CN113151403B

CN113151403B - 一种dna及其甲基化水平的检测试剂盒和制备方法、应用

Info

Publication number: CN113151403B
Application number: CN202110366210.2A
Authority: CN
Inventors: 邹纲; 杨珂昕
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2021-04-06
Filing date: 2021-04-06
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2041-04-06
Also published as: CN113151403A

Abstract

本发明涉及DNA的检测分析领域，特别涉及一种DNA及其甲基化水平的检测试剂盒和制备方法、应用。该检测试剂盒包括ssDNA1修饰的壳聚糖纤维、ssDNA2修饰的金纳米粒子；ssDNA1为与目的DNA一端序列互补的ssDNA；ssDNA2为与目的DNA另一端序列互补的ssDNA；壳聚糖纤维为带有荧光标记的壳聚糖纤维。本发明检测方法对p16及其甲基化显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确，检测手段简单。

Description

一种DNA及其甲基化水平的检测试剂盒和制备方法、应用

技术领域

本发明涉及DNA的检测分析领域，特别涉及一种DNA及其甲基化水平的检测试剂盒和制备方法、应用。

背景技术

DNA甲基化通常发生在CpG岛上，是在DNA甲基化转移酶的催化作用下，在胞嘧啶环的第五位碳上加入一个甲基化基团，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的过程。DNA甲基化在基因表达和调控、维持基因组稳定性、X染色体失活和哺乳动物细胞方面扮演着重要角色。肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态的变化可导致肿瘤抑制基因的转录沉默，因此被视为各种疾病和癌症的标志。已经开发了许多传统的DNA甲基化检测方法，但是这些方法都有一定的局限性，比如亚硫酸氢盐的处理可能会由于氧化损伤导致DNA降解，这对于甲基化的检测可能会产生误导性的结果；HPLC和MS只能测量整体甲基胞嘧啶的含量，且需要大量输入DNA和复杂仪器。

荧光检测方法由于其灵敏度高、操作简单，目前正在获得越来越多的关注。然而，目前荧光传感器具有一些特殊的局限性，如在复杂环境中稳定性低、与背景荧光光谱相重叠等等。此前我们已经开发了基于聚二乙炔微米管对miRNA-21进行检测的光波导传感器，但是其对于DNA甲基化检测的应用尚未探究过。此外，合成聚二乙炔微米管的步骤繁琐且成本高昂，因此开发一种新型的基于荧光的光波导传感器对DNA甲基化进行高特异性和高灵敏度地检测仍然是一项非常有挑战性的任务。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种DNA及其甲基化水平的检测试剂盒和制备方法、应用。本发明采用了壳聚糖天然高分子材料，本发明制备了一维壳聚糖纤维，并结合荧光共振能量转移机制、DNA的三明治杂交、浓缩富集效应等，构筑了高灵敏度、高选择性的新型生物传感器用于p16等DNA及其甲基化的检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种DNA的检测试剂盒，包括ssDNA1修饰的壳聚糖纤维、ssDNA2修饰的金纳米粒子；ssDNA1为与目的DNA一端序列互补的ssDNA；ssDNA2为与目的DNA另一端序列互补的ssDNA；壳聚糖纤维为带有荧光标记的壳聚糖纤维。

在本发明提供的具体实施例中，荧光标记为FITC。但荧光标记种类并非限定于此，本领域技术人员认可的种类均在本发明的保护范围之内。

在本发明提供的具体实施例中，目的DNA为p16。但DNA的种类并非限定于此，本领域技术人员认可的种类均在本发明的保护范围之内。

本发明方法基于目标分子p16与ssDNA1、ssDNA2的杂交，形成三明治结构，通过ssDNA2修饰的金纳米粒子，使壳聚糖纤维端头光波导荧光信号淬灭。随着浓缩富集反应，低浓度的p16就可产生高的信号，从而实现目标的检测。该检测方法对p16及其甲基化显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

本发明还提供了该检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

将壳聚糖、荧光素溶于溶剂中，得到壳聚糖溶液，浓缩，制成纤维；除去纤维表面的溶剂，干燥，表面修饰环氧基团，得到环氧修饰的壳聚糖纤维；氨基修饰的ssDNA1与环氧修饰的壳聚糖纤维发生反应，得到ssDNA1修饰的壳聚糖纤维；

将金纳米粒子与巯基修饰的ssDNA2进行孵育，得到ssDNA2修饰的金纳米粒子。

作为优选，以g/mg/mL计，壳聚糖溶液中壳聚糖、荧光素与溶剂的比例为(0.5～5)：(1～10)：(10～50)。

作为优选，表面修饰环氧基团的方法为：乙二醇二缩水甘油醚与壳聚糖纤维在25～30℃条件下反应10～20h；

作为优选，氨基修饰的ssDNA1与环氧修饰的壳聚糖纤维发生反应的温度为15～35℃，时间为3～6h。

作为优选，溶剂为三氟乙酸。

本发明还提供了一种非诊断目的检测DNA的方法，采用上述检测试剂盒进行检测，具体为：

将ssDNA1修饰的壳聚糖纤维与经解链处理的待检测样品进行杂交反应，得到第一杂交产物；

将ssDNA2修饰的金纳米粒子与第一杂交产物进行杂交反应，得到第二杂交产物；

检测第二杂交产物的光波导荧光亮度，若荧光发生淬灭，则待检测样品中含有目的DNA，目的DNA的浓度根据标准曲线获得；若荧光未发生淬灭，则待检测样品中不含有目的DNA。

作为优选，杂交反应的温度为36～38℃，时间为1～3h。

本发明还提供了一种DNA甲基化水平的检测试剂盒，包括ssDNA1修饰的壳聚糖纤维、ssDNA2修饰的金纳米粒子和目的DNA甲基化标准试剂；ssDNA1为与目的DNA一端序列互补的ssDNA；ssDNA2为与目的DNA另一端序列互补的ssDNA；壳聚糖纤维为带有荧光标记的壳聚糖纤维。

本发明还提供了一种非诊断目的检测DNA甲基化水平的方法，采用上述检测试剂盒进行检测，具体为：

检测第二杂交产物的光波导荧光亮度，根据标准曲线获得目的DNA甲基化水平。

本发明提供了一种DNA及其甲基化水平的检测试剂盒和制备方法、应用。该检测试剂盒包括ssDNA1修饰的壳聚糖纤维、ssDNA2修饰的金纳米粒子；ssDNA1为与目的DNA一端序列互补的ssDNA；ssDNA2为与目的DNA另一端序列互补的ssDNA；壳聚糖纤维为带有荧光标记的壳聚糖纤维。本发明的技术效果如下：

本发明提供了一种DNA修饰的壳聚糖纤维光波导传感器对于p16及其甲基化的灵敏检测方法。本方法是基于三明治杂交的壳聚糖纤维光波导传感平台，通过p16、ssDNA1和ssDNA2三种寡核苷酸的杂交形成三明治结构，从而通过ssDNA2修饰的金纳米粒子淬灭壳聚糖纤维的荧光。通过壳聚糖纤维端头光波导信号的变化，可实现目标DNA的定量检测。同时，结合了浓缩富集的信号放大策略，提高了传感平台的灵敏度。该检测方法对p16及其甲基化显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确，检测手段简单。

附图说明

图1：实施例1ssDNA1修饰微米管的过程；a图为壳聚糖纤维修饰上ssDNA1的过程，b图为X射线光电子能谱；从X射线光电子能谱图中可以看出，在与DNA反应前，壳聚糖纤维不具有P的特征峰，当修饰上ssDNA1后，在133.4eV处出现了P的特征峰，说明了ssDNA1成功修饰在了壳聚糖表面；通过测溶液中ssDNA1反应前后变化的量及壳聚糖纤维的表面积，计算得到壳聚糖纤维表面接枝ssDNA1的密度为0.14amol/um²(0.8条DNA/nm²)；

图2：实施例2金纳米粒子的表征；将制备成功的金纳米粒子溶液滴在铜网上，干了之后送样进行透射电镜的观察；从透射电镜可看出，所合成的金纳米粒子粒径约为50nm，形态为典型的球形；通过紫外分光光度计测得制备的金纳米粒子的紫外吸收峰在525nm，与壳聚糖的荧光发射光谱可以很好地重叠；

图3：实施例3金纳米粒子修饰ssDNA2的拉曼光谱和动态光散射变化；从拉曼光谱可以看出，通过冷冻-解冻法使金纳米粒子与巯基修饰的ssDNA2之间形成了Au-S键，即ssDNA2与金纳米粒子通过Au-S键相连；从动态光散射数据可以看出，经过冷冻-解冻之后金纳米粒子的平均直径从53.71nm增加到了69.62nm，而ssDNA2的长度估算为16nm，说明冷冻-解冻法成功将ssDNA2修饰到了金纳米粒子上；

图4：实施例4壳聚糖纤维接上金纳米粒子的SEM照片、EDS光谱；a图为ssDNA1-壳聚糖纤维和p16、ssDNA2金纳米粒子杂交后，壳聚糖纤维端头荧光淬灭过程；b图为xps光谱，i为ssDNA-微米管的xps光谱，ii为ssDNA1-微米管和ssDNA2杂交后的xps光谱，说明杂交后微米管表面有金元素，证明杂交成功；

图5：实施例5将ssDNA1-壳聚糖纤维置于离心管中，滴加20μL的p16溶液，95℃退火5min后在37℃下进行杂交反应2h，反应结束后将壳聚糖纤维洗涤干净；p16的浓度由10nM降低至10pM；然后滴加20μL的ssDNA2-金纳米粒子溶液，在37℃下进行杂交反应2h后将壳聚糖纤维洗涤干净，观察壳聚糖纤维端头光波导荧光亮度的变化；当体系中存在p16时，其一端会与ssDNA1杂交，而另一端会与ssDNA2杂交，从而使金纳米粒子绑定在壳聚糖纤维表面，使其荧光淬灭；逐渐降低p16的浓度，由10nM到10pM，得到检测极限为2pM；

图6：实施例6分别向五根ssDNA1-壳聚糖纤维滴加20μL分别含有p16、单碱基错配p16、三碱基错配p16、RASSF1A、p53的溶液；只有加入p16时，壳聚糖纤维的荧光才会淬灭，说明本文的方法对于p16有较好的检测专一性；

图7：实施例7将甲基化和非甲基化p16配制成一系列总DNA浓度相同(10nM)但甲基化比例不同的的混合溶液，分别含有100％、50％、10％、5％、1％的甲基化p16；分别在五根壳聚糖纤维上滴加20μL包含ssDNA2-金纳米粒子及不同甲基化比例p16溶液后，观察壳聚糖纤维端头光波导荧光变化；发现随着甲基化比例减小，荧光变化也减小，说明壳聚糖纤维可以检测p16的甲基化水平。

具体实施方式

本发明公开了一种DNA及其甲基化水平的检测试剂盒和制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

p16：p16基因又叫MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，是1994年美国冷泉港实验室Kamb等发现的新抗癌基因，这是一种细胞周期中的基本基因，直接参与细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，在人类50％肿瘤细胞株纯发现有纯合子缺失，突变，认为是比p53更重要的一种新型抗癌基因。有人把它比作细胞周期中的刹车装置，一旦失灵则会导致细胞恶性增殖，导致恶性肿瘤发生。P16基因已经在肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中发现纯合子缺失以及无义，错义及移码突变，表明p16基因以缺失，突变方式广泛参与肿瘤形成，检测p16基因有无改变对判断患者肿瘤的易感性以及预测肿瘤的预后，具有十分重要的临床意义。

ssDNA：单链DNA(single－stranded DNA)，大部分DNA以双螺旋结构存在，但一经热或碱处理就会变为单链状态。

FITC：一般是指异硫氰酸荧光素。异硫氰酸荧光橙红，异硫氰酸荧光黄，异硫氰酸荧光红，异硫氰酸荧光素异构体I，5-异硫氰酸荧光素。其形态为黄色粉末，有吸湿性，是一种生化试剂，也是医学诊断药物，可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。

本发明试剂盒制备方法如下：

步骤1、向15mL三氟乙酸中加入1.2g的壳聚糖以及3mg的FITC，在25℃下机械搅拌过夜形成均匀的壳聚糖溶液。将溶液真空干燥除去多余的三氟乙酸，形成较为浓稠的壳聚糖溶液。用干净的玻璃棒将其拉成长度、粗细均匀的纤维。将制好的纤维放入真空干燥箱，除去纤维中多余的三氟乙酸。然后将纤维在10％的NaOH凝固浴中浸泡30min中和掉残余的三氟乙酸，再用超纯水清洗掉表面的NaOH，最后干燥即可。制备好的壳聚糖纤维用乙二醇二缩水甘油醚进行表面修饰，使表面带有环氧基团，以便与带有氨基的DNA进行反应。具体操作是将乙二醇二缩水甘油滴在壳聚糖纤维表面，在25℃下反应过夜，然后用纯水冲洗干净并干燥即可，得到壳聚糖纤维。具体的，取10μL乙二醇二缩水甘油醚稀释至100μL，加入壳聚糖纤维，25℃下反应过夜，得到环氧修饰的壳聚糖纤维。

步骤2、将氨基修饰的ssDNA1(1uM)与环氧修饰的壳聚糖纤维在室温下反应6小时，得到ssDNA1修饰的壳聚糖纤维。具体的，将环氧修饰的壳聚糖纤维与10μL氨基修饰的ssDNA1混合均匀，在25℃反应6h，得到ssDNA1修饰的壳聚糖纤维。

步骤3、通过种子生长法制备出的金纳米粒子，与巯基修饰的ssDNA2(ssDNA1可和ssDNA2互补配对)进行孵育，得到ssDNA2修饰的金纳米粒子。通过碱基互补配对原则，将ssDNA1-壳聚糖纤维、p16与ssDNA2-金纳米粒子杂交配对形成三明治结构。杂交后，金纳米粒子和壳聚糖纤维距离缩进至10nm以下，使金纳米粒子能够淬灭壳聚糖纤维的荧光。通过这一步骤，使壳聚糖纤维端头光波导荧光淬灭。

本发明检测方法如下：

步骤1、将ssDNA1-壳聚糖纤维置于离心管中，滴加20μL p16溶液，在37℃下进行杂交反应2h后将壳聚糖纤维洗涤干净。p16的浓度由10nM降低至10pM。然后滴加20μL的ssDNA2-金纳米粒子溶液，在37℃下进行杂交反应2h后将壳聚糖纤维洗涤干净，观察壳聚糖纤维端头光波导荧光亮度的变化。当体系中存在p16时，其一端会与ssDNA1杂交，而另一端会与ssDNA2杂交，从而使金纳米粒子绑定在壳聚糖纤维表面，使其荧光淬灭。以p16浓度为横坐标，以壳聚糖纤维端头的光波导荧光亮度变化为纵坐标，作图。结合浓缩富集原理，在离心管中进行反应，可以降低反应极限。改变p16浓度，由10nM到10pM，得到检测极限为pM量级。

步骤2、分别向五根ssDNA1-壳聚糖纤维上滴加20μL包含ssDNA2-金纳米粒子及分别含有p16、单碱基错配p16、三碱基错配p16、RASSF1A、p53的溶液。只有加入p16时，壳聚糖纤维的荧光才会淬灭，说明壳聚糖纤维具有很好的目标选择性。

步骤3、将甲基化和非甲基化p16配制成一系列总DNA浓度相同(10nM)但甲基化比例不同的的混合溶液，分别含有100％、50％、10％、5％、1％的甲基化p16。分别在五根壳聚糖纤维上滴加20μL包含ssDNA2-金纳米粒子及不同甲基化比例p16溶液后(或者，分别在五根壳聚糖纤维上滴加20μL包含不同甲基化比例p16溶液，反应完成后再分别向五根壳聚糖纤维滴加20μL ssDNA2-金纳米粒子溶液)，观察壳聚糖纤维端头光波导荧光变化。发现随着甲基化比例减小，荧光变化也减小，说明壳聚糖纤维可以检测p16的甲基化水平。

本发明提供的DNA及其甲基化水平的检测试剂盒和制备方法、应用中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

取10μL乙二醇二缩水甘油醚稀释至100μL，加入壳聚糖纤维，25℃下反应过夜，得到环氧修饰的壳聚糖纤维。将环氧修饰的壳聚糖纤维与10μL氨基修饰的ssDNA1(序列为：5’-GCCGGACGCCTG-3’)混合均匀，在25℃反应6h，得到ssDNA1修饰的壳聚糖纤维。将与DNA反应前后的壳聚糖纤维送去测试X射线光电子能谱。从X射线光电子能谱图(图1)中可以看出，在与DNA杂交前，壳聚糖纤维不具有P的特征峰，当与DNA杂交后，在133.4eV处出现了P的特征峰。说明了DNA成功修饰在了壳聚糖表面。通过测溶液中ssDNA1反应前后变化的量及壳聚糖纤维的表面积，计算得到壳聚糖纤维表面接枝ssDNA1的密度为0.14amol/um²(0.8条DNA/nm²)。

实施例2

通过种子生长法制备出的金纳米粒子，与巯基修饰的ssDNA2(序列为：5’-GAACGCAACTCC-3’)进行孵育，得到ssDNA2修饰的金纳米粒子。制备金纳米粒子及金纳米粒子接DNA的过程如下：首先，分别配制浓度为0.1M的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液、0.01M的氯金酸水溶液、0.01M的硼氢化钠水溶液、0.01M的抗坏血酸水溶液、0.01M的硝酸银水溶液。随即开始制备金纳米粒子所需的种子液，在7.5mL的CTAB中加入250uL氯金酸水溶液搅拌均匀，随即加入600uL硼氢化钠溶液(硼氢化钠溶液在冰箱中-20℃的温度下保存10分钟)，在转速为400转每分钟的条件下搅拌两分钟，使溶液充分反应均匀。两分钟后得到茶棕色的金种子溶液，在室温下稳定放置1小时后使用。之后配制生长液，在机械搅拌转速为250转每分钟的情况下，向32mL超纯水中先后加入6.4mL的CTAB溶液、800uL的氯金酸水溶液、4.8mL抗坏血酸溶液。将金种子溶液用超纯水稀释10倍，然后取60uL金种子溶液加入生长液中，搅拌1min后停止。保持温度在25～30℃之间静置一夜，第二天即可得到金纳米粒子溶液(图2)。整个过程要求避光操作。

实施例3

用冻融法制备ssDNA2修饰的金纳米粒子。将巯基修饰的ssDNA2与金纳米粒子以金纳米粒子表面每nm²有3条DNA单链的比例进行混合，放入冰箱在-20℃下进行冷冻。待冷冻完全后取出，在室温下缓慢解冻，之后再进行离心除去多余未反应的ssDNA2，便得到了ssDNA2修饰的金纳米粒子(图3)。最终将制备好的ssDNA2-金纳米粒子置于4℃冰箱保存。

实施例4

通过碱基互补配对原则，将ssDNA1-壳聚糖纤维与p16和ssDNA2-金纳米粒子杂交配对。杂交所使用的缓冲溶液为TAE缓冲溶液。

将ssDNA1-壳聚糖纤维置于离心管中，浸没于20μL的p16溶液中，置于95℃的水浴环境中5分钟。之后将水浴锅缓慢降温至室温，降温时间约为1h-2h。反应完成后，用针管从p16溶液中挑出ssDNA1-壳聚糖纤维，用TAE缓冲溶液轻轻地冲洗纤维数次，除去吸附的p16。之后将ssDNA1-壳聚糖纤维置于离心管中，浸没于20μL的ssDNA2-金纳米粒子溶液中，并在37℃下反应2h。反应完成后，用针管将壳聚糖纤维挑出，用TAE缓冲溶液轻轻地冲洗纤维数次，除去吸附的ssDNA2-金纳米粒子。通过这一步骤，使纤维端头光波导荧光淬灭。修饰上金纳米粒子的纤维的SEM照片见图4(a)。通过SEM照片可以看到，在杂交形成三明治结构后，壳聚糖纤维表面能观察到金纳米粒子。修饰上金纳米粒子的纤维的EDS光谱见图4(b)。通过EDS能谱数据可以看出，在杂交形成三明治结构后，壳聚糖纤维微区上出现了Au元素。这些都说明金纳米粒子成功通过三明治结构绑定到了壳聚糖纤维的表面上。

实施例5

将ssDNA1-壳聚糖纤维置于离心管中，滴加20μL的p16溶液，95℃退火5min后在37℃下进行杂交反应2h，反应结束后将壳聚糖纤维洗涤干净。p16的浓度由10nM降低至10pM。然后滴加20μL的ssDNA2-金纳米粒子溶液，在37℃下进行杂交反应2h后将壳聚糖纤维洗涤干净，观察壳聚糖纤维端头光波导荧光亮度的变化。当体系中存在p16时，其一端会与ssDNA1杂交，而另一端会与ssDNA2杂交，从而使金纳米粒子绑定在壳聚糖纤维表面，使其荧光淬灭。以p16浓度为横坐标，以壳聚糖纤维端头的光波导荧光亮度变化为纵坐标，作图(图5)。结合浓缩富集原理，在离心管中进行反应，可以降低反应极限。逐渐降低p16的浓度，由10nM到10pM，得到检测极限为2pM。

实施例6

分别向五根ssDNA1-壳聚糖纤维上滴加20μL分别含有p16、单碱基错配p16、三碱基错配p16、RASSF1A、p53的溶液。只有加入p16时，壳聚糖纤维的荧光才会淬灭，说明本文的方法对于p16有较好的检测专一性(图6)。

实施例7

将甲基化和非甲基化p16配制成一系列总DNA浓度相同(10nM)但甲基化比例不同的的混合溶液，分别含有100％、50％、10％、5％、1％的甲基化p16。分别在五根壳聚糖纤维上滴加20μL包含ssDNA2-金纳米粒子及不同甲基化比例p16溶液后，观察壳聚糖纤维端头光波导荧光变化。发现随着甲基化比例减小，荧光变化也减小，说明壳聚糖纤维可以检测p16的甲基化水平(图7)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种DNA的检测试剂盒，其特征在于，包括ssDNA1修饰的壳聚糖纤维、ssDNA2修饰的金纳米粒子；所述ssDNA1为与目的DNA一端序列互补的ssDNA；所述ssDNA2为与目的DNA另一端序列互补的ssDNA；所述壳聚糖纤维为带有荧光标记的壳聚糖纤维。

2.根据权利要求1的所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光标记为FITC。

3.根据权利要求1的所述的检测试剂盒，其特征在于，所述目的DNA为p16。

4.权利要求1至3中任一项所述检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，以g/mg/mL计，所述壳聚糖溶液中壳聚糖、荧光素与溶剂的比例为（0.5~5）：（1~10）：（10~50）。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述表面修饰环氧基团的方法为：乙二醇二缩水甘油醚与壳聚糖纤维在25~30℃条件下反应10~20h；

氨基修饰的ssDNA1与环氧修饰的壳聚糖纤维发生反应的温度为15~35℃，时间为3~6h。

7.一种非诊断目的检测DNA的方法，其特征在于，采用权利要求1至3中任一项所述检测试剂盒进行检测，具体为：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述杂交反应的温度为36~38℃，时间为1~3h。

9.一种p16 DNA甲基化水平的检测试剂盒，其特征在于，包括ssDNA1修饰的壳聚糖纤维、ssDNA2修饰的金纳米粒子、p16DNA甲基化标准试剂和HpaII酶；所述ssDNA1为与p16 DNA一端序列互补的ssDNA；所述ssDNA2为与目的DNA另一端序列互补的ssDNA；所述壳聚糖纤维为带有荧光标记的壳聚糖纤维；

所述ssDNA1序列为5'-GCCGGACGCCTG-3';

所述ssDNA2序列为:5'-GAACGCAACTCC-3'。

10.一种非诊断目的检测p16 DNA甲基化水平的方法，其特征在于，采用权利要求9所述检测试剂盒进行检测，具体为：

将ssDNA2修饰的金纳米粒子与第一杂交产物进行杂交反应，得到第二杂交产物后经HpaII酶切；

检测第二杂交产物的光波导荧光亮度，根据标准曲线获得p16DNA甲基化水平；

所述ssDNA1序列为5'-GCCGGACGCCTG-3';

所述ssDNA2序列为:5'-GAACGCAACTCC-3'。