JP2021528096A - エキソソーム細胞外小胞及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
様々な実施形態において、本開示は、少なくとも1つのエキソソーム(例えば、本明細書に記載のエキソソームのいずれか)を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、複数のエキソソームを含む。本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、被験者への投与に好適な他の成分、例えば、薬学的に許容可能な担体及び/又は賦形剤に加えて、少なくとも1つのエキソソームの調製物を指す。本明細書に提供される医薬組成物は、投与を可能にし、その後、有効成分の意図される生物活性を提供し、且つ/又は治療効果を達成するような形態である。本明細書に提供される医薬組成物は、好ましくは、製剤が投与される被験者に対して許容できない毒性の追加成分を一切含有しない。
様々な実施形態では、本開示は、有効量のエキソソーム又は少なくとも1つのエキソソームを含む医薬組成物(例えば、本明細書に記載のエキソソーム又は医薬組成物のいずれか)と細胞を接触させ、これにより修飾RNAを細胞に送達することによって、修飾RNAを細胞に送達する方法を提供する。
脂質ナノ粒子(LNP)の製剤化及び特性決定
2つの異なるタイプのLNP、すなわち、修飾hEPO mRNA(858ヌクレオチド)(5meC、Ψ)(Trilink)を含有するDLin−MC3−DMA(MC3−LNP)及びDLin−DMA LNP(DD−LNP)は、以前記載されている(Yanez Arteta et al.(2018)PNAS 115(15):E3351−60)通りに、4つの異なる脂質成分と一緒にmRNAを沈殿させることによって調製した。4つの成分は、以下:低pHでイオン化可能な(カチオン性)イオン化脂質(DLin−MC3−DMA又はDLin−DMA);2つのヘルパー脂質(DSPC及びコレステロール);並びにPEG化脂質(PEG2000−DMPE)を含んだ。MilliQ−waterに溶解させたmRNA、100mMクエン酸バッファー(pH3)、及びMilliQ−waterを混合して、50mMクエン酸塩の溶液を取得することにより、hEPO mRNA水溶液を調製した。4つの脂質成分(イオン化脂質:DSPC:コレステロール:PEG2000−DMPE=50:10:38.5:1.5モルパーセント)及び総脂質含量12.5mMの組成物を用いて、エタノール中の脂質溶液(99.5%)を調製した。容積調合比がAq:EtOH=3:1で、定全流量が12mL/分のNanoAssemblr(Precision Nanosystems)マイクロ流体混合システムで、mRNA及び脂質溶液を混合した。混合時に、イオン化脂質上の窒素原子とmRNA鎖上のリン原子の比は、3.1であった。「空」のLNP(すなわち、mRNAを含まないLNP)が調製された場合には、エタノール相を50mMクエン酸バッファー(pH3)のみと混合した。調製されたLNP溶液の初期0.35mLと最終0.05mLを廃棄し、容積の残りをサンプル画分として収集した。
ヒト上皮HTB−177(NCI−H460)細胞株をAmerican Type Culture Collection(ATCC)から購入し、ATCCガイドラインに記載される通りに培養した。ピルビン酸ナトリウム及びHEPESを含まず、重炭酸ナトリウムを含有するRPMI−1640増殖培地(Sigma Aldrich)に、5%CO2の存在下、37℃で、エキソソーム欠失ウシ胎仔血清(FBS)(Sigma Aldrich)、1%のL−グルタミン(2mM)(Thermo Fisher Scientific)及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン(10,000U/mL)(Thermo Fisher Scientific)を添加した。熱不活性化FBSは、70Tiロータ(Beckman Coulter)を備えるOptima L−100 XP超遠心分離機において120,000×g、4℃で2時間の超遠心分離によりエキソソームを欠失させ、エキソソーム欠失上清を0.2μmフィルタで濾過した。
ヒト上皮(HTB−177)細胞を、30mLの増殖培地に175Tフラスコ当たり3×106細胞の密度で接種し、24時間インキュベートした。24時間のインキュベーション後、1%ヒト血清(Sigma Aldrich)の存在下、フラスコ当たり100μgのhEPO mRNAを含有する1mLのDD−LNP又はMC3−LNPで細胞を処理した。1mLのLNP溶液中100μgのhEPO mRNAは、以下:(1)日目:200μLのLNP(20μgのmRNA);(2)日目:400μLのLNP(40μgのmRNA);(3)日目:400μLのLNP(40μgのmRNA)のように3つの異なる用量で投与し、96時間後に採取した。同量(200μL、400μL、400μL)の対応する空のDD−LNP又は空のMC3−LNP(すなわち、mRNAを含まないLNP)で処理した細胞、並びに非処理の細胞を陰性対照として使用した。
以前記載されている(El−Andaloussi et al.(2012)Nat Protoc.7(12):2112−26)通りに、LNP処置細胞の馴化培地及び陰性対照からEVを単離した。手短には、細胞残屑を除去するために、4K15遠心分離機(Sigma)により、4℃、3000×gで15分間遠心分離した。得られた上清を収集し、4℃、60,000×gで35分間の超遠心分離後、0.2μmフィルタによる濾過を実施して、直径が200nm未満のEVを取得した。続いて、濾過した上清を4℃、120,000×gで70分間超遠心分離して、EVをペレット化した。EVペレットを適切な量(50〜80μL)のPBS(Sigma Aldrich)中に再懸濁させた。全ての超遠心分離工程は、70Tiロータ(Beckman Coulter)を用いたOptima L−100 XP超遠心分離機で実施した。
miRCURY(商標)RNA単離キット−細胞及び植物(Exiqon)を用いて、製造者の指示に従い、EV及びLNP処理細胞から全RNAを単離した。全RNAは、Qubit 2.0フルオロメータ(Thermo Fisher Scientific)を用いて定量した。NanoDrop 1000(Thermo Fisher Scientific)を用いて、RNA品質(230/260比)を評価した。
Hamamatsu C11440−50B/A11893−02カメラを備えたNanoSight LM10計器(Malvern Panalytical)を用いて、HTB−177 MC3−EV及び非処理EVを粒径(nm)及び濃度(粒子/mL)について評価した。解析の前に、粒子を0.1μM濾過PBS(Sigma)中で500倍希釈して、視野内の粒子数をフレーム当たり180粒子未満に減少させた。3回の独立した測定(生物学的反復)をスキャッターモードで実施した。各EVサンプルについての測定読取りは、個別のサンプル及び手動での温度モニタリングに応じて、調節したカメラレベル(10〜16)及び検出閾値(5〜15)、各々25フレーム毎秒(fps)で、60秒間5キャプチャーにて取得した。ブラー・マックスジャンプ距離(Blur and Max Jump Distance)は自動に設定した。NanoSight Fluorescent NTA LM10ソフトウェア バージョン3.3(Malvern Panalytical)を用いて、読取り、収集、及びデータ解析を実施した。
EV、LNP投与後のそれらの親細胞の溶解物、及び対応する陰性対照におけるhEPO mRNAを、定量的リアルタイムPCR(RT−qPCR)を用いて定量した。RNA収率に基づき、0.25〜1μgの全EV RNA及び細胞の全RNAを、大容量cDNAキット(Thermo Fisher Scientific)を用いてcDNAに変換した。製造者の指示に従い、ViiA(商標)7 instrument(Thermo Fisher Scientific)でのTaqManプローブアッセイを用いて、hEPO mRNAの定量に100ngの全cDNAを使用した。2μgの純粋なhEPO mRNA(TrilinkからのRNA)を逆転写し、得られたcDNAを段階希釈(10倍)して、7つの標準(最高点:100ng)を調製し、これらを3回技術反復することにより、標準曲線を作成した。続いて、EV cDNA及び細胞cDNAをhEPO mRNA解析のために使用し;最小R2>0.975の標準曲線に対して、絶対定量を補間した。GAPDHを内標準として使用した。hEPO mRNAのモル量を計算するために、以下のように推定した:1モルhEPO mRNA=858hEPO mRNAヌクレオチド。
HTB−177細胞を、前述したように、100μgのCy5−mRNA(Trilink)を含有するMC3−LNPで処理した。非処理細胞を対照として含んだ。96時間後、分画超遠心分離(前濃縮)により、LNP処理細胞(MC3−EV)及び非処理細胞(EV)の培地から全EVを単離し、PBSに再懸濁させた後、定量した。前濃縮後、親和性に基づく方法を用いて、CD63/CD9陽性EVを単離し、FACSにより、Cy5−mRNAの存在について評価した。細胞培地についてのエキソソーム−ヒトCD63単離/検出試薬(Thermo Fisher Scientific)を使用して、製造者の指示に従い、CD63陽性EVを常磁性Dynabeadsに固定化した。結合反応の際に、20μLの常磁性Dynabeadsを25μg又は50μgの全MC3−EVと一緒にインキュベートした。陰性対照として、20μLの常磁性Dynabeadsを等量のPBS(EVなし)と一緒にインキュベートした。CD63陽性EVの固定化後、EVをマウス抗ヒトPE−CD9抗体(BD Pharmingen、Cat.No.555372)で、製造者の指示に従い染色した。BD FACSLyric system(BD Biosciences)によりEVを取得した後、CD9及びCy5−mRNAを検出した。FlowJoソフトウェア(TreeStar Inc.)を用いて、データを解析した。実験は、生物学的二重反復で実施した。
LNPとEVを直接混合した後、様々な割合(量)のLNP及びEVを用いて、37℃でインキュベート(細胞の非存在下)した。いずれの事前の処理も受けていない2つの異なる割合(量)のEVを300μLのDD−LNP又はMC3−LNP(39μgのhEPO mRNA)と一緒に、37℃の30mLのPBS中で2時間インキュベートした。第1のセットアップにおいて、EVとLNPとの割合は、200μgのEV+300μLのLNP(1×)であったが、第2のセットアップでは、この割合は、50μgのEV+300μLのLNP(4×)であった。2時間のインキュベーション後、超遠心分離によりEVを再度単離し、EVから全RNAを単離し、hEPO mRNAをqPCRにより定量して、LNPからEVへのhEPO mRNAの直接移入を評価した。陰性対照として、等量のDD−LNP又はMC3−LNPを、EVを含まないPBS中でインキュベートした後、超遠心分離した。陽性対照として、hEPO mRNAを含有するDD−LNP又はMC3−LNPを細胞に投与した後、EVを単離した(それぞれ、DD−EV又はMC3−EV)。RNAを単離し、hEPO mRNAをqPCRにより定量した。実験は生物学的三重反復で実施した。データは、LNPにより細胞に送達されたhEPO mRNAの投与量又はEVと直接混合したhEPO mRNAの量に対して、EV中に検出されたhEPO mRNAのパーセンテージとして表示する。反復の標準偏差(SD)と共に平均値を示す。
前述したように、100μgのhEPO mRNAを含有するMC3−LNPで、HTB−177細胞を処理した。非処理細胞を対照として含んだ。96時間後、EVを単離し、定量した。初めに、RNase A活性(Thermo Fisher Scientific)の効率を評価するために、280ngの純粋なhEPO mRNA(Trilink)をRNase A(0.5μg/μL)又は等量のPBSと一緒に37℃で20分間インキュベートした。次に、同じ条件を用いて、200μgのMC3−EVをRNase Aで処理した。陰性対照として、200μgのMC3−EV及び150μgの非処理EVを、RNase Aの代わりにPBSを用いた以外は同じ条件下でインキュベートした。インキュベーション後、miRCURYTM RNA Isolationキット−Cell and Plant(Exiqon)を用いて、EVからの全RNAを単離した。EVの外部に存在する場合に、hEPO mRNA含量に対するRNase Aの作用を評価するために、hEPO mRNAをqPCRにより定量した。実験は、生物学的三重反復で実施した。
EVの画分を使用して、EV中のLNP由来イオン化脂質の存在を検定した。5〜10μLの各EVサンプル(MC3−LNP及びDD−LNP処理細胞から取得)をPBSで50倍希釈した後、トリス/EDTAバッファー中2w/v%のTriton(登録商標)X−100の混合物でさらに1+1希釈した。サンプルを37℃で30分間インキュベートした後、Single Quad Detector(SQD)(Waters)に接続したAcquity Ultra Performance LCに注入した。分析カラムは、60℃に維持したWaters Acquity UPLC(登録商標)CSH C18、1.7μm、2.1×100mmであった。流量は、水中の0.1%ギ酸(A)と、アセトニトリル及びイソプロピルアルコールの等量混合物中の0.1%ギ酸(B)との移動相を用いて、0.50mL/分であった。0.0minで10%Bを、1.0から5.0minまで85%Bに上昇させた後、7.5minまで85%Bに維持する勾配ランを適用した。勾配ランには、7.6minから9.5minまで99%Bの洗浄ステップを加えた。次に、10%Bをコンディショニングのために9.6minから12.0minまで適用した。これらの条件下で、DLin−DMAの溶離時間は6.3minであり、DLin−MC3−DMAの溶離時間は6.5minであった。エタノール99.5%に溶解させたDLin−DMA及びDLin−MC3−DMAの外部標準溶液を用いて、定量を決定した。エレクトロスプレー、ポジティブモードを用いて、SQDを実行し、DLin−MC3−DMAの溶液による自動調整を用いて調整した。カチオン性脂質の記録は、各カチオン性脂質についてM+1のSingle Ion Recording(SIR)を用いて実施した。
LNP処理の後、細胞馴化上清を収集し、hEPOタンパク質検出のために直接使用したのに対し、1%ハルト(halt)プロテアーゼ阻害剤カクテル(Thermo Fisher Scientific)の存在下、500μLのM−PER Mammalian Protein Extraction Reagent(Thermo Fisher Scientific)を用いて、細胞溶解物から全細胞タンパク質を抽出した。手短には、細胞を3次元Bio−rockerにより4℃で10分間穏やかに攪拌し、14,000×gで10分間遠心分離することにより、細胞残屑をペレット化した。得られた上清(タンパク質含有)を新しいチューブに移した。同時に、培養した上清を4K15遠心分離機(Sigma)により4℃、3000×gで15分間遠心分離して、細胞残屑を除去した。得られた上清を新しいチューブに移した。また、hEPOタンパク質は、エリスロポエチンELISAキット(STEMCELL Technologies)を用いて、製造者の指示に従い、EV溶解物中でも分析した。2μLのEV懸濁液を2μLのM−PER Mammalian Protein Extraction Reagent(Thermo Fisher Scientific)と一緒にインキュベートし、Ultrasonic cleaner(VWR)により54℃で5分間超音波処理して、EV抽出物を生成した。培養上清からの全細胞タンパク質及び全タンパク質、並びに全EVタンパク質を、Qubit 2.0フルオロメータ(Thermo Fisher Scientific)を用いて、製造者のプロトコルに従い、定量した。hEPOタンパク質を検出するために、エリスロポエチンELISAキット(STEMCELL Technologies)を製造者の指示に従って使用した。50μLの全タンパク質溶液(細胞及び培養上清の両方について)を使用し、相対標準曲線に従って、hEPOタンパク質レベルをmU/mLとして算出した。換算法(119mU=1ng)を用いて、濃度をfg/mLに変換し、細胞の総数に対して正規化した。
細胞挙動に対するLNPの作用を決定すると共に、LNP処理(DD−LNP又はMC3−LNP)に対する細胞耐容性を評価するために、DD−LNP又はMC3−LNPによる96時間の処理後に、細胞世代時間(細胞増殖)、細胞全RNA、細胞内タンパク質の総含量、及び分泌されたタンパク質の総含量を計算した。LNPによる処理後の全EV RNA及びタンパク質含量を定量することにより、EVに対するLNPの作用も検定した。
G=t/n
t=LNP投与間隔(h)
ヒト上皮(HTB−177)細胞をT175フラスコ当たり5×106細胞の密度で接種し、RPMI−1640完全培地中で培養した。MC3−LNP処理細胞から単離した600μgのMC3−EV(700ngのhEPO mRNA)、及びDD−LNP処理細胞から単離した600μgのDD−EV(1100ngのhEPO mRNA)をRPMI−1640培地中に溶解させ、以下の通り2日にわたり、独立したアッセイでレシピエント細胞に移入した:(1)日目:300μgのMC3−EV、及び(2)日目:300μgのMC3−EVを、150μgの2回の個別用量で各々8時間後。同様に、300μgのDD−EV(1日目)及び300μg(2日目)を独立したアッセイでレシピエント細胞に移入した。空のEV(hEPO mRNAを含まない)及び非処理細胞からのEVを、対照としてレシピエント細胞に送達した。48時間後、細胞及び培養上清を収集し、全RNAを単離した。hEPO mRNA及びhEPOタンパク質を、それぞれRT−qPCR及びELISAにより、前述のプロトコルに従って評価した。実験は、2回の独立した生物学的反復で実施した。
1mLのLNPが、フラスコ当たり76μgの蛍光Cy5−EGFP−mRNAを含有する(これに対し、hEPO mRNAは、100μg/mLであった)以外は前述のプロトコルに従って、蛍光シアニン5(Cy5)−EGFP−mRNAを含有する1mLのDD−LNPを様々な用量(200μL、400μL、400μL)でHTB−177細胞に送達した。LNPの投与から96時間後、馴化培地(上清)並びに親細胞を採取し、hEPO mRNA及びhEPOタンパク質について分析したか、又はさらなる試験のために保存した。空のDD−LNP(mRNAを含まない)及び非処理細胞を対照として使用した。HTB−177細胞並びに、末梢血単核細胞(PBMC、前述した通り、バフィーコートから単離される)から精製したB細胞、T細胞、及び単球などの免疫細胞をウェル当たり2×105細胞の密度で接種し、96ウェルの丸底プレート内の200μLの培地に培養し、37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。培養細胞の24時間の刺激後、25μLのPBS溶液中のCy5−EGFP−mRNA(Trilink)を含有する78μgのDD−EVをレシピエント細胞に送達した。対照アッセイのために、空のDD−EV(EGFP−mRNAを含まない)及びネイティブEV(非処理細胞からのEV)を細胞に送達するか、又は細胞を未処理のまま残した。5時間、24時間、及び48時間のEV処理後、細胞を採取し、CD19(B細胞)、CD3(T細胞)、及びCD14(単球)(Becton−Dickinson Biosciences)に対し、モノクローナル抗体(mAb)により表面マーカについて染色した。細胞は、FACSVerse(BD Biosciences)で取得した。Cy5−EGFP−mRNAは、各細胞型における蛍光に基づいて検出し、FlowJoソフトウェア(TreeStar Inc.)を用いて、データを解析した。
0.011mg/mLの濃度でhEPO mRNAを含有するMC3−LNPを、静止条件下、37℃で、150mM NaCl(pH7.4、6.6、若しくは5.8)と一緒に、10mMクエン酸−Na2HPO4バッファー溶液中でインキュベートした。RiboGreenアッセイにおいて0.125mM TritonX−100(VWR Proteomics Grade)及び0.125mMドデシル硫酸ナトリウム(Sigma)を用い、ゼロ時点でmRNAの総量を測定した。様々なpH(pH7.4、6.6、又は5.8)のLNPから放出されたmRNAの画分を評価するために、Perkin Elmer LS55 Luminescence Spectrometer(例えば、480nm、em:525nm)を用い、Quant−iT RiboGreen RNA Reagent Assayキット(Thermo Fisher ScientificによるInvitrogen)で遊離量のmRNAを分析した。
実験手順は、ゴーテンバーグの地域実験動物倫理委員会(Regional Laboratory Animal Ethics Committee of Gothenburg,Sweden)により承認された(倫理審査申請書番号83−2015)。手順は全て、スウェーデン動物保護法(Swedish Animal Welfare Act)及び規定SJVFS 2012:26に準拠する。C57BL6/N Crl雌マウス(n=36)、9〜10週齢をCharles River Laboratory(Germany)から購入し、AstraZeneca,Molndal,Swedenにある動物施設に収容した。マウスは、標準の条件(21℃ RT、12:12h光周期、45〜55%湿度)下でケージ当たり4匹のマウスの群で飼育し、通常の固形飼料(R70、Lactamin AB)及び水を自由に摂取させた。環境エンリッチメントを提供した(カートン、木製舌圧子、及び綿ネスティングパッド)。等量の1.5μg hEPO mRNAを含有する100μLのMC3−LNP由来EV又はMC3−LNPをマウスに静脈内注射した(群当たりn=4)。100μLのPBSを対照マウスに注射した。EV及びLNPの注射から2、5、24、及び48時間後に伏在静脈(Vena Saphena)マイクロサンプリングにより、血液サンプルをマウスの群(n=4)から収集した。35μL EDTA−プレップキャピラリーチューブに収集した血液サンプルを、血漿を収集するため1700×gで遠心分離し、分析の時間まで−86℃で冷凍保存した。注射から5、24、及び96時間後、臓器を収集するために、マウス群を死なせた。イソフルラン麻酔によりマウスを鎮静させ、眼窩静脈叢から採血した後、心臓を切除した。続いて、全臓器(肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、心臓、胸腺、肺、及び脳)を収集し、液体窒素でスナップ冷凍し、分析の時間まで−86℃で保存した。
MC3−LNP及びMC3−EVによるhEPO mRNA送達後のマウス血漿中のhEPOタンパク質を分析するために、Gyrosプラットフォーム上でhEPOアッセイを自社開発した。EZ−Link Sulfo−NHS−LC−Biotinキット(Thermo Fisher Scientific、#21327)を用いて、キット添付文書に従って、補足抗体(3F6、MAIIA Diagnostics)をビオチン化した。モノクローナル抗体標識キット(Thermo Fisher Scientific、#A20186)を用いて、検出抗体(7D3、MAIIA Diagnostics)をAlexa 647標識した。hEPOタンパク質(自社製)を用いて、12.2pg/mL〜50ng/mLの範囲で、Rexxip Aバッファー(Gyros Protein Technologies)中の標準曲線を作成した。分析前に、マウス血漿サンプルをRexxip A−maxバッファー(Gyros Protein Technologies)で1:1(v:v)希釈した。Gyrolab計器(Gyrolab xP workstation、Gyros Protein Technologies)を備えるGyrolab Bioaffy 1000 CD(Gyros Protein Technologies)でサンプルを分析した。標準曲線のために5パラメータ曲線当てはめを使用した。全ての標準及びサンプルは、10%未満のCVを有した。
1%ハルト(halt)プロテアーゼ阻害剤カクテル(Thermo Fisher Scientific)の存在下、M−PER Mammalian Protein Extraction Reagent(Thermo Fisher Scientific)を用いて、製造者の指示に従い、臓器からの全タンパク質を抽出した。手短には、Tissue Lyser II(Qiagen)中のプロテアーゼ阻害剤(Thermo Fisher Scientific)を添加した200〜350μLの溶解バッファー(組織重量に応じて)において、最大速(30Hz)で3〜5分間20〜70mgの組織を溶解させた後、4℃、10,000×gで15分間遠心分離することにより、組織残屑を全て除去した。得られた上清は、Qubit 2.0フルオロメータ(Thermo Fisher Scientific)を用いるタンパク質定量のために使用した。エリスロポエチンELISAキット(STEMCELL Technologies)を用いて、製造者の指示に従い、hEPOタンパク質検出について50μLの全タンパク質を分析した。各臓器中のhEPOタンパク質(ng)の量を相対臓器重量(g)に対して正規化した。
MC3−LNP及びMC3−EVの静脈内投与後、IL−6、KC、MCP−1、RANTES、TNFα、IFN−γ、IL−1β、及びIP−10の同時定量のために、EMD Millipore’s MILLIPLEX(登録商標)MAP Mouse Cytokine磁気ビーズキット(Merck KGaA、#MCYTOMAG−70K)により、マウスサイトカインの血漿中濃度を測定した。まず、サンプルをアッセイバッファーで1:2希釈し、次に、標準及び品質対照と一緒に96ウェルプレート内に配置した。ビーズを含有する溶液を添加し;ビーズは、特定の抗体でコーティングした磁気ミクロスフィアである。混合物を4℃で一晩インキュベートした後、各ミクロスフィアの表面上での反応を完了させるために、ストレプトアビジン−PEコンジュゲートと一緒にインキュベートした。プレートを分析装置Bio Rad Luminex 200(登録商標)上で読み取った。個別のミクロスフィアを各々同定し、そのバイオアッセイの結果を、蛍光リポータシグナルに基づいて定量化した。5パラメータロジスティック曲線当てはめ法を使用し、蛍光強度中央値(MFI)のデータを用いて、濃度を測定した。
RNeasyキット(Qiagen)を用いて、製造者の推奨に従い、マウス臓器から全RNAを単離した。Tissue Lyser II(Qiagen)中のRLTバッファー(600μL)において10〜50mgの組織を最大速(30Hz)で3〜4分間溶解させた後、20℃、10,000×gで3分間遠心分離することにより、組織残屑を全て除去した。続いて、上清をカラムに移し、さらに処理した。RNAを定量し、Qubit 2.0フルオロメータ(Thermo Fisher Scientific)を用いて、RNAを定量し、NanoDrop 1000(Thermo Fisher Scientific)を用いて、RNA品質を評価した。RNA収率に基づき、0.5〜1μgの全RNAをcDNAにレトロ転写し、100ngを用い、RT−qPCRにより、前述したプロトコルに従って、hEPO mRNAを検出した。各臓器中のhEPO mRNAの量(μg)を相対臓器重量(g)に対して正規化した。
全ての実験について、GraphPad Prism v.7(GraphPad)を用いて、統計解析を実施した。インビトロデータは、独立2群両側スチューデントt検定を用いて解析したが、例外的に、HTB−177増殖、RNA含量、及びタンパク質含量に対するLNP投与の効果については、1元配置分散分析(one−way ANOVA)、続いてテューキー(Tukey)の多重比較検定を用いて解析した(有意なP値<0.05)。マウス血漿及び臓器中のhEPO含量は、独立2群両側スチューデントt検定を用いて解析したのに対し、マウス血漿中のサイトカインのレベルは、1元配置分散分析、続いてシダックの多重比較検定を用いて解析した。P値の有意性のレベルは、以下のように表示した:*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、及び****p<0.0001。
実施例1:脂質ナノ粒子(LNP)の特性決定
本明細書に記載の実験で使用されるLNPは、5つの主要成分、すなわち、イオン化脂質(DLin−MC3−DMA又はDLin−DMA)、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、コレステロール、PEG化脂質(PEG2000−DMPE)、及びmRNA(hEPO mRNA)を含んだ。DLin−MC3−DMAイオン化脂質を含有するLNPは、MC3−LNPと呼ばれ;DLin−DMAイオン化脂質を含有するLNPは、DD−LNPと呼ばれる。両方のLNP製剤を、ローディング効率、平均粒径、多分散指数(PDI)、及び個々のLNP成分間のモルパーセント比を含め、複数の生物物理的パラメータに関して、特性決定した(表2)。データは、表2に平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表示する(MC3−LNP、n=4;DD−LNP、n=9)。
LNPの2つの異なる製剤による、細胞へのヒトエリスロポエチン(hEPOタンパク質)をコードするmRNAの送達を調べた。DLin−DMA−LNP(DD−LNPと称する)及びDLin−MC3−LNP(MC3−LNPと称する)を介したmRNA送達の有効性を、細胞内hEPO mRNAの量、並びに細胞内及び細胞外環境の両方で産生されたhEPOの量を決定することによって検定した。
研究から、大部分のLNPで送達されたRNAは、リソソーム分解及び/又はエンドサイトーシス再循環経路を経るのに対し、エンドソームから脱出するのは、僅かな量のみであり;例えば、LNP送達siRNAの正味脱出は、2%未満であり得ると推定されている(Semple et al.(2010)Nat Biotechnol.28(2):172−6;Sahay et al.(2013)Nat Biotechnol.31(7):653−8;Sahay et al.(2010)J Control Release 145(3):82−95)。
前述した実験は、LNPのエンドサイトーシスの後、外性hEPO mRNAをエンド−EVに組み込むことができることを示唆している(図1F及び図9)。次に、(a)EVが、その後、送達ビヒクルとして働くことにより、外性hEPO mRNAをレシピエント細胞に輸送することができるか否か;並びに(b)EVを介して細胞に送達されたhEPO mRNAが、機能性である、すなわち、mRNAを翻訳して、hEPOタンパク質を産生することができるか否かを調べた。
エンド−EVが、インビトロでhEPO mRNAを送達することができると判定した後、これらのEVが、外性mRNA(すなわち、hEPO mRNA)をインビボで送達することもできるか否かを調べた。hEPO mRNAをインビボで投与する前に、非処理の健康なC57BL6/NCrlマウスから血液を採取し、ヒトエリスロポエチンELISAによりhEPOタンパク質を検定して、レシピエントマウスにヒト型のEPOタンパク質(hEPO)が欠失しており、且つこれを発現しないことを確認した。予想通り、非処理のマウスの血漿は、hEPOタンパク質について陰性であった(図12)。
MC3−LNPに比べて、EVが、hEPO mRNAをいかに効率的に送達するかを決定するために、インビボでのLNP及びEVによるhEPO mRNAの送達後に、hEPOタンパク質の産生を比較した。臓器において、LNPによるhEPO mRNA送達からのhEPOタンパク質の量は、脾臓を除いて概ねEVと同等であり、脾臓は、タンパク質産生に有意な差を示し、それに心臓が続いた(有意差はより小さい)(図5)。血液中のhEPOタンパク質の量は、EVと比較して、LNP送達の方が高かった(図5)。さらに、組織に対するMC3−LNP及びMC3−EVの作用を検定した。MC3−LNP及びMC3−EVは、レシピエントマウスの臓器重量に有意な作用を示さなかった(図15A〜H)。
EVが、レシピエントマウスに対しLNPと比べて低免疫原性であるか否かを調べるために、単回用量のMC3−LNP(マウス1匹当たり1.5μgのhEPO mRNA)及びMC3−EV(マウス1匹当たり1.5μgのhEPO mRNA)をC57BL6/NCrlマウスに静脈内注射した。2つの時間間隔(5時間及び24時間)で、一般に免疫及び炎症反応に関与する8つの異なるサイトカインの濃度をマウス血漿中で測定した。注射から5時間後に検出された複数の炎症誘発性サイトカイン(特に、IL−6、IP−10、RANTES、MCP−1、及びKC)の分泌レベルは、EV送達後よりLNP送達後で有意に高かった(図6A〜E)。
LNP−mRNAが、EVにより担持されていることを確認するために、HTB−177細胞を、100μgのCy5−mRNAを含有するMC3−LNPで処理するか、又はそれなしで処理した。96時間後、LNP処理細胞(MC3−EV)及び非処理細胞(EV)の培地から全EVを分画超遠心分離により単離し、PBS中に再懸濁させた後、定量した。25μg若しくは50μgの全MC3−EV又は全非処理EVを、抗CD63抗体と共役した20μLの常磁性Dynabeadsと一緒にインキュベートした後、Exosome−Human CD63 Isolation/Detectionキット(Thermo Fisher Scientific)を用いて、CD63陽性EVを特異的に単離した。次に、CD63陽性EVを、マウス抗ヒトPE−CD9抗体(BD Pharmingen、Cat.No.555372)で染色してから、Cy5−mRNA検出についてFACSにより分析した。FACS分析から、非処理細胞からの免疫沈降EV(50μgアッセイ)の約96%は、CD63及びCD9について陽性であったが、mRNAについては陰性であったことが明らかにされた。対照的に、LNP−mRNA処理細胞からの免疫沈降EV(50μgアッセイ)の約88%は、CD63及びCD9について陽性であったが、26%が、Cy5−mRNAを含有するLNPのエンドサイトーシス後に分泌されたmRNA(Cy5−mRNA)を含有する(図17A)。陰性対照(ビーズのみ、並びに非処理細胞から得られるCD63/CD9陽性EV)では、Cy5−mRNAシグナルは一切検出されず、これは、mRNAがEV(CD63/CD9陽性EV)により担持されていることを示している。
mRNAが、EV膜と結合しているのではなく、EV内部に位置し、且つ保護されていることを確認するために、hEPO mRNAを含有するMC3−EVをRNase処理に曝露した。RNase処理の後、全RNAをEVから単離し、qPCRにより、hEPO mRNAを定量した。RNaseの効率的なエンドヌクレオチド結合分解活性(EVフリーRNAに示される)にもかかわらず、RNaseで処理しなかったMC3−EVと比較して、RNase処理MC3−EVでは、hEPO mRNA含量に2Ct倍率変化の減少しか認められなかった。3回の生物学的反復(n=3)で実験を実施し、hEPO mRNA qPCRデータを散布ドットプロット及び平均標準偏差(SD)として表す(図17B)。RNase処理なしの非処理細胞から得られたEVは、陰性対照として使用した。送達mRNAの僅かな部分がEVの外膜層に結合している可能性はあるが、ほとんどのhEPO mRNAは、エンドヌクレオチド結合分解活性から保護されて、EV内に存在することが判明した。
Claims (92)
- 以下:
(a)修飾RNAを含む1つ以上の脂質ナノ粒子(LNP)を提供するステップ;
(b)細胞によるLNP取込みを可能にする条件下で、1つ以上の前記細胞をLNPと接触させるステップ;及び
(c)前記1つ以上の細胞により産生されるエキソソームを単離するステップを含むプロセスにより調製される修飾RNAを含む単離エキソソームであって、ここで、前記少なくとも1つの単離エキソソームは、前記修飾RNAを含む、単離エキソソーム。 - 前記LNPが、少なくとも1つのイオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び/又はPEG脂質を含む、請求項1に記載のエキソソーム。
- 前記少なくとも1つのイオン化脂質が、DLin−MC3−DMA及び/又はDLin−DMAである、請求項2に記載のエキソソーム。
- 前記少なくとも1つのイオン化脂質が、DLin−MC3−DMAである、請求項2又は3のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記少なくとも1つのイオン化脂質が、DLin−DMAである、請求項2又は3のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記少なくとも1つのリン脂質が、DSPCである、請求項2〜5のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記少なくとも1つの構造脂質が、コレステロールである、請求項2〜6のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記少なくとも1つのPEG脂質が、PEG−DMPE又はPEG2000−DMPEである、請求項2〜7のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記LNPが、DLin−MC3−DMA若しくはDLin−DMAであるイオン化脂質、DSPCであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び/又はPEG−DMPE若しくはPEG2000−DMPEであるPEG脂質を含有する、請求項1〜8のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記LNPが、DLin−MC3−DMAであるイオン化脂質、DSPCであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及びPEG−DMPE若しくはPEG2000−DMPEであるPEG脂質を含有する、請求項9に記載のエキソソーム。
- 前記LNPが、DLin−DMAであるイオン化脂質、DSPCであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及びPEG−DMPE若しくはPEG2000−DMPEであるPEG脂質を含有する、請求項9に記載のエキソソーム。
- 前記LNPが、約2:1〜約4:1、又は約4:1、約3:1、又は約2:1のイオン化脂質:修飾RNAヌクレオチドモル比を有する、請求項1〜11のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記LNPが、約3:1のイオン化脂質:修飾RNAヌクレオチドモル比を有する、請求項1〜12のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記エキソソームが、少なくとも1つのイオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び/又はPEG脂質を含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記少なくとも1つのイオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び/又はPEG脂質が、LNPに由来する、請求項14に記載のエキソソーム。
- 前記少なくとも1つのイオン化脂質が、DLin−MC3−DMA及び/又はDLin−DMAである、請求項14又は15に記載のエキソソーム。
- 前記少なくとも1つのイオン化脂質が、DLin−MC3−DMAである、請求項14〜16のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記少なくとも1つのイオン化脂質が、DLin−DMAである、請求項14〜16のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記少なくとも1つのリン脂質が、DSPCである、請求項14〜18のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記少なくとも1つの構造脂質が、コレステロールである、請求項14〜19のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記エキソソームが、DLin−MC3−DMA若しくはDLin−DMAであるイオン化脂質、DSPCであるリン脂質、及び/又はコレステロールである構造脂質を含有する、請求項1〜20のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記エキソソームが、DLin−MC3−DMAであるイオン化脂質、DSPCであるリン脂質、及びコレステロールである構造脂質を含有する、請求項21に記載のエキソソーム。
- 前記エキソソームが、DLin−DMAであるイオン化脂質、DSPCであるリン脂質、及びコレステロールである構造脂質を含有する、請求項21に記載のエキソソーム。
- 前記エキソソームが、約1:1〜約3:1、又は約3:1、約2:1、約1:1、又は約1:1未満のイオン化脂質:修飾RNAヌクレオチドモル比を含む、請求項1〜23のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記エキソソームが、約1:1又は約1:1未満のイオン化脂質:修飾RNAヌクレオチドモル比を含む、請求項1〜24のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記エキソソームは、前記LNPが含むイオン化脂質:修飾RNAヌクレオチドモル比より低いイオン化脂質:修飾RNAヌクレオチドモル比を含む、請求項1〜25のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記エキソソームは、約1:1又は約1:1未満のイオン化脂質:修飾RNAヌクレオチドモル比を含み、前記LNPが、約3:1のイオン化脂質:修飾RNAヌクレオチドモル比を含む、請求項1〜26のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記エキソソームが、約30nm〜約300nmの直径を有する、請求項1〜27のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記エキソソームが、約40nm〜約150nmの直径を有する、請求項1〜28のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記細胞が、被験者から取得される、請求項1〜29のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記細胞が、上皮細胞、免疫細胞、前駆細胞、又は幹細胞である、請求項1〜30のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記細胞が、Bリンパ球、Tリンパ球、又は単球である、請求項1〜31のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記修飾RNAが、エリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項1〜32のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記修飾RNAが、ヒトエリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項1〜33のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記修飾RNAが、配列番号1のエリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項1〜34のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記プロセスが、インビトロで実施される、請求項1〜35のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 1つ以上の細胞を前記LNPと接触させるステップが、ヒト血清の存在下で実施される、請求項1〜36のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 前記ヒト血清が、約0.5体積%、約1体積%、又は約1.5体積%で存在する、請求項37に記載のエキソソーム。
- 前記ヒト血清が、約1体積%で存在する、請求項37又は38に記載のエキソソーム。
- 1つ以上の細胞を前記LNPと接触させるステップが、前記1つ以上の細胞を、少なくとも2つ、少なくとも3つ、又は少なくとも4つの異なる用量の前記LNPと接触させることを含む、請求項1〜39のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 1つ以上の細胞を前記LNPと接触させるステップが、前記1つ以上の細胞を、少なくとも3つの異なる用量の前記LNPと接触させることを含む、請求項1〜40のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- エキソソームを単離するステップが、インビトロ細胞培地のサンプルからエキソソームを単離するステップを含む、請求項1〜41のいずれか1項に記載のエキソソーム。
- 請求項1〜42のいずれか1項に記載の少なくとも1つのエキソソームと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
- 修飾RNAを細胞に送達する方法であって、有効量の請求項1〜42のいずれか1項に記載のエキソソーム又は請求項43に記載の医薬組成物と前記細胞を接触させ、これにより、前記修飾RNAを前記細胞に送達するステップを含む方法。
- 前記細胞を接触させるステップが、前記エキソソーム若しくは医薬組成物をインビトロ細胞培養物に添加するか、又は前記エキソソーム若しくは医薬組成物を被験者に投与するステップを含む、請求項44に記載の方法。
- 前記細胞が、インビトロ細胞培地中に存在する、請求項44又は45に記載の方法。
- 前記細胞が、被験者から取得される、請求項44〜46のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、被験者に存在する、請求項44又は45に記載の方法。
- 前記細胞が、上皮細胞、免疫細胞、前駆細胞、又は幹細胞である、請求項44〜48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、Bリンパ球、Tリンパ球、又は単球である、請求項44〜49のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞への修飾RNAの送達が、細胞世代時間を改変しない、請求項44〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞への修飾RNAの送達が、重量単位での総細胞タンパク質含量を改変しない、請求項44〜51のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞への修飾RNAの送達における、有効量の請求項1〜42のいずれか1項に記載のエキソソーム又は請求項43に記載の医薬組成物の使用。
- 前記細胞が、インビトロ細胞培地中に存在する、請求項53に記載の使用。
- 前記細胞が、被験者から取得される、請求項53又は54に記載の使用。
- 前記細胞が、被験者に存在する、請求項53に記載の使用。
- 前記細胞が、上皮細胞、免疫細胞、前駆細胞、又は幹細胞である、請求項53〜56のいずれか1項に記載の使用。
- 前記細胞が、Bリンパ球、Tリンパ球、又は単球である、請求項53〜57のいずれか1項に記載の使用。
- 前記細胞への前記修飾RNAの送達が、細胞世代時間を改変しない、請求項53〜58のいずれか1項に記載の使用。
- 前記細胞への前記修飾RNAの送達が、重量単位での総細胞タンパク質含量を改変しない、請求項53〜59のいずれか1項に記載の使用。
- 被験者の障害を処置又は予防する方法であって、有効量の請求項1〜42のいずれか1項に記載のエキソソーム又は請求項43に記載の医薬組成物を前記被験者に投与するステップを含み、ここで、前記エキソソームが、前記障害を処置する上で有効な修飾RNAを含む方法。
- 前記障害が、貧血、脊髄形成異常、免疫若しくは炎症性疾患、単一遺伝子病、及び複合病から選択される、請求項61に記載の方法。
- 前記障害が、貧血である、請求項61又は62に記載の方法。
- 前記障害が、脊髄形成異常である、請求項61又は62に記載の方法。
- 前記障害が、免疫若しくは炎症性疾患である、請求項61又は62に記載の方法。
- 前記修飾RNAが、エリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項61〜65のいずれか1項に記載の方法。
- 前記修飾RNAが、ヒトエリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項61〜66のいずれか1項に記載の方法。
- 前記修飾RNAが、配列番号1のエリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項61〜67のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被験者が、エキソソームの非存在下での処置に比べ、エキソソームの存在下での処置に対して低下した免疫及び/又は炎症反応を有する、請求項61〜68のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫及び/又は炎症反応の低下が、少なくとも1つのサイトカインのレベルの増加又は減少を含む、請求項69に記載の方法。
- 前記免疫及び/又は炎症反応の低下が、少なくとも1つのサイトカインのレベルの減少を含み、ここで、前記サイトカインは、IL−6、IP−10、RANTES、MCP−1、及びKCから選択される、請求項69又は70に記載の方法。
- 前記エキソソームが、前記被験者から取得された細胞から単離される、請求項61〜71のいずれか1項に記載の方法。
- 被験者の障害の処置又は予防における、有効量の請求項1〜42のいずれか1項に記載のエキソソーム又は請求項43に記載の医薬組成物の使用であって、前記エキソソームが、前記障害を処置する上で有効な修飾RNAを含む使用。
- 被験者の障害を処置又は予防する方法であって、以下:
(a)前記被験者から取得された1つ以上の細胞を提供するステップ;
(b)前記細胞によるLNP取込みを可能にする条件下で、修飾RNAを含む1つ以上の脂質ナノ粒子(LNP)と前記1つ以上の細胞を接触させるステップ;
(c)前記1つ以上の細胞により産生されるエキソソームを単離するステップであって、少なくとも1つの単離エキソソームが、前記修飾RNAを含むステップ;並びに
(d)有効量の前記単離エキソソームを前記被験者に投与するステップ
を含み、ここで、前記修飾RNAは、前記障害を処置する上で有効である方法。 - 前記細胞が、上皮細胞、免疫細胞、前駆細胞、又は幹細胞である、請求項74に記載の使用。
- 前記細胞が、Bリンパ球、Tリンパ球、又は単球である、請求項74又は75に記載の使用。
- 前記障害が、貧血、脊髄形成異常、免疫若しくは炎症性疾患、単一遺伝子病、及び複合病から選択される、請求項74〜76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記障害が、貧血である、請求項74〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記障害が、脊髄形成異常である、請求項74〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記障害が、免疫又は炎症性疾患である、請求項74〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記修飾RNAが、エリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項74〜80のいずれか1項に記載の方法。
- 前記修飾RNAが、ヒトエリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項74〜81のいずれか1項に記載の方法。
- 前記修飾RNAが、配列番号1のエリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項74〜82のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被験者が、エキソソームの非存在下の処置に比べ、エキソソームの存在下での処置に対して低下した免疫及び/又は炎症反応を有する、請求項74〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫及び/又は炎症反応の低下が、少なくとも1つのサイトカインのレベルの増加又は減少を含む、請求項84に記載の方法。
- 前記免疫及び/又は炎症反応の低下が、少なくとも1つのサイトカインのレベルの減少を含み、ここで、前記サイトカインは、IL−6、IP−10、RANTES、MCP−1、及びKCから選択される、請求項84又は85に記載の方法。
- 1つ以上の細胞を前記LNPと接触させるステップが、ヒト血清の存在下で実施される、請求項74〜86のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒト血清が、約0.5体積%、約1体積%、又は約1.5体積%で存在する、請求項87に記載の方法。
- 前記ヒト血清が、約1体積%で存在する、請求項87又は88に記載の方法。
- 1つ以上の細胞を前記LNPと接触させるステップが、前記1つ以上の細胞を、少なくとも2つ、少なくとも3つ、又は少なくとも4つの異なる用量の前記LNPと接触させることを含む、請求項74〜89のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の細胞を前記LNPと接触させるステップが、前記1つ以上の細胞を、少なくとも3つの異なる用量の前記LNPと接触させることを含む、請求項74〜90のいずれか1項に記載の方法。
- エキソソームを単離するステップが、インビトロ細胞培地のサンプルからエキソソームを単離することを含む、請求項74〜91のいずれか1項に記載の方法。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010285426A (ja) * | 2009-05-11 | 2010-12-24 | National Cancer Center | 核酸導入方法 |
JP2012524052A (ja) * | 2009-04-17 | 2012-10-11 | アイシス イノヴェイション リミテッド | 遺伝物質の送達用の組成物 |
JP2015501844A (ja) * | 2011-12-16 | 2015-01-19 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドModerna Therapeutics,Inc. | 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物 |
JP2017502997A (ja) * | 2014-01-21 | 2017-01-26 | アンヤリウム バイオサイエンシーズ アーゲー | ハイブリドソーム、それを含む組成物、それらの製造方法、およびその使用 |
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JP2010285426A (ja) * | 2009-05-11 | 2010-12-24 | National Cancer Center | 核酸導入方法 |
JP2015501844A (ja) * | 2011-12-16 | 2015-01-19 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドModerna Therapeutics,Inc. | 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物 |
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