CN117679354A

CN117679354A - 含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN117679354A
Application number: CN202410156184.4A
Authority: CN
Inventors: 刘廷竹; 王娟
Original assignee: Zhixiang Shandong Medical Technology Co ltd
Current assignee: Zhixiang Shandong Medical Technology Co ltd
Priority date: 2024-02-04
Filing date: 2024-02-04
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2044-02-04
Also published as: CN117679354B

Abstract

本发明公开了一种含有γ‑氨基丁酸的外泌体制剂及其制备方法，具体是对金花茶愈伤组织诱导后提取得到的含γ‑氨基丁酸的外泌体制剂。该制备方法包括如下步骤：将金花茶愈伤组织利用额外添加0.5～5mg/L谷氨酸的培养基和额外添加1～100μM NaCl的培养基分别培养或同时培养，诱导愈伤组织产生γ‑氨基丁酸后，提取诱导后愈伤组织中的外泌体，即得。本发明获得的含有γ‑氨基丁酸的外泌体制剂较之现有γ‑氨基丁酸可以有效解决γ‑氨基丁酸对皮肤的刺激作用，使γ‑氨基丁酸渗透性更弱，有效地解决了γ‑氨基丁酸在作为护肤品添加成分及药物载体时对皮肤产生的刺激性副作用等问题。

Description

含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种外泌体制剂，具体地说是一种含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂及其制备方法。

背景技术

γ-氨基丁酸（GABA）是一种非蛋白质氨基酸，在食品保健品和医药行业有广泛的应用。它具有降血压、抗惊厥、镇痛和改善记忆的功效。γ-氨基丁酸分子量小，能迅速穿透皮肤，放松紧张的肌肉，从而显著减少细纹、淡化皱纹。因此，在化妆品行业中，γ-氨基丁酸表现出优异的保湿和抗皱功效，广泛用于各种保湿或抗皱化妆品中。然而，γ-氨基丁酸在使用时会带来即时的不适感，尤其是刺痛感，从而限制了其在化妆品中的使用。目前已经有报道通过γ-氨基丁酸和其他成分的复配来缓解其刺激性，但是其存在的技术问题是复配成分需要多次筛选，工作量巨大，还要规避缓释成分与功效成分之间的拮抗，同时复配比例也会对刺激性产生不同的影响，需要大量实验验证，提高了实验成本。另外，复配成分虽然可以通过缓释缓解γ-氨基丁酸的刺激性，但是复配对其功效的一致性和稳定性也会有一定影响。如何缓解γ-氨基丁酸在化妆品或作为药物载体在药品中的刺激性等副作用，仍然是本领域技术人员研究的热点问题。

γ-氨基丁酸不仅仅是植物中的一种代谢产物，也是一种细胞间信号分子，参与维持细胞溶质pH值、渗透调节和碳氮代谢等，但是在植物中γ-氨基丁酸含量较低，有研究人员发现在一定时间厌氧处理的条件下γ-氨基丁酸含量会有所增加。γ-氨基丁酸在高等植物中的合成主要来自γ-氨基丁酸支路和多胺降解途径，起主导作用的酶分别为谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15）和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO，EC 1.4.3.6）。

金花茶(Camellia nitidissima Chi)属山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia L.）金花茶组（Sect. Chrysantha Chang），被誉为“茶族皇后”和“植物界大熊猫”，是山茶科山茶属植物中唯一花瓣金黄色的珍稀物种。它具有食用、观赏和药用的多重价值，被广泛应用于清热解毒、美容消肿等方面。金花茶富含次生代谢物质，如黄酮类、多糖、茶多酚、皂苷等多种生理活性成分，以及氨基酸、蛋白质等营养成分。体外抗氧化实验结果表明，金花茶的茶多酚能够有效清除DPPH自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基。此外，金花茶的茶多酚还能够显著提高SOD酶活力、降低MDA含量，有效增强对氧化损伤的抵抗力，是优质的护肤品制备原料。然而，金花茶作为野生药用植物资源逐年减少，并且其人工栽培投入较大、周期较长。因此，利用金花茶愈伤组织定向诱导产生次生代谢产物是目前解决其供不应求问题最为行之有效的方法，具有成本低、不受自然条件影响的优势。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题在于提供一种含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂的制备方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种由上述方法制备得到的含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂。

本发明所要解决的又一技术问题是提供一种上述含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂的新用途。

为实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，提供一种含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂的制备方法，所述外泌体制剂是对金花茶愈伤组织诱导后提取外泌体得到的，具体诱导方法步骤如下：

将金花茶愈伤组织利用额外添加谷氨酸的培养基和额外添加NaCl的培养基分别培养或同时培养，诱导所述愈伤组织产生γ-氨基丁酸后，提取诱导后的愈伤组织中的外泌体，即得。

经实验证实，谷氨酸的添加量在0.5～5mg/L范围内较佳，可以提高γ-氨基丁酸诱导率。NaCl采用低浓度诱导效果较佳，推荐的NaCl的浓度范围为1～100μM。

其中较优地，所述愈伤组织在含0.5～3mg/L谷氨酸的培养基中培养1～30天。

其中较优地，所述愈伤组织在含10～100μM NaCl的培养基中培养1～30天。

其中较优地，所述培养基为第二培养基，配方为：WPM基础培养基或MS基础培养基、蔗糖10～40g/L、6-苄氨基嘌呤1～5 mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.5～2mg/L、琼脂2～10g/L和肌醇30～200mg/L。

其中较优地，所述第二培养基的较佳推荐配方为：WPM基础培养基、蔗糖20～30g/L、6-苄氨基嘌呤1～2 mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1～2mg/L、琼脂2～5g/L和肌醇50～100mg/L。

在所述金花茶愈伤组织诱导γ-氨基丁酸前，首先进行金花茶愈伤组织的诱导和继代培养，本发明具体是利用金花茶叶片进行愈伤组织诱导和继代培养。

其中较优地，所述金花茶愈伤组织诱导方法为：将金茶花叶片消毒，切块后将叶片表面划伤，然后接种在愈伤组织诱导培养基上诱导培养。将诱导得到的金花茶愈伤组织在第二培养基上继续进行继代培养，筛选生长好、质地松散的愈伤组织无性系进行后续步骤。

其中较优地，所述外泌体提取前先对所述金花茶愈伤组织进行研磨，所述研磨可以为手工研磨。较之超声提取外泌体，研磨后提取得到的外泌体保存更为完整，颗粒数更多。

根据本发明实施例的第二方面，提供一种含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂，由上述方法制备得到。

根据本发明实施例的第三方面，提供上述含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂在制备化妆品、化妆品原料或药物载药系统中的应用。

与现有技术相比较，本发明具有以下的技术效果：

（1）本发明解决了利用外泌体包裹γ-氨基丁酸时，由于制备方法不佳导致的γ-氨基丁酸在外泌体中含量不高和自包裹率较低的问题。本发明对制备方法及工艺参数进行改进，显著提升了金花茶愈伤组织外泌体中γ-氨基丁酸的含量，并且同时提高了外泌体对γ-氨基丁酸的自包裹率。

（2）本发明获得的含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂，较之现有技术制备的γ-氨基丁酸，透皮吸收性及渗透性更弱，有效降低γ-氨基丁酸对皮肤的刺激，解决了γ-氨基丁酸作为护肤品添加成分及药物载体时对皮肤产生的刺激性副作用问题。

（3）本发明以金花茶叶片为材料，以植物组织培养为基础进行金花茶愈伤组织的培养，有生长速度快、条件可控且不依赖于外界环境等特点，同时，按本发明方法进行处理，不会对金花茶活体植株造成伤害，保护了稀缺植物品种，并且在成功诱导愈伤组织后可进行大规模培养，具有规模化效应。

附图说明

图1A为培养基配方A对金花茶叶片愈伤组织块培养效果图；

图1B为培养基配方B对金花茶叶片愈伤组织块培养效果图；

图2A为培养基配方A-1对金花茶叶片愈伤组织块培养效果图；

图2B为培养基配方A-2对金花茶叶片愈伤组织块培养效果图；

图2C为培养基配方A-3对金花茶叶片愈伤组织块培养效果图；

图3A 为Q-1外泌体的电镜照片图；

图3B 为Q-2外泌体的电镜照片图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术内容进行详细具体的说明。

虽然外泌体包裹γ-氨基丁酸是个很好的研究方向，但进一步研究发现，金花茶愈伤组织在外泌体提取工艺下很难得到有效包裹剂量的γ-氨基丁酸，也就是说往往外泌体中γ-氨基丁酸的含量较低，自包裹率也不高。针对上述现有技术中的问题，本发明实施例首次提出利用金花茶愈伤组织外泌体包裹γ-氨基丁酸作为化妆品原料或载药系统以降低γ-氨基丁酸的刺激性，并且外泌体的缓释效果能最大化的发挥γ-氨基丁酸的护肤功效。

本发明实施例的原料来源见表1。

表1

实施例1 金茶花愈伤组织诱导及增殖体系构建

（1）金花茶愈伤组织的诱导：取生长健壮的成年植株叶片，反复漂洗数次，然后消毒。之后用滤纸吸净叶片表面多余水分，在无菌滤纸上切成面积约为1cm²的小块，并用接种刀将叶片表面划伤，然后接种于愈伤组织诱导培养基，即本发明第一培养基，第一培养基配方为：WPM基础培养基、30g/L蔗糖、6g/L琼脂、1.5mg/L 6-BA、0.5 mg/L 吲哚乙酸（IAA）、4mg/L 萘乙酸（NAA）。于25±1℃、黑暗条件下以周期为30d进行诱导培养；第一培养基也可以换成本领域技术人员熟知的其他有利于金花茶愈伤组织形成生长的培养基。

（2）金茶花愈伤组织继代培养：将诱导出的金花茶叶片愈伤组织接种于第二培养基，以30d为培养周期，25±1℃黑暗条件下进行继代培养。第二培养基配方见下述实施例记载。

所述第二培养基配方以金花茶愈伤组织在诱导条件下仍能茁壮生长为目标，因此现有技术中可以起到相同作用的培养基均可以应用于本发明。

实施例2 第二培养基的筛选

1．第二培养基配方筛选

在培养基配方实验中，下述用量范围内可以实现对金花茶愈伤组织的培养，具体为：WPM基础培养基或MS基础培养基、蔗糖10～40g/L、6-BA 1～5 mg/L、2,4-D 0.5～2mg/L、琼脂2～10g/L和肌醇30～200mg/L。

进一步筛选如下：

表2

通过进一步筛选实验，如表2所示，相同大小愈伤组织块培养相同时间下，培养基配方A和配方B均可以实现对金花茶愈伤组织的优质培养。使用培养基配方A培养金花茶愈伤组织状态质地更疏松，颜色呈现淡黄，明显优于使用配方B，因此更为推荐使用配方A。具体如图1A和图1B所示，图1A为培养基配方A，图1B为培养基配方B。

2.培养基中琼脂浓度优化

通过实验，所述第二培养基的配方在下述范围内均可以实现对金花茶愈伤组织的培养：WPM基础培养基、蔗糖20～30g/L、6-BA 1～2 mg/L、2,4-D 0.5～2mg/L、琼脂2～5g/L和肌醇50～100mg/L。

后续对上述配方进一步筛选，筛选得到三组培养基配方，分别为A-1、A-2和A-3，如表3所示。

表3

实验筛选得到三组培养基配方，分别为A-1、A-2和A-3，相同大小愈伤组织块培养相同时间下，配方A-1、配方A-2和配方A-3均可以实现对金花茶愈伤组织的优质培养。相比之下，5g/L琼脂浓度的培养基上的金花茶愈伤组织颜色整体呈现淡黄色，并且质地更疏松，生长状态更佳，因此推荐使用配方A-1。具体见图2A、图2B和图2C所示。图2A为培养基配方A-1，图2B为培养基配方A-2、图2C为培养基配方A-3。

实施例3盐胁迫对于外泌体及γ氨基丁酸生成的影响

1．方法：将正常培养30天的愈伤组织转移到额外添加不同盐浓度(0、1μM、10μM、100μM、1mM)的A-1培养基上，不同盐浓度下设置不同的培养时间：1d、5d、10d、15d、30d，培养温度25℃±1℃。

2. 外泌体提取方法：

（1）愈伤组织30g，加入PBS溶液进行研磨，置于50mL离心管中。 500g离心10 min，取上清置于另一干净离心管中，沉淀再次加入PBS溶液研磨后，再次离心取上清。

（2）70µm滤器置于新离心管上，上清液混匀倒入，进行过滤。

（3）过滤后的溶液2000g离心20min，取上清置于另一干净离心管中。

（4）10000g离心20min，取上清置于另一干净离心管中。

（5）0.8µm 滤器过滤后，再0.22µm 滤器过滤于干净离心管中，得到愈伤组织提取液100mL，取该愈伤组织提取溶液50mL，使用100kDa超滤管，纯化，然后以PBS复溶至50mL，得到外泌体溶液制剂。

3.外泌体检测：

使用纳米流式检测仪（nanoFCM）（N30E，厦门福流生物科技有限公司）进行检测。

4.γ-氨基丁酸含量测试

使用液相色谱仪（1260，安捷伦科技有限公司）进行检测。

分别检测愈伤组织提取液中γ氨基丁酸含量，外泌体溶液制剂中γ氨基丁酸含量，并计算γ-氨基丁酸自包裹率。

5.检测结果

（1）外泌体颗粒浓度

表4

（2）愈伤组织中γ-氨基丁酸含量

表5

（3）外泌体中γ-氨基丁酸含量

表6

（4）γ-氨基丁酸外泌体自包裹率

表7

通过结果可以看出：低浓度盐胁迫下，随着时间的延长，外泌体颗粒浓度增多，同时γ-氨基丁酸浓度升高，γ-氨基丁酸外泌体自包裹率升高，而随着盐浓度升高及作用时间延长，出现降低的情况。

推测出现这种状况的原因：植物最重要的抗盐机制之一是在胞内合成并积累一些有机和无机溶质，从而增强自身的渗透调节能力以平衡外部环境或液泡的渗透压，保证盐渍环境下水分的正常供应。植物在低盐胁迫条件下能够增强谷氨酸脱羧酶（glutamatedecarboxylase，GAD）的活性，从而富集GABA，而当盐离子浓度过高且作用时间过长时，导致细胞离子平衡的破坏和渗透胁迫等伤害，而后造成过氧化胁迫等次生伤害，进而影响愈伤组织生长活性，从而也导致外泌体膜破碎，进而其自包裹的γ-氨基丁酸降低。

实施例4谷氨酸对于外泌体生成的影响

1．愈伤组织培养：将正常培养30天的愈伤组织转移到额外添加不同的谷氨酸浓度(0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、3mg/L、5mg/L)的A-1培养基上，培养温度25℃±1℃，培养30天。

2. 外泌体提取方法：

（1）愈伤组织30g，加入 PBS 溶液进行研磨，置于50mL离心管中。500g离心10 min，取上清置于另一干净离心管中，沉淀再次加入PBS溶液研磨后，再次离心取上清。

（3）过滤后的溶液2000g离心 20min，取上清置于另一干净离心管中。

（4）10000g离心20min，取上清置于另一干净离心管中。

（5）0.8µm滤器过滤后，再次0.22µm滤器过滤于干净离心管中，得到愈伤组织提取液100mL，取该愈伤组织提取溶液50mL，使用100kDa超滤管，纯化，然后以PBS复溶至50mL,得到外泌体溶液制剂。

3. 外泌体检测：

4.γ-氨基丁酸含量检测：

使用液相色谱（1260，安捷伦科技有限公司）进行检测。

分别检测愈伤组织提取液中γ氨基丁酸含量，外泌体溶液中γ氨基丁酸含量，并计算γ-氨基丁酸外泌体自包裹率。

5.检测结果

表8

通过上表结果可以看出，谷氨酸浓度为0.5～5mg/L时，随着谷氨酸浓度的提高，外泌体颗粒浓度无明显增加，但是外泌体中的γ-氨基丁酸含量及愈伤组织中的γ-氨基丁酸含量均明显提高，γ-氨基丁酸外泌体自包裹率也明显提高，说明谷氨酸浓度0.5～5mg/L均是可行的。

推测L-谷氨酸是谷氨酸脱羧酶（GAD）的唯一底物，在培养基中添加可以提高植物的渗透调节能力，增加底物从而增加γ-氨基丁酸含量。谷氨酸作为底物，浓度为3mg/L时已经接近饱和，考虑到生产成本及经济效益，谷氨酸3mg/L推荐为较佳添加浓度。

实施例5谷氨酸及盐胁迫协同作用对于外泌体及γ-氨基丁酸生成的影响

1.愈伤组织培养：根据上述实施例中γ氨基丁酸测试结果，选择最佳的谷氨酸作用浓度为3mg/L；

（1）先将愈伤组织置于额外添加3mg/L谷氨酸的A-1培养基培养，温度25℃±1℃，培养30天，然后转移到额外添加不同浓度的盐及3mg/L谷氨酸的A-1培养基上，盐浓度设置：0、10μM、100μM，不同盐浓度设置不同的处理时间：1d、5d、10d、15d、30d。

2.外泌体提取方法：

（1）愈伤组织30g，加入PBS溶液进行研磨，置于50mL离心管中。 500g离心10min，取上清置于另一干净离心管中，沉淀再次加入PBS溶液研磨后，再次离心取上清。

（3）过滤后的溶液 2000g离心20min，取上清置于另一干净离心管中。

（4）10000g离心20min，取上清置于另一干净离心管中。

（5）0.8µm滤器过滤后，再次0.22µm滤器过滤于干净离心管中，得到愈伤组织提取液100mL，取该愈伤组织提取溶液50mL，使用100kDa超滤管，纯化，然后以PBS复溶至50mL，得到外泌体溶液。

3.外泌体检测：

4.γ-氨基丁酸含量检测：

使用液相色谱（1260，安捷伦科技有限公司）进行检测。

分别检测愈伤组织提取液中γ氨基丁酸含量，外泌体溶液中γ氨基丁酸，并计算γ-氨基丁酸自包裹率。

5. 检测结果

表9

表10

表11

通过上述结果可以看出，谷氨酸及盐胁迫协同作用时，可以明显提高外泌体中γ氨基丁酸生成含量及自包裹率。推测谷氨酸和盐胁迫出现协同的作用原因：盐胁迫条件下，触发愈伤组织抗盐机制，促进外泌体生产，同时增强谷氨酸脱羧酶活性，而加入谷氨酸，实际是提高谷氨酸脱羧酶底物浓度，所以γ-氨基丁酸生成及自包裹率得到明显提高。

实施例6外泌体的提取及相关鉴定测试

1. 外泌体提取方法：

（1）取A-1培养基培养的愈伤组织30g两份，记为Q-1和Q-2。Q-1加入 PBS 溶液进行研磨，80r/min，5min；Q-2加入PBS溶液进行超声破壁。

（2）之后分别置于50mL离心管中。500g离心10min，取上清置于另一干净离心管中。Q-1沉淀再次加入PBS溶液研磨，80r/min，2min，再次离心取上清。Q-2沉淀再次加入PBS溶液超声破壁，再次离心取上清。

（3）70µm滤器置于新离心管上，上清液混匀倒入，进行过滤。

（4）过滤后的溶液2000g离心20min，取上清置于另一干净离心管中。

（5）10000g离心20min，取上清置于另一干净离心管中。

（6）0.8µm滤器过滤后，再0.22µm滤器过滤于干净离心管中，然后使用100kDa超滤管，纯化，复溶，分别得到外泌体溶液制剂Q-1（研磨）、Q-2（超声）。

2. 外泌体鉴定测试

（1）分别用纳米流式检测仪（nanoFCM）（N30E，厦门福流生物科技有限公司）进行粒径分布及颗粒浓度测定；以透射电子显微镜（JEM-2100Plus，日本电子JEOL）进行形态观察并拍照记录；以纳米粒度ZETA电位分析仪（SZ-100VZ，HORIBA）进行Zeta电位测试。

3. 检测结果

表12

电镜照片如图3A和图3B所示，图3A为Q-1外泌体图，图3B为Q-2外泌体图，结果可以看出，通过研磨，能得到更多的外泌体颗粒。推测可能由于超声的空化作用、机械作用导致外泌体膜被破坏，从而得到较少的外泌体。

实施例7本发明含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂的较优制备方法

S1.利用金花茶叶片诱导金花茶愈伤组织；

将金茶花叶片用流水漂洗，消毒，之后用滤纸吸净叶片表面多余水分，在无菌条件下将叶片切成1cm²左右的小块，用接种刀将叶片表面划伤，接种在第一培养基上，进行诱导。第一培养基配方如实施例1中所述。

S2.将S1诱导的金花茶愈伤组织继代培养；

在S1基础上，将诱导出的金花茶愈伤组织接种在第二培养基上，进行愈伤组织的继代培养。在此基础上反复筛选生长好、质地松散的愈伤组织无性系。第二培养基如实施例2中所述。

S3.诱导金花茶愈伤组织产生γ-氨基丁酸

将S2培养得到的愈伤组织置于含3mg/L谷氨酸的第二培养基培养30天，然后转移到含10μM NaCl的第二培养基培养30天，收集愈伤组织。第二培养基如实施例2中所述。谷氨酸和NaCl的诱导培养顺序可以颠倒，或者也可以将3mg/L谷氨酸和10μM NaCl同时加入第二培养基中，用谷氨酸和NaCl同时对金花茶愈伤组织进行诱导。γ-氨基丁酸的诱导结果不受诱导顺序的影响。

S4.外泌体提取：提取S3得到的金花茶愈伤组织中含γ-氨基丁酸的外泌体制剂

（1）称取S3中各个条件愈伤组织各30g，切成小块状加入 PBS 溶液进行研磨，然后置于50mL离心管中。500g离心10min，取上清置于另一干净离心管中，沉淀再次加入PBS溶液研磨，80r/min，2min，再次500g离心取上清。

（4）10000g离心20min，取上清置于另一干净离心管中。

（5）0.8µm滤器过滤后，再次0.22µm滤器过滤于干净离心管中，然后使用100kDa超滤管，纯化，得到外泌体浓缩液。然后再以PBS复溶，得到外泌体制剂以备检测。

实施例8 金花茶愈伤组织与金花茶叶片中外泌体颗粒浓度对比

1. 样品准备：

（1）各取30g金花茶愈伤组织及金花茶叶片。切成小块状加入 PBS 溶液进行研磨，然后置于50mL离心管中。500g离心10 min，取上清置于另一干净离心管中，沉淀再次加入PBS溶液研磨后，再次离心取上清。

（2）70µm 滤器置于新离心管上，上清液混匀倒入，进行过滤。

（4）10000g离心20 min，取上清置于另一干净离心管中。

（5）0.8µm滤器过滤后，再0.22µm滤器过滤于干净离心管中，然后使用100kDa超滤管，纯化。分别复溶至50mL。得到样品Q-3（来源愈伤组织），Q-4（来源叶片）。

2. 外泌体检测

用纳米流式检测仪（nanoFCM）（N30E，厦门福流生物科技有限公司）进行粒径分布及颗粒浓度测定。

3.检测结果

表13

通过上述结果可以看出，金花茶叶片愈伤组织中含有的外泌体显著高于普通的叶片中，推测是由于愈伤组织相比普通叶片组织更为致密。

实施例9本发明制备含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂的缓释性测试

1.样本：

（1）取实施例7制备的外泌体制剂（γ-氨基丁酸浓度4.20mg/mL）4mL，加入4mL生理盐水中，得到浓度含2.10mg/mLγ氨基丁酸的外泌体溶液，即为样品Q-5；

（2）取21.0mgγ-氨基丁酸标准品（B21979，上海源叶生物科技有限公司），溶解于10mL 生理盐水中，得到浓度为2.10mg/mL γ氨基丁酸，即为样品Q-6。

（3）通过扩散池实验，测试样品Q-5和样品Q-6透过情况。

2.具体实验方法：将处理好的猪皮肤固定于扩散池的给药室与接受室之间。接受液为生理盐水。分别取样品Q-5和样品Q-6各2mL置于给药室中并用封口膜将其顶部密封，平行做3组。水浴温度37.4±0.5℃。

试验开始时刻为0时刻，在设定时间2、4、6、8、12、24时刻取样。用液相色谱检测样液中γ-氨基丁酸的含量，计算γ-氨基丁酸透皮释放的单位面积累积量。

单位面积累积透过量的计算公式为：

其中，Q_n:累积渗透量；V₀：接收室中接受液体积；C_n：第n个取样点测得的浓度；V：每次取样体积。A：透皮面积。

表14单位面积γ-氨基丁酸累积透过量（μg/cm²）

通过上述结果可以看出，样本Q-5外泌体中的γ-氨基丁酸透皮吸收明显弱于样品Q-6，尤其是24h透过量，Q-5远远小于Q-6。说明经过本发明方法得到的外泌体自包裹的γ氨基丁酸制剂，渗透性减弱，并且长效性更好，长期使用效果更佳。本发明外泌体制剂有效地减少了γ氨基丁酸使用过程中对皮肤的可能刺激。

实施例10 测定本发明外泌体的护肤功效

1. 样品：将愈伤组织置于额外添加3mg/L谷氨酸的A-1培养基培养温度25℃±1℃，培养30天，之后将其转移到额外添加3mg/L谷氨酸及10μM盐溶液的A-1培养基，培养温度25℃±1℃，培养30天。

然后进行外泌体提取，方法同实施例7。

2. 测试方法：共30名皮肤敏感的亚洲志愿者参加测试，测试期无志愿者退出。

1）水分含量测试：分别在使用样品前、使用样品4周后，进行水分含量测试实验。皮肤水分含量测试仪 Corneometer(CM 825，Courage and Khazaka，德国)基于电容的原理进行皮肤水分含量测试。使用样品第4周，30名志愿者中有28名出现不同程度水含的升高，人群有效率为93%，说明样品均具有保湿效果。

2）乳酸刺痛实验：分别在使用样品前、使用样品4周后，进行乳酸刺痛实验。具体实验方法为：将10%乳酸溶液50μL涂抹于鼻唇沟，在2.5 min时询问受试者的自觉症状（0分为没有刺痛感，1分为轻度刺痛，2分为中度刺痛，3分为重度刺痛）。

3.结果显示，在使用样品第4周，24名志愿者均出现刺痛感不同程度的降低，人群有效率80%，通过结果可以看出，本发明制备的含γ氨基丁酸的外泌体制剂可以修护皮肤屏障，舒缓不适，减少刺激等副作用的发生。

上面对本发明提供的含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂及其制备方法进行了详细的说明。对本领域的一般技术人员而言，在不背离本发明实质内容的前提下对它所做的任何显而易见的改动，都将构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。

Claims

1.一种含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂的制备方法，其特征在于所述外泌体制剂是对金花茶愈伤组织诱导后提取得到的含γ-氨基丁酸的外泌体制剂，具体诱导方法步骤如下：

将金花茶愈伤组织利用额外添加0.5～5mg/L谷氨酸的培养基和额外添加1～100μMNaCl的培养基分别培养或同时培养，诱导所述金花茶愈伤组织产生γ-氨基丁酸后，提取诱导后的愈伤组织中的外泌体，即得。

2.如权利要求1所述的含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂的制备方法，其特征在于：

所述愈伤组织在含0.5～3mg/L谷氨酸的培养基中培养1～30天。

3.如权利要求1所述的含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂的制备方法，其特征在于：

所述愈伤组织在含10～100μM NaCl的培养基中培养1～30天。

4.如权利要求1所述的含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂的制备方法，其特征在于：

所述培养基为第二培养基，其配方为：WPM基础培养基或MS基础培养基、蔗糖10～40g、6-苄氨基嘌呤 1～5 mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸 0.5～2mg/L、琼脂2～10g/L和肌醇30～200mg/L。

5.如权利要求4所述的含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂的制备方法，其特征在于：

所述第二培养基的配方为：WPM基础培养基、蔗糖20～30g、6-苄氨基嘌呤 1～2 mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸 0.5～2mg/L、琼脂2～5g/L和肌醇50～100mg/L。

6.如权利要求4或5所述的含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂的制备方法，其特征在于：

所述金花茶愈伤组织是利用金花茶叶片进行愈伤组织诱导和继代培养得到的。

7.如权利要求6所述的含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂的制备方法，其特征在于所述金花茶愈伤组织诱导方法为：

将金茶花叶片消毒，切块后将叶片表面划伤，然后接种在愈伤组织诱导培养基上诱导培养；将诱导得到的金花茶愈伤组织在第二培养基上继续进行继代培养，筛选生长好、质地松散的愈伤组织无性系进行后续步骤。

8.如权利要求1所述的含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂的制备方法，其特征在于：

所述外泌体提取前先对所述金花茶愈伤组织进行研磨。

9.一种含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂，其特征在于：

所述外泌体制剂是由权利要求1至8中任意一项所述方法制备得到的。

10.权利要求9所述的含有γ-氨基丁酸的外泌体制剂在制备化妆品、化妆品原料或药物载药系统中的应用。