CN111808605A - 靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针，涉及生物荧光探针技术领域，该荧光探针结构包括有手性量子点和叶酸耦合而形成的手性荧光双标记探针。同时还公开了一种靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针的制备方法。本发明通过荧光探针中叶酸和肿瘤细胞表面叶酸受体亚型结合的现象特异性识别肿瘤细胞，并利用手性荧光双标记探针的光学活性在肿瘤细胞和炎症区域产生相应荧光信号响应性变化，进行手性及荧光双标记，即可用于肿瘤细胞的靶向识别和对肿瘤细胞进行空间定位和空间结构的识别。本发明还具有稳定性高，灵敏度高，使用量少的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物荧光探针技术领域，尤其涉及一种靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针及其制备方法。
背景技术
癌症是一类严重危害人们生命健康的疾病，进行癌症的早期诊断及有效识别可以有效提高对癌症的治疗。细胞的形态大小不一，与正常细胞相比，癌细胞体积要大，核质比高，代谢旺盛，DNA和RNA聚合酶活性均高。
传统的癌细胞识别和诊断主要通过癌胚蛋白检测，酶类标志物，肿瘤抗原检测，血浆蛋白检测和同位素检测法来确定。但是传统方法均存在效率低、识别率低等缺点，随着分子生物标记技术的不断发展，分子生物标记技术在肿瘤细胞的早期识别和诊断逐渐受到人们的关注。而荧光探针是在一定体系内，当一种物质或体系中某一物质性质发生变化时，荧光信号发生相应改变的分子。荧光光谱由于其检测方便、灵敏度高等优点而展现出优越的性能。
目前，国内外研究学者经研究发现，与传统的有机荧光染料相比，荧光量子点具有宽而连续的激发光谱，发射光谱可控且窄而对称，较大的Stockes位移，吸光系数大，荧光量子产率高，抗光漂白性能强，具有空间兼容性，可用于多光子荧光显微成像，这些独特的荧光特性使得量子点具有取代传统有机染料，作为新型生物荧光探针的深远潜力。
在《近场光学显微镜结合量子点标记人胃腺癌SGC-7901细胞靶点的观察》中表明，CdTe量子点可作为新型的荧光标记材料，核壳型 CdTe/CdS量子点与叶酸偶联后稳定性较好，FA.PEG.CdTe/CdS量子点荧光探针具有良好的靶向性，在高表达叶酸受体的肿瘤诊断和治疗方面具有良好的应用前景。
在肿瘤细胞荧光成像靶向研究中，采用叶酸-叶酸受体转运原理，设计肿瘤靶向荧光探针在肿瘤识别研究方面，取得了显著进展。叶酸具有相对较小的分子量以及化学毒性低的特点，而且在对肿瘤细胞标记中其叶酸及其偶联物不会被运送至溶酶体，而是留在细胞吞腔内或被释放到细胞液中，可以有效提高靶向投递的效率，因此被广泛应用。
分子生物学和分子病理学研究揭示，叶酸受体(FR)在大部分恶性肿瘤组织表面高度表达，而在正常细胞中不表达或者低表达。叶酸受体FR有四种亚型：FR-"α"，FR-"β"，FR-"γ"，FR-"δ"。其中肿瘤细胞组织主要以FR-"α"和FR-"β"两种亚型为主，且两种亚型在同一有机体上可以同时表达。在临床诊断中，恶性肿瘤患者可能同时会受到炎症性疾病的折磨，在炎症区域积累活化巨噬细胞而高度表达FR-"β"。
由于叶酸和叶酸偶联物对FR-"α"和FR-"β"这两种亚型具有相近的亲和力，因此迫切需要寻求一种新型的叶酸受体亚型识别探针，探索新的识别原理，进而提高肿瘤细胞和炎症区域的识别灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针及其制备方法，可以利用叶酸-叶酸受体作用的高特异性，通过叶酸和手性量子点耦合的手性荧光双标记探针的手性特异性识别肿瘤细胞和炎症区域，并进行荧光标记，提高肿瘤细胞和炎症区域的识别灵敏度。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针，该探针结构包括有手性量子点和叶酸耦合而形成的探针，所述探针的末端是叶酸 (FA)，所述手性量子点具有手性光学活性，所述探针具有能够靶向识别肿瘤细胞和荧光显像的特性；其中，所述手性荧光双标记探针的手性量子点结构包括有：L/D-Cys-CdTe结构、L/D-Cys-CdTe/CdS核壳结构、L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-Cd(Zn)Te(Se,S)结构和 L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素- (Cd,Zn)(Te,Se,S)/(Cd,Zn)(Te,Se,S)核壳结构。
一种靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针的制备方法：
手性量子点的制备：
1)量取0.01-0.10Te/Se/S粉与0.01-0.10gNaBH4并溶解于5ml去离子水中，在惰性气体的保护下，获得前体溶液；
2)量取0.1-0.3g氯化镉/氯化锌(CdCl2/ZnCl2)、配体与上述获得的前体溶液相互混合于45ml去离子水中，并且pH值为7-12，其中，所述配体为手性配体；
3)将步骤2)中的混合溶液，在加热并有惰性气体保护条件下反应，反应时间100-150min；
4)CdTe/CdS/CdSe回流2小时后，自然冷却至30℃-80℃，分别配置 Na2S溶液和CdCl2/ZnCl2溶液各5ml，超声溶解，待温度降到60℃，分别滴加配置好的Na2S溶液和CdCl2/ZnCl2溶液，滴加完毕后，加热温度至50℃-90℃回流1-3小时即可得到手性量子点溶液；
手性荧光双标记探针的制备(手性量子点与叶酸耦合)：
5)上述包壳后的溶液再次降温至50-75℃，先后加入250μL浓度为 0.01-0.1mol/LDCC和250μL相同浓度的NHS，室温条件下反应0.5- 1.5小时；
6)加入250μL 0.01-0.1mol/L的叶酸(FA)溶液，氮气保护下不加热搅拌反应8-24小时，然后在去离子水中透析8-24小时，透析期间换水3-4次，得到纯化后的靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针。
优选地：所述手性配体为L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、谷胱甘肽、青霉素等手性配体中的一种。
优选地：所述步骤2)的混合溶液中，Cd/Zn：Te/Se/S：配体的摩尔比为1:(0.1-1):(0.1-5)，其中，CdCl2的摩尔浓度为1- 10mmol/L。
优选地：所述步骤3)中加热方式包括水浴法、油浴法和水热法，水浴法的加热温度为80-100℃，油浴法、水热法的加热温度为 75-185℃。
综上所述，本发明的有益技术效果为：
(1)基于叶酸-叶酸受体作用的高特异性，通过手性荧光双标记探针中叶酸和肿瘤细胞表面叶酸受体亚型结合的现象特异性识别肿瘤细胞，并利用手性荧光双标记探针的光学活性在肿瘤细胞和炎症区域产生相应手性及荧光信号响应性变化，进行标记，即对肿瘤细胞和炎症区域进行靶向标记，从而从微观水平认知肿瘤细胞表面叶酸受体亚型的三维构型及获取更多的癌细胞的特征信息。相比于现有技术，手性配体包裹的量子点具有较强的光学活性，提高了选择性靶向肿瘤显像效果，进而提高了肿瘤细胞和炎症区域的识别灵敏度。
(2)本发明首次提出靶向叶酸受体亚型手性荧光双标记无机量子点探针，拓展了传统肿瘤靶向探针的范围。
(3)一般的配体包裹的量子点没有光学活性，而手性配体包裹的量子点具有光学活性，且活性强。通过控制手性配体和量子点的配比，可以灵敏的调节量子点的手性特征，为手性量子点在与叶酸的结合当中拥有更加多样化的表现，从而适应不同肿瘤细胞的靶向定位。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1得到的L-Cys-CdTe手性量子点的微观结构图，其中
图1(a)是STEM图，图1(b)是HRTEM图；
图2为实施例1得到的L-Cys-CdTe手性量子点的XRD图谱；
图3为实施例1得到的L-Cys-CdTe手性量子点的红外光谱及XPS谱；
图4为实施例1得到的L-Cys-CdTe与D-Glu作用的圆二色谱；
图5为实施例1得到的L-Cys-CdTe与D-Glu作用的荧光光谱图；
图6为实施例1得到的FA-L-Cys-CdTe手性荧光双标记探针红外光谱；
图7为实施例1得到的FA-L-Cys-CdTe手性荧光双标记探针圆二色谱；
图8为实施例1得到的FA-L-Cys-CdTe手性荧光双标记探针荧光光谱图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的手性荧光双标记探针结构包括有手性量子点和叶酸耦合而形成的探针，所述探针的末端是叶酸(FA)，手性量子点具有宽而连续的激发光谱，可用于多光子荧光显微成像，所述生物探针具有能够手性靶向识别肿瘤细胞和荧光显像的特性。所述手性荧光双标记探针的手性量子点结构包括有：L/D-Cys-CdTe结构、L/D- Cys-CdTe/CdS核壳结构、L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素- Cd(Zn)Te(Se,S)结构和L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素- (Cd,Zn)(Te,Se,S)/(Cd,Zn)(Te,Se,S)核壳结构。
实施例1一种新型靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针 FA-L/D-Cys-CdTe结构的制备方法
L/D-Cys-CdTe手性量子点的制备：
(1)量取0.01-0.10Te粉与0.01-0.10gNaBH4并溶解于5ml去离子水中，在惰性气体的保护下获得前体溶液。
优选地，Te粉的质量为0.06g，NaBH4的质量为0.06g，该步骤的目的是合成NaHTe作为Te源。
(2)将0.1-0.3g氯化镉(CdCl2)、0.3-0.5g配体与步骤(1)中获得的前体溶液相互混合于45ml去离子水中，并且pH值的值为7-12。上述中的配体采用手性配体，为L-半胱氨酸或D-半胱氨酸。
优选地，氯化镉的质量为0.23g，配体的质量为0.36g，pH值为10，配体为L-半胱氨酸。该步骤中使用的有机配体成功诱导了CdTe量子点的手性，一般的配体包裹的量子点没有光学活性，而手性配体包裹的量子点具有光学活性，且活性强，能较好地用于后续手性量子点与叶酸的耦合，使得最后的探针具有较高的光学活性。
(3)将步骤(2)中的混合溶液，在75-185℃惰性气体保护下反应，反应时间100-150min。
优选地，反应时间为120min，上述两个步骤的目的是为了让NaHTe 溶液与CdCl2溶液反应生成CdTe手性量子点，从而获得L/D-Cys-CdTe 结构。
L/D-Cys-CdTe手性量子点与叶酸耦合：
(4)上述溶液再次降温至60℃，先后加入250μL浓度为0.01-0.1 mol/L DCC和250μL相同浓度的NHS，室温条件下反应0.5小时。
优选地，DCC和NHS溶液浓度为0.05mol/L，加入有机试剂的目的为提升叶酸的溶解度。
(5)加入250μL浓度为0.01-0.1mol/L的叶酸(FA)溶液，氮气保护下不加热搅拌反应12小时，然后在去离子水中透析12小时，透析期间换水3-4次。
优选地，叶酸(FA)溶液浓度为0.05mol/L。将叶酸与手性量子点耦合后通过透析去除多余的有机试剂后，最终得到纯化后的靶向标记叶酸受体亚型手性量子点FA-L/D-Cys-CdTe结构。
实施例2一种新型靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针 FA-L/D-Cys-CdTe/CdS核壳结构的制备方法
与实施例1的不同之处在于，在手性量子点的制备步骤(3)后增加以下步骤：冷却至60℃后加入5ml浓度为0.1-0.3mol/L的CdCl2溶液和相同浓度的Na2S溶液。在温度为100℃的条件下进行反应，优选地，反应时间120min，Na2S和CdCl2浓度为0.2mol/L。该步骤的目的是为了合成CdS量子点包裹于CdTe量子点表面的核壳结构，即CdS为量子点的壳，CdTe为量子点的核，以提升其稳定性，提高量子点发光效率。
获得L/D-Cys-CdTe/CdS核壳结构的溶液后，再进行实施例1相同的步骤(4)和步骤(5)，完成与叶酸的耦合，最后得到纯化后的靶向标记叶酸受体亚型手性量子点FA-L/D-Cys-CdTe/CdS核壳结构。
实施例3一种新型靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针 FA-L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-Cd(Zn)Te(Se,S)结构的制备方法
L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-Cd(Zn)Te(Se,S)手性量子点的制备：
(1)量取0.01-0.10gTe/Se/S粉与0.01-0.10gNaBH4并溶解于去离子水中，在惰性气体的保护下，获得前体溶液。
优选地，Te/Se/S粉的投入量为0.0638g，NaBH4的质量为 0.0574g-0.0845g。该步骤目的是为了合成NaHTe/NaHSe/NaHS作为 Te/Se/S源。
(2)量取0.1-0.3g氯化镉/氯化锌(CdCl2/ZnCl2)，配体与前体溶液相互混合，并且pH值的值为7-12。上述中的配体可以选择L-半胱氨酸、 R-半胱氨酸、谷胱甘肽、青霉素等手性配体中的一种。其中，配体优选为L-半胱氨酸。优选地，混合溶液中Cd/Zn：Te/Se/S：配体的摩尔比为1：(0.1-1)：(0.1-5)，其中，CdCl2的摩尔浓度为1-10mmol/L。 (3)将步骤(2)中的混合溶液，在加热条件下反应，反应时间100- 150min，最后冷却至室温即可得到结构为L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-XY的手性量子点溶液，其中，X可以Cd，Zn，Y可以是Te,Se,S, 即手性量子点结构包括有：L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-CdTe, L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-ZnTe,L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-CdTe,L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-CdSe,L/D-半胱氨酸/ 谷胱甘肽/青霉素-ZnSe,L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-CdS, L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-ZnS。
其中，加热方式包括水浴法、油浴法和水热法。水浴法的加热温度为80-100℃，油浴法、水热法的加热温度为75-185℃。加热容器包括圆底烧瓶，三颈烧瓶，本实施例中优选为三颈烧瓶。
(4)将步骤(3)的量子点溶液与有机试剂以1:(1-10)的比例进行混合、分离，有机试剂优选为异丙醇，最后得到的沉淀即为纯化后的L/D- 半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-Cd(Zn)Te(Se,S)手性量子点。
L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-Cd(Zn)Te(Se,S)手性量子点与叶酸耦合：
(5)将上述已得到的L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-Cd(Zn)Te (Se,S)手性量子点，再次降温至50-75℃，并加入250μL浓度为0.05- 0.30mol/L的DCC和及250μL浓度为0.05-0.30mol/L的NHS，并且室温条件下反应0.5-1.5小时。
(6)将步骤(1)中得到的产物与叶酸在惰性气体的保护下进行反应，优选地采用氮气保护下室温条件下搅拌反应8-24h，再进行透析8-24h。
将叶酸与手性量子点耦合后通过透析去除多余的有机试剂后，最终得到纯化后的靶向标记叶酸受体亚型手性量子点FA-L/D-Cys- Cd(Zn)Te(Se,S)结构。
实施例4一种新型靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针 FA-L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素- (Cd,Zn)(Te,Se,S)/(Cd,Zn)(Te,Se,S)核壳结构的制备方法
与实施例3的不同之处在于，在手性量子点的制备步骤(4)后增加以下步骤：CdTe/CdS/CdSe回流2小时后，抬起三颈烧瓶自然冷却至30℃-80℃。分别配置Na2S溶液与CdCl2/ZnCl2溶液各5ml于烧杯中 (Na2S用小烧杯称取)，再经过超声溶解，待温度降到60℃，分别滴加配置好的Na2S和CdCl2/ZnCl2溶液，滴加完毕后，加热温度至50℃-90℃回流1-3小时。该步骤的目的是为了合成X2Y2量子点包裹于X1Y1量子点表面的核壳结构(L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-X1Y1/X2Y2),即X2Y2为量子点的壳，X1Y1为量子点的核，以提升量子点的稳定性，提高量子点发光效率。其中，X1,X2可以是Cd，Zn,Y1,Y2可以是Te,Se,S，因此， X1Y1和X2Y2的结构均包括有：CdTe,ZnTe,CdSe,ZnSe,CdS,ZnS，即该手性量子点核壳结构包括有：L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素- CdTe/ZnTe，L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-CdTe/CdSe，L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-CdTe/ZnSe，L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素 -CdTe/CdS,L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-CdTe/ZnS，L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-ZnTe/CdSe,L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素- ZnTe/ZnSe,L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-ZnTe/CdS,L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-ZnTe/ZnS,L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素- CdSe/ZnSe,L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-CdSe/CdS,L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-CdSe/ZnS,L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素- ZnSe/CdS,L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-ZnSe/ZnS,L/D-半胱氨酸 /谷胱甘肽/青霉素-CdS/ZnS。
获得L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-(Cd,Zn)(Te,Se,S)/ (Cd,Zn)(Te,Se,S)核壳结构的溶液后，再进行与实施例3相同的步骤 (5)和步骤(6)，完成与叶酸的耦合，最后得到纯化后的靶向标记叶酸受体亚型手性量子点FA-L/D-Cys/谷胱甘肽/青霉素- (Cd,Zn)(Te,Se,S)/(Cd,Zn)(Te,Se,S)核壳结构。
本发明的工作原理及有益效果为：
通过上述方法制备的靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针包括：FA-L/D-Cys-CdTe结构、FA-L/D-Cys-CdTe/CdS核壳结构、FA- L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-Cd(Zn)Te(Se,S)结构和FA-L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-(Cd,Zn)(Te,Se,S)/(Cd,Zn)(Te,Se,S)核壳结构，均具有靶向识别和荧光标记的能力。
基于叶酸-叶酸受体作用的高特异性，所述的手性荧光双标记探针可以通过其叶酸和肿瘤细胞表面叶酸受体亚型结合的现象特异性识别肿瘤细胞，并利用探针的光学活性在肿瘤细胞和炎症区域产生相应手性及荧光信号响应性变化，进行手性及荧光标记，从而从微观水平认知肿瘤细胞表面叶酸受体亚型的三维构型及获取更多的癌细胞的特征信息，即所述手性荧光双标记探针可用于肿瘤细胞的靶向识别和对肿瘤细胞进行空间定位和空间结构的识别。相比于现有技术，手性配体包裹的量子点具有较强的光学活性，提高了选择性靶向肿瘤显像效果，进而提高了肿瘤细胞和炎症区域的识别灵敏度。同时，由于叶酸具有相对较小的分子量以及化学毒性低的特点，而且在对肿瘤细胞标记中其叶酸及其偶联物不会被运送至溶酶体，而是留在细胞吞腔内或被释放到细胞液中，可以有效提高靶向投递的效率。
下面以FA-L/D-Cys-CdTe结构的手性荧光双标记探针为例进行详细说明：
参照图1，图1(a)为实施例1得到的L-Cys-CdTe手性量子点STEM 图，从STEM图中所示，水相制备的材料呈现很好的分散性，平均径粒大概为3nm；图1(b)为实施例1得到的L-Cys-CdTe手性量子点HRTEM图，从HRTEM图中所述，晶面距离约为0.37nm，符合CdTe量子点(111)晶面。
参照图2，为实施例1得到的L-Cys-CdTe手性量子点的XRD图谱， L-Cys-CdTe量子点在23.8°，39.6°,和46.8°出现了明显的衍射峰，分别对应于CdTe的(111),(220),和(311)晶面。
参照图3，为实施例1得到的L-Cys-CdTe量子点红外光谱图，红外光谱图表明：当CdTe量子点表面游离的L-半胱氨酸分子与CdTe量子点表面结合时，信号在2500cm-1(S-H)处消失，表明半胱氨酸分子的巯基与表面镉原子之间有很强的键合作用。L-Cys-CdTe量子点在3430 cm-1处的宽吸收带可能是由于表面结合的半胱氨酸分子的氨基和羧基之间形成了部分氢键。在L-Cys-CdTe量子点中，还观察到1400cm-1和 1580cm-1处羧基(COO-)的对称和不对称拉伸模式振动。由于L-Cys- CdTe量子点是在碱性介质环境中制备的，因此羧基经过去质子化过程，提供静电斥力以保持CdTe量子点在溶液中的良好分散。
用XPS对L-Cys-CdTe量子点的表面组成和元素分析结果进行表征，图3(b)显示了所有元素的原始XPS光谱，图中包含了C,Cd，Te以及S 元素。在Te3d光谱区，可以清楚地看到两个在582.5eV和572eV位置的对称谱峰，对应于自旋轨道相互作用引起的3d3/2和3d5/2分裂(图3 (d))。S2p光谱信号(图3(c))在161.5eV(S 2p3/2)和162.7eV (S 2p1/2)处出现两个对称峰，这也可以归因于自旋轨道诱导的分裂，证实Cd-S键在QDs表面形成。XPS结果为L-半胱氨酸中巯基与CdTe量子点表面的结合性质提供了额外的证据。
参照图4，为实施例1得到的L-Cys-CdTe与右旋谷氨酸(D-Glu) 作用之后的圆二色谱图。由图中可知，随着右旋谷氨酸浓度的增大， L-Cys-CdTe左旋手性的信号逐渐降低。并且在210nm和250nm附近均出现了明显的手性振动，根据文献报告，其中210nm附近的手性振动归属于L-Cys,而250nm处的手性振动属于Cys-Cd组成的络合物的手性振动，该结果表明L-Cys将手性信息传递给了CdTe量子点,并诱导CdTe产生手性。
参照图5，为实施例1得到的L-Cys-CdTe与右旋谷氨酸(D-Glu) 作用之后的荧光光谱图。由图中可知，随着右旋谷氨酸浓度的增大， L-Cys-CdTe荧光光谱的强度先增加，随后剧烈下降。
参照图6，为实施例1得到的FA-L-Cys-CdTe手性荧光双标记探针红外光谱，印证了图3得出的结论。
参照图7，为实施例1得到的FA-L-Cys-CdTe荧光双标记探针的圆二色谱图，该图表征了FA-L-Cys-CdTe在250nm处附近出现了明显的手性振动，印证了图4得出的结论。
参照图8，为实施例1得到的FA-L-Cys-CdTe手性荧光双标记探针荧光光谱图，该图表征该材料的波长在613nm附近，发橙红色光，荧光发光光谱尖锐，具有较大的Stockes位移，直观地验证了本发明所述的FA-L/D-Cys-CdTe手性荧光双标记探针的荧光性能。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (5)
1.一种靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针，其特征在于：该探针结构包括有手性量子点和叶酸耦合而形成的手性荧光双标记探针，所述探针的末端是叶酸(FA)，所述手性量子点具有手性光学活性，所述探针具有能够靶向识别肿瘤细胞和荧光显像的特性；
其中，所述手性荧光双标记探针的手性量子点结构包括有：L/D-Cys-CdTe结构、L/D-Cys-CdTe/CdS核壳结构、L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-Cd(Zn)Te(Se,S)结构和L/D-半胱氨酸/谷胱甘肽/青霉素-(Cd,Zn)(Te,Se,S)/(Cd,Zn)(Te,Se,S)核壳结构。
2.一种根据权利要求1所述靶向标记叶酸受体亚型手性量子点手性荧光双标记探针的制备方法，该方法包括以下步骤：
手性量子点的制备：
1)量取0.01-0.10gTe/Se/S粉与0.01-0.10gNaBH4并溶解于5ml去离子水中，在惰性气体的保护下，获得前体溶液；
2)量取0.1-0.3g氯化镉/氯化锌(CdCl2/ZnCl2)、配体与上述获得的前体溶液相互混合于45ml去离子水中，并且pH值为7-12，其中，所述配体为手性配体；
3)将步骤2)中的混合溶液，在加热并有惰性气体保护条件下反应，反应时间100-150min；
4)CdTe/CdS/CdSe回流2小时后，自然冷却至30℃-80℃，分别配置浓度为0.5mol/L的Na2S溶液和浓度为0.5mol/L的CdCl2/ZnCl2溶液各5ml，超声溶解，待温度降到60℃，分别滴加配置好的Na2S溶液和CdCl2/ZnCl2溶液，滴加完毕后，加热温度至50℃-90℃回流1-3小时即可得到手性量子点溶液；
手性荧光双标记探针的制备(手性量子点与叶酸耦合)：
5)上述溶液再次降温至50-75℃，先后加入250μL浓度为0.01-0.1mol/L DCC和250μL相同浓度的NHS，室温条件下反应0.5-1.5小时；
6)加入250μL 0.01-0.1mol/L的叶酸(FA)溶液，氮气保护下不加热搅拌反应8-24小时，然后在去离子水中透析8-24小时，透析期间换水3-4次，得到纯化后的靶向标记叶酸受体亚型手性荧光双标记探针。
3.根据权利要求2所述的靶向标记叶酸受体亚型手性量子点荧光探针的制备方法，其特征在于：所述手性配体为L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、谷胱甘肽、青霉素等手性配体中的一种。
4.根据权利要求2所述的一种靶向标记叶酸受体亚型手性量子点荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤2)的混合溶液中，Cd/Zn：Te/Se/S：配体的摩尔比为1：(0.1-1)：(0.1-5)，其中，CdCl2的摩尔浓度为1-10mmol/L。
5.根据权利要求2所述的一种靶向标记叶酸受体亚型手性量子点荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中加热方式包括水浴法、油浴法和水热法，水浴法的加热温度为80-100℃，油浴法、水热法的加热温度为75-185℃。
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