CN103830745B

CN103830745B - 一种基于量子点的多功能纳米siRNA载体系统的制备及其应用

Info

Publication number: CN103830745B
Application number: CN201410087972.9A
Authority: CN
Inventors: 朱红艳; 谢爱梅; 杨池; 张贝贝; 王逸飞
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Pengli biomedical technology (Shanghai) Co.,Ltd.
Priority date: 2014-03-11
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: CN103830745A

Abstract

一种集肿瘤靶向、pH敏感、可视等多种功能的siRNA纳米载体的制备方法和应用。本发明所述的siRNA纳米载体系统的核心由碲化镉量子点构成，所述的纳米载体壳层由肿瘤靶向基团、9聚精氨酸肽链及PEG组成。本发明的siRNA纳米载体生物相容性好、肿瘤靶向性强、细胞转染效率高，同时具有量子产率高、光稳定性强、可以进行无损在位实时监测等特点，因此适合用作肿瘤体内基因治疗的纳米传输系统。

Description

一种基于量子点的多功能纳米siRNA载体系统的制备及其应用

技术领域

本发明涉及基因治疗所用siRNA载体，具体涉及一种肿瘤靶向、生物相容性好、可见可动态监测的高分子生物材料与无机量子点形成的复合纳米基因载体的制备方法和应用。

背景技术

RNA干扰是指由于目标mRNA降解或翻译抑制所引起的转录后基因沉默。含21～23个碱基的单链或双链RNA，即小分子干扰RNA(Small-interferingRNA,siRNA)，siRNA可以通过RNA干扰，高效、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。但是裸siRNA在生物体内容易被核酶(RNase)降解、半衰期短、转染效率低，这些缺点成为siRNA临床应用的拦路虎，使得RNA干扰技术很难在活体细胞中取得应用。因此，研发新型、高效、安全的核酸药物载体成为肿瘤基因治疗的关键。

siRNA现有的载体主要包括病毒载体与非病毒载体两大类。病毒是目前基因治疗领域应用最多的一种核酸药物载体，其具有转染效率高的优点，但存在着制备困难、目的基因容量小、靶向特异性差，以及生物安全性等问题。而非病毒载体因其制备简单、siRNA携带量大、无免疫原性、无感染和恶化风险，在基因治疗的研究中越来越受到重视。

量子点（quantumdot，QDs）是近年来发展的一类新型的无机纳米荧光探针，其粒径约为1-50nm，具有激发光谱宽，发射波长可“调谐”且对称，光稳定性高，荧光寿命长等优点。这些优势使量子点在生命科学领域，尤其在生物标记、动态监测以及基因传输方面显示出巨大的应用价值。然而，量子点用作siRNA载体目前还存在以下几方面的问题：

（1）制备量子点的材料通常都含有毒重金属，重金属结合线粒体蛋白质内的巯基后，可使蛋白失活，造成细胞损伤；

（2）作为基因载体，表面带正电荷的量子点进入体内后可与体内的多种细胞发生非特异性结合，从而使siRNA的传输效率降低，并对正常组织造成一定的毒副作用；

（3）目前已有的基因载体不能同时兼顾生物相容性与转染效率，往往通过表面修饰改善量子点生物相容性的同时也大大降低了其转染效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肿瘤靶向的、生物相容性好、可视、高效的复合纳米siRNA载体的制备及应用。

实现本发明的技术方案如下：

本发明首先采用水相法制备碲化镉量子点（CdTe），筛选出最合适的量子点制备方法。然后优化合成条件，调节表面配体组成，将肿瘤靶向配体、带正电荷的小肽通过共价连接的方法，共价修饰到高分子生物材料上，最后通过配体置换的方法构建得到具有生物相容性好、肿瘤靶向、荧光可视等特点的复合纳米基因载体。其中：

1）该复合纳米载体粒径优选10～100nm，Zeta电位优选-10～+20mV；

2）疏水性碲化镉量子点荧光发射波长优选350～850nm；粒径优选2～20nm；

3）高分子生物材料的分子量优选2～200KDa。

本发明的制备方法包括：

1）碲化镉量子点的制备：分别称取碲粉（Te）和硼氢化钠（NaBH4）溶于乙醇中，通入氮气保护。然后，向溶液中加入去离子水，在一定温度下搅拌反应；向上述溶液中加入硫酸，产生碲化氢气体。将碲化氢用NaOH溶液吸收，制成特定浓度的NaHTe溶液。然后称取一定量的表面稳定剂溶于去离子水，用NaOH调节溶液pH，再加入氯化镉溶液搅拌。在氮气保护下，将新制成的NaHTe溶液加入到先前已制备好的镉溶液中，反应一定的时间，形成CdTe前体。最后高温下回流，在不同时间段获得不同粒径和波长的量子点。其中，碲与量子点表面稳定配体的摩尔比为1:1～1:10，更优选1:3；量子点表面稳定剂可为N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、巯基乙胺（CA）、2-二甲氨基乙硫醇（DMAE）或还原型谷胱甘肽（GSH），更优选巯基乙胺；量子点溶液的pH值为6～10，更优选7～8；形成碲化氢气体所需的实验温度为40～70℃，更优选60℃。最后高温回流形成量子点的温度为90～220℃，更优选100℃。2）量子点表面置换配体的制备，可分为四步完成：第一步，采用DCC/NHS体系活化硫辛酸上的羧基，与L-赖氨酸的氨基反应。（DL-硫辛酸与Boc-L-赖氨酸摩尔比优选1:1.2）第二步，脱Boc的硫辛酸与赖氨酸活化产物与阳离子小肽反应。第三步，将高分子生物材料与肿瘤靶向分子共价结合，并进一步与第二步反应产物结合，形成携带有肿瘤靶向分子和阳离子小肽的高分子复合材料。其中，所述的肿瘤靶向配体为脱氧氨基葡萄糖（DG）、叶酸（FA）、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽（RGD）或表皮细胞生长因子（EGF）；阳离子小肽为9聚精氨酸（9R）、TAT、MPG或Pep-1；高分子生物材料优选聚乙二醇（PEG）、聚乙烯亚胺（PEI）、聚丙烯酰胺（PAM）或壳聚糖（Chitosan）。

3）生物相容性好、可视的、肿瘤靶向的复合纳米siRNA载体的制备：将上述合成的置换配体溶于无水乙醇/水的体系中，然后将CdTe量子点滴加到上述高分子配体的乙醇/水溶液中搅拌，即可得肿瘤靶向、生物相容性好、可携带siRNA的复合纳米载体。

4）带负电荷的siRNA与表面修饰有带正电荷的小肽通过静电作用结合成为siRNA-量子点复合物。为了得到更稳定的siRNA-量子点复合物，可以调整量子点与siRNA的比例，一般为1:1～1:40，更为优选1:10。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本专利发明的siRNA复合载体基因转染效率高，同时具有肿瘤细胞靶向性、生物相容性好等优点，解决了传统基因载体安全性能差、转染效率低的问题。另外，本项目制备的多功能纳米载体集siRNA基因治疗与siRNA细胞内监测功能于一身。这种新型的多功能纳米载体的构建为实现siRNA基因治疗的同时实时观察、监测细胞内siRNA的转染过程提供了一种方便有效的研究手段。

附图说明

图1为本发明制备的复合纳米基因载体的紫外-可见吸收光谱；

图2为本发明制备的复合纳米基因载体的荧光发射光谱；

图3为本发明制备的复合纳米基因载体的粒径分布图；

图4为本发明制备的复合纳米基因载体的Zeta电位图

图5为本发明制备的复合纳米基因载体的透射电镜示意图；

图6为本发明制备的复合纳米基因载体的生物相容性实验；

图7为本发明制备的复合纳米基因载体的琼脂糖凝胶电泳图；

图8为本发明制备的复合纳米基因载体的细胞转染图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

1.CdTe量子点纳米粒子的制备

（1）碲氢化钠的制备：分别称取碲粉（Te）50mg和硼氢化钠80mg（碲粉和硼氢化钠摩尔比=1:5）溶于乙醇3.5mL中，通入氮气保护。然后，向溶液中加入去离子水1.5mL，在60℃搅拌下反应30min；向上述溶液中加入0.5mol/L硫酸5.5mL，产生碲化氢气体。将碲化氢用0.2mol/LNaOH溶液0.75mL吸收，制成特定浓度的NaHTe溶液。

（2）称取巯基乙胺盐酸盐（CA）102.3mg溶于去离子水33mL，用0.2mol/LNaOH调节溶液pH至6～8，再加入0.1mol/L氯化镉溶液3mL，搅拌。在氮气保护下，将新制成的NaHTe溶液加入到先前已制备好的镉溶液（Cd）中，反应30min，形成CdTe前体，100℃回流1～24小时（Cd:Te:CA=1:1.3:3），即得CA为配体的CdTe量子点。

2.量子点表面置换配体的制备

（1）DL-硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的反应：将DL-硫辛酸溶于DMF溶液中，加入二环己基碳二亚胺（DCC），搅拌15min后加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（硫辛酸:DCC:NHS=1:1.2:1.5），室温搅拌过夜，除去副产物得到硫辛酸活化酯，再加入Boc-L-赖氨酸（DL-硫辛酸:Boc-L-赖氨酸=1:1.2）室温搅拌过夜，既得硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的连接产物。之后将硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的连接产物溶于二氯甲烷/三氟乙酸体积比为7:3的体系，室温搅拌过夜，脱去L-赖氨酸氨基上的Boc保护。

（2）脱Boc保护后的硫辛酸-赖氨酸反应产物与9聚精氨酸（9R）反应：将氨基端Fmoc保护的9聚精氨酸溶于DMF溶液中，搅拌5min后加入1-乙基-3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC），NHS（9R:EDC:NHS=1:1.2:1.5），常温搅拌4h，活化9R一端的羧基，再加入脱掉Boc的硫辛酸-赖氨酸（9R与硫辛酸-赖氨酸的摩尔比为1:1.5），常温搅拌4h，与脱Boc保护后的硫辛酸-赖氨酸的氨基连接，最后经透析处理后备用。

（3）DG-PEG的制备：首先将氨基端Boc保护的NH2-PEG-COOH溶于DMF溶液中，加入DCC，NHS（PEG:DCC:NHS=1:1.2:1.5），室温条件下搅拌过夜，去除副产物，得到羧基端活化的PEG。脱氧氨基葡萄糖（DG）溶于DMF溶液中，搅拌5min后加入三乙胺，搅拌15min后滴加到羧基端活化的PEG溶液中，常温反应4h（PEG:DG=1:1.2），形成DG-PEG复合物。（4）DG-PEG与9R-硫辛酸-赖氨酸反应：将DG-PEG溶于二氯甲烷/三氟乙酸7:3的体系，室温搅拌过夜，脱去PEG氨基端上的Boc保护。然后，将9R-硫辛酸-赖氨酸溶于DMF溶液中，搅拌5min后加入EDC，NHS（9R-硫辛酸-赖氨酸:EDC:NHS=1:1.2:1.5），常温搅拌4小时，将9R-硫辛酸-赖氨酸中赖氨酸上的羧基活化，再加入DG-PEG的DMF溶液，常温搅拌4小时，与DG-PEG的氨基端反应（9R-硫辛酸-赖氨酸与DG-PEG的摩尔比为1:1.5）。最后将上述合成产物溶于DMF中，搅拌5分钟后加入20%的哌啶，DMF与哌啶体积比为5:1，室温反应30分钟，脱去9R上氨基保护的Fmoc。

3.配体置换：首先将上述制备得到的配体溶于无水乙醇/水体积比1:1的体系中，然后将CdTe量子点滴加到所合成配体的乙醇/水溶液中，80°C恒温水浴中避光搅拌12h，通过配体置换即得以高分子生物材料为配体的量子点复合纳米载体。

4.与siRNA结合形成复合物：将带负电荷的siRNA按不同的摩尔比（1:1；1:5；1:10；1:20）与该纳米载体混合20min，siRNA与纳米载体表面修饰有带正电荷的小肽9R，通过静电作用结合成为siRNA复合纳米基因载体。

实施例2

1.CdTe量子点纳米粒子的制备

（1）碲氢化钠的制备：分别称取碲粉50mg和硼氢化钠80mg（碲粉和硼氢化钠摩尔比=1:5）溶于乙醇3.5mL中，通入氮气保护。然后，向溶液中加入去离子水1.5mL，在60℃搅拌下反应30min；向上述溶液中加入0.5mol/L硫酸5.5mL，产生碲化氢气体。将碲化氢用0.2mol/LNaOH溶液0.75mL吸收，制成特定浓度的NaHTe溶液。

（2）称取N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）147mg溶于去离子水33mL，用0.2mol/LNaOH调节溶液pH至8～9，再加入0.1mol/L氯化镉溶液3mL，搅拌。在氮气保护下，将新制成的NaHTe溶液加入到先前已制备好的镉溶液中，反应40min，形成CdTe前体，120℃回流3～120小时（Cd:Te:NAC=1:1.33:3），得到NAC稳定的CdTe量子点。

2.量子点表面置换配体的制备

（1）DL-硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的反应：将DL-硫辛酸溶于DMF溶液中，加入DCC，搅拌15min后加入NHS（硫辛酸:DCC:NHS=1:1.2:1.5），室温搅拌过夜，除去副产物得到硫辛酸活化酯，再加入Boc-L-赖氨酸（DL-硫辛酸:Boc-L-赖氨酸=1:1.2）室温搅拌过夜，既得硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的连接产物。之后将硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的连接产物溶于二氯甲烷/三氟乙酸体积比为7:3的体系，室温搅拌过夜，脱去L-赖氨酸氨基上的Boc保护。

（2）脱Boc保护后的硫辛酸-赖氨酸反应产物与阳离子肽Tat反应：将氨基端Fmoc保护的Tat溶于DMF溶液中，搅拌5min后加入EDC，NHS（Tat:DCC:NHS=1:1.2:1.5），常温搅拌4h，活化Tat一端的羧基。再加入脱掉Boc的硫辛酸-赖氨酸（Tat与硫辛酸-赖氨酸的摩尔比为1:1.5）常温搅拌4h，羧基端活化的Tat与脱Boc保护后的硫辛酸-赖氨酸的氨基连接，最后经透析处理备用。

（3）FA-Chitosan的制备：首先将叶酸（FA）溶于DMF溶液中，加入DCC，NHS（FA:DCC:NHS=1:1.2:1.5），室温条件下搅拌过夜，去除副产物，得到羧基端活化的叶酸，然后滴加到壳聚糖（Chitosan）溶液中，常温反应4h（Chitosan:FA=1:1.5），形成FA-Chitosan复合物。

（4）FA-Chitosan与Tat-硫辛酸-赖氨酸反应：将Tat-硫辛酸-赖氨酸溶于DMF溶液中，搅拌5min后加入EDC，NHS（Tat-硫辛酸-赖氨酸:EDC:NHS摩尔比=1:1.2:1.5），常温搅拌4小时，活化Tat-硫辛酸-赖氨酸中赖氨酸上的羧基，再加入至FA-Chitosan的DMF溶液，常温搅拌4小时，与FA-Chitosan的氨基端反应（Tat-硫辛酸-赖氨酸与FA-Chitosan的摩尔比为1:1.6）。最后将上述合成产物FA-Chitosan与Tat-硫辛酸-赖氨酸连接产物溶于DMF中，搅拌5分钟后加入20%的哌啶，DMF与哌啶体积比为5:1，室温反应30分钟，脱去Tat上氨基保护的Fmoc。3.配体置换：首先将上述制备得到的配体溶于无水乙醇/水体积比1:1的体系中，然后将CdTe量子点滴加到所合成配体的乙醇/水溶液中，60°C恒温水浴中避光搅拌12h，通过配体置换即得高分子材料与量子点形成的复合纳米载体。

4.与siRNA结合形成复合物：将带负电荷的siRNA按不同的摩尔比（1:1；1:5；1:10；1:20）与该纳米载体混合20min，siRNA与纳米载体表面修饰有带正电荷的小肽Tat，通过静电作用结合成为siRNA复合纳米基因载体。

实施例3

1.CdTe量子点纳米粒子的制备

（2）称取2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐（DMAE）127.503mg溶于去离子水33mL，用0.2mol/LNaOH调节溶液pH6～8，再加入0.1mol/L氯化镉溶液3mL，搅拌。在氮气保护下，将新制成的NaHTe溶液加入到先前已制备好的镉溶液中，反应30min，形成CdTe前体，150℃回流1～72小时（Cd:Te:DMAE=1:1.33:3），形成DMAE稳定的CdTe量子点。

2.量子点表面置换配体的制备

（1）DL-硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的反应：将DL-硫辛酸溶于DMF溶液中，加入DCC，搅拌15min后加入NHS（硫辛酸:DCC:NHS=1:1.2:1.5），室温搅拌过夜，除去副产物得到硫辛酸活化酯，再加入Boc-L-赖氨酸（DL-硫辛酸：Boc-L-赖氨酸=1:1.2）室温搅拌过夜，既得硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的连接产物。之后将硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的连接产物溶于二氯甲烷/三氟乙酸体积比为7:3的体系，室温搅拌过夜，脱去L-赖氨酸氨基上的Boc保护。

（2）脱Boc保护后的硫辛酸-赖氨酸反应产物与MPG反应：将氨基端Fmoc保护的MPG溶于DMF溶液中，搅拌5min后加入EDC，NHS（MPG:DCC:NHS=1:1.2:1.5），常温搅拌4h，活化MPG一端的羧基。再加入脱掉Boc的硫辛酸-赖氨酸（MPG与硫辛酸-赖氨酸的摩尔比为1:1.5），常温搅拌4h，MPG的羧基与脱Boc保护后的硫辛酸-赖氨酸的氨基连接，最后经透析处理后备用。

（3）RGD-PEI的制备：首先将氨基端Boc保护的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽（RGD）溶于DMF溶液中，加入DCC，NHS（RGD:DCC:NHS=1:1.2:1.5），室温条件下搅拌过夜，去除副产物，得到羧基端活化的RGD，然后滴加到聚乙烯亚胺（PEI）溶液中（PEI:RGD=1:1.8），常温反应4h，形成RGD-PEI复合物。

(4)RGD-PEI与MPG-硫辛酸-赖氨酸反应：将MPG-硫辛酸-赖氨酸溶于DMF溶液中，搅拌5min后加入EDC，NHS（MPG-硫辛酸-赖氨酸:EDC:NHS摩尔比=1:1.2:1.5），常温搅拌4小时，将MPG-硫辛酸-赖氨酸中赖氨酸上的羧基活化，再加入RGD-PEIDMF溶液，常温搅拌4小时，与RGD-PEI的氨基反应（MPG-硫辛酸-赖氨酸与RGD-PE的摩尔比为1:1.2）。最后将上述合成产物溶于DMF中，搅拌5分钟后加入20%的哌啶，DMF与哌啶体积比为5:1，室温反应30分钟，脱去MPG上氨基保护的Fmoc。

3.配体置换：首先将上述制备得到的配体溶于无水乙醇/水体积比1:1的体系中，然后将CdTe量子点滴加到所合成配体的乙醇/水溶液中，60°C恒温水浴中避光搅拌12h，通过配体置换即得高分子材料与量子点形成的复合纳米载体。

4.与siRNA结合形成复合物：将带负电荷的siRNA按不同的摩尔比（1:1；1:5；1:10；1:20）与该纳米载体混合20min，siRNA与纳米载体表面修饰有带正电荷的小肽MPG，通过静电作用结合成为siRNA复合纳米基因载体。

实施例4

1.CdTe量子点纳米粒子的制备

（2）称取谷胱甘肽（GSH）276.59mg溶于去离子水33mL，用0.2mol/LNaOH调节溶液pH7～9，再加入0.1mol/L氯化镉溶液3mL，搅拌。在氮气保护下，将新制成的NaHTe溶液加入到先前已制备好的镉溶液中，反应30min，形成CdTe前体，100℃回流3～96小时（Cd:Te:GSH=1:1.33:3），得到GSH稳定的CdTe量子点。

2.量子点表面置换配体的制备

（2）脱Boc保护后的硫辛酸-赖氨酸反应产物与Pep-1反应：将氨基端Fmoc保护的Pep-1溶于DMF溶液中，搅拌5min后加入EDC，NHS（Pep-1:DCC:NHS=1:1.2:1.5），常温搅拌4h，活化Pep-1一端的羧基。再加入脱掉Boc的硫辛酸-赖氨酸（Pep-1与硫辛酸-赖氨酸的摩尔比为1:1.5），常温搅拌4h，Pep-1的羧基与脱Boc保护后的硫辛酸-赖氨酸的氨基连接，最后经透析处理后备用。

（3）EGF-PAM的制备：首先将表皮细胞生长因子（EGF）溶于DMF溶液中，加入DCC，NHS（EGF:DCC:NHS=1:1.2:1.5），室温条件下搅拌过夜，去除副产物，得到羧基端活化的EGF，然后滴加到聚丙烯酰胺（PAM）溶液中，常温反应4h（PAM:EGF=1:1.2），得到EGF-PAM复合物。

(4)EGF-PAM与Pep-1-硫辛酸-赖氨酸反应：将Pep-1-硫辛酸-赖氨酸溶于DMF溶液中，搅拌5min后加入EDC，NHS（Pep-1-硫辛酸-赖氨酸:EDC:NHS摩尔比=1:1.2:1.5），常温搅拌4小时，将Pep-1-硫辛酸-赖氨酸中赖氨酸上的羧基活化，再加入EGF-PAMDMF溶液，常温搅拌4小时，与EGF-PAM的氨基反应（Pep-1-硫辛酸-赖氨酸与EGF-PAM的摩尔比为1:1.5）。最后将上述合成产物溶于DMF中，搅拌5分钟后加入20%的哌啶，DMF与哌啶体积比为5:1，室温反应30分钟，脱去Pep-1上氨基保护的Fmoc。

4.与siRNA结合形成复合物：将带负电荷的siRNA按不同的摩尔比（1:1；1:5；1:10；1:20）与该纳米载体混合20min，siRNA与纳米载体表面修饰有带正电荷的小肽Pep-1，通过静电作用结合成为siRNA复合纳米基因载体。

Claims

1.一种基于量子点的多功能纳米siRNA载体系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、CdTe量子点纳米粒子的制备：

(1)碲氢化钠的制备：分别称取碲粉50mg和硼氢化钠80mg溶于乙醇3.5mL中，通入氮气保护；然后，向溶液中加入去离子水1.5mL，在60℃搅拌下反应30min；向上述溶液中加入0.5mol/L硫酸5.5mL，产生碲化氢气体；将碲化氢用0.2mol/LNaOH溶液0.75mL吸收，制成NaHTe溶液；

(2)称取巯基乙胺盐酸盐102.3mg溶于去离子水33mL，用0.2mol/LNaOH调节溶液pH至6～8，再加入0.1mol/L氯化镉溶液3mL，搅拌；在氮气保护下，将新制成的NaHTe溶液加入到先前已制备好的镉溶液中，反应30min，形成CdTe前体，100℃回流1～24小时，其摩尔比为Cd:Te:CA＝1:1.3:3，即得CA为配体的CdTe量子点；

步骤二、量子点表面置换配体的制备

(1)DL-硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的反应：将DL-硫辛酸溶于DMF溶液中，加入二环己基碳二亚胺(DCC)，搅拌15min后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，其摩尔比为硫辛酸:DCC:NHS＝1:1.2:1.5，室温搅拌过夜，除去副产物得到硫辛酸活化酯，再加入Boc-L-赖氨酸，其摩尔比为DL-硫辛酸:Boc-L-赖氨酸＝1:1.2，室温搅拌过夜，即得硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的连接产物；之后将硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的连接产物溶于二氯甲烷/三氟乙酸体积比为7:3的体系，室温搅拌过夜，脱去L-赖氨酸氨基上的Boc保护；

(2)脱Boc保护后的硫辛酸-赖氨酸反应产物与9聚精氨酸(9R)反应：将氨基端Fmoc保护的9聚精氨酸溶于DMF溶液中，搅拌5min后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和NHS，其摩尔比为9R:EDC:NHS＝1:1.2:1.5，常温搅拌4h，活化9R一端的羧基，再加入脱掉Boc的硫辛酸-赖氨酸，9R与硫辛酸-赖氨酸的摩尔比为1:1.5，常温搅拌4h，与脱Boc保护后的硫辛酸-赖氨酸的氨基连接，最后经透析处理后备用；

(3)DG-PEG的制备：首先将氨基端Boc保护的NH2-PEG-COOH溶于DMF溶液中，加入DCC和NHS，其摩尔比为PEG:DCC:NHS＝1:1.2:1.5，室温条件下搅拌过夜，去除副产物，得到羧基端活化的PEG；脱氧氨基葡萄糖(DG)溶于DMF溶液中，搅拌5min后加入三乙胺，搅拌15min后滴加到羧基端活化的PEG溶液中，常温反应4h，摩尔比PEG:DG＝1:1.2，形成DG-PEG复合物；(4)DG-PEG与9R-硫辛酸-赖氨酸反应：将DG-PEG溶于二氯甲烷/三氟乙酸7:3的体系，室温搅拌过夜，脱去PEG氨基端上的Boc保护；然后，将9R-硫辛酸-赖氨酸溶于DMF溶液中，搅拌5min后加入EDC和NHS，摩尔比为9R-硫辛酸-赖氨酸:EDC:NHS＝1:1.2:1.5，常温搅拌4小时，将9R-硫辛酸-赖氨酸中赖氨酸上的羧基活化，再加入DG-PEG的DMF溶液，常温搅拌4小时，与DG-PEG的氨基端反应，9R-硫辛酸-赖氨酸与DG-PEG的摩尔比为1:1.5；最后将上述合成产物溶于DMF中，搅拌5分钟后加入20％的哌啶，DMF与哌啶体积比为5:1，室温反应30分钟，脱去9R上氨基保护的Fmoc；

步骤三、配体置换：首先将上述制备得到的配体溶于无水乙醇/水体积比1:1的体系中，然后将CdTe量子点滴加到所合成配体的乙醇/水溶液中，80℃恒温水浴中避光搅拌12h，通过配体置换即得以高分子生物材料为配体的量子点复合纳米载体；

步骤四、与siRNA结合形成复合物：将带负电荷的siRNA按不同的摩尔比1:1或1:5或1:10或1:20与纳米载体混合20min，siRNA与纳米载体表面修饰有带正电荷的小肽9R，通过静电作用结合成为siRNA复合纳米基因载体。