 2；X3 = 19，和X4 = 16。
在另一个具体实施方案中，具有式A的siNA分子包含X5 = 0；每个X1和X2 = 2；X3 = 19，和X4 = 19。
在特定实施方案中，具有式A的siNA分子包含在有义链或有义区的3'和5'末端处的帽（B）。
在特定实施方案中，具有式A的siNA分子包含在反义链或反义区的3'-末端处的帽（B）。
在多个实施方案中，具有式A的siNA分子包含在有义链或有义区的3'和5'末端处的帽（B），和在反义链或反义区的3'-末端处的帽（B）。
在另外其他实施方案中，具有式A的siNA分子包含仅在双链核酸分子的有义（上部）链的5'-末端处的帽（B）。
在一些实施方案中，具有式A的siNA分子进一步包含在核苷酸之间的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。在其他实施方案中，具有式A的siNA分子包含在核酸分子的有义链、反义链、或有义链和反义链的3'-末端上的第一个末端（N）和相邻核苷酸之间的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。例如，双链核酸分子可以包含X1和/或X2 = 2，具有含硫代磷酸酯核苷酸间键的突出端核苷酸位置，例如（NsN），其中“s”指示硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，具有式A的siNA分子的一个或多个核苷酸具有通用碱基。
在特定实施方案中，当在第14位处的核苷酸是嘌呤时，具有式A的siNA分子具有在来自反义链的5'-末端的第14位处的核糖核苷酸。在其他实施方案中，当在第14位处的核苷酸是嘧啶核苷酸时，具有式A的siNA分子具有在来自反义链的5'-末端的第14位处的核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核苷酸或2'-O-甲基核苷酸。
在一些实施方案中，具有式A的siNA分子包含与CTNNB1靶多核苷酸序列中的核苷酸互补的在反义链（下部链）中的（N）核苷酸，其也与反义（下部）链的N和[N]核苷酸具有互补性。
在特定实施方案中，本发明的一种或多种siNA分子是根据如USSN 61/408,428和USSN 61/408,303中所示且描述的修饰标准修饰的，所述两个专利都引入本文作为参考。
如可应用于本发明的siNAs上文讨论的上文描述的修饰中的任何或其组合，包括引用的参考文献中的那些，可以应用于本发明的siNA分子的任何实施方案。
C. siNA分子的生成/合成
本发明的siNAs可以使用本领域技术人员已知的许多技术获得。例如，siNA可以是化学合成的或可以由质粒编码（例如转录为自动折叠成具有发夹环的双链体的序列。）。siNA还可以通过E coli RNA酶II或切酶切割更长dsRNA（例如长度大于约25个核苷酸的dsRNA）生成。这些酶将dsRNA加工成生物活性siNA（参见例如，Yang等人，PNAS USA 99:9942-9947（2002）；Calegari等人PNAS USA 99:14236（2002）Byron等人Ambion Tech Notes；10（1）:4-6（2009）；Kawaski等人，Nucleic Acids Res. ，31:981-987（2003），Knight和Bass，Science，293:2269-2271（2001）和Roberston等人，J. Biol. Chem 243:82（1969）。
1. 化学合成
优选地，本发明的siNA是化学合成的。寡核苷酸（例如特定修饰寡核苷酸或缺乏核糖核苷酸的寡核苷酸的部分）使用本领域已知的方案合成，例如如Caruthers等人，1992，Methods in Enzymology 211，3-19，Thompson等人，国际PCT公开号WO 99/54459，Wincott等人，1995，Nucleic Acids Res. 23，2677-2684，Wincott等人，1997，Methods Mol. Bio.，74，59，Brennan等人，1998，Biotechnol Bioeng. ，61，33-45，和Brennan，美国专利号6,001,311中所述的。寡核苷酸的合成利用常见的核酸保护和偶联基团，例如在5'-末端处的二甲氧三苯甲基和在3'-末端处的亚磷酰胺。
不含修饰的siNA分子使用如Usman等人，1987，J. Am. Chem. Soc.，109，7845；Scaringe等人，1990，Nucleic Acids Res.，18，5433中所述的程序合成。这些合成利用常见的核酸保护和偶联基团，例如可以用于本发明的特定siNA分子的在5'-末端处的二甲氧三苯甲基和在3'-末端处的亚磷酰胺。
在特定实施方案中，本发明的siNA分子可以根据美国专利号6,995,259、6,686,463、6,673,918、6,649,751、6,989,442，和美国专利申请号10/190,359进行合成、脱保护且分析。
在非限制性合成例子中，小规模合成在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪上进行，使用0.2 µmol规模方案伴随2.5分钟偶联步骤用于2'-O-甲基化核苷酸，和45秒偶联步骤用于2'-脱氧核苷酸或2'-脱氧-2'-氟核苷酸。表10概述在合成循环中使用的试剂的量和接触时间。
可替代地，本发明的siNA分子可以分开合成且在合成后连接在一起，例如通过连接（Moore等人，1992，Science 256，9923；Draper等人，国际PCT公开号WO 93/23569；Shabarova等人，1991，Nucleic Acids Research 19，4247；Bellon等人，1997，Nucleosides & Nucleotides，16，951；Bellon等人，1997，Bioconjugate Chem. 8，204），或在合成和/或脱保护后通过杂交。
本发明的多种siNA分子也可以使用Scaringe等人，美国专利号5,889,136；6,008,400；和6,111,086的教导合成。
2. 载体表达
可替代地，与编码靶CTNNB1分子的基因相互作用且下调其的本发明的RNA分子可以由插入到DNA或RNA载体内的转录单位（参见例如Couture等人，1996，TIG.，12，510）表达且递送。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。表达siNA的病毒载体可以基于但不限于下述进行构建：腺伴随病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒。
在一些实施方案中，基于pol III的构建体用于表达本发明的核酸分子。siNA分子序列的转录可以由用于真核RNA聚合酶I（pol I）、RNA聚合酶II（pol II）或RNA聚合酶III（pol III）的启动子驱动。（参见例如，Thompson，美国专利号5,902,880和6,146,886）（还参见，Izant和Weintraub，1985，Science ，229，345；McGarry和Lindquist，1986，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 83，399；Scanlon等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88，10591-5；Kashani-Sabet等人，1992，Antisense Res. Dev. ，2，3-15；Dropulic等人，1992，J. Virol. ，66，1432-41；Weerasinghe等人，1991，J. Virol. ，65，5531-4；Ojwang等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89，10802-6；Chen等人，1992， Nucleic Acids Res. ，20，4581-9；Sarver等人，1990 Science ，247，1222-1225；Thompson等人，1995，Nucleic Acids Res. ，23，2259；Good等人，1997，Gene Therapy，4，45。来自pol II或pol III启动子的表达在所有细胞中以高水平表达；给定pol II启动子在给定细胞类型中的水平取决于附近存在的基因调节序列（增强子、沉默基因等）的性质。还可以使用真核RNA聚合酶启动子，前提是原核RNA聚合酶在合适的细胞中表达（Elroy-Stein和Moss，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. U S A，87，6743-7；Gao和Huang 1993，Nucleic Acids Res.，21，2867-72； Lieber等人，1993，Methods Enzymol. ， 217，47-66； Zhou等人，1990，Mol. Cell. Biol.，10，4529-37）。几个研究者已证实由此类启动子表达的核酸分子可以在哺乳动物细胞中起作用（例如Kashani-Sabet等人，1992， Antisense Res. Dev.， 2，3-15；Ojwang 等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. U S A，89，10802-6；Chen等人，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9； Yu等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U S A，90，6340-4；L'Huillier等人，1992，EMBO J. ，11，4411-8；Lisziewicz等人，1993， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A，90，8000-4；Thompson等人，1995，Nucleic Acids Res. ，23，2259；Sullenger & Cech，1993，Science ，262，1566）。更具体而言，转录单位例如衍生自编码U6小核（snRNA）、转移RNA（tRNA）和腺病毒VA RNA的基因的那些在细胞中产生高浓度的所需RNA分子例如siNA方面是有用的（Thompson等人，同上；Couture和Stinchcomb，1996,同上；Noonberg等人，1994，Nucleic Acid Res.，22，2830；Noonberg等人，美国专利号5,624,803；Good等人，1997，Gene Ther. ，4，45；Beigelman等人，国际PCT公开号WO 96/18736。上述siNA转录单位可以掺入多种载体内用于引入哺乳动物细胞内，包括但不限于，质粒DNA载体、病毒DNA载体（例如，腺病毒或腺伴随病毒载体）、或病毒RNA载体（例如逆转录病毒或甲病毒载体）（关于综述参见Couture和Stinchcomb，1996，同上）。
用于表达本发明的siNA分子的载体可以编码siNA双链体的一条或两条链，或自我杂交成siNA双链体的单条自互补链。编码本发明的siNA分子的核酸序列可以以允许siNA分子表达的方式可操作地连接（参见例如Paul等人，2002，Nature Biotechnology ，19，505；Miyagishi和Taira，2002，Nature Biotechnology ，19，497；Lee等人，2002，Nature Biotechnology ，19，500；和Novina等人，2002，Nature Medicine，预先在线公开doi：10.1038/nm725）。
D. 载体/递送系统
本发明的siNA分子可以直接添加，或可以与阳离子脂质复合，包装在脂质体内，或作为表达siNA分子的重组质粒或病毒载体，或以其他方式递送给靶细胞或组织。用于递送核酸分子的方法在下述中描述：Akhtar等人，1992，Trends Cell Bio.，2，139；Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，ed. Akhtar，1995，Maurer等人，1999，Mol. Membr. Biol. ，16，129-140；Hofland和Huang，1999，Handb. Exp. Pharmacol. ，137，165-192；和Lee等人，2000，ACS Symp. Ser. ，752，184-192。Beigelman等人，美国专利号6,395,713和Sullivan等人，PCT WO 94/02595进一步描述了用于递送核酸分子的一般方法。这些方案可以用于递送事实上任何核酸分子。核酸分子可以通过本领域技术人员已知的多种方法施用于细胞，包括但不限于，被囊化在脂质体中，通过离子电渗疗法，或通过掺入其他媒介物内，所述其他媒介物例如生物可降解聚合物、水凝胶、环糊精（参见例如Gonzalez等人，1999，Bioconjugate Chem.，10，1068-1074；Wang等人，国际PCR公开号WO 03/47518和WO 03/46185）、乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）和PLCA小球体（参见例如美国专利6,447,796和美国专利申请公开号US 2002130430）、生物可降解纳米胶囊（nanocapsule）、和生物粘附小球体，或通过蛋白质载体（O'Hare和Normand，国际PCT公开号WO 00/53722）。
在一个方面，本发明提供了含有本文描述的siNA分子的载体系统。在一些实施方案中，载体系统是基于脂质的载体系统、阳离子脂质、或脂质体核酸复合物、脂质体、微团、病毒体、脂质纳米颗粒或其混合物。在其他实施方案中，载体系统是基于聚合物的载体系统，例如阳离子聚合物-核酸复合物。在另外实施方案中，载体系统是基于环糊精的载体系统，例如环糊精聚合物-核酸复合物。在进一步的实施方案中，载体系统是基于蛋白质的载体系统例如例如阳离子肽-核酸复合物。优选地，载体系统是脂质纳米颗粒（“LNP”）制剂。
在特定实施方案中，本发明的siNA分子用脂质纳米颗粒组合物配制，例如美国专利申请号11/353,630、11/586,102、61/189,295、61/204,878、61/235,476、61/249,807、61/298,022、61/351373、61/347640、61/345754、61/322054、12/640342和12/617079，以及PCT申请号PCT/US10/020013和 PCT/US09/053336中所述的。在特定优选实施方案中，本发明的siNA分子用脂质纳米颗粒组合物配制，所述脂质纳米颗粒组合物包含以40/48/2/10比值的阳离子脂质/胆固醇/PEG-C-DMA/DSPC或以40/48/2/10比值的阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMA/DSPC。在更特定实施方案中，阳离子脂质是DLinDMA（参见表12），PEG是PEG-DMG，并且制剂的N/P比值是2.8。在更优选实施方案中，阳离子脂质是DLinDMA（参见表11和12）。
在多个实施方案中，表11中所述的脂质纳米颗粒制剂应用于本文的任何siNA分子或siNA分子的组合。在一些实施方案中，本发明的特征在于包含本发明的siNA分子的组合物，其配制为制剂LNP-051；LNP-053；LNP-054；LNP-069； LNP-073；LNP-077；LNP-080；LNP-082；LNP-083；LNP-060；LNP-061；LNP-086；LNP-097；LNP-098；LNP-099；LNP-100；LNP-101；LNP-102；LNP-103；或LNP-104（参见表11）中的任何。
在特定其他实施方案中，本发明的特征在于包含本发明的siNA分子的组合物，其用美国专利申请号61/189,295、61/204,878、61/235,476、61/249,807和61/298,022中所述的阳离子脂质制剂中的任何配制。
在其他实施方案中，本发明的特征在于本发明的siNA分子的缀合物和/或复合物。此类缀合物和/或复合物可以用于促进siNA分子递送到生物系统例如细胞内。由本发明提供的缀合物和复合物可以赋予治疗活性，通过转移治疗化合物跨越细胞膜，改变药物代谢动力学，和/或调节本发明的核酸分子的定位。此类缀合物的非限制性例子在美国公开号US2008/0152661 A1和US 2004/0162260 A1（例如CDM-LBA、CDM-Pip-LBA、CDM-PEG、CDM-NAG等）和美国专利申请号10/427,160 10/201,394、61/322422和61/315223；以及美国专利号6,528,631；6,335,434；6,235,886；6,153,737；5,214,136；和5,138,045中描述。
在多个实施方案中，聚乙二醇（PEG）可以共价附着至本发明的siNA化合物。附着的PEG可以是任何分子量，优选约100 – 约50,000道尔顿（Da）。
在另外其他实施方案中，本发明的特征在于包含表面修饰的脂质体（其含有聚（乙二醇）脂质（PEG修饰的，或长循环脂质体或隐性脂质体）和本发明的siNA分子的组合物或制剂，例如公开于例如国际PCT公开号WO 96/10391；Ansell等人，国际PCT公开号WO 96/10390；Holland等人，国际PCT公开号WO 96/10392中。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子也可以用聚乙烯亚胺及其衍生物配制或与聚乙烯亚胺及其衍生物复合，例如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺（PEI-PEG-GAL）或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺（PEI-PEG-triGAL）衍生物。在一个实施方案中，本发明的核酸分子如美国专利申请公开号20030077829中所述进行配制。
在其他实施方案中，本发明的siNA分子与膜破裂试剂例如美国专利申请公开号20010007666中描述的那些复合。在另外其他实施方案中，一种或多种膜破裂试剂和siNA分子还与阳离子脂质或辅助脂质分子例如美国专利号6,235,310中描述的那些脂质复合。
在特定实施方案中，本发明的siNA分子与如下述专利中描述的递送系统复合：美国专利申请公开号2003077829；20050287551；20050164220；20050191627；20050118594；20050153919；20050085486；和20030158133；以及国际PCT公开号WO 00/03683和WO 02/087541。
在一些实施方案中，本发明的脂质体制剂包含用下述专利中所述的化合物和组合物配制或与之复合的本发明的siNA分子（例如siNA）：美国专利号6,858,224；6,534,484；6,287,591；6,835,395；6,586,410；6,858,225；6,815,432；6,586,001；6,120,798；6,977,223；6,998,115；5,981,501；5,976,567；5,705,385；和美国专利申请公开号2006/0019912；2006/0019258；2006/0008909；2005/0255153；2005/0079212；2005/0008689；2003/0077829，2005/0064595，2005/0175682，2005/0118253； 2004/0071654；2005/0244504；2005/0265961和 2003/0077829。
可替代地，表达本发明的siNAs的如上文讨论的重组质粒和病毒载体可以用于递送本发明的分子。siNA分子表达载体的递送可以是全身性的，例如通过静脉内或肌内施用，通过施用于从受试者外植的靶细胞随后重新引入受试者内，或通过将允许引入所需靶细胞内的任何其他方式（关于综述参见Couture等人，1996，TIG.，12，510）。此类重组质粒也可以直接或与合适递送试剂结合施用，所述递送试剂包括例如Mirus Transit LT1亲脂试剂；lipofectin；lipofectamine；cellfectin；聚阳离子（例如聚赖氨酸）或基于脂质体脂质的载体系统、阳离子脂质、或脂质体核酸复合物、微团、病毒体、脂质纳米颗粒。
E. 试剂盒
本发明还提供了以试剂盒形式的核酸。试剂盒可以包含容器。试剂盒一般含有本发明的核酸与关于其施用的说明书。在特定情况下，核酸可以具有附着的靶向部分。附着靶向部分（例如抗体、蛋白质）的方法是本领域技术人员已知的。在特定情况下，核酸是化学修饰的。在其他实施方案中，试剂盒含有本发明的超过一种siNA分子。试剂盒可以含有本发明的siNA分子与药学可接受的载体或稀释剂。试剂盒可以进一步包含赋形剂。
F. 治疗用途/药物组合物
在CTNNB1研究中呈现的大量知识指出需要测定CTNNB1活性的方法和可以调节CTNNB1表达的化合物用于研究、诊断和治疗用途。如下文所述，本发明的核酸分子可以用于测定中，以诊断CTNNB1水平有关的疾病状态。此外，核酸分子和药物组合物可以用于治疗与CTNNB1 RNA水平有关的疾病状态。
1. 与 CTNNB1 相关的疾病状态
可以与CTNNB1表达调节相关的特定疾病状态包括多种癌症，包括实体瘤。此类癌症的非限制性例子包括：胆管癌、膀胱癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、骨肉瘤、脑癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、乳腺癌、化生性癌、宫颈癌、颈部鳞状细胞癌、直肠癌、结肠直肠癌、结肠癌、遗传性非息肉性结肠直肠癌、结肠直肠腺癌、胃肠道间质瘤（GISTs）、子宫内膜癌、子宫内膜间质肉瘤、食管癌、食管鳞状细胞癌、食管腺癌、眼黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、胆囊癌、胆囊腺癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、肾母细胞瘤、白血病、急性淋巴细胞性白血病（ALL）、急性髓样白血病（AML）、慢性淋巴细胞性（CLL）、慢性髓样（CML）、慢性骨髓单核细胞性（CMML）、肝癌、肝脏癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、胆管上皮癌、肝胚细胞瘤、肺癌、非小细胞肺癌（NSCLC）、间皮瘤、B细胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、前体T成淋巴细胞淋巴瘤/白血病、外周T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌（NPC）、成神经细胞瘤、口咽癌、口腔鳞状细胞癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、假乳头状赘生物、腺泡细胞癌、前列腺癌、前列腺腺癌、皮肤癌、黑素瘤、恶性黑素瘤、皮肤黑素瘤、小肠癌、胃癌、胃部癌、胃肠道间质瘤（GIST）、子宫癌和子宫肉瘤。
应当理解本发明的siNA分子可以降解靶CTNNB1 mRNA（且因此抑制上述疾病）。疾病的抑制可以通过直接测量受试者中的疾病进展进行评估。它还可以通过观察与疾病相关的状况中的变化或逆转进行推断。另外，本发明的siNA分子可以用作预防。因此，本发明的核酸分子和药物组合物的使用可以用于改善、治疗、预防和/或治愈与CTNNB1基因表达调节相关的这些疾病及其他。
2. 药物组合物
本发明的siNA分子提供了有用的试剂和方法，用于多种治疗、预防、化妆品、兽医、诊断、靶标确认、基因组发现、基因工程和药物基因组学应用。
a. 制剂
因此，在一个方面，本发明还提供了所述siNA分子的药物组合物，即在药学可接受的载体或稀释剂中的组合物。这些药物组合物包括上述化合物的盐、酯或此类酯的盐，例如酸加成盐例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、乙酸和苯磺酸的盐。其他盐包括例如钠、钾、锰、铵和钙盐。这些制剂或组合物可以包含如本领域一般已知的药学可接受的载体或稀释剂。
在一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：5的至少15个核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：4918的至少15个核苷酸序列。在另外一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：194的至少15个核苷酸序列。在另外一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：5107的至少15个核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：196的至少15个核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：5109的至少15个核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：151的至少15个核苷酸序列。在另外一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：5064的至少15个核苷酸序列。在另外一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含式（A）。
本发明的siNA分子优选根据本领域已知的技术，在施用于受试者之前配制为药物组合物。本发明的药物组合物表征为至少无菌和无热原的。用于制备本发明的药物组合物的方法在本领域技术内，例如如Remington's Pharmaceutical Science，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.（1985）中所述的。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物（例如siNA和/或其LNP制剂）进一步包含常规药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括防腐剂、矫味剂、稳定剂、抗氧化剂、摩尔渗透压浓度调整剂、缓冲剂和pH调整剂。合适的添加剂包括生理学生物相容性缓冲液（例如盐酸三甲胺）、螯合剂（例如DTPA或DTPA-双酰胺）或钙螯合络合物（例如钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺）的添加、或任选地钙或钠盐（例如氯化钙、抗坏血酸盐钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙）的添加。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
用于局部施用的各种类型制剂的非限制性例子包括软膏、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、泡沫剂、用于通过经皮贴剂递送的制剂、粉末、喷雾剂、气溶胶、用于在吸入器或吹入器中使用的胶囊或药液筒或滴剂（例如眼或鼻滴剂）、用于喷雾化的溶液/悬浮液、栓剂、子宫托、保留灌肠剂和可咀嚼或可吮吸片剂或丸剂（例如用于治疗口疮性溃疡）或脂质体或微胶囊制剂。
软膏、乳膏剂和凝胶剂可以例如用水或油基质配制，伴随合适增稠剂和/或胶凝剂和/或溶剂的添加。此类基质的非限制性例子因此可以例如包括水和/或油例如液体石蜡或植物油例如花生油或蓖麻油、或溶剂例如聚乙二醇。多种增稠剂和胶凝剂可以取决于基质的性质使用。此类试剂的非限制性例子包括软石蜡、硬脂酸铝、鲸蜡硬脂醇、聚乙二醇、羊毛脂、蜂蜡、羧聚乙烯和纤维素衍生物、和/或单硬脂酸甘油酯和/或非离子型乳化剂。
在一个实施方案中，洗剂可以用水或油基质配制，并且一般而言还将包含一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂或增稠剂。
在一个实施方案中，用于外用的粉末可以借助于任何合适的粉末基质例如滑石、乳糖或淀粉形成。滴剂可以用水或非水基质配制，还包括一种或多种分散剂、增溶剂、悬浮剂或防腐剂。
预期用于经口使用的组合物可以根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法进行制备，并且此类组合物可以包含一种或多种此类甜味剂、矫味剂、着色剂或防腐剂以便提供药学上精致和可口的制剂。片剂包含与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的化学成分，所述赋形剂适合于制备片剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂；例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化和崩解剂，例如玉米淀粉、或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是无包被的，或它们可以通过已知技术进行包被。在某些情况下此类包被可以通过已知技术进行制备，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收且因此提供经过较长时间段的持续作用。例如，可以使用时间延迟材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用于经口使用的制剂也可以呈现为其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合的硬明胶胶囊，或呈现为其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊。
水性悬浮液包含与适合于制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性材料。此类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散或湿润剂可以是天然存在的磷脂例如卵磷脂，或烯化氧与脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸酯；或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物例如十七乙烯氧基鲸蜡醇（heptadecaethyleneoxycetanol），或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。水性悬浮液还可以包含一种或多种防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种矫味剂，和一种或多种甜味剂例如蔗糖或糖精。
油性悬浮液可以通过使活性成分悬浮于植物油或矿物油例如液体石蜡中来制备，所述植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油。油性悬浮液可以包含增稠剂例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂和矫味剂以提供可口的经口制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸进行防腐。
本发明的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油或矿物油或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶，天然存在的磷脂例如大豆、卵磷脂，以及衍生自脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯，例如山梨糖醇酐单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。乳剂还可以包含甜味剂和矫味剂。
糖浆和酏剂可以用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖进行配制。此类制剂还可以包含缓和剂、防腐剂以及矫味剂和着色剂。药物组合物可以是无菌可注射的水性或含油悬浮液的形式。这种悬浮液可以根据已知技术进行配制，其中使用上文已提及的那些合适的分散或湿润剂和悬浮剂。无菌可注射的制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为溶于1,3-丁二醇的溶液。在可以使用的可接受的媒介物和溶剂中有水、林格液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的、固定油照惯例用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以使用任何温和的固定油包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸在可注射物的制备中找到用途。
本发明的核酸分子也可以以栓剂的形式施用，例如用于药物的直肠施用。这些组合物可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合进行制备，所述赋形剂在常温下是固体的但在直肠温度下是液体的，并且因此在直肠中将融化以释放药物。此类材料包括可可脂和聚乙二醇。
本发明的核酸分子可以在无菌介质中肠胃外施用。取决于使用的媒介物和浓度，药物可以悬浮于或溶解于媒介物中。有利地，佐剂例如局部麻醉药、防腐剂和缓冲剂可以溶解于媒介物中。
在其他实施方案中，本文提供的用于在肺递送中使用的siNA和LNP组合物和制剂进一步包含一种或多种表面活性剂。用于增强本发明的组合物摄取的合适表面活性剂或表面活性剂组分包括合成和天然以及完整和截短形式的表面活性蛋白A，表面活性蛋白B，表面活性蛋白C，表面活性蛋白D和表面活性蛋白E，二饱和磷脂酰胆碱（除二棕榈酰外），二棕榈酰磷脂酰胆碱，磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸；磷脂酸，泛醌，溶血磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰胆碱，棕榈酰-溶血磷脂酰胆碱，脱氢表雄酮，多萜醇，sulfatidic酸，甘油-3-磷酸，二羟丙酮磷酸，甘油，甘油-3-磷酸胆碱，二羟丙酮，棕榈酸盐，胞苷二磷酸（CDP）二酰甘油，CDP胆碱，胆碱，磷酸胆碱；以及天然和人造片层体，其是关于表面活性剂组分的天然载体媒介物，ω-3脂肪酸，聚烯酸（polyenic acid），多烯酸，卵磷脂，棕榈酸，氧化乙烯或丙烯的非离子嵌段共聚物，聚氧丙烯、单体和聚合的，聚氧乙烯、单体和聚合的，具有葡聚糖和/或烷酰基侧链的聚乙烯胺，Brij 35，Triton X-100和合成表面活性剂ALEC，Exosurf，Survan和Atovaquone，以及其他。这些表面活性剂可以在制剂中作为单个表面活性剂或多组分表面活性剂的部分使用，或作为与本文的药物组合物的核酸组分的5'和/或3'末端共价结合的附加物使用。
b. 组合
根据本发明的siNAs和药物制剂可以单独施用于受试者或与一种或多种其他治疗剂组合使用或包括一种或多种其他治疗剂，所述治疗剂例如抗癌剂。因此，目前公开的化合物与其他抗癌或化学治疗剂的组合在本发明的范围内。此类试剂的例子可以在Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita和S. Hellman（编辑），第6版（2001年2月15日），Lippincott Williams & Wilkins Publishers中找到。本领域普通技术人员将能够基于所涉及药物和癌症的具体特征，区别哪个试剂组合将是有用的。此类抗癌剂包括但不限于下述：雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、视黄醇类受体调节剂、细胞毒素/细胞生长抑制剂、抗增殖剂、异戊二烯蛋白质转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂及其他血管生成抑制剂、细胞增殖和存活信号传导的抑制剂、细胞凋亡诱导剂和干扰细胞周期检查点的试剂。本发明的siNAs与在HCC治疗中使用的任何治疗剂（例如但不限于索拉非尼）组合也是有用的。当与放射治疗共施用时，本发明是特别有用的。
因此，在进一步的实施方案中，本发明提供了包含本发明的siNA分子或式（A）或其药学可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同一种或多种抗癌或化学治疗剂的组合，所述siNA分子例如但不限于包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4918、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：5107、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：5109、SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：5064的至少15个核苷酸序列的siNA分子。
在特定实施方案中，本发明的siNA分子与已知抗癌剂组合是有用的，包括下述：雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、视黄醇类受体调节剂、细胞毒素剂、抗增殖剂、异戊二烯蛋白质转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂及其他血管生成抑制剂。
可以与本发明的化合物组合使用的雌激素受体调节剂的例子包括但不限于，它莫西芬、雷洛昔芬、艾多昔芬、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、4-[7-（2,2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-（1-哌啶基）乙氧基]苯基]-2H-1-苯并呋喃-3-基]-苯基-2,2-二甲基丙酸酯，4,4’-二羟基二苯甲酮-2,4-二硝基苯-腙、和SH646。
可以与本发明的化合物组合使用的雄激素受体调节剂的例子包括但不限于，非那雄胺及其他5α-还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟他胺、比卡鲁胺、利阿唑和乙酸阿比特龙。
可以与本发明的化合物组合使用的此类视黄醇类受体调节剂的例子包括但不限于，贝沙罗汀、维甲酸、13-顺式-视黄酸、9-顺式-视黄酸、α-二氟甲基鸟氨酸、ILX23-7553、反式-N-（4’-羟苯基）视黄酰胺和N-4-羧基苯基视黄酰胺。
可以与本发明的化合物组合使用的细胞毒素剂的例子包括但不限于，sertenef，恶病质素、异环磷酰胺、他索那敏、氯尼达明、卡铂、六甲蜜胺、泼尼氮芥、二溴卫矛醇、雷莫司汀、福莫司汀、奈达铂、奥沙利铂、替莫唑胺、庚铂、雌氮芥、甲苯磺酸英丙舒凡、曲磷胺、尼莫司汀、二溴螺氯铵、嘌嘧替派、洛铂、沙铂、甲基丝裂霉素、顺铂、伊罗夫文、右异环磷酰胺、顺式-胺二氯（2-甲基-吡啶）铂、苄基鸟嘌呤、葡磷酰胺、GPX100、（顺式，顺式，顺式）-二-μ-（己烷-1,6-二胺）-μ-[二胺-铂（II）]双[二胺（氯）铂（II）]四氯化物、二偶氮烷基精胺、三氧化二砷、1-（11-十二烷基氨基-10-羟基十一烷基）-3,7-二甲基黄嘌呤、佐柔比星、伊达比星、柔红霉素、比生群、米托蒽醌、吡柔比星、吡萘非特、戊柔比星、氨柔比星、抗赘生物药（antineoplaston）、3’-去氨基-3’-吗啉代-13-脱氧-10-羟基洋红霉素、脂质体蒽环霉素（annamycin）、加柔比星、依利奈法德、MEN10755和4-去甲氧基-3-去氨基-3-氮丙啶基-4-甲磺酰-柔红霉素（参见WO 00/50032）。
可以与本发明的化合物组合使用的低氧可激活化合物的例子是替拉扎明。
可以与本发明的化合物组合使用的蛋白酶体抑制剂的例子包括但不限于，乳胞素和硼替佐米。
可以与本发明的化合物组合使用的微管抑制剂/微管稳定剂的例子包括但不限于，紫杉醇、硫酸长春地辛、3’,4’-二脱氢-4’-脱氧-8’-正长春碱（norvincaleukoblastine）、多西紫杉醇、根霉素、多拉司他汀、羟乙基磺酸米伏布林、auristatin、西马多丁、RPR109881、BMS184476、长春氟宁、cryptophycin、2,3,4,5,6-五氟-N-（3-氟-4-甲氧基苯基）苯磺酰胺、脱水长春碱、N,N-二甲基-L-缬氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-缬氨酰-L-脯氨酰-L-脯氨酸-叔丁酰胺、TDX258、大环内酯（参见例如美国专利号6,284,781和6,288,237）和BMS188797。
可以与本发明的化合物组合使用的拓扑异构酶抑制剂的一些例子包括但不限于，托泊替康、hycaptamine、伊立替康、卢比替康、6-乙氧基丙酰基-3’,4’-O-外-苯亚甲基-教酒菌素、9-甲氧基-N,N-二甲基-5-硝基吡咯并[3,4,5-kl]吖啶-2-（6H）丙胺、1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[脱]吡喃并[3’,4’:b,7]-吲哚嗪[1,2b]喹啉-10,13（9H,15H）二酮、勒托替康、7-[2-（N-异丙基氨基）乙基]-（20S）喜树碱、BNP1350、BNPI1100、BN80915、BN80942、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、索布佐生、2’-二甲氨基-2’-脱氧-依托泊苷、GL331、N-[2-（二甲氨基）乙基]-9-羟基-5,6-二甲基-6H-吡啶并[4,3-b]咔唑-1-甲酰胺、asulacrine、（5a,5aB,8aa,9b）-9-[2-[N-[2-（二甲氨基）乙基]-N-甲氨基]乙基]-5-[4-羟基（hydro0xy）-3,5-二甲氧基苯基]-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并（3’,4’:6,7）萘并（2,3-d）-1,3-二氧杂环戊烯-6-酮、2,3-（亚甲基二氧基）-5-甲基-7-羟基-8-甲氧基苯并[c]-菲啶鎓、6,9-双[（2-氨乙基）氨基]苯并[g]异喹啉（isoguinoline）-5,10-二酮、5-（3-氨丙基氨基）-7,10-二羟基-2-（2-羟基乙氨基甲基）-6H-吡唑并[4,5,1-de]吖啶-6-酮、N-[1-[2（二乙氨基）乙基氨基]-7-甲氧基-9-氧代-9H-硫代呫吨-4-基甲基]甲酰胺、N-（2-（二甲氨基）乙基）吖啶-4-甲酰胺、6-[[2-（二甲氨基）乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2,1-c] 喹啉-7-酮和地美司钠。
可以与本发明的化合物组合使用的，有丝分裂驱动蛋白且特别是人有丝分裂驱动蛋白KSP的抑制剂的例子包括但不限于，PCT公开WO 01/30768、WO 01/98278、WO 03/050,064、WO 03/050,122、WO 03/049,527、WO 03/049,679、WO 03/049,678、WO04/039774、WO03/079973、WO03/099211、WO03/105855、WO03/106417、WO04/037171、WO04/058148、WO04/058700、WO04/126699、WO05/018638、WO05/019206、WO05/019205、WO05/018547、WO05/017190、US2005/0176776中所述的抑制剂。在一个实施方案中，有丝分裂驱动蛋白的抑制剂包括但不限于KSP的抑制剂、MKLP1的抑制剂、CENP-E的抑制剂、MCAK的抑制剂、Kif14的抑制剂、Mphosph1的抑制剂和Rab6-KIFL的抑制剂。
可以与本发明的化合物组合使用的“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”的例子包括但不限于，TSA、oxamflatin、PXD101、MG98丙戊酸和scriptaid。关于其他组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的进一步参考可以在下述原稿中找到：Miller，T.A.等人J. Med. Chem. 46（24）:5097-5116（2003）。
可以与本发明的化合物组合使用的涉及有丝分裂进展的激酶的抑制剂包括但不限于，aurora激酶的抑制剂、Polo样激酶（PLK）的抑制剂（特别是PLK-1的抑制剂）、bub-1的抑制剂和bub-R1的抑制剂。
可以与本发明的化合物组合使用的抗增殖剂包括但不限于，反义RNA和DNA寡核苷酸例如G3139、ODN698、RVASKRAS、GEM231和INX3001，和抗代谢药例如依诺他滨、卡莫氟、替加氟、喷司他丁、去氧氟尿苷、三甲曲沙、氟达拉滨、卡培他滨、加洛他滨、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐、fosteabine氢氧化钠、雷替曲塞、paltitrexid、乙嘧替氟、噻唑呋林、地西他滨、诺拉曲塞、培美曲塞、奈拉滨、2’-脱氧-2’-次甲基胞苷、2’-氟亚甲基-2’-脱氧胞苷、N-[5-（2,3-二氢-苯并呋喃基）磺酰基]-N’-（3,4-二氯苯基）脲、N6-[4-脱氧-4-[N2-[2（E）,4（E）-十四碳二烯酰基（tetradecadienoyl）]甘氨酰氨基]-L-甘油-B-L-甘露-吡喃庚糖基]腺嘌呤、aplidine、海鞘素、曲沙他滨、4-[2-氨基-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-嘧啶基[5,4-b][1,4]噻嗪-6-基-（S）-乙基]-2,5-噻吩基（thienoyl）-L-谷氨酸、氨基蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、11-乙酰基-8-（氨基甲酰氧基甲基）-4-甲酰基-6-甲氧基-14-氧杂-1,11-二氮杂四环（7.4.1.0.0）-十四-2,4,6-三烯-9-基乙酸酯、苦马豆素、洛美曲索、右雷佐生、甲硫氨酸酶、2’-氰基-2’-脱氧-N4-棕榈酰-1-B-D阿糖呋喃胞苷和3-氨基吡啶-2-甲醛缩氨基硫脲。
可以与本发明的化合物组合使用的抗体靶向治疗剂的例子包括那些治疗剂，其具有附着至癌细胞特异性或靶细胞特异性单克隆抗体的细胞毒素剂或放射性同位素，例如Bexxar。
可以与本发明的化合物组合使用的，可以使用的HMG-CoA还原酶抑制剂的例子包括但不限于，洛伐他汀（MEVACOR®；参见美国专利号4,231,938、4,294,926和4,319,039）、辛伐他汀（ZOCOR®；参见美国专利号4,444,784、4,820,850和4,916,239）、普伐他汀（PRAVACHOL®；参见美国专利号4,346,227、4,537,859、4,410,629、5,030,447和5,180,589）、氟伐他汀（LESCOL®；参见美国专利号5,354,772、4,911,165、4,929,437、5,189,164、5,118,853、5,290,946和5,356,896）和阿托伐他汀（LIPITOR®；参见美国专利号5,273,995、4,681,893、5,489,691和5,342,952）。可以在本方法中使用的这些和另外的HMG-CoA还原酶抑制剂的结构式在M. Yalpani，"Cholesterol Lowering Drugs"，Chemistry & Industry，第85-89页（1996年2月5日）的第87页以及美国专利号4,782,084和4,885,314中描述。
可以与本发明的化合物组合使用的异戊二烯蛋白质转移酶抑制剂的例子包括但不限于，可以在下述出版物和专利中发现的：WO 96/30343、WO 97/18813、WO 97/21701、WO 97/23478、WO 97/38665、WO 98/28980、WO 98/29119、WO 95/32987、美国专利号5,420,245、美国专利号5,523,430、美国专利号5,532,359、美国专利号5,510,510、美国专利号5,589,485、美国专利号5,602,098、欧洲专利公开0 618 221、欧洲专利公开0 675 112、欧洲专利公开0 604 181、欧洲专利公开0 696 593、WO 94/19357、WO 95/08542、WO 95/11917、WO 95/12612、WO 95/12572、WO 95/10514、美国专利号5,661,152、WO 95/10515、WO 95/10516、WO 95/24612、WO 95/34535、WO 95/25086、WO 96/05529、WO 96/06138、WO 96/06193、WO 96/16443、WO 96/21701、WO 96/21456、WO 96/22278、WO 96/24611、WO 96/24612、WO 96/05168、WO 96/05169、WO 96/00736、美国专利号5,571,792、WO 96/17861、WO 96/33159、WO 96/34850、WO 96/34851、WO 96/30017、WO 96/30018、WO 96/30362、WO 96/30363、WO 96/31111、WO 96/31477、WO 96/31478、WO 96/31501、WO 97/00252、WO 97/03047、WO 97/03050、WO 97/04785、WO 97/02920、WO 97/17070、WO 97/23478、WO 97/26246、WO 97/30053、WO 97/44350、WO 98/02436和美国专利号5,532,359。关于异戊二烯蛋白质转移酶抑制剂对血管生成的作用的例子，参见European J. of Cancer，第35卷，No. 9，第1394-1401页（1999）。
可以与本发明的化合物组合使用的血管生成抑制剂的例子包括但不限于，酪氨酸激酶抑制剂例如酪氨酸激酶受体Flt-1（VEGFR1）和Flk-1/KDR（VEGFR2）的抑制剂，表皮衍生的、成纤维细胞衍生的或血小板衍生的生长因子的抑制剂，MMP（基质金属蛋白酶）抑制剂，整联蛋白阻滞剂，干扰素-α，白细胞介素-12，多硫酸戊聚糖酯，环加氧酶抑制剂包括非类固醇抗炎剂（NSAIDs）如阿司匹林和布洛芬，以及选择性环加氧酶-2抑制剂如塞来昔布和罗非昔布（PNAS，第89卷，第7384页（1992）；JNCI，第69卷，第475页（1982）；Arch. Opthalmol.，第108卷，第573页（1990）；Anat. Rec.，第238卷，第68页（1994）；FEBS Letters，第372卷，第83页（1995）；Clin ， Orthop. 第313卷，第76页（1995）；J. Mol. Endocrinol.，第16卷，第107页（1996）；Jpn. J. Pharmacol.，第75卷，第105页（1997）；CancerRes.，第57卷，第1625页（1997）；Cell，第93卷，第705页（1998）；Intl. J. Mol. Med.，第2卷，第715页（1998）；J. Biol. Chem.，第274卷，第9116页（1999）），类固醇抗炎剂（例如皮质类固醇、盐皮质激素、地塞米松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、倍他米松），羧胺三唑，考布他汀A-4，角鲨胺，6-O-氯乙酰基-羰基）-烟曲霉醇，沙立度胺，血管他丁，肌钙蛋白-1，血管紧张素II拮抗剂（参见Fernandez等人，J. Lab. Clin. Med. 105:141-145（1985）），和针对VEGF的抗体（参见Nature Biotechnology，第17卷，第963-968页（1999年10月）；Kim等人，Nature，362，841-844（1993）；WO 00/44777；和WO 00/61186）。
调节或抑制血管生成的其他治疗剂也可以与本发明的化合物组合使用，且包括调节或抑制凝固和纤维蛋白溶解系统的试剂（参见在Clin. Chem. La. Med. 38:679-692（2000）中的综述）。可以与本发明的化合物组合使用的调节或抑制凝固和纤维蛋白溶解途径的此类试剂的例子包括但不限于肝素（参见Thromb. Haemost. 80:10-23（1998））、低分子量肝素和羧肽酶U抑制剂（也称为活性凝血酶可激活纤维蛋白溶解抑制剂 [TAFIa]的抑制剂）（参见Thrombosis Res. 101:329-354（2001））。TAFIa抑制剂已在PCT公开WO 03/013,526和美国系列号60/349,925（2002年1月18日）中描述。
可以与本发明的化合物组合使用的干扰细胞周期检查点的试剂包括但不限于，ATR、ATM、Chk1和Chk2激酶的抑制剂以及cdk和cdc激酶抑制剂，并且通过7-羟基星形孢菌素、flavopiridol、CYC202（Cyclacel）和BMS-387032具体例示。
可以与本发明的化合物组合使用的干扰受体酪氨酸激酶（RTKs）的试剂包括但不限于，c-Kit、Eph、PDGF、Flt3和CTNNB1的抑制剂。进一步的试剂包括由Bume-Jensen和Hunter，Nature，411:355-365，2001描述的RTKs的抑制剂。
可以与本发明的化合物组合使用的细胞增殖和存活信号传导途径的抑制剂包括但不限于，EGFR的抑制剂（例如吉非替尼和埃罗替尼）、ERB-2的抑制剂（例如曲妥珠单抗）、IGFR的抑制剂、细胞因子受体的抑制剂、CTNNB1的抑制剂、PI3K的抑制剂（例如LY294002）、丝氨酸/苏氨酸激酶（包括但不限于例如在WO 02/083064、WO 02/083139、WO 02/083140、US 2004-0116432、WO 02/083138、US 2004-0102360、WO 03/086404、WO 03/086279、WO 03/086394、WO 03/084473、WO 03/086403、WO 2004/041162、WO 2004/096131、WO 2004/096129、WO 2004/096135、WO 2004/096130、WO 2005/100356、WO 2005/100344中所述的Akt的抑制剂）、Raf激酶的抑制剂（例如BAY-43-9006）、MEK的抑制剂（例如CI-1040和PD-098059）和mTOR的抑制剂（例如Wyeth CCI-779）。此类试剂包括小分子抑制剂化合物和抗体拮抗剂。
可以与本发明的化合物组合使用的细胞凋亡诱导剂的例子包括但不限于，TNF受体家族成员（包括TRAIL受体）的激活物。
可以与本发明的化合物组合使用的其为选择性COX-2抑制剂的NSAIDs包括但不限于，公开于下述专利中的那些NSAIDs：美国专利5,474,995、美国专利5,861,419、美国专利6,001,843、美国专利6,020,343、美国专利5,409,944、美国专利5,436,265、美国专利5,536,752、美国专利5,550,142、美国专利5,604,260、U.S. 5,698,584、美国专利5,710,140、WO 94/15932、美国专利5,344,991、美国专利5,134,142、美国专利5,380,738、美国专利5,393,790、美国专利5,466,823、美国专利5,633,272和美国专利5,932,598，所有专利在此引入作为参考。
与本发明的化合物组合特别有用的COX-2的抑制剂包括：3-苯基-4-（4-（甲磺酰）苯基）-2-（5H）-呋喃酮；和5-氯-3-（4-甲磺酰）-苯基-2-（2-甲基-5-吡啶基）吡啶；或其药学可接受的盐。
已描述为COX-2的特异性抑制剂且因此在本发明中有用的化合物包括但不限于：帕瑞考昔、CELEBREX®和BEXTRA®或其药学可接受的盐。
可以与本发明的化合物组合使用的血管生成抑制剂包括但不限于，内皮他丁、ukrain、豹蛙酶、IM862、5-甲氧基-4-[2-甲基-3-（3-甲基-2-丁烯基）环氧乙烷基]-1-氧杂螺[2,5]辛-6-基（氯乙酰基）氨基甲酸酯、acetyldinanaline、5-氨基-1-[[3,5-二氯-4-（4-氯苯甲酰基）-苯基]甲基]-1H-1,2,3-三唑-4-甲酰胺、CM101、角鲨胺、考布他汀、RPI4610、NX31838、硫酸化甘露庚糖磷酸酯、7,7-（羰基-双[亚氨基-N-甲基-4,2-吡咯并羰基亚氨基[N-甲基-4,2-吡咯]-羰基亚氨基]-双-（1,3-萘二磺酸酯）和3-[（2,4-二甲基吡咯并-5-基）亚甲基]-2-吲哚酮（SU5416）。
可以与本发明的化合物组合使用的酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于，N-（三氟甲基苯基）-5-甲基异噁唑-4-甲酰胺、3-[（2,4-二甲基吡咯-5-基）亚甲基）吲哚-2-酮、17-（烯丙基氨基）-17-去甲氧基格尔德霉素、4-（3-氯-4-氟苯基氨基）-7-甲氧基-6-[3-（4-吗啉基）丙基（propoxyl）]喹唑啉、N-（3-乙炔基苯基）-6,7-双（2-甲氧基乙氧基）-4-喹唑啉胺、BIBX1382、2,3,9,10,11,12-六氢-10-（羟甲基）-10-羟基-9-甲基-9,12-环氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg:3’,2’,1’-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二氮芳辛-1-酮、SH268、染料木黄酮、伊马替尼（STI571）、CEP2563、4-（3-氯苯基氨基）-5,6-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶甲烷磺酸酯、4-（3-溴-4-羟基苯基）氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、4-（4’-羟基苯基）氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、SU6668、STI571A、N-4-氯苯基-4-（4-吡啶基甲基）-1-酞嗪胺和EMD121974。
与除了抗癌化合物外的化合物的组合也包含在本组合物和方法中。例如，请求保护的化合物与PPAR-γ（即PPAR- gamma）激动剂和PPAR-δ（即PPAR-delta）激动剂的组合在特定恶性肿瘤的治疗中是有用的。PPAR-γ和PPAR-δ是核过氧化物酶体增殖物激活受体γ和δ。PPAR-γ在内皮细胞上的表达及其在血管生成中的牵涉已在文献中报道（参见J. Cardiovasc. Pharmacol. 31:909-913（1998）；J. Biol. Chem. 274:9116-9121（1999）；Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 41:2309-2317（2000））。最近，PPAR-γ激动剂已显示抑制在体外针对VEGF的血管生成应答；曲格列酮和马来酸罗格列酮抑制小鼠中的视网膜新生血管形成的发展（Arch. Ophthamol. 119:709-717（2001））。可以与本发明的化合物组合使用的PPAR-γ激动剂和PPAR-γ/α激动剂的例子包括但不限于噻唑啉二酮（例如DRF2725、CS-011、曲格列酮、罗格列酮和吡格列酮）、非诺贝特、吉非贝齐、氯贝丁酯、GW2570、SB219994、AR-H039242、JTT-501、MCC-555、GW2331、GW409544、NN2344、KRP297、NP0110、DRF4158、NN622、GI262570、PNU182716、DRF552926、2-[（5,7-二丙基-3-三氟甲基-1,2-苯并异噁唑-6-基）氧基]-2-甲基丙酸（公开于USSN 09/782,856）和2（R）-7-（3-（2-氯-4-（4-氟苯氧基）苯氧基）丙氧基）-2-乙基色烷-2-羧酸（公开于USSN 60/235,708和60/244,697中）。
本发明的另一个实施方案是目前公开的化合物与基因疗法组合用于治疗癌症的用途。对于治疗癌症的遗传策略的概述，参见Hall等人（Am J Hum Genet 61:785-789（1997））和Kufe等人（Cancer Medicine，第5版，第876-889页，BC Decker，Hamilton，2000）。基因疗法可以用于递送任何肿瘤抑制基因。此类基因的例子包括但不限于可以经由重组病毒介导的基因转移递送的p53（参见例如美国专利号6,069,134）、uPA/uPAR拮抗剂（"Adenovirus-Mediated Delivery of a uPA/uPAR Antagonist Suppresses Angiogenesis-Dependent Tumor Growth and Dissemination in Mice," Gene Therapy，August 5（8）:1105-13（1998））、和干扰素γ（J Immunol 164:217-222（2000））。
本发明的化合物也可以与固有多药抗性（MDR）的抑制剂组合施用，特别是与转运蛋白的高水平表达相关的MDR。此类MDR抑制剂包括p-糖蛋白（P-gp）的抑制剂，例如LY335979、XR9576、OC144-093、R101922、VX853和PSC833（伐司扑达）。
本发明的化合物可以与止吐药结合采用，以治疗恶心或呕吐，包括急性、延迟、晚期和预期呕吐，其可以起因于单独或与放射疗法的本发明的化合物的使用。对于呕吐的预防或治疗，本发明的化合物可以与其他止吐药结合使用，尤其是神经激肽-1受体拮抗剂、5HT3受体拮抗剂例如昂丹司琼、格拉司琼、托烷司琼和扎托司琼（zatisetron）、GABAB受体激动剂例如巴氯芬、皮质类固醇例如地卡特隆（地塞米松）、康宁乐、Aristocort、Nasalide、Preferid、Benecorten或例如公开于美国专利号2,789,118、2,990,401、3,048,581、3,126,375、3,929,768、3,996,359、3,928,326和3,749,712中的其他，抗多巴胺例如吩噻嗪（例如丙氯拉嗪、氟非那嗪、硫利达嗪和美索达嗪）、甲氧氯普胺或屈大麻酚。在一个实施方案中，选自神经激肽-1受体拮抗剂、5HT3受体拮抗剂和皮质类固醇的止吐药作为佐剂施用，用于治疗或预防可以在本化合物施用后产生的呕吐。
与本发明的化合物结合使用的神经激肽-1受体拮抗剂例如在下述专利中充分描述：美国专利号5,162,339、5,232,929、5,242,930、5,373,003、5,387,595、5,459,270、5,494,926、5,496,833、5,637,699、5,719,147；欧洲专利公开号EP 0 360 390、0 394 989、0 428 434、0 429 366、0 430 771、0 436 334、0 443 132、0 482 539、0 498 069、0 499 313、0 512 901、0 512 902、0 514 273、0 514 274、0 514 275、0 514 276、0 515 681、0 517 589、0 520 555、0 522 808、0 528 495、0 532 456、0 533 280、0 536 817、0 545 478、0 558 156、0 577 394、0 585 913,0 590 152、0 599 538、0 610 793、0 634 402、0 686 629、0 693 489、0 694 535、0 699 655、0 699 674、0 707 006、0 708 101、0 709 375、0 709 376、0 714 891、0 723 959、0 733 632和0 776 893； PCT国际专利公开号WO 90/05525、90/05729、91/09844、91/18899、92/01688、92/06079、92/12151、92/15585、92/17449、92/20661、92/20676、92/21677、92/22569、93/00330、93/00331、93/01159、93/01165、93/01169、93/01170、93/06099、93/09116、93/10073、93/14084、93/14113、93/18023、93/19064、93/21155、93/21181、93/23380、93/24465、94/00440、94/01402、94/02461、94/02595、94/03429、94/03445、94/04494、94/04496、94/05625、94/07843、94/08997、94/10165、94/10167、94/10168、94/10170、94/11368、94/13639、94/13663、94/14767、94/15903、94/19320、94/19323、94/20500、94/26735、94/26740、94/29309、95/02595、95/04040、95/04042、95/06645、95/07886、95/07908、95/08549、95/11880、95/14017、95/15311、95/16679、95/17382、95/18124、95/18129、95/19344、95/20575、95/21819、95/22525、95/23798、95/26338、95/28418、95/30674、95/30687、95/33744、96/05181、96/05193、96/05203、96/06094、96/07649、96/10562、96/16939、96/18643、96/20197、96/21661、96/29304、96/29317、96/29326、96/29328、96/31214、96/32385、96/37489、97/01553、97/01554、97/03066、97/08144、97/14671、97/17362、97/18206、97/19084、97/19942和97/21702；和英国专利公开号2 266 529、2 268 931、2 269 170、2 269 590、2 271 774、2 292 144、2 293 168、2 293 169和2 302 689。此类化合物的制备在前述专利和出版物中完全描述，其引入本文作为参考。
在一个实施方案中，用于与本发明的化合物结合使用的神经激肽-1受体拮抗剂选自：2-（R）-（1-（R）-（3,5-双（三氟甲基）-苯基）乙氧基）-3-（S）-（4-氟苯基）-4-（3-（5-氧代-1H,4H-1,2,4-三唑并）甲基）吗啉或其药学可接受的盐，其在美国专利号5,719,147中描述。
本发明的化合物也可以与双膦酸盐（应理解为包括双膦酸盐、二膦酸盐、双膦酸和二膦酸）组合用于治疗或预防癌症，包括骨癌。双膦酸盐的例子包括但不限于：依替膦酸盐（Didronel）、帕米磷酸盐（Aredia）、阿屈膦酸盐（Fosamax）、利塞膦酸盐（Actonel）、唑来膦酸盐（Zometa）、伊班膦酸盐（Boniva）、伊卡膦酸盐或英卡膦酸盐、氯膦酸、EB-1053、米诺膦酸盐、奈立膦酸盐、piridronate和替鲁膦酸盐，包括任何和所有药学可接受的盐、衍生物、水合物及其混合物。
本发明的化合物也可以与在贫血治疗中有用的试剂一起施用。此类贫血治疗剂是例如连续促红细胞生成素受体激活物（例如阿法依泊汀）。
本发明的化合物也可以与在嗜中性粒细胞减少症的治疗中有用的试剂一起施用。此类嗜中性粒细胞减少症治疗剂是例如调节嗜中性粒细胞的生产和功能的造血生长因子，例如人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）。G-CSF的例子包括非格司亭和PEG-非格司亭。
本发明的化合物也可以与免疫学增强药物一起施用，例如左旋咪唑、异丙肌苷和日达仙。
本发明的化合物也可以与芳香酶抑制剂组合用于治疗或预防乳腺癌。芳香酶抑制剂的例子包括但不限于：阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。
本发明的化合物也可以与其他siNA治疗组合用于治疗或预防癌症。
本发明的化合物也可以与γ-分泌酶抑制剂和/或NOTCH信号传导的抑制剂一起施用。此类抑制剂包括下述专利中所述的化合物：WO 01/90084、 WO 02/30912、WO 01/70677、WO 03/013506、WO 02/36555、WO 03/093252、WO 03/093264、WO 03/093251、WO 03/093253、WO 2004/039800、WO 2004/039370、WO 2005/030731、WO 2005/014553、USSN 10/957,251、 WO 2004/089911、WO 02/081435、WO 02/081433、WO 03/018543、WO 2004/031137、WO 2004/031139、WO 2004/031138、WO 2004/101538、WO 2004/101539和WO 02/47671（包括LY-450139）。
本发明的化合物也可以与PARP抑制剂组合用于治疗或预防癌症。
本发明的化合物也可以与下述治疗剂组合用于治疗癌症：阿巴瑞克（Plenaxis depot®）；阿地白介素（Prokine®）；阿地白介素（Proleukin®）；阿仑珠单抗（Alemtuzumabb）（Campath®）；阿里维A酸（Panretin®）；别嘌呤醇 （Zyloprim®）；六甲蜜胺（Hexalen®）；氨磷汀（Ethyol®）；阿那曲唑（Arimidex®）；三氧化二砷（Trisenox®）；天冬酰胺酶（Elspar®）；阿扎胞苷（Vidaza®）；苯达莫司汀盐酸盐（Treanda®）；贝伐珠单抗（bevacuzimab）（Avastin®）；贝沙罗汀胶囊（Targretin®）；贝沙罗汀凝胶（Targretin®）；博来霉素（Blenoxane®）；硼替佐米（Velcade®）；布雷菲德菌素A；静脉内白消安（Busulfex®）；经口白消安（Myleran®）；卡普睾酮（Methosarb®）；卡培他滨（Xeloda®）；卡铂（Paraplatin®）；卡莫司汀（BCNU®，BiCNU®）；卡莫司汀（Gliadel®）；具有Polifeprosan 20 Implant的卡莫司汀（Gliadel Wafer®）；塞来昔布（Celebrex®）；西妥昔单抗（Erbitux®）；苯丁酸氮芥（Leukeran®）；顺铂（Platinol®）；克拉屈滨（Leustatin®，2-CdA®）；氯法拉滨（Clolar®）；环磷酰胺（Cytoxan®，Neosar®）；环磷酰胺（Cytoxan Injection®）；环磷酰胺（Cytoxan Tablet®）；阿糖胞苷（Cytosar-U®）；阿糖胞苷脂质体（DepoCyt®）；达卡巴嗪（DTIC-Dome®）；达卡巴嗪，放线菌素D（Cosmegen®）；达肝素钠注射（Fragmin®）；达依泊汀α（Aranesp®）；达沙替尼（Sprycel®）；柔红霉素脂质体（DanuoXome®）；柔红霉素，道诺霉素（Daunorubicin®）；柔红霉素，道诺霉素（Cerubidine®）；迪加瑞克（Firmagon®）；地尼白介素2（Ontak®）；右雷佐生（Zinecard®）；右雷佐生盐酸盐（Totect®）；代代宁B；17-DMAG；多西他赛（Taxotere®）；多柔比星（Adriamycin PFS®）；多柔比星（Adriamycin®，Rubex®）；多柔比星（Adriamycin PFS Injection®）；多柔比星脂质体（Doxil®）；丙酸屈他雄酮（Dromostanolone ®）；丙酸屈他雄酮（Masterone Injection®）；艾库组单抗注射（Soliris®）；Elliott's B溶液（Elliott's B Solution®）；eltrombopag（Promacta®）；表柔比星（Ellence®）；阿法依泊汀（epogen®）；埃罗替尼（Tarceva®）；雌氮芥（Emcyt®）；炔雌醇；磷酸依托泊苷（Etopophos®）；依托泊苷，VP-16（Vepesid®）；依维莫司片剂（Afinitor®）；依西美坦（Aromasin®）；ferumoxytol（Feraheme Injection®）；非格司亭（Neupogen®）；氟尿苷（intraarterial）（FUDR®）；氟达拉滨（Fludara®）；氟尿嘧啶，5-FU（Adrucil®）；氟维司群（Faslodex®）；吉非替尼（Iressa®）；格尔德霉素；吉西他滨（Gemzar®）；吉妥珠单抗奥佐米星（Mylotarg®）；乙酸戈舍瑞林（Zoladex Implant®）；乙酸戈舍瑞林（Zoladex®）；乙酸组氨瑞林（Histrelin implant®）；羟基脲（Hydrea®）；替伊莫单抗（Zevalin®）；伊达比星（Idamycin®）；异环磷酰胺（IFEX®）；甲磺酸伊马替尼（Gleevec®）；α干扰素2a（Roferon A®）；α干扰素2b（Intron A®）；碘苄胍I 123 注射（AdreView®）；伊立替康（Camptosar®）；依沙比酮（Ixempra®）；拉帕替尼片剂（Tykerb®）；来那度胺（Revlimid®）；来曲唑（Femara®）；甲酰四氢叶酸（Wellcovorin®，Leucovorin®）；乙酸亮丙瑞林（Eligard®）；左旋咪唑（Ergamisol®）；洛莫司汀，CCNU（CeeBU®）；meclorethamine，氮芥（Mustargen®）；乙酸甲地孕酮（Megace®）；美法仑，L-PAM（Alkeran®）；巯嘌呤，6-MP（Purinethol®）；美司钠（Mesnex®）；美司钠（Mesnex tabs®）；甲氨蝶呤（Methotrexate®）；甲氧沙林（Uvadex®）；8-甲氧沙林；丝裂霉素C（Mutamycin®）；米托坦（Lysodren®）；米托蒽醌（Novantrone®）；光辉霉素；苯丙酸诺龙（Durabolin-50®）；奈拉滨（Arranon®）；尼洛替尼（Tasigna®）；诺菲单抗（Verluma®）；ofatumumab（Arzerra®）；奥普瑞白介素（Neumega®）；奥沙利铂（Eloxatin®）；紫杉醇（Paxene®）；紫杉醇（Taxol®）；紫杉醇蛋白质结合的颗粒（Abraxane®）；帕利夫明（Kepivance®）；帕米膦酸（Aredia®）；帕木单抗（Vectibix®）；帕唑帕尼片剂（Votrienttm®）；培加酶（Adagen（Pegademase Bovine）®）；培门冬酶（Oncaspar®）；培非司亭（Neulasta®）；培美曲塞二钠（Alimta®）；喷司他丁（Nipent®）；哌泊溴烷（Vercyte®）；plerixafor（Mozobil®）；普卡霉素，光辉霉素（Mithracin®）；卟吩姆钠（Photofrin®）；普拉曲沙注射（Folotyn®）；丙卡巴肼（Matulane®）；奎纳克林（Atabrine®）；雷帕霉素；拉布立酶（Elitek®）；盐酸雷洛昔芬（Evista®）；利妥昔单抗（Rituxan®）；romidepsin（Istodax®）；romiplostim（Nplate®）；沙格司亭（Leukine®）；沙格司亭（Prokine®）；索拉非尼（Nexavar®）；链佐星（Zanosar®）；马来酸舒尼替尼（Sutent®）；滑石（Sclerosol®）；它莫西芬（Nolvadex®）；替莫唑胺（Temodar®）；坦罗莫司（Torisel®）；替尼泊苷，VM-26（Vumon®）；睾内酯（Teslac®）；硫鸟嘌呤，6-TG（Thioguanine®）；硫嘌呤；噻替派（Thioplex®）；托泊替康（Hycamtin®）；托瑞米芬（Fareston®）；托西莫单抗（Bexxar®）；托西莫单抗/I-131托西莫单抗（Bexxar®）；反式-视黄酸；曲妥珠单抗（Herceptin®）；维甲酸，ATRA（Vesanoid®）；三乙撑蜜胺；尿嘧啶氮芥（Uracil Mustard Capsules®）；戊柔比星（Valstar®）；长春碱（Velban®）；长春新碱（Oncovin®）；长春瑞滨（Navelbine®）；伏立诺他（Zolinza®）；渥曼青霉素；和唑来膦酸盐（Zometa®）。
本发明还提供了包含本发明的siNA分子或式（A）和/或其药学可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同另一种CTNNB1抑制剂的组合，所述siNA分子包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4918、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：5107、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：5109、SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：5064的至少15核苷酸序列。
上文提及的组合可以方便地呈现用于以药物制剂的形式使用，并且因此包括如上定义连同药学上可接受的稀释剂或载体的组合的药物组合物代表本发明的一个进一步方面。
此类组合的个别化合物可以在分开或组合药物制剂中顺次或同时施用。在一个实施方案中，个别化合物将在组合药物制剂中同时施用。
因此，所描述的分子可以与一种或多种已知化合物、治疗或操作组合用于预防或治疗如本领域已知的受试者或生物中疾病、病症、状况和性状，例如其他CTNNB1抑制剂。
3. 治疗应用
在CTNNB1研究中呈现的大量知识指出需要可以调节CTNNB1表达的方法用于治疗用途。
因此，本发明的一个方面包括治疗受试者包括但不限于患有通过CTNNB1基因表达的作用或作用的丧失介导的状况的人的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的本发明的双链siNA分子。在这个方面的一个实施方案中，siNA分子包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4918、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：5107、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：5109、SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：5064的至少15个核苷酸序列；或式（A）。在这个方面的另一个实施方案中，状况是癌症或由癌症引起。因此，在特定实施方案中，本发明的方法和组合物在用于治疗癌症的方法中是有用的。可根据本发明的这个方面治疗的癌症包括胆管癌、膀胱癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、骨肉瘤、脑癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、乳腺癌、化生性癌、宫颈癌、颈部鳞状细胞癌、直肠癌、结肠直肠癌、结肠癌、遗传性非息肉性结肠直肠癌、结肠直肠腺癌、胃肠道间质瘤（GISTs）、子宫内膜癌、子宫内膜间质肉瘤、食管癌、食管鳞状细胞癌、食管腺癌、眼黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、胆囊癌、胆囊腺癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、肾母细胞瘤、白血病、急性淋巴细胞性白血病（ALL）、急性髓样白血病（AML）、慢性淋巴细胞性（CLL）、慢性髓样（CML）、慢性骨髓单核细胞性（CMML）、肝癌、肝脏癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、胆管上皮癌、肝胚细胞瘤、肺癌、非小细胞肺癌（NSCLC）、间皮瘤、B细胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、前体T成淋巴细胞淋巴瘤/白血病、外周T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌（NPC）、成神经细胞瘤、口咽癌、口腔鳞状细胞癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、假乳头状赘生物、腺泡细胞癌、前列腺癌、前列腺腺癌、皮肤癌、黑素瘤、恶性黑素瘤、皮肤黑素瘤、小肠癌、胃癌、胃部癌、胃肠道间质瘤（GIST）、子宫癌、子宫肉瘤。
在一个实施方案中，本发明的siNA分子在用于治疗或预防选自下述的癌症的方法中是有用的：脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、白血病、肝细胞癌、肺癌、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤和胃癌。在特定实施方案中，本发明的方法用于治疗乳腺癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、肺癌；和前列腺癌。在特定实施方案中，本发明的化合物用于治疗肝细胞癌。
在另一个实施方案中，本发明的siNA分子在用于治疗或调节癌细胞和癌症的转移的方法中是有用的。特别地，本发明的siNA分子在预防或调节选自下述的癌症的转移的方法中是有用的：脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、白血病、肝细胞癌、肺癌、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤和胃癌。
在特定实施方案中，siNA分子的施用是经由局部施用或全身施用。在其他实施方案中，本发明的特征在于例如经由肺递送经由给相关组织或细胞例如肺细胞和组织的局部施用，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。在另外其他实施方案中，本发明的特征在于经由给相关组织或细胞的全身施用（例如经由siNA的静脉内或皮下施用）使受试者或生物与本发明的siNA分子接触，所述组织或细胞例如受试者或生物中的癌组织或细胞。
本发明的siNA分子也用作离体应用中的试剂。例如，为了疗效将siNA试剂引入移植到受试者内的组织或细胞内。细胞和/或组织可以得自随后接受外植体的生物或受试者，或可以得自移植前的另一种生物或受试者。siNA分子可以用于调节细胞或组织中的一种或多种基因的表达，从而使得细胞或组织获得所需表型或当体内移植时能够执行功能。在一个实施方案中，从患者中提取特定CTNNB1靶细胞。在适合于经由这些细胞摄取siNAs的条件下（例如，使用递送试剂例如阳离子脂质、脂质体等，或使用技术例如电穿孔以促进siNA递送到细胞内），使这些提取的细胞与靶向细胞内的特定核苷酸序列的CTNNB1 siNA接触。随后将细胞再引回到相同患者或其他患者内。
对于治疗应用，将药学有效剂量的本发明的siNA分子或药物组合物施用于受试者。药学有效剂量是预防、抑制发生、或治疗（使症状减轻至某一程度，优选所有症状）疾病状态所需的那种剂量。本领域技术人员可以通过考虑下述因素容易地决定待施用于给定受试者的本发明的siNA的治疗有效剂量：例如受试者的大小和重量，疾病进展或穿透程度，受试者的年龄、健康和性别，施用途径，和施用是局部还是全身性的。一般地，取决于带负电荷聚合物的效力，施用0.1 μg/kg - 100 mg/kg体重/天的活性成分量。最佳给药方案可以通过测量患者体内的药物蓄积进行计算。本发明的siNA分子可以在单个剂量或多个剂量中施用。
本发明的siNA分子可以每月、每周、每天（QD）施用一次，或分成多个每月、每周或日剂量，例如但不限于每天两次（BID）、每天三次（TID）、每两周一次。基于测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度，本领域普通技术人员可以容易地评估关于给药的重复率。
此外，施用可以是连续的，即每天，或间歇地。例如，本发明的化合物的间歇施用可以是每周施用一到六天，或它可以意指以循环的施用（例如每天施用共连续两到八周，随后高达一周的无施用的休息期），或它可以意指隔日施用。
G. 施用
组合物或制剂可以以多种方式施用。本发明的施用方法的非限制性例子包括经口、经颊、舌下、肠胃外（即关节内、静脉内、腹膜内、皮下或肌内）、局部直肠施用或其他局部施用。在一个实施方案中，本发明的组合物可以通过吹入和吸入施用。施用可以经由单个或分份剂量完成。在一些实施方案中，药物组合物通过推注静脉内或腹膜内施用（参见例如，美国专利号5,286,634）。脂质核酸颗粒可以通过在疾病部位的直接注射或通过在远离疾病部位的部位注射进行施用（参见例如，Culver，HUMAN GENE THERAPY，MaryAnn Liebert，Inc.，Publishers，New York. 第70-71页（1994））。在一个实施方案中，如本文描述和如本领域一般已知的，将本发明的siNA分子及其制剂或组合物施用于细胞、受试者或生物。
1. 体内施用
在本发明的任何一种治疗方法中，siNA可以如本文所描述的或本领域其他方面已知的全身性地给受试者施用，单独作为单一疗法或与本文描述的或本领域已知的另外疗法组合。全身施用可以包括例如，如本领域一般已知的肺（吸入、喷雾法等）静脉内、皮下、肌内、导管插入、鼻咽、经皮和/或经口/胃肠施用。
在本发明的任何一种治疗或预防方法中，siNA可以如本文描述的或本领域其他方面已知的局部地施用于受试者或施用于局部组织，单独作为单一疗法或与本领域已知的另外疗法组合。局部施用可以包括例如，如本领域一般已知的吸入、喷雾法、导管插入、植入、直接注射、皮肤/经皮应用、贴剂、支架、滴耳剂/滴眼剂、或门静脉施用于相关组织，或任何其他局部施用技术、方法或操作。
在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如本领域一般已知的施用于肝（参见例如W Wen等人，2004，World J Gastroenterol. ，10，244-9；Murao等人，2002，Pharm Res. ，19，1808-14；Liu等人，2003，gene Ther. ，10，180-7；Hong等人，2003，J Pharm Pharmacol. ，54，51-8；Herrmann等人，2004，Arch Virol. ，149，1611-7；和Matsuno等人，2003，gene Ther. ，10，1559-66）。
在一个实施方案中，本发明的特征在于将本发明的siNA分子递送给造血细胞，包括单核细胞和淋巴细胞的方法的用途。这些方法由Hartmann等人，1998，J. Phamacol. Exp. Ther. ，285（2），920-928；Kronenwett等人，1998，Blood ，91（3），852-862；Filion和Phillips，1997，Biochim. Biophys. Acta. ，1329（2），345-356；Ma和Wei，1996，Leuk. Res. ，20（11/12），925-930；和Bongartz等人，1994，Nucleic Acids Research ，22（22），4681-8详细描述。
在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如本领域一般已知的直接或地方性地（例如，局部地）施用于真皮或滤泡（参见例如Brand，2001，Curr. Opin. Mol. Ther. ，3，244-8；Regnier等人，1998， J. Drug Target ，5，275-89；Kanikkannan，2002，BioDrugs ，16，339-47；Wraight等人，2001，Pharmacol. Ther. ，90，89-104；和Preat和Dujardin，2001，STP PharmaSciences，11，57-68）。在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物直接或地方性地施用，其中使用包含醇（例如，乙醇或异丙醇）、水且任选包括另外试剂例如肉豆蔻酸异丙酯和卡波姆980的含水醇凝胶制剂。在其他实施方案中，siNA配制为局部施用于鼻腔。局部制剂可以通过每天一次或多次应用施用于受累区域；在皮肤区域上可以有利地使用封闭敷料。连续或延长递送可以通过粘着储库系统达到。
在一个实施方案中，本发明的siNA分子离子电渗地例如施用于特定器官或区室（例如，眼、眼后、心脏、肝、肾、膀胱、前列腺、肿瘤、CNS等）。离子电渗疗法递送的非限制性例子在例如WO 03/043689和WO 03/030989中得到描述，所述专利整体引入本文作为参考。
在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如本文描述和如本领域一般已知的施用于肺。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如美国专利公开号2006/0062758；2006/0014289；和2004/0077540中描述的施用于肺组织和细胞。
2. 气溶胶和递送装置
a. 气溶胶制剂
单独或与其他合适组分组合的本发明的组合物可以制备成气溶胶制剂（即，它们可以是“喷雾状的”），以经由吸入施用（例如鼻内或气管内）（参见Brigham等人，Am. J. Sci. ，298:278（1989））。气溶胶制剂可以置于增压可接受的抛射剂内，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂经由肺递送施用，例如通过经由吸入设备或喷雾器施用的气溶胶或喷雾干燥制剂的吸入，从而提供核酸分子快速的局部摄取进入相关肺组织内。包含微粉化核酸组合物的可吸收干燥颗粒的固体微粒组合物可以通过下述制备：将干燥或冻干的核酸组合物研磨，且随后使微粉化组合物通过例如400目筛以破碎或分出大附聚物。包含本发明的siNA组合物的固体微粒组合物可以任选包含分散剂，所述分散剂用于促进气溶胶以及其他治疗化合物的形成。合适的分散剂是乳糖，其可以与核酸化合物以任何合适的比值例如按重量计的1：1比值掺合。
包含本发明的siNA分子或组合物的喷雾组合物可以例如配制为水溶液或悬浮液，或配制为由增压包例如计量吸入器递送的气溶胶，使用合适的液化抛射剂。在一个实施方案中，适合于吸入的本发明的气溶胶组合物可以是悬浮液或溶液，并且一般包含siNA分子（其包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4918、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：5107、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：5109、SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：5064的至少15个核苷酸序列；或式（A））和合适的抛射剂，例如碳氟化合物或含氢含氯氟烃或其混合物，特别是氢氟烷，特别是1,1,1,2-四氟乙烷、1,1,1,2,3,3,3-六氟正丙烷或其混合物。气溶胶组合物可以任选包含本领域众所周知的另外配制赋形剂，例如表面活性剂。非限制性例子包括油酸、卵磷脂或寡聚乳酸或衍生物例如WO94/21229和WO98/34596中所述的那些、和共溶剂例如乙醇。在一个实施方案中，本发明的药物气溶胶制剂包括本发明的化合物和碳氟化合物或含烃含氯氟烃或其混合物作为抛射剂，任选与表面活性剂和/或共溶剂组合。
本发明的气溶胶制剂可以通过加入合适缓冲剂进行缓冲。
气溶胶制剂可以包括任选的添加剂，包括防腐剂，如果制剂未制成无菌的。非限制性例子包括羟苯甲酯、抗氧化剂、矫味剂、挥发性油、缓冲剂和乳化剂及其他制剂表面活性剂。在一个实施方案中，碳氟化合物或全氟化碳载体用于减少降解且提供本发明的组合物（例如siNA和/或其LNP制剂）更安全的生物相容性非液体微粒悬浮液。在另一个实施方案中，包括喷雾器的装置递送包括含氟化合物的本发明的组合物（例如siNA和/或其LNP制剂），所述含氟化合物是抑菌的，从而减少在相容装置中的微生物生长可能性。
可以配制用于在例如胶质的吸入器或吹入器中使用的包括本发明组合物的胶囊和药液筒，其包含用于吸入本发明的化合物和合适粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。在一个实施方案中，每个胶囊或药液筒含有siNA分子和一种或多种赋形剂，所述siNA分子包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4918、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：5107、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：5109、SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：5064的至少15个核苷酸序列；或式（A）。在另一个实施方案中，本发明的化合物可以不含赋形剂例如乳糖呈现。
本发明的气溶胶组合物可以作为包括可吸收大小的颗粒的制剂施用到呼吸系统内，例如大小足够小的颗粒以在吸入后经过鼻、口和喉以及通过肺的支气管和肺泡。一般而言，可吸收粒子大小为约0.5 - 10微米。在一个实施方案中，微粒范围可以是1 – 5微米。在另一个实施方案中，微粒范围可以是2 – 3微米。包括在气溶胶中的不可吸收大小的颗粒倾向于沉积在喉中且被吞咽，并且气溶胶中不可吸收颗粒的量因此降到最低。对于鼻施用，10 - 500 um的粒度是优选的，以确保保留在鼻腔中。
在一些实施方案中，本发明的siNA组合物局部施用于鼻例如用于治疗鼻炎，经由通过增压泵或通过喷雾法施用于鼻的增压气溶胶制剂、水性制剂。合适的制剂含有水作为稀释剂或载体用于这个目的。在特定实施方案中，用于将本发明的组合物施用于肺或鼻的水性制剂可以与常规赋形剂例如缓冲试剂、张度修饰剂等一起提供。
b. 装置
本发明的siNA分子可以如上文讨论的作为颗粒和/或气溶胶配制和递送，并且由通过本领域技术人员已知的多种气溶胶化装置分配。
包含本发明的siNA分子或制剂的液体或非液体颗粒的气溶胶可以通过任何合适方法产生，例如用包含喷雾器的装置（参见例如美国专利4,501,729）例如超声或空气喷射喷雾器。
包含本发明的siNA分子或制剂和表面活性剂的固体颗粒气溶胶可以由任何固体微粒气溶胶发生器产生。与本发明的siNA分子一起使用的一类固体颗粒气溶胶发生器是吹入器。第二类举例说明性气溶胶发生器包含计量吸入器（“MDI”）。含有本文教导的siNA分子或制剂的MDIs可以通过本领域方法进行制备（例如参见Byron上文和WO96/32099）。
siNA分子也可以配制为液体制剂用于由液体分配器递送，例如WO05/044354中描述且举例说明的那些。
在本发明的特定实施方案中，喷雾器装置在用于有意识、自主呼吸的受试者和用于所有年龄的控制通气（ventilated）受试者的应用中使用。喷雾器装置可以用于对于肺的靶向局部和全身性药物递送。在一个实施方案中，包括喷雾器的装置用于将本发明的siNA分子或制剂局部递送至肺或肺组织。在另一个实施方案中，包含喷雾器的装置用于全身递送本发明的siNA分子或制剂。
H. 本发明的siNA分子的其他应用/用途
本发明的siNA分子也可以用于诊断应用、研究应用和/或药物的制造。
在一个方面，本发明的特征在于用于诊断受试者中的疾病、性状或状况的方法，其包括在适合于诊断受试者中的疾病、性状或状况的条件下，给受试者施用本发明的组合物。
在一个实施方案中，本发明的siNA分子用于下调或抑制起于单元型多态性的CTNNB1蛋白质的表达，所述单元型多态性与受试者或生物中的性状、疾病或状况相关。CTNNB1基因、或CTNNB1蛋白质或RNA水平的分析可以用于鉴定具有此类多态性的受试者或处于发展本文描述的性状、状况或疾病的危险中的那些受试者。这些受试者顺应这样的治疗，例如用本发明的siNA分子和在治疗与靶基因表达相关的疾病中有用的任何其他组合物的治疗。照这样，CTNNB1蛋白质或RNA水平的分析可以用于确定受试者治疗中的治疗类型和疗程。CTNNB1蛋白质或RNA水平的监控可以用于预测治疗结果和测定化合物和组合物的效力，所述化合物和组合物调节与性状、病症、状况或疾病相关的某些CTNNB1蛋白质的水平和/或活性。
在另一个实施方案中，本发明包括根据本发明的双链核酸用于在药物制备中使用的用途。在一个实施方案中，药物用于在治疗通过CTNNB1的作用或通过CTNNB1作用的丧失介导的状况中使用。在一个实施方案中，药物用于治疗癌症的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗选自下述的癌症的用途：脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、白血病、肝细胞癌、肺癌、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤和胃癌。在特定实施方案中，本发明的化合物对于治疗肝细胞癌有用。
在特定实施方案中，其中至少一条链包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4918、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：5107、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：5109、SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：5064的至少15个核苷酸序列；或式（A）的siNAs用于在治疗癌症的方法中使用，例如但不限于脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、白血病、肝细胞癌、肺癌、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤和胃癌。
I. 实施例
本发明现在用下述非限制性例子举例说明。本领域技术人员将容易认识到可以改变或修饰以获得基本上相同的结果的多种非关键参数。
实施例1：针对CTNNB1活性的siNAs的设计、合成和鉴定
CTNNB1siNA 合成
针对CTNNB1基因表达设计、合成且就功效评估一系列siNA分子。通过美国申请号60/182,604中所示的方法设计且选择特定CTNNB1序列。使用有专利权的算法设计且选择其他序列。关于人siNAs的特定CTNNB1序列设计的主要标准是（i）在两个物种（人和恒河猴）之间的同源性，和（ii）如通过有专利权的算法通过测定的高功效得分。siNAs对CTNNB1 RNA水平的作用。选择的siNAs的靶序列在表1a（靶序列）中显示。对应于表1a中的靶序列的siNA序列的有义和反义链在表1b中显示。合成的多种化学修饰的siNAs在表1c中显示。
表1a：CTNNB1靶序列，指出人靶位点。
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表1b. 对应于表1a中鉴定的靶序列的多种c-CTNNB1 siNA有义和反义序列。
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对于靶序列的每种寡核苷酸，使用固相合成分开合成siNA的两条个别的、互补链，随后通过反相固相提取（SPE）分开纯化。使互补链退火以形成双链（双链体）且以所需浓度和在选择的缓冲液中递送。
简言之，使用如本领域一般已知的程序（参见例如美国申请号12/064,014），使用亚磷酰胺化学法在自动化固相合成仪上合成单链寡核苷酸。将合成柱装满由第一个核苷残基（天然或合成修饰的）衍生的固体支持体。通过酸不稳定的5'-O-二甲氧三苯甲基的脱三苯甲基作用以释放5'-羟基来起始合成。将溶于乙腈的适当保护的亚磷酰胺和合适的活化剂同时递送给合成柱，从而导致亚酰胺（amidite）与5'-羟基的偶联。随后用溶剂例如乙腈洗涤柱。将氧化溶液例如碘溶液泵过柱以使亚磷酸三酯键P（III）氧化成其磷酸三酯P（V）类似物。在2,6-二甲基吡啶和N-甲基咪唑的存在下，未反应的5'-羟基使用试剂例如乙酸酐进行加帽。对于下一个亚磷酰胺掺入，延伸循环由脱三苯甲基作用步骤重新开始。重复这个过程直至所需序列合成。用最后的5’末端保护基团（三苯甲基或5’-O-二甲氧三苯甲基）终止合成。
在合成结束时，将固体支持体和结合的寡核苷酸在氩压力或真空下干燥。添加水基且使混合物加热，以实现琥珀酰键的切割、氰乙基磷酸保护基团的去除和环外胺保护的脱保护。
对不包含核糖核苷酸的单链执行下述过程：用水基处理固体支持体后，过滤混合物以使固体支持体和脱保护的粗合成材料分开。随后用水漂洗固体支持体，将其与滤液组合。所得到的碱性溶液允许保留5’-O-二甲氧三苯甲基，以保留在5'末端位置上（带有三苯甲基）。
对于包含核糖核苷酸的单链，执行下述过程：用水基处理固体支持体后，过滤混合物以使固体支持体和脱保护的粗合成材料分开。随后用二甲基亚砜（DMSO）漂洗固体支持体，将其与滤液组合。将氟化物试剂例如三氢氟酸三乙胺加入混合物中，并使溶液加热。用合适的缓冲液猝灭反应，以提供在最后的5'末端位置上具有5’-O-二甲氧三苯甲基基团的粗制单链的溶液。
每种粗制单链的带有三苯甲基的溶液使用层析纯化例如SPE RPC纯化进行纯化。三苯甲基的疏水性允许所需全长寡核苷酸比非三苯甲基化的截短失败序列的更强保留。失败序列用合适溶剂例如低百分比乙腈从树脂中选择性洗涤。随后将保留的寡核苷酸在柱上用三氟乙酸脱三苯甲基化，以去除酸不稳定的三苯甲基。将残留酸从柱中洗涤，执行盐交换，并且开始材料的最后脱盐。全长寡核苷酸以纯化形式用水性有机溶剂回收。随后就纯度（HPLC）、同一性（Maldi-TOF MS）和收率（UV A260）分析最终产物。经由冻干或真空冷凝使寡核苷酸干燥。
退火：基于产物的分析，将干燥的寡核苷酸溶解于合适缓冲液中，随后为混合等摩尔量的（使用理论消光系数计算的）有义和反义寡核苷酸链。随后通过层析法就双链体的纯度和所需终浓度分析溶液。如果分析指出任一链的过量，那么滴定另外的非过量链直至双链体形成完成。当分析指出已达到靶产物纯度时，将材料递送且准备使用。
下文是显示使用这个方案合成的或可以使用这个方案或使用本领域已知的方法合成的多种修饰siNAs的表。
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其中：
A、C、G和U = 核糖A、C、G或U
a、g、c和u = 2'-脱氧-2'-氟 A、G、C或U
A、U、C和G = 2'-O-甲基（2'-OMe）A、U、C或G
A、U 、 C 和 G = 脱氧A、U、C或G
B = 反向脱碱基的
T = 胸苷
I = 肌苷
s = 硫代磷酸酯键。
用于商业制剂的进一步合成步骤
当分析指出在退火步骤后已达到靶产物纯度时，与在退火步骤前做到这点相反，将材料转移至切向流过滤（TFF）系统用于浓缩和脱盐。
超滤：退火的产物溶液使用包含合适的分子量截止膜的TFF系统进行浓缩。浓缩后，产物溶液经由渗滤使用Milli-Q水进行脱盐，直至滤液的传导性是水的那种。
冻干：将浓缩的溶液转移至瓶，速冻且附着至冷冻干燥机。随后将产物冷冻干燥成粉末。从冷冻干燥机中取出瓶且现在准备使用。
初期筛选方案（ 96 孔板转染）
细胞培养物制备：
使人肝瘤细胞系HepG2、猕猴肾上皮细胞系LLC-MK2衍生物和Huh7细胞系在改良伊格尔培养基中生长。所有培养基都补充有10%胎牛血清、100µg/mL链霉素、100U/mL青霉素和1%碳酸氢钠。
转染和筛选
以在100μL合适培养基中3500（（HepG2和LLC-MK2衍生物和Huh7）细胞/孔的最终计数，将细胞铺平板到组织培养物处理的96孔板的所有孔中。在5% CO2的存在下，在37℃铺平板后，将细胞培养过夜。
在第二天时，如下制备含有siNA和RNAiMax（Invitrogen）的复合物。制备在OPTI-MEM中33倍稀释的RNAiMax溶液。平行地，在OPTI-MEM中以120 nM终浓度制备用于测试的siNA溶液。在RNAiMax/OPTI-MEM溶液在室温孵育5分钟后，对于每种siNA一起加入相等体积的siNA溶液和RNAiMax溶液。
混合导致其中siNA浓度是60 nM的siNA/RNAiMax溶液。将这种溶液在室温温育20分钟。在温育后，将20 μL溶液加入有关孔各自中。siNA在每个孔中的终浓度是10 nM，并且RNAiMax在每个孔中的终体积是0.3ul。
对于低浓度筛选，将siNAs以200、150、100或75pM/孔转染。对于12点剂量应答曲线研究，将siNA系列以30nM开始6倍系列稀释，或以40nM开始4倍系列稀释。所有转染设置为多重生物学重复。
与RNAiMax-siNA复合物的温育时间是24小时，并且在转染和收获用于筛选和剂量应答曲线研究之间不存在培养基更换。对于持续时间测定，与RNAiMax-siNA复合物的温育时间是24、72和120小时。对于24和72小时时间点，在转染和收获之间不存在培养基更换。对于120小时时间点，在转染后72小时将培养基替换为新鲜培养基。
Cells-to-Ct 和逆转录反应
在所需时间点，将培养基从培养板的孔中抽吸且弃去。将转染细胞用50uL DPBS溶液/孔洗涤一次。将五十微升/孔的补充有DNA酶I的来自TaqMan® Gene Expression Cells-to-CT™ Kit（Applied Biosystems，目录# 4399002）的裂解溶液直接加入板中，以裂解细胞。在5分钟后，将五十微升/孔的来自相同试剂盒的停止液加入板中，以灭活D酶I。将裂解板在室温温育至少2分钟。板可以在4℃贮存2小时或在-80℃贮存2个月。
逆转录板的每个孔需要10uL 2X逆转录酶缓冲液、1uL 20X逆转录酶和2uL无核酸酶水。通过混合2X逆转录酶缓冲液、20X逆转录酶混合物和无核酸酶水制备逆转录主要（master）混合物。将13uL逆转录主要混合物分配到逆转录板（半缘）的每个孔中。对于每块细胞板制备分开的逆转录板。对于每块细胞板制备分开的逆转录板。将来自上述细胞裂解程序的七微升/裂解产物加入逆转录板的每个孔内。将板密封且在离心机上旋转（1000rpm共30秒），以使内容物沉降至逆转录板的底部。将板置于热循环仪中在37℃60分钟、95℃5分钟和4℃直至板从热循环仪中取出。在取出后，如果未立即使用，那么将板在-20℃冷冻。
对于持续时间测定，遵循相似方案，然而，在转染后1、3或5天裂解细胞。使用Cells-to-CtTM Kit（Applied Biosystems）生成cDNA。
定量 RT-PCR （ Taqman）
一系列探针和引物用于检测CTNNB1和GAPDH基因的各种miRNA转录物。用于本文描述的实验的所有Taqman探针和引物作为预验证组由Applied Biosystems，Inc.供应。（参见表2）。
表2：用于执行用于CTNNB1 mRNA分析的实时RT/PCR（Taqman）反应的探针和引物
物种 基因 ABI目录#
人 CTNNB1 Hs00355045_m1
人 GAPDH 4310884E
猕猴 GAPDH Rh02621745_g1
小鼠 CTNNB1 Mm00483033_m1
小鼠 GAPDH 4352339E
根据制造商的说明书，在ABI 7900仪器上执行测定。使用TaqMan Gene Expression Master Mix（在Cells-to-CT™ Kit中提供，Applied Biosystems，目录#4399002）。PCR反应在50℃执行2分钟，95℃ 10分钟，随后为在95℃ 15秒和60℃ 1分钟的40个循环。
在每次实验内，基线设置在扩增曲线的指数期，并且基于基线与扩增曲线的交叉点，通过仪器指定Ct值。
计算
使用比较Ct方法计算目的基因的表达水平和基因表达的%抑制（%KD）：
ΔCt = Ct 靶 – Ct GAPDH
ΔΔCt（log2（倍数变化））= ΔCt（靶 siNA ）– ΔCt（ NTC ）
相对表达水平= 2- ΔΔ Ct
% KD = 100 x（1 - 2- ΔΔ Ct）。
除非另有说明，选择非靶向对照siNA作为针对其计算基因表达的百分比抑制（击倒）的值，因为它是最有关的对照。
另外，仅检查反映细胞的一般健康和RNA提取的质量的标准化数据。这通过察看处理细胞中两种不同mRNAs的水平完成，第一种是靶mRNA，并且第二种是标准物mRNA。这允许消除可能潜在地对于细胞毒性的siNAs，而不是仅仅击倒目的基因。这通过关于整个板相对于GAPDH Ct比较每个孔中关于GAPDH的Ct来完成。
使用R.2.9.2软件执行所有IC50s计算。对于简单配体结合使用S形剂量应答（变量斜度）等式分析数据。在百分比抑制（击倒）的所有计算中，相对于用非靶向对照（对照siNA）处理的样品中目的基因表达的标准化水平进行计算，除非另有说明。
根据设备的那个部分的方案，使用Bio-Rad VersaDoc Imager定量蛋白质水平。使用相等大小的面积，在每个泳道中执行像素计数。每个样品随后与合适对照处理的样品相比较，且转换为与对照相比较保留的蛋白质百分比。
使用双尾斯氏T检验，使前导siNAs对CTNNB1蛋白质水平的作用与通用对照的作用相比较，以获得P值。P < 0.05视为显著的。
结果：
如先前所述设计且合成CTNNB1 siNAs。在HepG2、MK2D和Huh7细胞中筛选多种siNAs。在人细胞中在用多种修饰CTNNB1siNAs处理后，CTNNB1基因表达中的log 2（倍数变化）显示于表3a中。每次筛选在24小时时执行。定量RT-PCR用于估计CTNNB1 mRNA的水平，并且数据针对GAPDH（遍在表达的‘看家’基因）的表达水平标准化。每个处理随后针对非CTNNB1靶向对照标准化。
表3a：记录为CTNNB1基因表达中的log 2（倍数变化），在HepG2细胞、MK2D细胞和Huh7细胞（n = 2）中的初步筛选数据。
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在初步筛选中具有大log 2（倍数变化）的来自表3a的siNAs子集在Huh7细胞中再筛选。结果显示于表3b中。
表3b：记录为CTNNB1基因表达中的log 2（倍数变化），在Huh7细胞（n = 2）中的初步筛选数据。
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如先前所述设计且合成CTNNB1 siNAs。在MK2D细胞中筛选多种siNAs。在人细胞中在用多种修饰CTNNB1siNAs处理后，CTNNB1基因表达中的log 2（倍数变化）显示于表3c中。每次筛选在24小时时执行。定量RT-PCR用于估计CTNNB1 mRNA的水平，并且数据针对GAPDH（遍在表达的‘看家’基因）的表达水平标准化。每个处理随后针对非CTNNB1靶向对照标准化。
表3c：记录为CTNNB1基因表达中的log 2（倍数变化），在MK2D细胞（n = 2）中的初步筛选数据。
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使用剂量应答曲线，就Huh7细胞中的功效和效力进一步分析由表3a和3b选择的高排序siNAs。关于这些siNAs的结果显示于表4中。效力50是产生50%靶mRNA击倒的计算的siNA转染浓度。在24小时暴露时间后测定IC50。
表4：在Huh细胞中关于多种siNAs的剂量应答数据。由剂量应答曲线测定计算的最大ΔΔCt。
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使用剂量应答曲线，就MK2D细胞中的功效和效力进一步分析来自表3a和3b的另外siNAs。关于这些siNAs的结果显示于表5中。效力50是产生50%靶mRNA击倒（knockdown）的计算的siNA转染浓度。在24小时暴露时间后测定IC50。
表5：在MK2D细胞中关于多种siNAs的剂量应答数据。由剂量应答曲线测定计算的最大ΔΔCt。
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实施例2：测定siNAs的体外血清稳定性
将siNAs用H2O重构为50μM - 100μM原液，并且加入预温至37℃的人血清至20μg/mL的终浓度。随后将混合物在37℃温育0、1和2小时。在每个时间点结束时，通过混合相等体积的Phenomenex裂解-加样缓冲液停止反应。通过Phenomenex固相提取在96孔形式中纯化寡核苷酸，并且冻干直至用Labconco Triad Lyo-00417干燥。在用无RNA酶H2O制备的150 μL 1 mM EDTA中重构冻干样品。随后将样品溶液用1 mM EDTA再稀释5倍，用于在ThermoFisher Orbitrap上的液体层析/质谱法（LC/MS）分析。基于测量的分子量测定siNAs的血清代谢产物。
实施例3：细胞因子诱导的测试
为了估计在液体纳米颗粒（以40/48/2/10比值的DLinDMA/胆固醇/ S-PEG-C-DMA/DSPC）中装载的本发明的多种siNAs的免疫刺激作用，将C57Bl/6小鼠通过尾静脉注射用单个3mpk剂量的LNP配制的siNAs给药。在给药后3和24小时收集血清或血浆样品。根据制造商的说明书，用来自Aushon Biosciences的SearchLight IR Cytokine Array测量在这些样品中的细胞因子和趋化因子水平。测量的细胞因子和趋化因子是IL-1α、IL-1β、IL-6、KC、IL-10、IFNγ、TNF、GMCSF、MIP-1β、MCP-1/JE和RANTES。
实施例4：在小鼠中的功效研究
使用2个不同的3周给药方案将小鼠经由尾静脉注射LNP封装的siNAs或媒介物对照IV给药：一个1 mg/kg剂量共连续3天或单个6 mg/kg剂量/周。在一些实验中，将小鼠用索拉非尼以100 mg/kg的剂量共给药，每天BID，共3周。通过显微CT扫描成像测量总肿瘤负荷。在最后一个siNA剂量后5天（第23天）处死动物，并且收集来自每只动物的正常肝和肿瘤组织用于RNA纯化。使用RNeasy 96试剂盒（Qiagen，目录# 74182）纯化总RNA。使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（目录#：4368813）由总RNA生成cDNA。用TaqMan Universal PCR Master Mix（目录#：4304437）执行定量PCR反应。人CTNNB1 TaqMan Gene Expression Assay（Hs00355045_m1）和人GAPDH TaqMan Gene Expression Assay用于监控肿瘤组织中的两种转录物的mRNA水平。小鼠CTNNB1 TaqMan Gene Expression Assay（Mm00483033_m1）和小鼠GAPDH TaqMan Gene Expression Assay用于监控肝组织中的两种转录物的mRNA水平。CTNNB1的表达水平针对GAPDH标准化，以使技术变异降到最低。
实施例5：在非人灵长类动物中的药效研究
将恒河猴用单个2.5mpk剂量的siNA装载的脂质纳米颗粒通过静脉内输注给药。为了监控靶mRNA击倒，在剂量前和后的多个时间点用16T号Menghini针执行肝活组织检查，共约20mg组织/动物。全血和血清/血浆也在剂量前和后的多个时间点收集，以监控与处理有关的潜在毒性。所有程序都坚持USDA Animal Welfare Act（9 CFR，部分1、2和3）中概述的条例和The Guide for Care and Use of Laboratory Animals（ILAR publication，1996，National Academy Press）中指定的条件。使用RNeasy 96试剂盒（Qiagen，目录# 74182）纯化来自肝活组织检查组织的总RNA。使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（目录#：4368813），由总RNA生成cDNA。用TaqMan Universal PCR Master Mix（目录#：4304437）执行定量PCR反应。人CTNNB1 TaqMan Gene Expression Assay（Hs00355045_m1）和猕猴GAPDH TaqMan Gene Expression Assay（Rh02621745_g1）用于监控肝活组织检查组织中的两种转录物的mRNA水平。CTNNB1的表达水平针对GAPDH标准化，以使技术变异降到最低。
测试包含siNA的LNP制剂（以40/48/2/10比值的DLinDMA/胆固醇/S-PEG-C-DMA/DSPC）。在给药后第3、7、14和28天测定CTNNB1基因表达中的Log2（倍数变化）。在第一次给药前7天测量关于猴的剂量前CTNNB1表达水平。
实施例6：在小鼠中的药效研究
使用单个0.33 mg/kg将小鼠经由尾静脉注射LNP封装的siNAs或媒介物对照IV给药。在siNA剂量后2、7、14和21天处死接受每种处理的五只动物，并且收集来自每只动物的肝组织用于RNA纯化。使用RNeasy 96试剂盒（Qiagen，目录# 74182）纯化总RNA。使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（目录#：4368813）由总RNA生成cDNA。用TaqMan Universal PCR Master Mix（目录#：4304437）执行定量PCR反应。小鼠CTNNB1 TaqMan Gene Expression Assay（Mm00483033_m1）和小鼠GAPDH TaqMan Gene Expression Assay用于监控两种转录物的mRNA水平。CTNNB1的表达水平针对GAPDH标准化，以使技术变异降到最低。数据显示于表6中。
表6：记录为CTNNB1基因表达中的log 2（倍数变化），在C57Bl/6小鼠中的体内筛选数据。
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实施例7：在非人灵长类动物中的药效研究
将恒河猴用单个3.34 mg/m2体表面积剂量的siNA装载的脂质纳米颗粒通过静脉内输注给药。为了监控靶mRNA击倒，在剂量前和后的多个时间点用16T号Menghini针执行肝活组织检查，共约20mg组织/动物。全血和血清/血浆也在剂量前和后的多个时间点收集，以监控与处理有关的潜在毒性。所有程序都坚持USDA Animal Welfare Act（9 CFR，部分1、2和3）中概述的条例和The Guide for Care and Use of Laboratory Animals（ILAR publication，1996，National Academy Press）中指定的条件。使用RNeasy 96试剂盒（Qiagen，目录# 74182）纯化来自肝活组织检查组织的总RNA。使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（目录#：4368813），由总RNA生成cDNA。用TaqMan Universal PCR Master Mix（目录#：4304437）执行定量PCR反应。人CTNNB1 TaqMan Gene Expression Assay（Hs00355045_m1）和猕猴GAPDH TaqMan Gene Expression Assay（Rh02621745_g1）用于监控肝活组织检查组织中的两种转录物的mRNA水平。CTNNB1的表达水平针对GAPDH标准化，以使技术变异降到最低。数据显示于表7中。测试包含siNA的LNP制剂（以40/48/2/10比值的DLinDMA/胆固醇/S-PEG-C-DMA/DSPC）。在给药后第2和7天测定CTNNB1基因表达中的Log2（倍数变化）。在第一次给药前6天测量关于猴的剂量前CTNNB1表达水平。
表7：记录为CTNNB1基因表达中的log 2（倍数变化），在猕猴中的体内筛选数据。
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实施例8：短干扰核酸脂质纳米颗粒（LNP）制剂
A. 用于 LNP 制剂的一般 LNP 过程描述：
通过碰撞射流过程制备脂质纳米颗粒。通过混合溶解于醇中的脂质与溶解于柠檬酸盐缓冲液中的siNA形成颗粒。脂质溶液含有阳离子脂质、辅助脂质（胆固醇）、PEG（例如PEG-C-DMA，PEG-DMG）脂质、和以5-15 mg/mL浓度的DSPC与溶于醇（例如乙醇）的9-12 mg/mL靶。脂质的比值对于阳离子脂质具有25-98的摩尔百分比范围伴随35-65的靶，辅助脂质具有0-75的摩尔百分比范围伴随30-50的靶，PEG脂质具有1-15的摩尔百分比范围伴随1-6的靶，并且DSPC具有0-15的摩尔百分比范围伴随0-12的靶。siNA溶液含有在具有pH 3.5-5范围中的柠檬酸钠缓冲的盐溶液中以0.3 - 0.6 mg/mL浓度范围的一种或多种siNA序列，伴随0.3 -0.9 mg/mL的靶。将两种溶液加热至在15-40℃范围中的温度，靶向30-40℃，并且随后在碰撞射流混合器中混合，立即形成LNP。teeID具有0.25 - 1.0 mm的范围，和10-600 mL/分钟的总流速。流速和管道ID的组合具有将LNPs的粒子大小控制在30 - 200 nm之间的作用。随后将LNP悬液与以更高pH的缓冲溶液混合，具有在1:1 - 1:3体积:体积范围中的混合比值，但靶向1:2体积:体积。这种缓冲溶液在15-40℃范围中的温度，靶向30-40℃。将这种LNP悬液与以更高pH的缓冲溶液进一步混合，具有在1:1 - 1:3体积:体积范围中的混合比值，但靶向1:2体积:体积。这种缓冲溶液在15-40℃范围中的温度，靶向30-40℃。在阴离子交换过滤步骤之前，将混合LNPs保持30分钟 – 2小时。在温育过程中的温度在15-40℃范围中，靶向30-40℃。在温育后，将LNP悬液通过含有0.8 um滤器的阴离子交换分离步骤过滤。这个过程使用范围为1 mm ID - 5 mm ID的管道IDs和0 - 2000 mL/分钟的流速。将LNPs浓缩且经由超滤过程渗滤，其中去除醇且将柠檬酸盐缓冲液交换为最终缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。超滤过程使用切向流过滤形式（TFF）。这个过程使用30 -500 KD的膜额定分子量筛截范围。膜形式具有空心纤维或扁平层盒。具有合适分子量筛截的TFF过程将LNP保留在渗余物中，并且滤液或渗透物含有醇；柠檬酸盐缓冲液；和最终缓冲液废物。TFF过程是具有最初浓度至1 -3 mg/mL的siNA浓度的多步过程。在浓缩后，将LNP悬液针对最终缓冲液渗滤10 -20体积，以去除醇且执行缓冲液更换。随后将材料浓缩另外1-3倍。LNP过程的最后步骤是无菌过滤浓缩的LNP溶液和将产物装瓶。
分析程序：
1）siNA浓度
使用具有2996 PDA检测器的Waters 2695 Alliance系统（Water Corporation，Milford MA），通过强阴离子交换高效液相层析（SAX-HPLC）测定siNA双链体浓度。在另外称为RNAi递送媒介物（RDVs）的LNPs用0.5% Triton X-100处理，以释放总siNA，并且使用Dionex BioLC DNAPac PA 200（4 × 250 mm）柱伴随在254 nm的UV检测，通过SAX分离分析。流动相由下述组成：A：25 mM NaClO4、10 mM Tris、20% EtOH，pH 7.0和B：250 mM NaClO4、10 mM Tris、20% EtOH，pH 7.0，具有0-15分钟的线性梯度和1 ml/分钟的流速。通过与siNA标准曲线相比较来测定siNA量。
2）封装率
荧光试剂SYBR Gold用于RNA定量，以监控RDVs的封装率。含或不含Triton X-100的RDVs用于测定游离siNA和总siNA量。使用来自Molecular Devices（Sunnyvale，CA）的SpectraMax M5e微板分光光度计执行测定。在485 nm激发样品，并且在530 nm测量荧光发射。通过与siNA标准曲线相比较来测定siNA量。
封装率=（1- 游离siNA/总siNA）×100%。
3）粒子大小和多分散性
将含有1 μg siNA的RDVs用1 × PBS稀释至3 ml的最终体积。使用ZetaPALS仪器（Brookhaven Instruments Corporation，Holtsville，NY），通过动态光散射方法测量样品的粒子大小和多分散性。用He–Ne激光器在25℃伴随90°的散射角测量散射强度。
4）ζ电位分析
将含有1 μg siNA的RDVs用1 mM Tris缓冲液（pH 7.4）稀释至2 ml的最终体积。使用具有电极和He–Ne激光器作为光源的ZetaPALS仪器（Brookhaven Instruments Corporation，Holtsville，NY），测定样品的电泳迁移率。在ζ电位的计算中假定Smoluchowski限制。
5）脂质分析
使用具有Corona荷电气溶胶检测器（CAD）（ESA Biosciences，Inc，Chelmsford，MA）的Waters 2695 Alliance系统（Water Corporation，Milford MA），通过反相高效液相层析（RP-HPLC）测定个别液体浓度。使用具有CAD的Agilent Zorbax SB-C18（50 × 4.6 mm，1.8 μm粒子大小）柱在60℃分析在RDVs中的个别液体。流动相由下述组成：A：0.1% TFA的H2O溶液和B：0.1% TFA的IPA溶液。梯度从时间0的60%流动相A和40%流动相B变成在1.00分钟时的40%流动相A和60%流动相B；从1.00到5.00分钟的40%流动相A和60%流动相B；从5.00分钟的40%流动相A和60%流动相B到10.00分钟时的25%流动相A和75%流动相B；从10.00分钟的25%流动相A和75%流动相B到15.00分钟时的5%流动相A和95%流动相B；和从15.00的5%流动相A和95%流动相B到20.00时的60%流动相A和40%流动相B，具有1 ml/分钟的流速。通过比较具有在RDVs中的所有脂质组分的标准曲线与二次曲线拟合来测定个别脂质浓度。每种脂质的摩尔百分比基于其分子量进行计算。
B. 关于表 11 中的多种制剂的一般 LNP 制剂
表11中的siNA纳米颗粒悬液通过将siNA和/或载体分子以约0.40 mg/mL的浓度溶解于20 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 5.0）中进行制备。脂质溶液通过将阳离子脂质（例如（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺，参见表12中的结构）、DSPC、胆固醇和PEG-DMG（表11中所示的比值）的混合物以约8 mg/mL的浓度溶解于无水乙醇中进行制备。氮与磷酸盐比值是接近6:1。
接近相等体积的siNA/载体和脂质溶液用2个FPLC泵以相同流速递送至混合T形连接器。背压阀用于调整至所需粒度大小。所得到的乳状混合物收集在无菌玻璃瓶中。随后用相等体积的柠檬酸盐缓冲液稀释这种混合物，随后为相等体积的PBS（pH 7.4），并且通过离子交换膜过滤，以去除混合物中的任何游离siNA/载体。针对PBS（7.4））的超滤用于去除乙醇，且更换缓冲液。最终LNP通过浓缩至所需体积获得，并且通过0.2 μm滤器无菌过滤。所获得的LNP就粒度大小、ζ电势、含醇量、总脂肪含量、封装的核酸和总核酸浓度而言进行表征。
LNP 制备过程
在一个非限制性例子中，LNPs如下批量制备。过程由下述组成：（1）制备脂质溶液；（b）制备siNA/载体溶液；（3）混合/粒子形成；（4）孵育；（5）稀释；（6）超滤和浓缩。
1. 脂质溶液的制备
将2L玻璃试剂瓶和量筒去热原。将脂质加温至室温。用移液管向玻璃试剂瓶内转移8.0g（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺，并且加入1.2g DSPC、3.5g胆固醇、0.9g PEG-DMG。向混合物中加入1L乙醇。将试剂瓶置于在不超过50℃温度的加热水浴中。将脂质悬液用搅拌棒搅拌。将热电偶探头通过具有密封衔接头的圆底烧瓶的一个颈放入悬液内。将悬液在30-40℃加热直至它变得澄清。允许溶液冷却至室温。
2. siNA/载体溶液的制备
向无菌容器（Corning贮存瓶）内称重水校正因子（约1.2）0.4g倍的siNA粉末。将siNA转移至去热原的2 L玻璃试剂瓶。用柠檬酸盐缓冲液（20mM，pH 5.0）将称重容器冲洗3x，并且将冲洗液置于2 L玻璃瓶内，用柠檬酸盐缓冲液QS至1 L。使用下述程序，用UV分光计测定siNA溶液的浓度。从溶液中取出20 μL，稀释50倍至1000 μL，并且在用柠檬酸盐缓冲液成为空白后，记录在A260 nm的UV读数。重复这个操作。应当指出，如果关于两个样品的读数是一致的，那么可以获得平均值且基于siNA的消光系数计算浓度。如果终浓度超出0.40 ± 0.01 mg/mL的范围，那么可以通过加入更多siNA/载体粉末或加入更多柠檬酸盐缓冲液调整浓度。在可应用时，可以对于第二种siNA重复这个过程。
当siNA/载体溶液包含单个siNA双链体代替两种或多种siNA双链体和/或载体的混合物（cocktail）时，那么将siNA/载体溶解于20 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 5.0）中，以给出0.4 mg/mL的终浓度。
随后使用Master 蠕动泵型号7520-40，将脂质和乙醇溶液通过Pall Acropak 20 0.8/0.2 µm无菌滤器PN 12203无菌过滤到去热原的玻璃容器内，以提供用于封装过程的无菌原材料。过滤过程以80 mL规模用20 cm2膜面积运行。流速是280 mL/分钟。这个过程可通过增加管道直径和过滤面积依比例决定。
3. 颗粒形成 – 混合步骤
使用双筒（two-barrel）注射器驱动泵（Harvard 33 Twin Syringe），以相等或接近相等的流速在0.5mm IDＴ型混合器（混合阶段I）中混合无菌液体/乙醇溶液和无菌siNA/载体或siNA/载体混合物/柠檬酸盐缓冲液（20 mM柠檬酸盐缓冲液，pH 5.0）溶液。所得到的出口LNP悬液含有40-50体积%乙醇。为了获得45体积%乙醇出口悬液，分别以54 mL/分钟和66 mL/分钟的流速混合无菌液体/乙醇溶液和无菌siNA/载体或siNA/载体混合物/柠檬酸盐缓冲液溶液，从而使得混合出口的总流速是120 mL/分钟。
4. 稀释
将混合阶段I的出口流直接供给到4mm IDＴ型混合器（混合阶段II）内，在其中将它用以更高pH的缓冲溶液（20 mM柠檬酸钠、300 mM氯化钠，pH 6.0）以1:1体积:体积 %的比值稀释。这种缓冲溶液在30-40℃范围中的温度，并且经由蠕动泵（Cole Parmer MasterFlex L/S 600 RPM）以120 mL/分钟的流速递送至4mm Ｔ型混合器。
将混合阶段II的出口流直接供给到6mm IDＴ型混合器（混合阶段III）内，在其中将它用以更高pH的缓冲溶液（PBS，pH 7.4）以1:1体积:体积 %的比值稀释。这种缓冲溶液在15-25℃范围中的温度，并且经由蠕动泵（Cole Parmer MasterFlex L/S 600 RPM）以240 mL/分钟的流速递送至6mm Ｔ型混合器。
5. 温育和游离siNA去除
在混合后使混合阶段III的出口流保持用于30分钟孵育。孵育在35-40℃的温度进行，并且加工中溶液避光。在温育后，用Mustang Q层析滤器（胶囊），经由阴离子交换去除游离（未封装的）siNA。在使用之前，将层析滤器用1N NaOH、1M NaCl和溶于PBS中的12.5体积%乙醇的最终溶液冲刷顺次预处理。检查最终冲刷的pH以确保pH <8。随后将温育的LNP流经由Mustang Q滤器经由蠕动泵（Cole Parmer MasterFlex L/S 600 RPM）以约100 mL/分钟的流速过滤。将过滤的流接受到无菌玻璃容器内用于如下超滤和浓缩。
6. 超滤、浓缩和无菌过滤
超滤过程是定时过程，并且必须小心地监控流速。这是两步过程；第一步是浓缩步骤，获得稀释材料且浓缩约8倍，至约0.3-0.6 mg/mL siNA的浓度。
在第一个步骤中，将已装入超滤膜100 kDa PES（Spectrum Labs）的环形支架附着至蠕动泵（Spectrum KrosFloII System）。将9.2 L无菌蒸馏水加入储库中；将3 L排干至废物并且将剩余部分通过渗透物排干至废物。将5.3 L 0.25 N氢氧化钠加入储库中，其中1.5 L排干至废物，并且3.1 L通过渗透物排干至废物。将剩余氢氧化钠保持在系统中用于消毒（至少10分钟），并且随后将泵排干。将9.2 L 70（v/v）%异丙醇加入储库中，其中1.5 L排干至废物，并且剩余部分通过渗透物至排干废物。加入6 L条件化缓冲液（溶于磷酸盐缓冲盐水中的12.5%乙醇），其中1.5 L排干至废物，并且剩余部分通过渗透物排干，直至废物具有中性pH（7-8）。记录膜流量值，并且随后排干泵。
将稀释的LNP溶液置于储库内至1.1 L标记。以2.3 L/分钟打开泵。在再循环5分钟后，以62.5 mL/分钟打开渗透物泵，并且液体水平在储库中恒定在约950 mL。将稀释的LNP溶液在140分钟内从9.8 L浓缩到1.1 L，并且当所有稀释的LNP溶液已转移至储库时，使泵暂停。
第二个步骤是渗滤步骤，将乙醇/含水缓冲液更换为磷酸盐缓冲盐水。在这个步骤过程中，使用约10-20渗滤体积的磷酸盐缓冲盐水。在渗滤后，采取第二次浓缩，以使LNP悬液3倍浓缩至约1-1.5 mg/mL siRNA。将浓缩悬液收集到无菌、塑料PETG瓶内。随后经由Pall 0.45 um PES和Pall 0.2 um PES滤器顺次过滤最终悬液，用于在小瓶填充前的终末灭菌。
所获得的LNPs就粒子大小、ζ电势、含醇量、总脂质含量、封装的核酸和总核酸浓度而言进行表征。
C. 新阳离子脂质的合成
新阳离子脂质的合成是从脂质酸（i）开始的线性过程。偶联至N,O-二甲基羟胺给出Weinreb酰胺ii。Grignard添加生成酮iii。钛介导的还原胺化给出类型iv的最终产物。
一般方案 1
Figure DEST_PATH_IMAGE218
单碳同素化的阳离子脂质v的合成是从脂质酮（iii）开始的线性过程。酮至腈（iv）的转化经由用TOSMIC和叔丁醇钾处理来完成。腈至伯胺的还原随后为还原胺化提供最终阳离子脂质v。
一般方案 2
二碳同素化的阳离子脂质viii的合成是从脂质酮（iii）开始的线性过程。酮至α,β-不饱和酰胺vi的转化在Peterson条件下完成。α,β-不饱和的共轭还原使用LS-Selectride执行，以给出酰胺vii。酰胺用氢化铝锂的还原提供最终阳离子脂质viii。
一般方案 3
Figure DEST_PATH_IMAGE220
根据一般方案4制备含环丙基脂质。对不饱和Weinreb酰胺ii实施Simmons-Smith环丙烷化条件，以给出含环丙基Weinreb酰胺ix。这些如一般方案1-3中概述的带进最终产物内。
一般方案 4
烯丙基胺阳离子脂质xv的合成是从醛x开始的线性过程。乙酸叔丁酯的添加生成β-羟基酯xi。羟基功能性至氟基团的转化随后为酸处理生成β-氟酸xii。酸至Weinreb酰胺的转化随后为Grignard添加给出β-氟酮xiv。还原胺化导致同时消除，以生成所需烯丙基胺xv。
一般方案 5
Figure DEST_PATH_IMAGE223
20,23- 二十九烷二烯 -10 胺， N,N- 二甲基 - ，（ 20Z,23Z ）（化合物 1 ）
将11,14-二十碳二烯酸，（11Z,14Z）-（50 g，162 mmol）、N,O-二甲基羟胺盐酸盐（31.6 g，324 mmol）、HOAt（44.1 g，324 mmol）、Et3N（45.2 mL，324 mmol）和EDC（62.1 g，324 mmol）在DCM（810 mL）中混合，并且在环境温度搅拌过夜。随后将反应用5 x 700 mL水洗涤，随后用1 x 600 mL 1 M NaOH洗涤，用硫酸钠干燥，通过硅藻土过滤且蒸发，以获得作为澄清金色油的53.06 g（93%） 11,14-二十碳二烯酰胺，N-甲氧基-N-甲基-，（11Z,14Z）。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 5.35（m，4H），3.68（s，3H），3.18（s，3H），2.77（m，2H），2.41（t，J = 7 Hz，2H），2.05（m，4H），1.63（m，2H），1.40-1.26（m，18H），0.89（t，J = 7 Hz，3H）。
Figure DEST_PATH_IMAGE225
将11,14-二十碳二烯酰胺，N-甲氧基-N-甲基-，（11Z,14Z）- 1（4 g，11.38 mmol）溶解于250 mL烧瓶中的无水THF（50.0 ml）中，随后在环境温度在氮下加入1 M壬基溴化镁（22.76 ml，22.76 mmol）。在10分钟后，将反应用过量饱和aq NH4Cl缓慢猝灭。将反应用己烷和水洗涤到分液漏斗内，振荡，弃去下层水层，并且将上层用硫酸钠干燥，过滤且蒸发，以给出作为金色油的粗制酮。向上述粗制酮中加入二甲胺（2 M的THF溶液）（14.22 ml，28.4 mmol），随后为Ti（O-i-Pr）4（6.67 ml，22.76 mmol），并且使得搅拌过夜。第二天，加入EtOH（50 ml），随后为NaBH4（0.646 g，17.07 mmol）。在搅拌5分钟后，将整个反应直接注射到40 g二氧化硅柱上，其和330 g二氧化硅柱成一直线。洗脱10分钟100% DCM，随后为30分钟0-15% MeOH/DCM，收集作为微金色油的20,23-二十九烷二烯-10胺，N,N-二甲基-，（20Z,23Z）（1）（2.45 g，5.47 mmol，48.1 %收率）。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 5.35（m，4H），2.78（m，2H），2.23（m，1H），2.21（s，6H），2.05（m，4H），1.45-1.16（m，38H），0.89（m，6H）。关于C31H61N计算值HRMS 448.4877，实测值448.4872。
化合物2-30是新阳离子脂质，并且根据上文的一般方案1制备。
Figure DEST_PATH_IMAGE227
Figure DEST_PATH_IMAGE229
Figure DEST_PATH_IMAGE231
（ 12Z,15Z ） -N,N- 二甲基 -2- 壬基二十一 -12,15- 二烯 -1- 胺（化合物 31 ）
Figure DEST_PATH_IMAGE232
将酮iii（4.0g，9.55mmol）、TOSMIC（2.4g，12.4mmol）的二甲氧基乙烷溶液冷却至0℃，并且用叔丁醇钾（19.1mmol，19.1mL 1M tBuOH溶液）处理。在90分钟后，反应在己烷和水之间分配。将有机物用水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤且在真空中蒸发。通过快速层析（0-5% EtOAc/己烷）纯化这种材料，以给出所需产物（含有~20% s.m.）。这种混合物原样带至下一个步骤。LC/MS（M+H）= 430.6。
Figure DEST_PATH_IMAGE233
在环境温度将氢化铝锂（23.9mmol，23.9mL 1M THF溶液）直接加入腈iv（3.42g，8mmol），并且将反应搅拌20分钟。将反应用100mL THF稀释，冷却至0℃，并且用十水合硫酸钠溶液小心猝灭。将固体过滤掉且用THF洗涤。将滤液在真空中蒸发且直接带进下一个反应粗制物内。LC/MS（M+H）= 434.6。
Figure DEST_PATH_IMAGE234
将伯胺（3.45g，6.2mmol）的二氯乙烷（100mL）溶液用甲醛（1.6mL，21.7mmol），随后为三乙酰氧基硼氢化钠（6.6g，31mmol）处理。在5分钟后，反应在二氯甲烷和1N NaOH之间分配。将有机物在硫酸钠上干燥，过滤且在真空中蒸发。通过反相制备型层析（C8柱）纯化粗混合物，以提供（12Z,15Z）-N,N-二甲基-2-壬基二十一-12,15-二烯-1-胺。HRMS计算值462.5033，实测值462.5026。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 5.35（m，4H），2.78（2H，t，J=5.6Hz）， 2.18（s，6H），2.05（m，6H），1.3（m，39H），0.89（m，6H）。
（ 13Z,16Z ） -N,N- 二甲基 -3- 壬基二十二 -13,16- 二烯 -1- 胺（化合物 32 ）
Figure DEST_PATH_IMAGE235
将甲硅烷基酰胺Peterson试剂（3.1g，16.7mmol）溶解于THF（35mL）中，且冷却至-63℃。向这种溶液中加入nBuLi（16.7mmol，6.7mL 2.5M溶液）。将反应加温至环境温度共30分钟。将酮（5.0g，11.9mmol）溶解于第二个烧瓶中的THF（25mL）中。在-60℃将Peterson试剂转移至酮溶液。将反应加温至-40℃共1小时，随后加温至0℃共30分钟。将反应用碳酸氢钠猝灭，用另外的水稀释且在水/己烷之间分配。将有机物用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤且在真空中蒸发。通过快速层析（0-40% MTBE/己烷）纯化给出α,β-不饱和酰胺vi。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 5.75（s，1H），5.36（m，4H），3.01（s，3H），2.99（s，3H），2.78（t，2H），2.28（t，2H），2.05（m，6H），1.35（m，34H），0.89（m，6H）。
Figure DEST_PATH_IMAGE236
将α,β-不饱和酰胺vi（1g，2.1mmol）和LS-Selectride（4.1mmol，4.1mL 1M溶液）在密封管中合并且加热至60℃共24小时。将反应冷却至环境温度，且在氯化铵溶液和庚烷之间分配。将有机物在硫酸钠上干燥，过滤且在真空中蒸发，以给出酰胺vii。这种中间产物直接带进下一个反应粗制物内。
Figure DEST_PATH_IMAGE237
向酰胺vii（2.85g，5.8mmol）的溶液中加入氢化铝锂（8.7mmol，8.7mL 1M溶液）。将反应在环境温度搅拌10分钟，随后通过缓慢添加十水合硫酸钠溶液猝灭。将固体过滤且用TFH洗涤，且在真空中蒸发滤液。通过反相制备型层析（C8柱）纯化粗混合物，以提供作为油的（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺（化合物32）。HRMS（M+H）计算值476.5190，实测值476.5189. 1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 5.37（m，4H），2.78（t，2H），2.42（m，8H），2.05（q，4H），1.28（m，41H），0.89（m，6H）。
N ,N- 二甲基 -1- （ 2- 辛基环丙基）十七烷 -8- 胺（化合物 33 ）
Figure DEST_PATH_IMAGE238
向冷却至0℃的油酸（1g，3.5mmol）的DCM（500 mL）溶液中加入CDI（0.63g，3.9mmol）。在冷却至0℃，并且首先用三乙胺（0.39g，3.9mmol）随后为二甲基羟胺盐酸盐（0.38g，3.9mmol）处理前，将反应加温至环境温度共30分钟。在1小时后，将反应在水和庚烷之间分配。将有机物在硫酸镁上干燥，过滤且在真空中蒸发，以给出粗制Weinreb酰胺ii，将其直接带进下一个反应内。
Figure DEST_PATH_IMAGE239
将二乙基锌（70.3mmol，70.3mL 1M溶液）的二氯甲烷（130mL）溶液冷却至-1℃，并且用TFA（8.0g，70.3mmol）逐滴处理。在30分钟后，加入二碘甲烷（18.8g，70.3mmol），并且将其在冰浴中老化（aged）30分钟。向这种溶液中加入Weinreb酰胺ii（7.6g，23.4mmol）。将反应加温至环境温度且搅拌1小时。将反应用氯化铵溶液（100mL）猝灭，并且将有机层分隔掉，用10%硫代硫酸钠洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤且在真空中蒸发。纯化是快速层析（0-30% MTBE/己烷），给出所需产物ix。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 3.72（s，3H），3.22（s，3H），2.48（t，2H），1.65（m，2H），1.39（m，22H）， 1.18（m，2H），0.91（t，3H），0.68（m，2H），0.59（m，1H），-0.32（m，1H）。
Weinreb酰胺ix至化合物33的转化以类似于上文对于化合物1描述的那种的方式（壬基Grignard添加随后为还原胺化）执行。LC/MS（M+H）= 436.6. 1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 2.25（s，6H），1.30（m，45H），0.91（m，6H），0.68（m，2H），0.59（m，1H），-0.31（m，1H）。
化合物34-43是新阳离子脂质，并且根据上文的一般方案1-4制备。
Figure DEST_PATH_IMAGE242
（ 11E,20Z,23Z ） -N,N- 二甲基二十九烷 -11,20,23- 三烯 -10- 胺（化合物 44 ）
Figure DEST_PATH_IMAGE244
向冷却至-78℃的LDA（95mmol，47.5mL 2M溶液）的THF（127mL）溶液中加入乙酸叔丁酯。将反应搅拌15分钟，随后添加醛x。将反应立即用氯化铵溶液猝灭，加温至环境温度，并且在水/戊烷之间分配。将有机物在硫酸钠上干燥，过滤且在真空中蒸发。LC/MS（M+H-tBu）= 325.4。
Figure DEST_PATH_IMAGE245
将羟基酮xi（7g，18.4mmol）溶解于二氯甲烷（150mL）中，且冷却至0℃并且用deoxofluor（7.3g，33.1mmol）处理。将反应伴随搅拌加温至环境温度共16小时，随后为用碳酸氢钠溶液猝灭。将反应分配且将有机物在硫酸钠上干燥，过滤且在真空中蒸发。快速柱层析（0-5%乙酸乙酯/己烷）给出β-氟酯。
氟酯中间产物（6g，15.6mmol）的二氯甲烷溶液用氯化氢（157mmol，39.2mL 4M二噁烷溶液）处理，并且将反应在环境温度搅拌16小时。将反应在真空中蒸发，以给出所需β-氟酸xii。LC/MS（M+H）= 327.3。
Figure DEST_PATH_IMAGE246
将氟羧酸xii（5.1g，15.7mmol）、EDC（6.0g，31.4mmol）、N,O-二甲基羟胺盐酸盐（3.1g，31.4mmol）、三甲胺（4.0g，39.2mmol）和HOAt（4.3g，31.4mmol）在DCM（78mL）中合并，且在环境温度搅拌16小时。将反应在水/DCM之间分配，并且将有机物用水（3x）和NaOH溶液（1x）洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤且在真空中蒸发。通过反相制备型层析纯化粗材料，以给出所需Weinreb酰胺xiii。LC/MS（M+H）= 370.4。
将Weinreb酰胺xiii（4.3g，11.7mmol）的THF（50mL）溶液用壬基溴化镁（23.4mmol，23.4mL 1M溶液）在环境温度处理。在1小时后将反应用氯化铵溶液猝灭，并且在水和戊烷之间分配。将有机物在硫酸钠上干燥，过滤且在真空中蒸发。将这种材料带进下一个步骤粗制物内。
Figure DEST_PATH_IMAGE248
将酮xiv（5.1g，11.7mmol）用二甲胺（29.3mmol，14.7mL 2M THF溶液）和异丙氧钛（IV）（6.7g，23.5mmol）处理，并且将反应在环境温度搅拌16小时。向反应混合物中加入乙醇（50mL），随后为硼氢化钠（0.67g，17.6mmol）。将反应直接装载到二氧化硅柱上，并且通过快速层析（0-15% MeOH/DCM）纯化。材料需要通过制备型反相层析的第二次纯化，以给出（11E,20Z,23Z）-N,N-二甲基二十九烷-11,20,23-三烯-10-胺。HRMS计算值446.4720，实测值446.4724. 1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 5.48（m，1H），5.37（m，4H），5.23（m，1H），2.78（t，2H），2.58（m，1H），2.22（s，6H），2.04（m，6H），1.56（m，1H），1.30（m，31H），0.89（m，6H）。
化合物45是如Nature Biotechnology，2010，28，172-176、WO 2010/042877 A1、WO 2010/048536 A2、WO 2010/088537 A2和WO 2009/127060 A1中所述的DLinKC2DMA。
Figure DEST_PATH_IMAGE249
化合物46是如WO 2010/054401和WO 2010/144740 A1中所述的MC3。
Figure DEST_PATH_IMAGE250
D. 脂质纳米颗粒组合物
本发明的下述脂质纳米颗粒组合物（LNPs）对于递送寡核苷酸特别是本发明的siNA分子是有用的：
阳离子脂质 / 胆固醇 / PEG-DMG 56.6/38/5.4；
阳离子脂质 / 胆固醇 / PEG-DMG 60/38/2；
阳离子脂质/ 胆固醇 / PEG-DMG 67.3/29/3.7；
阳离子脂质 / 胆固醇 / PEG-DMG 49.3/47/3.7；
阳离子脂质 / 胆固醇 / PEG-DMG 50.3/44.3/5.4；
阳离子脂质 / 胆固醇 / PEG-C-DMA / DSPC 40/48/2/10；
阳离子脂质 / 胆固醇 / PEG-DMG / DSPC 40/48/2/10；和
阳离子脂质 / 胆固醇 / PEG-DMG / DSPC 58/30/2/10。
技术人员应当理解本发明非常适合于执行目标且获得提及的目标和优点，以及其中固有的那些。作为优选实施方案的目前代表的本文描述的方法和组合物是示例性的且不意欲作为对本发明范围的限制。其中的改变和其他用途对于本领域技术人员将是显而易见的，其包含在本发明的精神内，且由权利要求的范围限定。
表8：CTNNB1 登记号
NM_001098210
智人联蛋白（钙粘蛋白关联蛋白质），β1，88kDa，（CTNNB1）， 转录变体3，mRNA.
NM_001098210.1 GI:148227671
NM_007614
小家鼠联蛋白（钙粘蛋白关联蛋白质），β1（Ctnnb1），转录变体1，mRNA
NM_007614.2 GI:31560726
XM_001115474
恒河猴联蛋白（钙粘蛋白关联蛋白质），β1，88kDa，转录变体（CTNNB1），mRNA。
XM_001115474.1 GI:109041278。
表9：用于化学修饰的 siNA 构建体的稳定化学的非限制性例子
用于化学修饰的siNA构建体的稳定化学的非限制性例子
Figure DEST_PATH_IMAGE252
Figure DEST_PATH_IMAGE253
CAP = 任何末端帽，参见例如图6。
所有Stab化学可以彼此组合用于本发明的双链体（例如作为有义和反义链化学的组合），或可替代地可以分离，例如用于本发明的单链核酸分子。
所有Stab化学可以包含具有2'-O-烷基、2'-脱氧-2'-氟、2'-脱氧、LNA或其他修饰核苷酸或非核苷酸的3’-突出端核苷酸。
所有Stab化学一般包含约19-21个核苷酸，但可以如本文所描述的改变。
所有Stab化学还可以包括如从反义或引导链的5'-末端测定的，在双链核酸双链体的第11个碱基配对位置处在有义或过客链中的单个核糖核苷酸。
所有Stab化学还可以具有在来自反义链5'末端的第14位处的2'-脱氧-2'-氟修饰代替上文指定的Stab，与它在那个位置是嘌呤还是嘧啶无关。
上文呈现的反义链的所有Stab化学可以具有在来自反义链5'末端的第1、2和/或3位处的胸苷代替2'-脱氧尿苷。
S = 有义链。
AS = 反义链
*Stab 23具有与3'-帽邻近的单个核糖核苷酸
*Stab 24和Stab 28具有在5'-末端处的单个核糖核苷酸
*Stab 25、Stab 26、Stab 27、Stab 35、Stab 35G*、Stab 35N*、Stab 35rev*、 Stab 36、Stab 50*、Stab53*、Stab 53N*和Stab 54具有在5'-末端处的三个核糖核苷酸。
*Stab 29、Stab 30、Stab 31、Stab 33和Stab 34在来自5'-末端的前3个核苷酸位置处的任何嘌呤是核糖核苷酸。
p = 硫代磷酸酯键。
†Stab 35具有在3'-突出端处的2'-O-甲基 U和在5'-末端处的三个核糖核苷酸。
†Stab 36具有与靶序列互补的2'-O-甲基突出端（天然存在的突出端）和在5'-末端处的三个核糖核苷酸。
‡ - Stab 04H、Stab 06C、Stabl07H、Stab07mU、Stab09H、Stab16C、Stab 16H、Stab18C、Stab 18H、Stab 52H、Stab 05C、Stab05N、Stab10C、Stab10N、Stab35G*、Stab35N*、Stab35N*、Stab35rev*、Stab 50*、Stab 53*、Stab 53N*、Stab 54具有两个2'-O-甲基 U 3’-突出端。
Stab35G*、Stab 35N*、Stab35rev*、Stab50*、Stab53*和Stab53N*不允许如由5'-末端测定的在引导链的第14位处的2'-O-甲基修饰。
表10：示例性固相寡核苷酸合成条件
A. 2.5 µmol合成循环ABI 394仪器
Figure DEST_PATH_IMAGE255
B. 0.2 µmol合成循环ABI 394仪器
Figure DEST_PATH_IMAGE257
C. 0.2 µmol合成循环96孔仪器
· 等待时间不包括在递送期间的接触时间
· 串联合成使用接头分子的双重偶联。
表11：所选脂质纳米颗粒制剂的组成
Figure DEST_PATH_IMAGE260
N/P比 = 在阳离子脂质和核酸之间的氮:亚磷比。
表12：在表 11 的制剂中的脂质的化学结构
Figure DEST_PATH_IMAGE261

Claims (39)

1.一种抑制CTNNB1表达的分离的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中
（a）所述siNA包含有义链和反义链；
（b）每条链独立地长度为15 – 30个核苷酸；和
（c）至少一条链包含SEQ ID NO:194的至少15个核苷酸序列。
2.一种抑制CTNNB1表达的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中
（a）所述siNA包含有义链和反义链；
（b）每条链独立地长度为15 – 30个核苷酸；和
（c）所述反义链包含与5’-ACGACUAGUUCAGUUGCUU-3' （SEQ ID NO：194）具有序列互补的至少15个核苷酸。
3.一种抑制CTNNB1表达的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中
（a）所述siNA包含有义链和反义链；
（b）每条链独立地长度为15 – 30个核苷酸；和
（c）所述反义链包含5’-AAGCAACUGAACUAGUCGU -3'（SEQ ID NO：5107）的至少15个核苷酸序列，并且其中所述核苷酸中的一个或多个是任选化学修饰的。
4.权利要求3的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述有义链包含5’- ACGACUAGUUCAGUUGCUU -3' （SEQ ID NO：194）的至少15个核苷酸序列，并且其中所述核苷酸中的一个或多个是任选化学修饰的。
5.一种抑制CTNNB1表达的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述siNA包含：
5’- ACGACUAGUUCAGUUGCUU -3'（SEQ ID NO：194）和5’- AAGCAACUGAACUAGUCGU -3'（SEQ ID NO：5107）。
6.根据权利要求1、2、3、4或5的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中至少一个核苷酸是化学修饰的核苷酸。
7.根据权利要求1、2、3、4或5的双链短干扰核酸（siNA）分子，其进一步包含至少一个非核苷酸。
8.根据权利要求1、2、3、4或5的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中至少一个核苷酸包含通用碱基。
9.根据权利要求1、2、3、4或5的双链短干扰核酸（siNA）分子，其具有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。
10.根据权利要求1、2、3、4或5的双链短干扰核酸（siNA）分子，其包含在至少一条链的3'-末端、5'-末端、或3'和5’末端上的帽。
11.根据权利要求1、2、3、4或5的双链短干扰核酸（siNA）分子，其包含在一条或两条链上的一个或多个3’-突出端核苷酸。
12.根据权利要求1、2、3、4或5的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述反义链的5'末端是磷酸化的。
13.权利要求11的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中在至少一条链上的所述3’-突出端核苷酸是2'-O-甲基核苷酸。
14.权利要求13的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述2'-O-甲基核苷酸由硫代磷酸酯核苷酸间键连接。
15.权利要求6的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述化学修饰的核苷酸是2'-脱氧-2'-氟核苷酸。
16.权利要求6的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述化学修饰的核苷酸是2'-脱氧核苷酸。
17.权利要求6的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述化学修饰的核苷酸是2'-O-烷基核苷酸。
18.根据权利要求1、2、3、4或5的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中在一条或两条链中的五个或更多个嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸。
19.根据权利要求1、2、3、4或5的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中在一条或两条链中的五个或更多个嘧啶核苷酸是2'-O-甲基嘧啶核苷酸。
20.根据权利要求1、2、3、4或5的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中在一条或两条链中的五个或更多个嘌呤核苷酸是2'-脱氧-2'-氟嘌呤核苷酸。
21.根据权利要求1、2、3、4或5的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中在一条或两条链中的五个或更多个嘌呤核苷酸是2'-O-甲基嘌呤核苷酸。
22.权利要求18的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中在一条或两条链中的五个或更多个嘌呤核苷酸是2'-O-甲基嘌呤核苷酸。
23.权利要求19的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中在一条或两条链中的五个或更多个嘌呤核苷酸是2'-脱氧-2'-氟核苷酸。
24.一种双链短干扰核酸（siNA）分子，其包含SEQ ID NOS：6372和6374。
25.一种双链短干扰核酸（siNA）分子，其包含SEQ ID NOS：6370和6369。
26.一种双链短干扰核酸（siNA）分子，其包含SEQ ID NOS：2021和2068。
27.一种双链短干扰核酸（siNA）分子，其包含SEQ ID NOS：6372和6373。
28.一种双链短干扰核酸（siNA）分子，其包含SEQ ID NOS：2147和6368。
29.根据权利要求24、25、26、27或28的双链短干扰核酸（siNA）分子，其包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
30.一种组合物，其包含在药学可接受的载体或稀释剂中的根据权利要求1、2、3、5、24、25、26、27或28的双链短干扰核酸（siNA）。
31.一种组合物，其包含
（a）具有SEQ ID NOS：6372和6374的双链短干扰核酸（siNA）；
（b）（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺；
（c）胆固醇；
（d）DSPC；和
（e）PEG-DMG。
32.一种组合物，其包含
（a）具有SEQ ID NOS：6370和6369的双链短干扰核酸（siNA）；
（b）（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺；
（c）胆固醇；
（d）DSPC；和
（e）PEG-DMG。
33.一种组合物，其包含
（a）具有SEQ ID NOS：2021和2068的双链短干扰核酸（siNA）；
（b）（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺；
（c）胆固醇；
（d）DSPC；和
（e）PEG-DMG。
34.一种组合物，其包含
（a）具有SEQ ID NOS：6372和6373的双链短干扰核酸（siNA）；
（b）（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺；
（c）胆固醇；
（d）DSPC；和
（e）PEG-DMG。
35.一种组合物，其包含
（a）具有SEQ ID NOS：2147和6368的双链短干扰核酸（siNA）；
（b）（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺；
（c）胆固醇；
（d）DSPC；和
（e）PEG-DMG。
36.根据权利要求31、32、33、34或35的组合物，其中所述（13Z,16Z）-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺、胆固醇、DSPC和PEG-DMG分别具有50:30:10:2的摩尔比。
37.根据权利要求31、32、33、34或35的组合物，其进一步包含蔗糖、海藻糖或其任何组合。
38.一种治疗患有状况的人受试者的方法，所述状况通过CTNNB1的作用或CTNNB1作用的丧失介导，所述方法包括给所述受试者施用有效量的权利要求24、25、26、27或28中任一项的双链短干扰核酸（siNA）分子。
39.根据权利要求39的方法，其中所述状况是癌症。
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