CN118105402A - 一种针对早产儿视网膜病变防治的干扰序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域,特别涉及一种针对早产儿视网膜病变防治的干扰序列及其应用。本发明提供了DANCR抑制剂的应用,实验表明DANCR通过调节ANXA2影响眼部病理性新生血管生成,可通过有效减少DANCR和/或ANXA2的表达,阻止病理状态下眼部新生血管的生成,用于预防和/或治疗早产儿视网膜病变,为早产儿视网膜病变提供了新的治疗靶点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,特别涉及一种针对早产儿视网膜病变防治的干扰序列及其应用。
背景技术
早产儿视网膜病变(ROP)是一种发生在早产儿和低出生体重儿的眼底疾病,其主要特征是视网膜血管异常增殖。如果不及时治疗,该病可能导致严重并发症,如视网膜脱离、新生血管性青光眼和斜视等,最终可能导致失明。ROP是全球儿童致盲的主要原因之一。随着围产医学和新生儿监护室的不断进步和普及,早产儿的存活率也在不断提高,这导致了ROP患儿数量的增加。国内报道的ROP检出率约为6.6%至24.6%。对于大多数儿童来说,早产儿视网膜病变会以较轻的形式发生,并会自然痊愈。然而,如果疾病进展到严重阶段,将会导致一只或双眼失明。如果未能及时发现和治疗,将会造成不可逆的眼底损伤,导致患儿失去视力,并对他们的日后生长发育产生严重影响。
早产儿视网膜病变发病机制非常复杂,目前研究认为可能与早产、低出生体质量及吸氧引发的相关细胞及细胞外基质多种因素改变有关。近年该病的治疗手段有了许多进展,如冷冻治疗、激光治疗、玻璃体视网膜手术和抗血管内皮生长因子(Vascularendothelial growth factor,VEGF)药物的应用,但疗效仍不理想,存在着病情容易反复、长期疗效差、反复多次给药、治疗不应答或快速抗药反应和不良反应等问题。这促使研究者们不断对其他分子机制的探索和新的药物靶点的识别。
大量研究表明,膜联蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)复合物作为纤溶酶原和组织纤溶酶原激活物的内皮细胞表面共受体,可加速纤溶酶的生成,促进纤维蛋白溶解。纤溶酶随后可激活涉及多种基质金属蛋白酶的下游蛋白水解级联反应。因此,除了维持血管通畅外,ANXA2复合物还可以通过其促纤维蛋白溶解活性促进血管生成。
长非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是由基因组中非编码序列转录生成的长度大于200nt且不具有翻译成蛋白质能力的转录本,在疾病病理机制中起着重要的作用。大量研究表明LncRNA通过改变染色质结构、转录后调控、蛋白复合物重组、细胞间信号转导和蛋白质的变构调节等方式在维持正常的生理功能和发病机制中发挥着重要作用。随着近年来RNA基因组学的快速发展,发现一些LncRNA与新生血管性疾病的发病机制密切相关,且发现一些LncRNA与部分眼新生血管性疾病密切相关,如已有许多研究证明,通过调节LncRNA NEAT1可抑制高葡萄糖诱导的糖尿病视网膜病变(The mechanism by whichcrocetin regulates the lncRNA NEAT1/miR-125b-5p/SOX7 molecular axis toinhibit high glucose-induced diabetic retinopathy.Exp Eye Res.2022Sep;222:109157.);LncRNA MALAT1影响视网膜新生血管生成(Effect and mechanism of the longnoncoding RNA MALAT1 on retinal neovascularization in retinopathy ofprematurity.Life Sci.2020Nov 1;260:118299.)(LncRNA-MALAT1 promotesneovascularization in diabetic retinopathy through regulating miR-125b/VE-cadherin axis.Biosci Rep.2019May 15;39(5):BSR20181469.)。同时,分化拮抗非蛋白编码RNA(differentiation antagonizing non-protein coding RNA,DANCR)是近年发现的一类LncRNA,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。近期有研究发现DANCR可促进卵巢癌的肿瘤生长和血管生成(LncRNA DANCR promotes tumor growth and angiogenesis inovarian cancer through direct targeting of miR-145.Mol Carcinog.2019Dec;58(12):2286-2296.)。DANCR同样可以促进胆管癌细胞增殖、迁移、浸润和血管生成(LncRNADANCR affected cell growth,EMT and angiogenesis by sponging miR-345-5pthrough modulating Twist1 in cholangiocarcinoma.Eur Rev Med PharmacolSci.2020Mar;24(5):2321-2334.)。并且有研究发现,LINC00941通过结合ANXA2并增强其稳定性,从而激活FAK/AKT信号通路,促进胰腺癌细胞的增殖和转移。这些研究结果预示着可能通过抑制DANCR来抵抗ANXA2的促新生血管作用来作为一种抗新生血管治疗方法,而关于DANCR在眼部新生血管性疾病中的功能应用还尚未见报道。
目前高频地眼内注射抗VEGF药物是治疗早产儿视网膜病变的一种常见的治疗方法,如注射VEGF-A单抗或VEGFR竞争性结合蛋白,以达到抑制VEGF的功能的目的。常用的抗VEGF药物有雷珠单抗、康柏西普和阿柏西普等,从本质上来说仍是对症治疗,需要多次注射,两次注射间隔从一个月到数月,病人需要反复玻璃体腔注药治疗,无法解决视网膜缺血缺氧的根本问题。同时部分患者对传统抗VEGF治疗不应答或快速抗药反应,且抗VEGF治疗有一定比例的不良反应,包括眼内炎和闭塞性血管炎等。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了DANCR在制备防治早产儿视网膜病变药物中的应用,本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足,提供DANCR和/或ANXA2作为靶点在制备预防和/或治疗早产儿视网膜病变的药物中的应用。
本发明旨在克服现有技术中存在的上述缺陷和不足,提供制备以DANCR和/或ANXA2作为靶点预防和/或治疗早产儿视网膜病变的药物的应用,提供一种更稳定、长效且副作用小的早产儿视网膜病变的治疗方法。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了DANCR抑制剂在如下任一项中的应用:
(I)、抑制新生血管性眼病;
(II)、制备抑制新生血管性眼病的药物;
所述新生血管性眼病包括早产儿视网膜病变。
在本发明的一些具体实施方案中,上述应用的所述DANCR抑制剂包括敲除或敲减DANCR的基因编辑试剂、沉默或下调DANCR表达的RNA干扰试剂或靶向DANCR的小分子抑制剂中的一种或多种;
所述基因编辑试剂包括靶向DANCR基因的CRISPR/Cas试剂,所述CRISPR/Cas试剂包括sgRNA;
所述RNA干扰试剂包括siRNA或shRNA。
在本发明的一些具体实施方案中,上述应用的所述DANCR抑制剂包括shDANCR和/或siDANCR;
所述shDANCR具有:
(1)、如SEQ ID NO:1、2或3所示的核苷酸序列,或与SEQ ID NO:1、2或3互补的核苷酸序列;或
(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且功能与(1)的相同或相似;或
(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90%同源性的核苷酸序列;
所述siDANCR具有:
(4)、如SEQ ID NO:6、7或8所示的核苷酸序列,或与SEQ ID NO:6、7或8互补的核苷酸序列;或
(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且功能与(4)的相同或相似;或
(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有90%同源性的核苷酸序列;
所述多个为2个至5个。
本发明还提供了ANXA2抑制剂和上述应用中所述的DANCR抑制剂在如下任一项中的应用:
(I)、抑制新生血管性眼病;
(II)、制备抑制新生血管性眼病的药物;
所述新生血管性眼病包括早产儿视网膜病变。
在本发明的一些具体实施方案中,上述应用的所述ANXA2抑制剂包括敲除或敲减ANXA2的基因编辑试剂、沉默或下调ANXA2表达的RNA干扰试剂或靶向ANXA2的小分子抑制剂中的一种或多种;
所述基因编辑试剂包括靶向ANXA2基因的CRISPR/Cas试剂,所述CRISPR/Cas试剂包括sgRNA;
所述RNA干扰试剂包括siRNA或shRNA。
在本发明的一些具体实施方案中,上述应用的所述ANXA2抑制剂包括siANXA2;
所述siANXA2具有:
(7)、如SEQ ID NO:4或5所示的核苷酸序列,或与SEQ ID NO:4或5互补的核苷酸序列;或
(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且功能与(7)的相同或相似;或
(9)、与如(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有90%同源性的核苷酸序列;
所述多个为2个至5个。
本发明还提供了核酸分子,其具有:
(10)、如SEQ ID NO:1~8任一所示的核苷酸序列,或与SEQ ID NO:1~8任一者互补的核苷酸序列;或
(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且功能与(10)的相同或相似;或
(12)、与如(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有90%同源性的核苷酸序列;
所述多个为2个至5个。
本发明还提供了核酸分子组合,包括核酸分子组合1和/或核酸分子组合2;
核酸分子组合1包括核酸分子1、核酸分子2、核酸分子3、核酸分子6、核酸分子7或核酸分子8中的两种或以上;
核酸分子组合2核酸分子4和/或核酸分子5;
所述核酸分子1具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列;
所述核酸分子2具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:2互补的核苷酸序列;
所述核酸分子3具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3互补的核苷酸序列;
所述核酸分子4具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:4互补的核苷酸序列;
所述核酸分子5具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5互补的核苷酸序列;
所述核酸分子6具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6互补的核苷酸序列;
所述核酸分子7具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7互补的核苷酸序列;
所述核酸分子8具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8互补的核苷酸序列。
本发明还提供了药物,包括上述核酸分子或上述核酸分子组合,以及可接受的辅料或助剂。
本发明还提供了抑制新生血管性眼病的方法,所述新生血管性眼病包括早产儿视网膜病变,包括:
(A)、沉默、下调、敲减或敲除DANCR;
(B)、沉默、下调、敲减或敲除DANCR和ANXA2;
(C)、施用上述药物;
所述药物的制剂方式可以是任何适于眼部局部施用的剂型,包括但不限于滴眼剂、注射剂、气雾剂或脂质体中的一种或多种。
本发明有如下效果:
1.本发明研究发现,相对于正常小鼠视网膜而言,在高氧诱导视网膜病变小鼠的病理性新生血管组织中可检测到异常的DANCR高表达;同样的,相对于常氧条件下培养的视网膜微血管内皮细胞,低氧条件下的视网膜微血管内皮细胞的DANCR表达量升高。
2.在体外,抑制DANCR可减少视网膜血管内皮细胞细胞的活性、增殖与成管,且相比如其他lncRNA(如MALAT1、NEAT1),DANCR的促血管形成的能力更强。沉默ANXA2可抵消DANCR对内皮细胞迁移和成管功能的促进作用,敲除小鼠的DANCR基因减轻小鼠视网膜新生血管的形成。结果表明,不同于其他LncRNA的作用机制,DANCR通过调节ANXA2影响眼部病理性新生血管生成,可通过抑制DANCR和/或ANXA2的表达(包括但不限于敲除、沉默、下调等方式),进而阻止眼部新生血管的生成,从而预防和/或治疗早产儿视网膜病变。
眼内注射抗VEGF药物虽然可以抑制新生血管的形成,但需要反复多次给药。同时部分患者对传统抗VEGF治疗不应答或快速抗药反应,且抗VEGF治疗有一定比例的不良反应,包括眼内炎和闭塞性血管炎等,而本发明公开了DANCR、ANXA2在制备防治早产儿视网膜病变的药物中的应用,本发明研究显示,DANCR通过调节ANXA2影响眼部病理性新生血管生成,可通过有效减少DANCR和/或ANXA2的表达,阻止病理状态下眼部新生血管的生成,用于预防和/或治疗早产儿视网膜病变,为早产儿视网膜病变提供了新的治疗靶点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示OIR小鼠模型建立示意图;
图2示OIR小鼠视网膜DANCR表达差异实验结果;
图3示内皮细胞DANCR表达差异实验结果图;
图4示过表达载体PCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-Puro(8132bp);
图5示内皮细胞过表达DANCR后其DANCR表达水平、细胞活性、细胞抗凋亡能力实验结果图;
图6示内皮细胞过表达DANCR后其迁移能力和DANCR与MALAT1的成管能力实验结果图;
图7示shDANCR-1、shDANCR-1、shDANCR-1敲低DANCR的结果图;
图8示内皮细胞沉默DANCR后其DANCR表达水平和细胞活性实验结果图;
图9示内皮细胞沉默DANCR、NEAT1后其增殖能力和成管能力实验结果图;
图10示siANXA2-1、siANXA2-2敲低ANXA2的结果图;
图11示RNA pull down、RIP和内皮细胞沉默ANXA2后其ANXA2基因和蛋白表达水平实验结果图;
图12A示内皮细胞迁移能力和成管能力实验结果图;
图12B示内皮细胞迁移能力和成管能力实验结果图;
图13示siDANCR-1、siDANCR-2、siDANCR-3敲低DANCR的结果图;
图14示OIR小鼠沉默DANCR后视网膜DANCR基因表达和新生血管情况实验结果图。
具体实施方式
本发明公开了DANCR在制备防治早产儿视网膜病变药物中的应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
应该理解,表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合,除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义,除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”,包括其语法同义语的使用,通常应该被理解为开放性和非限制性的,例如不排除其他未叙述的要素或步骤,除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解,只要本发明仍可操作,步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外,两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用,仅仅打算更好地说明本发明,并且除非提出权利要求,否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外,用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值,此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而,任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此,除非另有明确的说明,应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处,“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。
如无特殊说明,本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品,均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:不同视网膜病变病理样本中DANCR表达量检测
1、高氧诱导视网膜病变小鼠模型和体外视网膜微血管内皮细胞缺氧模型的构建
为探究DANCR与新生血管的作用,选择了氧诱导视网膜病变(OIR)模型,该模型是最常用的早产儿视网膜病变模型,模拟了早产儿视网膜病变的病理过程。模型构建示意图见图1,具体流程如下:a.记录小鼠(C57BL/6j,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司)出生日期,待小鼠饲养到第7天,称量体重,去除比较轻的乳鼠后,将余下的乳鼠和母鼠一起放置在含有75%氧气的动物氧仓内,准备另外一只哺乳期的母鼠交换用;b.监测氧气浓度,维持氧气浓度75±2%,每天交换母鼠,给予正常的食物和水;c.将乳鼠持续饲养放在75%氧仓5天,第12天时将母鼠和乳鼠一起放回正常氧环境中饲养。体外视网膜微血管内皮细胞缺氧模型则是将细胞放入1%氧浓度下培养24小时,对照组则是将细胞放在正常氧浓度下培养24小时。
2、实验方法
将小鼠随机分为正常氧组和OIR组,在出生后14天,取小鼠视网膜组织,使用RNA提取试剂盒(AG21023,艾科瑞,中国)提取RNA,逆转录后通过PCR实验观察DANCR表达情况;将内皮细胞分为正常氧组和低氧组,培养24小时后提取RNA,通过PCR检测观察DANCR表达情况。
3、实验结果
实验结果如图2所示(数据如表1所示),与正常氧组小鼠相比,OIR组小鼠视网膜DANCR表达量明显升高;同时如图3所示(数据如表2所示),与正常氧组内皮细胞相比,低氧组细胞DANCR基因表达量也明显升高。表明DANCR在新生血管中高表达,可能存在促进新生血管生长的作用。
表1:小鼠视网膜DANCR表达量(差异倍数)
DANCR表达量(样本1) | DANCR表达量(样本2) | DANCR表达量(样本3) | |
常氧组 | 0.71 | 0.75 | 1.54 |
OIR组 | 2.45 | 3.15 | 2.45 |
表2:内皮细胞DANCR表达量(差异倍数)
DANCR表达量(样本1) | DANCR表达量(样本2) | DANCR表达量(样本3) | |
常氧组 | 1.04 | 1.00 | 0.97 |
低氧组 | 1.40 | 1.28 | 1.26 |
实施例2:过表达DANCR质粒构建及其对血管内皮细胞的影响及DANCR与其他lncRNA效果的区别
1、实验分组及过表达质粒构建
实验分为空载对照组(oeNC)、DANCR过表达组(oeDANCR)和lncRNA MALAT1过表达组(oeMALAT1)三组。质粒构建:将DANCR(RefSeq序列号NR_145129.1)或MALAT1(RefSeq序列号NR_002819.4)序列亚克隆到带有CMV和EF1A启动子和红色荧光标签的质粒PCDH载体(载体图谱如图4所示)上,获得oeDANCR质粒、oeMALAT1质粒,并通过测序进行验证;对照组采用空载质粒(oeNC)。使用Endofree Plasmid Maxi kit II(DP118,天根,中国)扩增质粒DNA,使用NanoDrop 2000(Thermo,美国)测定质粒浓度。利用lipo3000(Thermo,美国)将目的质粒和慢病毒辅助质粒(pMD2.G和psPAX2)共转染HEK-293T细胞中,培养48小时后收集含有病毒颗粒的上清培养液,分装后-80℃保存。采用qPCR检测基因过表达的影响。
2、实验方法
(1)细胞培养:复苏人视网膜微血管内皮细胞(EC),稳定培养传代1-2代,转染前一天接种细胞到6孔板,控制在贴壁后细胞密度约为30%,每孔加入2ml内皮细胞完全培养基(ECM,1001,sciencell,美国)。转染当天吸出完全培养基,每孔加入2mL新鲜的OPTI-MEM转染基础液(Thermo,美国),用基础液稀释oeNC、oeDANCR和oeMALAT1质粒及Lipo3000分别加入到各组细胞组中,每孔加入质粒为2.5μg。在37℃的细胞培养箱中培养细胞8小时后更换内皮细胞完全培养基并培养细胞48小时后,提取细胞RNA进行逆转录,并通过PCR检测过表达效果。
(2)细胞活性实验:分别将oeNC和oeDANCR转染后的内皮细胞提前一天种到96孔细胞培养板中,24小时后除去原培养基,PBS洗1次。避光,向每个孔加100μl 10%CCK8溶液(MCE,美国),加液时注意不要产生气泡;将培养板放回培养箱,继续孵育4小时;酶标仪测定450nm波长处的吸光值(OD)。
(3)细胞凋亡实验:将oeNC和oeDANCR转染后的内皮细胞常规消化离心后去上清,用无血清ECM培养液重悬后接种到96孔培养板中。在培养箱培养24小时后弃去原培养基,用4%多聚甲醛固定15分钟,去掉PFA,PBS洗1次,加有0.3%Triton X-100的PBS,常温下通透10分钟;弃通透液,用PBS洗2次,每个孔加50μl TUNEL检测液(K1133,Apexbio,美国),37℃避光反应60分钟;弃检测液,PBS洗3次;加入DAPI稀释液,常温下避光孵10min,PBS洗3min,重复3次;每孔滴加少许抗荧光淬灭剂,尽快用荧光显微镜观察、拍照。
(4)细胞迁移实验:将oeNC和oeDANCR转染后的内皮细胞常规消化离心后去上清,用无血清ECM培养液重悬后接种到Transwell培养板(康宁,美国)上室中,下室加入含血清的ECM完全培养基培养基,注意避免上下室产生气泡。培养板在培养箱培养24小时后弃去原培养基,用4%多聚甲醛固定10分钟,蒸馏水洗涤2次后每孔加结晶紫染液索莱宝,中国)常温下孵20分钟。染色结束后用棉签去除小室上层细胞,用普通显微镜进行观察拍照和统计分析。
(5)细胞成管实验:将基质胶Matrigel(356231,康宁,美国)和移液器枪头放于4℃预冷。再96孔板中每孔加入50微升的基质胶平铺,避免产生气泡,随后将96孔板放入37℃培养箱中孵育30分钟,让基质胶凝固。分别将oeNC、oeDANCR和oeMALAT1转染后的内皮细胞进行种板,每孔细胞量为10000个,并加入新的培养基。6小时后在显微镜下观察拍照,记录细胞的成管形态。
3、实验结果
实验结果如图5、6所示,与对照组相比,DANCR过表达组(oeDANCR)明显上调DANCR基因表达(图5中的A,数据如表3所示),在EC中过表达DANCR可增强细胞的细胞活性(图5中的B,数据如表4所示)、抗凋亡能力(图5中的C,数据如表5所示)、细胞密度(图5中的C,数据如表6所示)、迁移能力(图6中的A)与成管能力(图6中的B),且DANCR促血管生成能力比MALAT1更强。
表3:DANCR表达量(差异倍数)
分组 | DANCR表达量(样本1) | DANCR表达量(样本2) | DANCR表达量(样本3) |
oeNC | 0.96 | 1.03 | 1.01 |
oeDANCR | 18965.78 | 18319.74 | 17532.91 |
表4:细胞活性
分组 | OD 450nm(样本1) | OD 450nm(样本2) | OD 450nm(样本3) | OD 450nm(样本4) |
oeNC | 0.349 | 0.336 | 0.324 | 0.351 |
oeDANCR | 0.861 | 0.870 | 0.788 | 0.703 |
表5:Tunel阳性细胞比例(%)
分组 | Tunel阳性比(样本1) | Tunel阳性比(样本2) | Tunel阳性比(样本3) |
oeNC | 5.70 | 7.01 | 6.85 |
oeDANCR | 1.75 | 2.82 | 1.99 |
表6:细胞密度(cells/mm2)
分组 | 细胞密度(样本1) | 细胞密度(样本2) | 细胞密度(样本3) |
oeNC | 412.26 | 513.25 | 444.08 |
oeDANCR | 630.84 | 687.57 | 625.31 |
表7:迁移细胞数
分组 | 迁移细胞数(样本1) | 迁移细胞数(样本2) | 迁移细胞数(样本3) |
oeNC | 98.25 | 86.25 | 87.5 |
oeDANCR | 134.75 | 132.5 | 139.5 |
表8:新生血管分指数(%)
分组 | 新生血管分支数(样本1) | 新生血管分支数(样本2) | 新生血管分支数(样本3) |
oeNC | 0.97 | 0.95 | 1.08 |
oeMALAT1 | 1.08 | 1.16 | 0.79 |
oeDANCR | 1.32 | 2.20 | 1.98 |
实施例3:沉默DANCR及其对血管内皮细胞的影响及DANCR与其他lncRNA效果的区别
1、实验分组及沉默细胞构建
实验分为对照序列组(shNC)、LncRNA NEAT1敲减组(shNEAT1)与DANCR敲减组(shDANCR)两组。
质粒构建:
沉默靶标序列包括shDANCR-1序列:GCGCCACTATGTAGCGGGTTT(SEQ ID NO:1);shDANCR-2序列:GGCCTCTTTGTCAGCTGGAGT(SEQ ID NO:2)和shDANCR-3序列:GCTCCAGGAGTTCGTCTCTTA(SEQ ID NO:3),三者皆能有效敲低DANCR的表达,但实验表明shDANCR-3效率最高(如图7和表9所示),因此选用shDANCR-3进行后续实验。
表9
分组 | DANCR表达量(样本1) | DANCR表达量(样本2) | DANCR表达量(样本3) |
shNC | 0.99 | 1.01 | 1.01 |
shDANCR-1 | 0.76 | 0.78 | 0.78 |
shDANCR-2 | 0.91 | 0.85 | 0.87 |
shDANCR-3 | 0.65 | 0.62 | 0.61 |
采用GV298载体构建沉默质粒。shNEAT1质粒为上海吉凯基因医学科技股份有限公司购买。将lipo3000转染试剂、含目的序列的沉默质粒、pMD2.G和psPAX2慢病毒包装质粒共转染HEK-293T细胞以获得病毒液。
2、实验方法
(1)细胞培养:复苏人视网膜微血管内皮细胞(EC),稳定培养传代1-2代,转染前一天将对数生长期细胞消化、重悬后,接种在6cm培养皿中培养过夜。第二天,更换新鲜培养基,同时加入含有目的基因的病毒液以及5μg/ml聚凝胺,混合均匀后,置于培养箱中继续培养;6小时后换液,然后继续培养48小时,之后用2μg/ml嘌呤霉素进行细胞筛选,筛选3天后的细胞即为shNC、shNEAT1和shDANCR细胞。
(2)细胞增殖实验:分别将shNC和shDANCR转染后的内皮细胞提前一天种到细胞培养板种,24小时后将Edu(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine,C0071S,碧云天,中国)添加到培养基中,使其浓度为10微摩尔/升,将细胞在37℃,5%二氧化碳的细胞培养箱中培养2小时,然后使用4%的多聚甲醛溶液室温固定15分钟。加入试剂盒中的Click反应液室温避光孵育30分钟行染色处理,结束后用共聚焦显微镜(LSM880,蔡司,德国)观察拍照和图像分析,计算细胞的增殖率。
(3)成管实验同实施例2。
3、实验结果
实验结果如图8、9所示,与对照组相比,DANCR敲减组中DANCR基因表达成功下调(图8中的A,数据如表10所示),在内皮细胞中敲减DANCR可降低细胞的细胞活性(图8中的B,数据如表11所示)、增殖能力(图9中的A,数据如表12所示)与成管能力(图9中的B,数据如表13所示),且敲减DANCR比敲减LncRNA NEAT1更能抑制新生血管的形成(图9中的B,数据如表13所示)。
表10:DANCR表达量
分组 | DANCR表达量(样本1) | DANCR表达量(样本2) | DANCR表达量(样本3) |
shNC | 1.05 | 0.97 | 0.98 |
shDANCR | 0.341 | 0.39 | 0.32 |
表11:细胞活性
分组 | OD 450nm(样本1) | OD 450nm(样本2) | OD 450nm(样本3) | OD 450nm(样本4) |
shNC | 0.65 | 0.68 | 0.66 | 0.66 |
shDANCR | 0.44 | 0.51 | 0.51 | 0.47 |
表12:增殖能力
分组 | Edu阳性百分比(样本1) | Edu阳性百分比(样本1) | Edu阳性百分比(样本1) |
shNC | 67.77 | 58.34 | 51.33 |
shDANCR | 41.14 | 43.17 | 38.42 |
表13:成管能力
分组 | 新生血管分支数(样本1) | 新生血管分支数(样本2) | 新生血管分支数(样本3) |
shNC | 0.97 | 0.95 | 1.08 |
shNEAT1 | 1.03 | 1.10 | 0.99 |
shDANCR | 0.93 | 0.61 | 0.55 |
实施例4:DANCR通过影响ANXA2对血管内皮细胞的影响
1、实验分组
实验分为常氧+过表达对照序列组(NO+oeNC)、低氧+oeNC组(HO+oeNC)、低氧+过表达DANCR组(HO+oeDANCR)、低氧+oeDANCR+siRNA(小干扰核糖核酸)对照序列组(HO+oeDANCR+siNC)与低氧+oeDANCR+ANXA2-siRNA组(HO+oeDANCR+siANXA2)。ANXA2-siRNA构建:沉默靶标序列包括siANXA2-1序列:GTCTGTCAAAGCCTATACT(SEQ ID NO:4)和siANXA2-2序列:CGGCTGTATGACTCCATGA(SEQ ID NO:5),两者皆能有效敲低ANXA2的表达,但实验表明siANXA2-1效率更高(如图10和表14所示),因此选用siANXA2-1进行后续实验。
表14
分组 | ANXA2表达量(样本1) | ANXA2表达量(样本2) | ANXA2表达量(样本3) |
siNC | 0.97 | 1.02 | 1.01 |
siANXA2-1 | 0.71 | 0.71 | 0.68 |
siANXA2-2 | 0.71 | 0.73 | 0.74 |
2、实验方法
(1)RNA下拉实验(RNA Pull Down):先设计包含T7启动子的体外转录引物,包括DANCR正义链(sense)和反义链(Antisense),经体外转录后获得DANCR RNA和AntisenseRNA后通过使用RNA pull down试剂盒(Thermo,美国)富集DANCR结合蛋白。蛋白电泳后通过银染结果进行DANCR结合蛋白的鉴定。
(2)RNA免疫共沉淀实验(RIP):根据RIP试剂盒(RN1001,MBL,日本)步骤,先将Protein A/G琼脂糖微珠与ANXA2抗体或阴性对照抗体结合,利用抗体-微珠结合细胞裂解物中的可以和ANXA2结合的RNA,再经过洗涤将靶RNA从微珠上洗脱,并通过PCR鉴定DANCR是否和ANXA2结合。
(3)细胞迁移实验同实施例2。
(4)成管实验同实施例2。
3、实验结果
如图11中的A所示,在内皮细胞中,DANCR可结合ANXA2蛋白;同时如图11中的B所示,ANXA2可以下拉DANCR的RNA,所以从正反两方面证明了DANCR与ANXA2可相互结合作用。与对照组(siNC)相比,ANXA2敲减组(siANXA2)中ANXA2的RNA和蛋白表达成功下调(图11中的C,数据如表15所示;图12中的D,数据如表16所示)。如图12所示,敲减ANXA2可抵消DANCR对内皮细胞迁移(图12A,数据如表17所示)和成管能力(图12B,数据如表18所示)的促进作用,说明DANCR通过调节ANXA2来影响内皮细胞功能。
表15:ANXA2表达量
表16:ANXA2/β-actin
分组 | ANXA2/β-actin(样本1) | ANXA2/β-actin(样本2) | ANXA2/β-actin(样本3) |
siNC | 1.13 | 1.11 | 0.77 |
siANXA2 | 0.77 | 0.36 | 0.40 |
表17:细胞迁移
分组 | 迁移细胞数(样本1) | 迁移细胞数(样本2) | 迁移细胞数(样本3) |
NO+oeNC | 62.5 | 60.75 | 60 |
HO+oeNC | 98.25 | 86.25 | 87.5 |
HO+oeDANCR | 134.75 | 132.5 | 139.5 |
HO+oeDANCR+shNC | 97.75 | 92.25 | 95.75 |
HO+oeDANCR+shANXA2 | 58.75 | 61.25 | 55.75 |
表18:成管能力
实施例5:沉默DANCR对高氧诱导的小鼠视网膜新生血管的治疗作用
1、实验分组及高氧诱导视网膜病变小鼠模型的构建
利用氧诱导视网膜病变(OIR)模型探究DANCR对新生血管的作用,造模方法同实施例1。实验分组:初生小鼠被随机均匀地分为四组-正常氧组(Control)、OIR组、OIR+对照阴性siRNA组(OIR+siNC)、OIR+DANCR-siRNA组(OIR+siDANCR)。沉默靶标序列包括DANCR-siRNA-1(siDANCR-1)序列:CCTGAAGGTAGTTTGCTAA(SEQ ID NO:6)、DANCR-siRNA-2(siDANCR-2)序列:CCTGTATATTGTTGCCTAT(SEQ ID NO:7)和DANCR-siRNA-3(siDANCR-3)序列:GCATGTAGTGACCAGGTTT(SEQ ID NO:8),三者皆能有效敲低DANCR的表达,但实验表明siDANCR-1效率最高(如图13和表19所示),因此选用shDANCR-1进行后续实验。
表19
分组 | DANCR表达量(样本1) | DANCR表达量(样本2) | DANCR表达量(样本3) |
siNC | 0.93 | 1.02 | 1.06 |
DANCR-siRNA-1 | 0.48 | 0.49 | 0.48 |
DANCR-siRNA-2 | 0.55 | 0.54 | 0.46 |
DANCR-siRNA-3 | 0.75 | 0.71 | 0.74 |
2、实验方法
在出生后第12天,OIR+对照阴性siRNA组和OIR+DANCR-siRNA组小鼠拿回到正常氧环境,并且使用汉密尔顿微量注射器(33G针头)通过玻璃体腔每只眼分别注射1nmol对照阴性siRNA和DANCR-siRNA。在出生后14天,取小鼠视网膜组织提取RNA,逆转录后精选PCR检测;在出生后17天取眼球固定,取视网膜铺片,进行植物凝集素(IB4)血管特异性染色,在共聚焦显微镜下观察视网膜血管发育程度。
3、实验结果
实验结果如图14所示,与OIR+对照阴性siRNA组小鼠相比,OIR+DANCR-siRNA组小鼠DANCR表达量明显降低(图14中的A,数据如表20所示),且新生血管区和无灌注区面积明显减小(图14中的B,数据如表21所示)。
表20:DANCR表达量
分组 | DANCR表达量(样本1) | DANCR表达量(样本2) | DANCR表达量(样本3) |
Control | 0.71 | 0.75 | 1.54 |
OIR | 2.45 | 3.15 | 2.45 |
OIR+siNC | 0.63 | 0.48 | 0.56 |
OIR+siDANCR | 0.34 | 0.28 | 0.34 |
表21:新生血管比例
以上结果表明,DANCR和ANXA2与眼部病理性新生血管生成相关,可通过抑制DANCR的表达(包括但不限于敲除、沉默、下调等方式),进而阻止眼部新生血管的生成,从而预防和/或治疗早产儿视网膜病变。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.DANCR抑制剂在如下任一项中的应用:
(I)、抑制新生血管性眼病;
(II)、制备抑制新生血管性眼病的药物;
所述新生血管性眼病包括早产儿视网膜病变。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述DANCR抑制剂包括敲除或敲减DANCR的基因编辑试剂、沉默或下调DANCR表达的RNA干扰试剂或靶向DANCR的小分子抑制剂中的一种或多种;
所述基因编辑试剂包括靶向DANCR基因的CRISPR/Cas试剂,所述CRISPR/Cas试剂包括sgRNA;
所述RNA干扰试剂包括siRNA或shRNA。
3.如权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述DANCR抑制剂包括shDANCR和/或siDANCR;
所述shDANCR具有:
(1)、如SEQ ID NO:1、2或3所示的核苷酸序列,或与SEQ ID NO:1、2或3互补的核苷酸序列;或
(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且功能与(1)的相同或相似;或
(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90%同源性的核苷酸序列;
所述siDANCR具有:
(4)、如SEQ ID NO:6、7或8所示的核苷酸序列,或与SEQ ID NO:6、7或8互补的核苷酸序列;或
(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且功能与(4)的相同或相似;或
(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有90%同源性的核苷酸序列;
所述多个为2个至5个。
4.ANXA2抑制剂和如权利要求1至3任一项所述的应用中所述的DANCR抑制剂在如下任一项中的应用:
(I)、抑制新生血管性眼病;
(II)、制备抑制新生血管性眼病的药物;
所述新生血管性眼病包括早产儿视网膜病变。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述ANXA2抑制剂包括敲除或敲减ANXA2的基因编辑试剂、沉默或下调ANXA2表达的RNA干扰试剂或靶向ANXA2的小分子抑制剂中的一种或多种;
所述基因编辑试剂包括靶向ANXA2基因的CRISPR/Cas试剂,所述CRISPR/Cas试剂包括sgRNA;
所述RNA干扰试剂包括siRNA或shRNA。
6.如权利要求4或5所述的应用,其特征在于,所述ANXA2抑制剂包括siANXA2;
所述siANXA2具有:
(7)、如SEQ ID NO:4或5所示的核苷酸序列,或与SEQ ID NO:4或5互补的核苷酸序列;或
(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且功能与(7)的相同或相似;或
(9)、与如(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有90%同源性的核苷酸序列;
所述多个为2个至5个。
7.核酸分子,其特征在于,具有:
(10)、如SEQ ID NO:1~8任一所示的核苷酸序列,或与SEQ ID NO:1~8任一者互补的核苷酸序列;或
(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且功能与(10)的相同或相似;或
(12)、与如(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有90%同源性的核苷酸序列;
所述多个为2个至5个。
8.核酸分子组合,其特征在于,包括核酸分子组合1和/或核酸分子组合2;
核酸分子组合1包括核酸分子1、核酸分子2、核酸分子3、核酸分子6、核酸分子7或核酸分子8中的两种或以上;
核酸分子组合2核酸分子4和/或核酸分子5;
所述核酸分子1具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列;
所述核酸分子2具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:2互补的核苷酸序列;
所述核酸分子3具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3互补的核苷酸序列;
所述核酸分子4具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:4互补的核苷酸序列;
所述核酸分子5具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5互补的核苷酸序列;
所述核酸分子6具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6互补的核苷酸序列;
所述核酸分子7具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7互补的核苷酸序列;
所述核酸分子8具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8互补的核苷酸序列。
9.药物,其特征在于,包括如权利要求7所述的核酸分子或如权利要求8所述的核酸分子组合,以及可接受的辅料或助剂。
10.抑制新生血管性眼病的方法,所述新生血管性眼病包括早产儿视网膜病变,其特征在于,包括:
(A)、沉默、下调、敲减或敲除DANCR;
(B)、沉默、下调、敲减或敲除DANCR和ANXA2;
(C)、施用如权利要求9所述的药物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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CN202410247981.3A CN118105402A (zh) | 2024-03-05 | 2024-03-05 | 一种针对早产儿视网膜病变防治的干扰序列及其应用 |
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