CN108502867A - 氟、氮掺杂碳量子点及其制备方法和应用 - Google Patents

氟、氮掺杂碳量子点及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种由含氟芳香化合物与阳离子聚合物制备的氟、氮掺杂碳量子点，所述含氟芳香化合物与阳离子聚合物通过共价键连接，所述阳离子聚合物为线性聚乙烯亚胺或支化聚乙烯亚胺。本发明还提供所述氟、氮碳量子点的制备方法及其作为基因递送载体的应用。本发明采用热溶剂一锅法制备氟、氮掺杂碳量子点，反应简单，制备成本低，原料易得，产率高，在细胞转染过程中可以达到高效转染效果，转染过程对细胞产生的毒性较小，能有效且安全地将基因分子输送到细胞中，是兼具高效、低毒、价格低廉、合成简易等优点的基因转染载体。

Description

氟、氮掺杂碳量子点及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米生物医学材料领域，更特别涉及合成技术和生物材料技术领域，具体为一种由含氟芳香化合物与阳离子聚合物制备氟、氮掺杂碳量子点的方法，及该碳量子点在基因递送方面的应用。
背景技术
基因治疗是指外源基因的片段在宿主细胞内瞬间表达或者发挥作用，或将外源基因片段整合进宿主细胞染色体中，使之稳定表达，从而修复或补充宿主细胞的功能。成功的基因治疗离不开高效、安全的基因载体，根据需要，人们设计和制备了多种基因载体，主要可分为病毒载体和非病毒载体。目前病毒载体在体外和体内都可以达到高效的转染效果，但是病毒载体的开发和制备需要使用缺陷病毒和互补细胞系的复杂技术，因此制备复杂且价格较高，而且病毒载体会涉及到安全性问题，基因片段大小的限制，非病毒载体能够在一定程度上克服这些弱点，具有更高的生物安全性，且易于大规模制备，其中，阳离子聚合物凭借高安全性、低免疫活性、可降解性、可修饰等特点，已经成为一种具有良好前景的基因载体。阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺(PEI)、聚精氨酸、L-聚赖氨酸(PLL)等。
PEI是迄今为止转染效率较高的阳离子聚合物载体之一，目前经常被用来作为新的基因载体评价标准，将新设计与新开发的基因载体与之比较。PEI表面的正电荷官能团能够通过离子作用结合并浓缩表面呈负电性的核酸，并形成纳米尺寸的复合物，从而保护核酸不被核酸酶降解并有利于其进入细胞。进入细胞后，复合物主要集中在内涵体或者溶酶体中，在“质子海绵”效应介导的机制下，核酸复合物可以从内涵体或者溶酶体中逃逸出来，并释放核酸。一般来说2000Da 以下的PEI无明显的细胞毒性，但转染效率也很低，而25kDaPEI有较高的转染效率，却伴随着较大的细胞毒性。
含氟化合物具有疏水、疏油的性质，可以赋予高分子优异的自组装性能、抗污染能力、化学和生物惰性、低细胞毒性等。文献报道了用七氟丁酸酐修饰聚酰胺-胺树形高分子、聚丙烯亚胺、25kDa PEI，大幅度提高了阳离子聚合物的基因递送性能，又极大地降低了阳离子高分子的细胞毒性和所需的氮磷比(Wang M,et al.A fluorinated dendrimerachieves excellent gene transfection efficacy at extremely low nitrogen tophosphorus ratios[J].Nature communications,2014,5: 3053.)。文献2报道了用含氟化合物修饰聚酰胺-胺树形高分子，其中 2,3,5,6-四氟-4-羟基苯甲酸修饰后的含氟树形高分子具有高转染性能。 (Wang M,et al.The effect offluorination on thetransfection efficacy of surface-engineered dendrimers[J].Biomaterials,2014,35(24): 6603-6613.)。
碳量子点是一种粒径小于10nm，微观近乎准球形、表面富含有机官能团、具有荧光性能的碳纳米颗粒，碳量子点不仅保持了传统碳材料良好的光、热和机械性能，还具有在水中良好的溶解度、优越的化学惰性、低毒性、易功能化、独特的发光、良好的生物相容性和抗光漂白性等优势。基于这些优异的特性，碳量子点在细胞成像、靶向示踪、分析化学、光学器件和药物载体等方面都有潜在应用价值。由于缺乏基因包裹能力，碳量子点很难应用在基因载体方面。目前，文献已公开了少量碳量子点作为基因载体的应用，但是这些碳量子点的基因转染效率低、适用范围窄且细胞毒性大，几乎无法在体内得到应用。文献3报道了一种用25kDaPEI和丙三醇通过微波的方法制备的蓝色荧光碳量子点，该量子点具有与25kDaPEI相当的转染效率，具有一定的细胞毒性(Liu C,et al.Nano-carrier for genedelivery and bioimaging based on carbon dots with PEI-passivation enhancedfluorescence[J].Biomaterials,2012,33(13):3604-3613.)。文献4报道了一种用1.8kDaBPEI和叶酸在180℃反应6h得到蓝色荧光碳量子点，该量子点对HepG2细胞具有靶向转染的效果(Yang X,et al.One-step synthesis of photoluminescent carbon dotswith excitation-independent emission for selective bioimaging and genedelivery[J].Journal ofcolloid and interface science,2017,492:1-7.)。上述量子点的细胞转染效率只与25kDa PEI相当，且适用的细胞范围窄，因此制约了其在临床医学上的广泛应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有碳量子点作为基因转染试剂的不足，创新地利用含氟芳香化合物和阳离子聚合物制备一种新型的氟、氮掺杂碳量子点，可用于高效、安全、低毒的基因转染。本方法制备得到的氟、氮掺杂碳量子点具有高转染效率、低细胞毒性的特点，发明方法简易，制备成本低，原料简单易得。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
本发明提供一种氟、氮掺杂碳量子点的制备方法，包括以下步骤：
(1)将作为氟源的含氟芳香化合物和作为氮源的阳离子聚合物溶解于溶剂中，得到前躯体溶液，其中，所述含氟芳香化合物为1-4 个氟原子苯环上取代的苯二甲酸化合物，所述阳离子聚合物为线性聚乙烯亚胺或支化聚乙烯亚胺；
(2)将所述前躯体溶液在密闭容器中于100-250℃反应，将反应液冷却至室温后得到悬浊液，分离得到氟、氮掺杂碳量子点。
进一步地，1-4个氟原子苯环上取代的苯二甲酸化合物为1-4个氟原子苯环上取代的邻苯二甲酸化合物、间苯二甲酸化合物或对苯二甲酸化合物。
更一步地，任一个氟原子苯环上取代的位置与苯二甲酸中的任何一个酸官能团形成邻位、间位或对位。
再进一步地，含氟芳香化合物是指如下式(Ia)、式(Ib)、式(Ic)、式(Id)、式(Ie)、式(If)、式(Ig)、式(Ih)、式(Ii)、式(Ij)、式(Ik)、式(Il)所示的含氟芳香化合物；
进一步地，阳离子聚合物是指线性聚乙烯亚胺(LPEI)、支化聚乙烯亚胺(BPEI)，分别如下式(II)、式(III)所示；
其中x，y为支化单元重复数量；
更进一步地，线性聚乙烯亚胺或支化聚乙烯亚胺的分子量为 600-25000Da。
进一步地，密闭容器为高压反应釜、闷罐或其它密闭容器
进一步地，含氟芳香环化合物的浓度为1～150mmol/L。
更进一步地，阳离子聚合物的浓度为1～100mmol/L。
再进一步地，溶剂为水、乙醇或甲醇。
再进一步地，反应时间为1～12h。
本发明提出一种新的基于含氟芳香化合物和阳离子聚合物制备的氟、氮掺杂碳量子点的基因转染载体及其复合物在体外作为质粒递送载体的应用。
本发明还提出了所述的制备方法制备的氟、氮掺杂碳量子点作为质粒递送载体的方法，即氟、氮掺杂碳量子点基因转染载体与质粒在室温孵育并形成稳定的基因转染复合物，进一步对细胞进行基因转染，完成基因转染过程。
本发明以增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为报告基因，利用本发明基因递送载体输送质粒，实验表明本发明具有以下优点：本发明在保持高的基因转染效率的同时，保持较好的生物相容性。通过基因转染实验发现，在优化的质量比条件下，所述的本发明的氟、氮掺杂碳量子点基因转染效率远远高于25kDa PEI和Lipofectamine 2000 (Lipo 2000)在优化条件下的基因转染效率，这体现了本发明材料在细胞转染应用中高效转染的特点；通过MTT细胞毒性检测实验发现，本发明的基因载体的细胞毒性较低，在高转染效率的浓度下细胞存活率大于90％，且具有良好的生物相容性。本方法利用含氟芳香化合物和阳离子聚合物制备具有高转染效率、低细胞毒性的氟、氮掺杂碳量子点，发明方法简单，制备成本低，原料简单易得。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
附图说明
图1是实施例1制备的氟、氮掺杂碳量子点的TEM图。
图2是实施例1制备的氟、氮掺杂碳量子点的XPS图。
图3是实施例1制备的氟、氮掺杂碳量子点的19F NMR图。
图4是实施例1制备的氟、氮掺杂碳量子点与DNA形成的复合物的琼脂糖凝胶电泳图。
图5是实施例1制备的氟、氮掺杂碳量子点与DNA形成的复合物的动态光散射检测数据图。
图6是实施例1制备的氟、氮掺杂碳量子点与DNA形成的复合物的Zeta电势检测数据图。
图7是实施例1制备的氟、氮掺杂碳量子点用于HEK 293T细胞的转染EGFP质粒的转染图。
图8是实施例1制备的氟、氮掺杂碳量子点用于HEK 293T细胞的流式细胞定量图。
图9是实施例1制备的氟、氮掺杂碳量子点用于COS-7细胞的转染EGFP质粒的转染图。
图10是实施例1制备的氟、氮掺杂碳量子点用于COS-7细胞的流式细胞定量图。
图11是实施例1制备的氟、氮掺杂碳量子点用于HEK 293T细胞的MTT检测图。
图12是实施例1制备的氟、氮掺杂碳量子点用于COS-7细胞的 MTT检测图。
具体实施方式
结合以下具体实施例、附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、试验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普通知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
以2,3,5,6-四氟对苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa BPEI作为氮源，溶解于乙醇中，得到前躯体溶液(2,3,5,6-四氟对苯二甲酸浓度为 70mmol/L，1.8kDa BPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点(F-CDs)。
图1是F-CDs的TEM图，可以看出氟、氮掺杂碳量子点的尺寸均一，大约在5nm左右，并且分散均匀。图2是F-CDs的XPS图，可以看出图中有4个信号，分别是284.8eV(C 1s)、398.4eV(N 1s)、 531.6eV(O 1s)和686.8eV(F 1s)。
以19F NMR法表征检测上述产物，具体方法为：取20mg F-CDs，溶于0.5mL D2O中，实验结果见图3。
图4、图5、图6分别是F-CDs与DNA形成的复合物的琼脂糖凝胶电泳图、动态光散射检测数据图和Zeta电势检测数据图。可以看出，F-CDs与DNA以0.4:1的质量比结合可以形成稳定的复合物，与25kDa PEI相似。当F-CDs与DNA的质量比达到0.1:1时，复合物在水溶液中的电势为负，当F-CDs与DNA的质量比达到0.5:1时，复合物在水溶液中的电势为正。而当F-CDs与DNA以2:1质量比结合时可以稳定形成尺寸小于200nm的纳米复合物，其Zeta电势大约20mV。
基因转染效率：将F-CDs和EGFP质粒在室温下形成复合物，然后在HEK 293T细胞和COS-7细胞中进行转染，以通过流式细胞术检测EGFP的表达量来评估载体的基因转染效率。具体方法：将HEK 293T细胞培养在24孔板中孵育24h，将F-CDs与1μg EGFP质粒以最优质量比的比例混合后加入PBS缓冲液混匀，体积为100μL，静置15-30min后加入200μL不含血清的培养基。将含有复合物的培养基与细胞一起孵育4-6h后，用900μL含10％血清的完全培养基替代孔中的培养液。对于HEK 293T，培养24h后，用胰酶消化，并用150μL PBS缓冲液重悬，立即用流式细胞仪检测成功转染 EGFP的细胞百分比。对于COS-7细胞，培养48h后，用胰酶消化，同样用流式细胞仪检测成功转染EGFP的细胞百分比。1.8kDa BPEI 作为阴性对照，25kDa PEI和Lipo 2000作为阳性对照。实验结果：图7、图8分别是F-CDs用于HEK 293T细胞的转染EGFP质粒的转染图、流式细胞定量图，图9、图10分别是F-CDs用于COS-7细胞的转染EGFP质粒的转染图、流式细胞定量图和MTT检测图。图8 和图10表明：F-CDs在HEK 293T细胞中的最佳转染效率91.78％，在COS-7细胞中的最佳转染效率84.9％，远远高于1.8kDa BPEI在 HEK 293T细胞的最佳转染效率(8.15％)和它在COS-7细胞的最佳转染效率(5.74％)，同样明显高于25kDaPEI(HEK 293T～56.25％， COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％，COS-7～33.47％) 的最佳转染效率，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。
细胞毒性：研究F-CDs与EGFP质粒形成的基因复合物对细胞的毒性。具体实验方法：在96孔板中孵育HEK 293T细胞和COS-7细胞，细胞密度大约104个/孔，培养24h后将培养基移出，加入100μ L含有与细胞转染过程相同量的基因转染载体复合物的新鲜培养基 (含10％血清)，培养48h后，通过MTT法检测细胞存活率。实验结果：如图11和图12所示的F-CDs与其他转染试剂与EGFP质粒的基因复合物对HEK293T细胞和COS-7细胞的毒性比对图。图11和图12均表明在最佳细胞转染条件下，F-CDs处理后的HEK 293T细胞和COS-7细胞的存活率接近100％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例2
以2,3,5,6-四氟对苯二甲酸作为氟源，再加入600Da BPEI作为氮源，溶解乙醇中，得到前躯体溶液(2,3,5,6-四氟对苯二甲酸浓度为 70mmol/L，600Da BPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(81.21％)和COS-7细胞的转染效率(64.24％)，远远高于600Da BPEI在HEK 293T细胞的转染效率(1.35％)和COS-7细胞的转染效率(0.35％)，同样明显高于25kDa PEI(HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％，COS-7～33.47％)的转染效率，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的 HEK 293T细胞和COS-7细胞的存活率大于90％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例3
以2,3,5,6-四氟对苯二甲酸作为氟源，再加入25kDa BPEI作为氮源，溶解乙醇中，得到前躯体溶液(2,3,5,6-四氟对苯二甲酸浓度为 70mmol/L，25kDa BPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(85.11％)和COS-7细胞的转染效率(68.29％)，明显高于25kDa PEI(HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％，COS-7～33.47％) 的效率，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK 293T细胞和COS-7细胞的存活率大于80％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例4
以2,3,5,6-四氟对苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa LPEI作为氮源，溶解乙醇中，得到前躯体溶液(2,3,5,6-四氟对苯二甲酸浓度为 70mmol/L，1.8kDa LPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(56.87％)和COS-7 细胞的转染效率(42.36％)，远远高于1.8kDa LPEI在HEK 293T细胞的效率(3.47％)和COS-7细胞的效率(0.87％)，与25kDa PEI(HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％， COS-7～33.47％)的效率相当，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK293T细胞和COS-7细胞的存活率大于90％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例5
以2,3,5-三氟对苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa BPEI作为氮源，溶解乙醇中，得到前躯体溶液(2,3,5-三氟对苯二甲酸浓度为70 mmol/L，1.8kDa BPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(85.49％)和COS-7细胞的转染效率(74.29％)，远远高于1.8kDa BPEI在HEK 293T细胞的效率(8.15％)和COS-7细胞的效率(5.74％)，同样明显高于25kDa PEI(HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％，COS-7～33.47％)的效率，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK 293T细胞和COS-7细胞的存活率大于90％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例6
以4,5-二氟邻苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa BPEI作为氮源，溶解乙醇中，得到前躯体溶液(4,5-二氟邻苯二甲酸浓度为70mmol/L， 1.8kDaBPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(82.67％)和COS-7细胞的转染效率(71.64％)，远远高于1.8kDaBPEI在HEK 293T细胞的效率(8.15％)和COS-7细胞的效率(5.74％)，同样明显高于25kDa PEI(HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％， COS-7～33.47％)的效率，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK 293T细胞和COS-7细胞的存活率大于90％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例7
以5-氟间苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa BPEI作为氮源，溶解乙醇中，得到前躯体溶液(5-氟间苯二甲酸浓度为70mmol/L， 1.8kDaBPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(59.39％)和COS-7细胞的转染效率(25.98％)，远远高于1.8kDaBPEI在HEK 293T细胞的效率(8.15％) 和COS-7细胞的效率(5.74％)，与25kDa PEI(HEK 293T～56.25％， COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％，COS-7～33.47％) 的效率相当，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK 293T细胞和COS-7细胞的存活率大于90％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例8
以2,3,5,6-四氟对苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa BPEI作为氮源，溶解水中，得到前躯体溶液(2,3,5,6-四氟对苯二甲酸浓度为70 mmol/L，1.8kDa BPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(86.35％)和COS-7细胞的转染效率(75.74％)，远远高于1.8kDa BPEI在HEK 293T细胞的效率(8.15％)和COS-7细胞的效率(5.74％)，同样明显高于25kDa PEI(HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％，COS-7～33.47％)的效率，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK 293T细胞和COS-7细胞的存活率大于90％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例9
以2,3,5,6-四氟对苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa BPEI作为氮源，溶解甲醇中，得到前躯体溶液(2,3,5,6-四氟对苯二甲酸浓度为 70mmol/L，1.8kDa BPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(88.41％)和COS-7 细胞的转染效率(81.36％)，远远高于1.8kDa BPEI在HEK 293T细胞的效率(8.15％)和COS-7细胞的效率(5.74％)，同样明显高于 25kDaPEI(HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％，COS-7～33.47％)的效率，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK293T细胞和COS-7细胞的存活率大于90％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例10
以2,3,5,6-四氟对苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa BPEI作为氮源，溶解乙醇中，得到前躯体溶液(2,3,5,6-四氟对苯二甲酸浓度为 70mmol/L，1.8kDa BPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于100℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(50.68％)和COS-7 细胞的转染效率(38.64％)，远远高于1.8kDa BPEI在HEK 293T细胞的效率(8.15％)和COS-7细胞的效率(5.74％)，与25kDa PEI(HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％， COS-7～33.47％)的效率相当，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK293T细胞和COS-7细胞的存活率大于90％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例11
以2,3,5,6-四氟对苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa BPEI作为氮源，溶解乙醇中，得到前躯体溶液(2,3,5,6-四氟对苯二甲酸浓度为 70mmol/L，1.8kDa BPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于250℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(61.35％)和COS-7 细胞的转染效率(49.67％)，远远高于1.8kDa BPEI在HEK 293T细胞的效率(8.15％)和COS-7细胞的效率(5.74％)，与25kDa PEI(HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％， COS-7～33.47％)的效率相当，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK293T细胞和COS-7细胞的存活率大于90％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例12
以2,3,5,6-四氟对苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa BPEI作为氮源，溶解乙醇中，得到前躯体溶液(2,3,5,6-四氟对苯二甲酸浓度为 70mmol/L，1.8kDa BPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应1h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(12.67％)和COS-7 细胞的转染效率(8.27％)，与1.8kDaBPEI在HEK 293T细胞的效率 (8.15％)和COS-7细胞的效率(5.74％)相当，落后于25kDa PEI (HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％，COS-7～33.47％)的效率，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK 293T细胞和COS-7细胞的存活率大于90％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例13
以2,3,5,6-四氟对苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa BPEI作为氮源，溶解乙醇中，得到前躯体溶液(2,3,5,6-四氟对苯二甲酸浓度为 70mmol/L，1.8kDa BPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应12h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(77.69％)和COS-7 细胞的转染效率(50.41％)，远远高于1.8kDa BPEI在HEK 293T细胞的效率(8.15％)和COS-7细胞的效率(5.74％)，同样明显高于 25kDaPEI(HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％，COS-7～33.47％)的效率，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK293T细胞和COS-7细胞的存活率大于90％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例14
以2,3,5,6-四氟对苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa BPEI作为氮源，溶解乙醇中，得到前躯体溶液(2,3,5,6-四氟对苯二甲酸浓度为70mmol/L，1.8kDaBPEI浓度为100mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(81.28％)和COS-7 细胞的转染效率(60.35％)，远远高于1.8kDa BPEI在HEK 293T细胞的效率(8.15％)和COS-7细胞的效率(5.74％)，同样明显高于 25kDaPEI(HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％，COS-7～33.47％)的效率，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK293T细胞和COS-7细胞的存活率大于90％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例15
以2,3,5,6-四氟对苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa BPEI作为氮源，溶解乙醇中，得到前躯体溶液(2,3,5,6-四氟对苯二甲酸浓度为 70mmol/L，1.8kDaBPEI浓度为1mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(78.59％)和COS-7细胞的转染效率(54.29％)，远远高于1.8kDa BPEI在HEK 293T细胞的效率(8.15％)和COS-7细胞的效率(5.74％)，同样明显高于25kDa PEI(HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％，COS-7～33.47％)的效率，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK293T细胞和COS-7细胞的存活率大于90％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例16
以2,3,5,6-四氟对苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa BPEI作为氮源，溶解乙醇中，得到前躯体溶液(2,3,5,6-四氟对苯二甲酸浓度为 150mmol/L，1.8kDaBPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(85.24％)和COS-7 细胞的转染效率(73.18％)，远远高于1.8kDa BPEI在HEK 293T细胞的效率(8.15％)和COS-7细胞的效率(5.74％)，同样明显高于 25kDaPEI(HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％，COS-7～33.47％)的效率，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK293T细胞和COS-7细胞的存活率大于90％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
实施例17
以2,3,5,6-四氟对苯二甲酸作为氟源，再加入1.8kDa BPEI作为氮源，溶解乙醇中，得到前躯体溶液(2,3,5,6-四氟对苯二甲酸浓度为1 mmol/L，1.8kDa BPEI浓度为35mmol/L)，再将前躯体溶液转移至聚四氟乙烯的高压反应釜中于180℃条件下反应6h，冷却至室温得到悬浊液，再用透析法分离，冻干，得到氟、氮掺杂碳量子点。基因转染效率实验和细胞毒性实验参照实施例1。本实施例中所制备的基因转染载体最佳HEK 293T细胞的转染效率(54.39％)和COS-7细胞的转染效率(34.28％)，远远高于1.8kDa BPEI在HEK 293T细胞的效率(8.15％)和COS-7细胞的效率(5.74％)，与25kDa PEI(HEK 293T～56.25％，COS-7～22.66％)和Lipo 2000(HEK 293T～65.11％， COS-7～33.47％)的效率相当，且转染EGFP平均荧光强度也是一样的现象。本实施例中所制备的基因转染试剂处理后的HEK 293T细胞和COS-7细胞的存活率大于80％，即较低的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种氟、氮掺杂碳量子点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将作为氟源的含氟芳香化合物和作为氮源的阳离子聚合物溶解于溶剂中，得到前躯体溶液，其中，所述含氟芳香化合物为1-4个氟原子苯环上取代的苯二甲酸化合物，所述阳离子聚合物为线性聚乙烯亚胺或支化聚乙烯亚胺；
(2)将所述前躯体溶液在密闭容器中于100-250℃反应，将反应液冷却至室温后得到悬浊液，分离得到氟、氮掺杂碳量子点。
2.根据权利要求1所述的氟、氮掺杂碳量子点的制备方法，其特征在于：所述1-4个氟原子苯环上取代的苯二甲酸化合物为1-4个氟原子苯环上取代的邻苯二甲酸化合物、间苯二甲酸化合物或对苯二甲酸化合物。
3.根据权利要求2所述的氟、氮掺杂碳量子点的制备方法，其特征在于：任一个氟原子苯环上取代的位置与苯二甲酸中的任何一个酸官能团形成邻位、间位或对位。
4.根据权利要求1所述的氟、氮掺杂碳量子点的制备方法，其特征在于：所述线性聚乙烯亚胺或支化聚乙烯亚胺的分子量为600-25000Da。
5.根据权利要求1所述的氟、氮掺杂碳量子点的制备方法，其特征在于：在所述前驱体溶液中，所述含氟芳香环化合物的浓度为1-150mmol/L。
6.根据权利要求1所述的氟、氮掺杂碳量子点的制备方法，其特征在于：在所述前驱体溶液中，所述阳离子聚合物的浓度为1-100mmol/L。
7.根据权利要求1中所述的氟、氮掺杂碳量子点的制备方法，其特征在于：所述溶剂为水、乙醇或甲醇。
8.根据权利要求4中所述的氟、氮掺杂碳量子点的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，反应时间为1～12h。
9.一种如权利要求1-8中任一项的方法制得的氟、氮掺杂碳量子点。
10.根据权利要求1-8中任一项的方法制得的氟、氮掺杂碳量子点在体外作为基因递送载体的应用。
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