ES2321841T3

ES2321841T3 - Copolimeros heterofuncionales de glicerol y polietilenglicol, sus conjugados y composiciones.

Info

Publication number: ES2321841T3
Application number: ES04809612T
Authority: ES
Inventors: Francis Ignatious
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 2003-08-26
Filing date: 2004-08-25
Publication date: 2009-06-12
Anticipated expiration: 2024-08-25
Also published as: JP2007503514A; US20050048650A1; DE602004019546D1; EP1663171B1; WO2005037911A2; ATE422880T1; US7196145B2; WO2005037911A3; EP1663171A4; EP1663171A2; EP1663171B9

Abstract

Un compuesto representado por la estructura: **(Ver fórmula)** en la cual l es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000; m es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000; n es un número entero que tiene un valor de 1 a 100; p es un número entero que tiene un valor de 1 a 100; y x es un número entero que tiene un valor de 1 a 100.

Description

Copolímeros heterofuncionales de glicerol y polietilenglicol, sus conjugados y composiciones.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a copolímeros heterofuncionales de glicerol y polietilenglicol, a conjugados de estos copolímeros heterofuncionales con agentes bioactivos, nanopartículas, y lípidos; y a composiciones que contienen estos conjugados. Estos conjugados pueden proporcionar una ampliación del tiempo de circulación en el cuerpo humano, en comparación con agentes bioactivos, nanopartículas y liposomas no conjugados.

Antecedentes de la invención

La conjugación de polímeros hidrosolubles con agentes bioactivos y sistemas portadores coloidales tales como nanopartículas, micelas, niosomas y liposomas, se utiliza para prolongar su semivida circulante y reducir la toxicidad en el cuerpo humano lo que, a su vez, confiere mayor eficacia, menor frecuencia de dosificación y una mejor cumplimentación por parte del paciente. La mayor eficacia de los agentes bioactivos conjugados con polímeros se pone de manifiesto en diversos productos comercializados tales como PEG-Intron®, Neulasta®, Somavert®, Oncospart®, Adagen® y PEGASY®, en los que se ha conjugado polietilenglicol, designado en lo sucesivo "PEG", a diversos productos terapéuticos de proteína. Estos productos constituyen ejemplos del uso de polímeros hidrosolubles conjugados con proteínas terapéuticas hidrosolubles para prolongar la semivida de circulación.

Se está estudiando la conjugación de polímeros hidrosolubles con agentes bioactivos insolubles en agua con el fin de potenciar la solubilidad de principios activos insolubles en agua. Ejemplos de sistemas de este tipo en desarrollo son camptotecina conjugada con polietilenglicol, paclitaxel conjugado con ácido poliglutámico, y paclitaxel conjugado con polihidroxi-metacrilamida.

Los polímeros hidrosolubles se pueden acoplar con polímeros hidrófobos en una arquitectura de bloques. Estos polímeros en bloque se auto-ensamblan en medio acuoso para formar micelas polímeras y nanopartículas. Estas micelas polímeras y nanopartículas tienen un núcleo hidrófobo y una cubierta hidrófila a su alrededor. El núcleo hidrófobo interior puede incorporar medicamentos hidrófobos insolubles en agua por asociación hidrófoba. Por lo tanto, estas micelas polímeras y nanopartículas se pueden utilizar para el suministro de medicamentos.

Una característica importante de los sistemas conjugados con polímeros es su acumulación pasiva en un sitio afectado por un tumor debido al efecto de tamaño, conocido como "efecto epr" (incremento de permeabilidad y retención, siglas en inglés), causado por la naturaleza de la vasculatura susceptible a sufrir filtraciones tumoral. Esta dianización pasiva es el mecanismo de acción de un agente antitumoral, SMANCS, autorizado en Japón contra la cirrosis hepática. SMANCS consiste en un copolímero de estireno anhídrido maleico, de bajo peso molecular, conjugado con neocarzinostatina a través de los grupos anhídrido presentes en el polímero. Aunque el peso molecular de SMANCS es de aproximadamente 16-17 kDa, forma agregados mayores con albúmina sérica. Se afirma que este tamaño agregado del conjugado, 80 kDa, es responsable de la acumulación espontánea, pero pasiva de SMANCS en el sitio del
tumor.

El mecanismo de dianización pasivo descrito anteriormente se pone de manifiesto también por medio de nanopartículas y micelas polímeras que tienen un diámetro menor que 200 nm, con la condición de que muestren una semivida de circulación en plasma prolongada. Dado que las nanopartículas y las micelas polímeras están recubiertas inherentemente con un polímero hidrosoluble hidrófilo, cabe esperar que potencien la semivida de la circulación en plasma y, por consiguiente, la acumulación pasiva en el sitio del tumor. A diferencia de las nanopartículas y micelas polímeras. Los liposomas carecen de una cubierta polímera hidrófila inherente para prevenir su captación por el Sistema Fagocitario Mononuclear (MPS), y son rápidamente retirados de la circulación hacia órganos ricos en células fagocitarias tales como el hígado, bazo y médula ósea.

Los liposomas son pequeñas vesículas que poseen una o múltiples bicapas lipídicas concéntricas que rodean un espacio acuoso. Debido a su versatilidad estructural en términos de tamaño, carga superficial, composición lipídica, fluidez de la bicapa, y gracias a su capacidad para encapsular prácticamente cualquier medicamento, se apreció fácilmente su importancia como sistemas de suministro de medicamentos. Sin embargo, tras la inyección intravenosa de liposomas, el Sistema Fagocitario Mononuclear (MPS) los reconoce como partículas extrañas y son rápidamente retirados de la circulación hacia órganos ricos en células fagocitarias tales como hígado, bazo y médula ósea.

Se han identificado diversas posibilidades para reducir este efecto tales como, por ejemplo, reducir el tamaño de partícula de los liposomas y modificar su carga de superficie. Otro desarrollo se refiere a la modificación superficial de los liposomas mediante la introducción de componentes polímeros hidrófilos específicos sobre la superficie de los liposomas, en donde estos grupos reducen la adsorción de proteínas sobre la superficie de la partícula. En consecuencia, estos liposomas están protegidos contra el reconocimiento por las células del MPS y exhiben un tiempo de residencia prolongada en la circulación general. Un ejemplo bien conocido de modificación de la superficie del liposoma es la incorporación, durante la preparación de composiciones liposómicas, de un derivado lipídico del polímero hidrófilo polietilenglicol (PEG). Habitualmente, este polímero hidrófilo está modificado terminalmente con un resto hidrófobo, que es el residuo de un derivado de fosfatidil etanolamina o un ácido graso de cadena larga. En sí mismo, polietilenglicol es un polímero bastante estable que repele la adhesión de proteínas y que no está sometido a degradación enzimática o hidrolítica bajo condiciones fisiológicas.

Se han obtenido buenos resultados con respecto a ampliar la semivida plasmática y disminuir la acumulación en órganos ricos en células fagocitarias tras la administración intravenosa de liposomas dotados de una superficie sobre la que se ha injertado PEG en varias especies animales y también en el ser humano (Storm G., Belliot S.O., Daemen T. y Lasic D.D.: Surface modificaction of nanoparticles to oppose uptake by the mononuclear phagocyte system, en Adv. Drug Delivery Rev. 17, 31-48 (1995); Moghimi S.M., Hunter A.C., y Murray J.C.: Long-circulating and target-specific nanoparticles; theory to practice, en Pharmacol. Rev. 53, 283-318 (2001)). Se han obtenido ya autorizaciones para la comercialización de preparaciones liposómicas de este tipo, que contienen doxorubicina.

Hasta la fecha, las preparaciones disponibles en el comercio basadas en liposomas-PEG son preparaciones de suspensión acuosa. Es bien sabido que la vida útil de las preparaciones de suspensión acuosa liposómicas, en general, y de los liposomas-PEG, es más bien limitada. Se conocen diversas técnicas para separar el vehículo o la fase continua de estas preparaciones tales como secado por pulverización, diafiltración, evaporación rotacional y liofilización. Recientemente, se ha propuesto un método de liofilización, que mejoró la vida útil a largo plazo de los liposomas-PEG que contienen el quelante de tecnecio hidrazino nicotinamida (Laveman P., van Bloois L., Boerman O.C., Oyen W.J.G., Corstens F.H.M., y Storm G.: Lyophilisation of Tc-99m-HYNIC labelled PEG-liposomes, en J. Liposome Res. 10 (2 y 3), páginas 117-129 (2000), pero se requieren investigaciones adicionales de los resultados y la aplicabilidad de esta técnica en preparaciones liposómicas.

Los inconvenientes inherentes al uso de polietilenglicol obligaron a los investigadores a analizar polímeros alternativos. Se han propuesto numerosos polímeros como candidatos apropiados para ser derivatizados con lípidos (formadores de vesículas) para su incorporación en liposomas (véase, por ejemplo, el documento EP-0688207). Los polímeros hidrosolubles e hidrófilos poli(vinilpirrolidona), poli(acrilomorfolina), poli(2-(m)etil-2-oxazolina), poliacrilamida y poliglicerol han demostrado prolongar, en cierto grado, el tiempo de circulación de los liposomas tras su administración intravenosa. Sin embargo, hasta la fecha estos conjugados de lípidos y polímeros no se han aplicado en preparaciones medicamentosas disponibles en el comercio, principalmente porque no han demostrado ninguna ventaja sobre los conjugados de lípidos-PEG ya conocidos.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de encontrar un polímero que pueda ser derivatizado con un lípido para permitir su incorporación en composiciones coloidales portadoras tales como liposomas, en donde dicho polímero tenga propiedades de circulación prolongada.

Dibujos detallados de la invención

Figura 1 revela tres ejemplos de copolímeros aleatorios o ramificados. El Ejemplo 1 muestra un copolímero aleatorio de glicidol y óxido de etileno. El Ejemplo 2 muestra un copolímero en bloque que contiene poliglicidol ramificado, al que se unen bloques de óxido de etileno. El Ejemplo 3 muestra un copolímero en bloque con una arquitectura diferente de la del Ejemplo 2.

Figura 2 muestra una representación esquemática de la polimerización de óxido de etileno, usando bis(trimetilsilil)amida de potasio.

Figura 3 describe una representación esquemática de un copolímero híper-ramificado que, tras la desprotección, proporciona un grupo aldehído en un extremo del copolímero, y grupos hidroxilo en el otro extremo terminal.

Figura 4 muestra una representación esquemática de un copolímero híper-ramificado heterofuncional, que tiene un grupo funcional carboxilo en un extremo, y múltiples grupos hidroxilo en el otro extremo terminal.

Sumario de la invención

El copolímero heterofuncional de la presente invención es un copolímero de glicerol y polietilenglicol, en donde el copolímero tiene una estructura aleatoria o en bloque (véase la Figura 1). Los copolímeros de la invención se pueden preparar a partir de monómeros de glicidol y óxido de etileno.

La presente invención se refiere, asimismo, a conjugados de estos copolímeros con agentes bioactivos y polipéptidos terapéuticos.

La presente invención se refiere a conjugados de estos copolímeros con polímeros hidrófobos, y los copolímeros anfífilos resultantes son capaces de formas micelas polímeras que se pueden utilizar como sistemas de suministro de agentes bioactivos.

La presente invención se refiere, también, a los conjugados de los copolímeros con lípidos, y tales conjugados de lípido-copolímero son capaces de formar liposomas que pueden actuar como sistemas de suministro para agentes bioactivos. Estos liposomas exhiben semividas de circulación prolongadas.

Descripción detallada de la invención I. Copolímeros Heterofuncionales A. Descripción de los Copolímeros Heterofuncionales

Los copolímeros heterofuncionales de la presente invención son un copolímero de glicerol y polietilenglicol, en donde el copolímero tiene una arquitectura aleatoria o en bloque. En una realización de la presente invención, los copolímeros se preparan a partir de monómeros de glicidol y óxido de etileno.

Un aspecto de la presente invención comprende compuestos representados por la estructura:

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1

en la cual

l es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

m es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

n es un número entero que tiene un valor de 1 a 100;

p es un número entero que tiene un valor de 1 a 100; y

x es un número entero que tiene un valor de 1 a 100.

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Otro aspecto de la presente invención comprende compuestos representados por la estructura:

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2

en la cual

l es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

m es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

n es un número entero que tiene un valor de 1 a 100;

p es un número entero que tiene un valor de 1 a 100; y

x es un número entero que tiene un valor de 1 a 100.

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3

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en la cual

l es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

m es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

n es un número entero que tiene un valor de 1 a 100;

p es un número entero que tiene un valor de 1 a 100; y

x es un número entero que tiene un valor de 1 a 100.

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4

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en la cual

Y es un polipéptido, un medicamento, un polímero hidrófobo seleccionado de poliésteres, ácido poliláctico, ácido polimálico, policaprolactona, polidioxanona, policarbonatos, polianhídridos, poliortoésteres, derivados hidrófobos de poli(alfa-aminoácidos), polialquil-éteres, polipropilenglicoles y sus copolímeros, o un lípido;

l es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

m es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

n es un número entero que tiene un valor de 1 a 100;

p es un número entero que tiene un valor de 1 a 100; y

x es un número entero que tiene un valor de 1 a 100.

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5

en la cual

X es NH_{2}, CHO o COOH; y

PEG es una unidad de repetición de polietilenglicol que tiene un peso molecular en peso desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 20.000.

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6

en la cual

X es NH2, CHO o COOH; y

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De acuerdo con la presente invención, el o los polipéptidos, medicamento(s), polímeros seleccionados de poliésteres, ácido poliláctico, ácido polimálico, policaprolactona, polidioxanona, policarbonatos, polianhídridos, poliortoésteres, derivados hidrófobos de poli(alfa-aminoácidos), polialquil-éteres, polipropilenglicoles y sus copolímeros, y lípidos están unidos químicamente con el copolímero heterofuncional. La conjugación química, por ejemplo, del copolímero heterofuncional con un medicamento insoluble en agua potenciará eficazmente la solubilidad del medicamento y mejorará, por lo tanto, su eficacia en el organismo humano.

La conjugación química del copolímero heterofuncional con un polipéptido pretende direccionar y optimizar el suministro de productos terapéuticos basados en proteínas. Durante su uso in vivo, muchas proteínas son eliminadas demasiado rápidamente de la circulación. Algunas proteínas presentan una solubilidad den agua menor que la óptima para un agente terapéutico que circula por el torrente sanguíneo. Algunas proteínas dan lugar a problemas inmunológicos cuando se utilizan como agentes terapéuticos. Se han comunicado problemas inmunológicos con proteínas sintéticas, incluso cuando el compuesto tiene, aparentemente, la misma estructura básica que el producto natural homólogo.

Para el uso in vivo, la cubierta polímera puede ayudar a proteger el compuesto contra ataques químicos, a limitar los efectos secundarios adversos del compuesto cuando se inyecta en el organismo, y a incrementar el tamaño del compuesto. Potencialmente, se pueden obtener de este modo compuestos útiles que tienen ciertos beneficios clínicos, pero de otra forma no resultan de utilidad o, incluso, pueden ser perjudiciales para el organismo. Por ejemplo, la cubierta polímera que rodea una proteína puede reducir la velocidad de excreción renal y las complicaciones inmunológicas, pudiendo incrementar la resistencia de la proteína a la degradación proteolítica en sustancias inactivas y más simples.

La conjugación química del copolímero heterofuncional con un polímero hidrófobo y biocompatible, conduce a la formación de copolímeros anfífilos, capaces de auto-ensamblarse espontáneamente en agua para formar micelas polímeras. Estos polímeros hidrófobos incluyen, pero no se limitan a: poliésteres, por ejemplo, ácido poliláctico, ácido polimálico, policaprolactona, polidioxanona, policarbonatos, polianhídridos, poliortoésteres; derivados hidrófobos de poli(alfa-aminoácidos) tales como los que se han descrito para polímeros hidrófilos; polialquil éteres (por ejemplo, polipropilenglicoles); copolímeros de los mismos; y derivados de los anteriores.

En otro aspecto de la presente invención, la conjugación química del copolímero heterofuncional con un lípido, de forma adecuada un lípido anfífilo, da lugar a un conjugado de lípido anfífilo-copolímero, capaz de formar o que se puede incorporar a un liposoma. Estos conjugados de lípido-copolímero se pueden utilizar, por tanto, como sistemas de suministro o vehículos para agentes bioactivos de elección. Se espera que los liposomas muestren semividas de circulación más prolongadas que con la administración del agente solo.

B. Métodos de Fabricación de los Copolímeros Heterofuncionales

El copolímero heterofuncional de la presente invención es un copolímero de glicerol y polietilenglicol, en donde el copolímero tiene una arquitectura aleatoria o en bloque (véase la Figura 1). Estos copolímeros de la invención se pueden preparar a partir de monómeros de glicidol y óxido de etileno.

En la bibliografía, se sabe que la polimerización controlada de glicidol puede dar lugar a poligliceroles híper-ramificados. La presencia de óxido de etileno en la mezcla de reacción produce copolímeros de óxido de etileno y glicerol (Ph. Dimitrov, Polymer 43 (2002) 7171-7178). La arquitectura del copolímero viene determinada por la relación de glicidol a óxido de etileno, por el orden de adición de los monómeros al medio de polimerización, así como por la velocidad de adición a la mezcla, que puede incluir también una alimentación continua de los monómeros. Como ejemplo representativo de lo anterior, una mezcla de óxido de etileno y glicidol puede conducir a copolímeros aleatorios de glicidol y óxido de etileno, véase el Ejemplo 1 en Figura 1. El inicio de la polimerización de glicidol en ausencia de óxido de etileno puede dar lugar a un poliglicidol altamente ramificado que, si se trata adicionalmente con óxido de etileno, produce copolímeros en bloque de poliglicidol y polietilenglicol. Estos copolímeros en bloque contienen poliglicidol ramificado al que se fijan bloques de óxido de etileno, véase el Ejemplo 2 en Figura 1. Sin embargo, si el óxido de etileno se polimeriza en primer lugar y, a continuación, se agrega glicidol, el copolímero en bloque resultante tendrá una arquitectura diferente, tal como se ve en el Ejemplo 3 en Figura 1.

Una característica importante de esta invención es la presencia de los dos tipos diferentes de grupos funcionales en los extremos del copolímero híper-ramificado de óxido de polietileno y poliglicidol. La presencia de los dos tipos diferentes de grupos funcionales facilita el uso selectivo de un grupo funcional para la conjugación de uno o múltiples agentes bioactivos terapéuticos, polímeros hidrófobos y lípidos.

Por ejemplo, el "copolímero" puede tener un grupo carboxílico en un extremo terminal y un grupo hidroxilo en el otro extremo terminal. En esta realización, el grupo carboxílico se puede utilizar para conjugar con agentes terapéuticos bioactivos, polímeros hidrófobos y lípidos. Se debe entender que el grupo carboxílico se puede activar o convertir en cualquier especie reactiva apropiada para esa conjugación.

En otra realización, cabe la posibilidad de tener al menos dos tipos diferentes de grupos funcionales en el copolímero, que pueden ser un grupo amino en un extremo terminal y grupos hidroxilo en el otro extremo terminal. En este caso, puesto que el grupo amino es más reactivo que el grupo hidroxilo, se le puede hacer reaccionar y usar para la conjugación con el agente bioactivo, el polímero hidrófobo y los lípidos deseados. Una tercera realización consiste en la presencia de un gru8po aldehído en un extremo terminal y grupos hidroxilo en el otro extremo terminal, con reacción y conjugación similares de los agentes bioactivos, polímeros hidrófobos y lípidos.

Como otro aspecto de la invención, se reconocerá que, debido a la capacidad de tener estos grupos funcionales adicionales tales como los grupos hidroxilo libres diseminados por toda la arquitectura, resulta posible agregar también medicamentos a estos grupos adicionales, generando de este modo una carga mayor, o más diversa, de agentes activos a suministrar, independientemente del grupo funcional en uno y otro extremos terminales que se use para conjugar el agente bioactivo, polímero hidrófobo o lípido inicial al copolímero heterofuncional.

La síntesis de un copolímero heterofuncional e híper-ramificado de óxido de polietileno y poliglicidol se puede llevar a cabo aplicando métodos descritos en la bibliografía. La polimerización aniónica es un método de elección para la síntesis de estos copolímeros.

Por ejemplo, el documento US 5.679.765 describe un procedimiento para la preparación de un poliéter que tiene un grupo amino en un extremo terminal y un grupo hidroxi en el otro extremo terminal, utilizando bis(trimetilsilil)amida de potasio como iniciador de la polimerización en la polimerización de un compuesto epoxídico, así como un iniciador aniónico de polimerización que comprende bis(trimetilsilil)amida de potasio. Cuando se lleva a cabo la polimerización aniónica con abertura del anillo de óxido de etileno y glicidol usando una sal de metal alcalino de bis(alquilsilil)amida o una ftalimida como iniciador de la polimerización, el copolímero final tendrá un grupo (R_{3}Si)_{2}N en un extremo terminal y grupos hidroxi en el otro extremo terminal. La reacción con un ácido débil convertirá este copolímero en un grupo amino primario al retirar el grupo protector trimetilsililo.

El grupo amino (NH_{2}) en un extremo tiene su origen en el iniciador de polimerización, de modo que el grupo amino está presente en cada cadena polímera. Este es un rasgo característico también de los poliéteres según se describen en este documento. El otro extremo del poliéter es el grupo nucleófilo -OK, en el que se puede introducir una amplia variedad de grupos funcionales por la reacción de este extremo terminal con un grupo tosilo, etc. Además, la bis(alquilsilil)amida que se origina en el iniciador de polimerización se puede hacer reaccionar con un reactivo adecuado, convirtiéndose de este modo en un grupo funcional diferente del grupo amino primario, y diferente del otro extremo, de modo que se puede sintetizar un poliéter que tiene una combinación arbitraria de diferentes tipos de grupos funcionales terminales.

La Figura 2 muestra la polimerización de óxido de etileno usando bis(trimetilsilil)amida de potasio. La polimerización evoluciona con una especie aniónica activa típica, de manera que no se produce terminación por polimerización y se puede obtener un óxido de polietileno dotado de una distribución de peso molecular extremadamente estrecha. Adicionalmente, se puede obtener un polímero con un peso molecular arbitrario variando la relación "monómero/iniciador de polimerización". Es decir, el grado medio de polimerización del polímero resultante es prácticamente el mismo que el "número de moles de monómero/número de moles de iniciador de la polimerización".

La aplicación de esta estrategia de síntesis a la copolimerización de óxido de etileno y glicidol conduce a la formación de un copolímero híper-ramificado que posee un grupo amino en un extremo y grupos hidroxilo en los restantes extremos.

Es posible introducir otros conjuntos diferentes de grupos funcionales en los extremos del "copolímero", usando hidroxi-aldehídos, en los que el grupo aldehído puede estar protegido, y la copolimerización aniónica de óxido de etileno y glicidol se puede iniciar por el álcali o la sal de metal alcalino-térreo del grupo hidroxi. El copolímero híper-ramificado resultante proporciona, después de la desprotección, un grupo aldehído en un extremo y grupos hidroxilo en los restantes extremos (Figura 3).

Una tercera estrategia para producir copolímeros heterofuncionales híper-ramificados se describe en el documento US 2003/0027929, que no implica la protección de grupos funcionales durante la polimerización aniónica. En consecuencia, se utiliza como iniciador la sal de ión metálico de un ácido hidroxicarboxílico. El ión metálico se puede seleccionar de Li, Na, K y Cs. La copolimerización de óxido de etileno y glicidol se inicia en el grupo hidroxilo, conduciendo a la formación de un grupo funcional carboxilo en un extremo y de múltiples grupos hidroxi en los otros extremos terminales (Figura 4).

La copolimerización se lleva a cabo bajo una atmósfera inerte y en un disolvente. Una vez completa la polimerización, se finaliza mediante la adición de un ácido tal como ácido acético, ácido dicloroacético y ácido clorhídrico. El disolvente se puede seleccionar de tetrahidrofurano, dioxano, N,N-dimetilformamida, dimetilsulfóxido, éter dimetílico de etilenglicol, y sus mezclas.

La copolimerización se puede llevar a cabo a aproximadamente 50ºC en presencia de un disolvente adecuado.

C. Conjugación del Copolímero con Componentes del Liposoma u Otras Moléculas Bioactivas

Métodos de Conjugación Química: En general, la unión covalente de los copolímeros heterofuncionales a una molécula bioactiva o un lípido formador de vesículas es logra por la activación de grupos químicos en un extremo del polímero, antes de la reacción con un lípido formador de vesículas. Para el acoplamiento de la molécula bioactiva o de un lípido se puede activar una amina o un grupo carboxilo terminal por medio de agentes activadores monofuncionales tales como N-hidroxisuccinimida, cloroformiato etílico, DCCD, Reactivo K de Woodward, ácido cianúrico y cloruro de trifluorometanosulfonilo, entre otros. Igualmente, se puede usar una serie de reactivos reticulantes bifuncionales que contienen grupos con diferentes reactividades tales como algunos de los diisocianatos, para activar los copolímeros antes de acoplarlos con componentes lipídicos.

En la Figura 4 se ilustra otra realización de la presente invención para activar copolímeros para su unión con un fosfolípido. En esta reacción, el grupo carboxilo terminal del polímero se activa por la reacción con N-hidroxisuccinimida. Después de esta etapa de activación, el polímero se hace reaccionar con un fosfolípido que contiene un grupo amino tal como fosfatidil-etanolamina para generar el lípido, formador de vesículas, derivatizado del copolímero, que forma parte de la composición de la invención.

Una característica importante del lípido anfífilo que se utiliza en el conjugado lípido-copolímero es que el lípido contiene un grupo funcional en su grupo o cabeza polar apto para la unión covalente con la cadena copolímera heterofuncional. El grupo o cabeza polar es, por ejemplo, un grupo amina primaria o secundaria, un grupo hidroxilo, un grupo aldehído, un haluro o un grupo carboxílico. El resto hidrófobo del lípido permite la incorporación de los conjugados lípido-copolímero a estructuras bicapa tales como liposomas, y actúa como sistema de anclaje. Los componentes lipídicos derivatizados de los liposomas según la presente invención pueden incluir, adicionalmente, un enlace lábil lípido-polímero tal como un enlace peptídico, éster o disulfuro, conocido en la técnica, y que puede ser escindido bajo condiciones fisiológicas selectivas tales como la presencia de la enzima peptidasa o esterasa, o de agentes reductores. El uso de estos enlaces para acoplar polímeros a fosfolípidos permite alcanzar elevados niveles en sangre de estos liposomas durante varias horas después de su administración, seguidos de la escisión de los enlaces reversibles y la eliminación del polímero de la bicapa liposómica exterior. Los liposomas exentos de polímero son, entonces, rápidamente captados por el sistema RES; véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 5.356.633, concedida a Woodle et al.

II. Preparación de los Liposomas A. Componentes del Liposoma

Los lípidos anfífilos que se utilizan en el conjugado lípido-copolímero pueden ser una diversidad de lípidos de origen sintético o natural, que tienen al menos una cola apolar hidrófoba y un grupo o cabeza polar hidrófila, tales como lípidos formadores de vesículas y lípidos de membrana. Existe una variedad de lípidos formadores de vesículas sintéticos y naturales, incluidos aquellos en los que dos cadenas de hidrocarburo pueden tener una longitud de entre 14 y 22 átomos de carbono, y con diversos grados de insaturación. En el liposoma según la invención se puede incluir también al menos uno de los nuevos lípidos conjugados con copolímeros descritos anteriormente.

Ejemplos de lípidos anfífilos apropiados incluyen, pero sin estar limitados a ellos: fosfolípidos, glicolípidos, ceramidas, colesterol y sus derivados, mono- o dialquilaminas C_{5}-C_{80} saturadas o parcialmente insaturadas, de cadena ramificada o lineal, aril-alquilaminas, cicloalquil-aminas, alcanoles, aldehídos, carbohaluros o ácidos alcanoicos y sus anhídridos.

Ejemplos representativos de estos lípidos anfífilos son fosfatidil-colina, fosfatidil-etanolamina, fosfatidil-inositol, fosfatidil-glicerol, ácido fosfatídico, fosfatidil-serina, esfingomielina, estearilamina, alcohol miristílico, colesterol y sus derivados; y ácido palmítico.

Un ejemplo de conjugado copolímero-lípido anfífilo heterofuncional es un lípido que tiene dos cadenas hidrófobas, típicamente cadenas alquilo, y un grupo o cabeza polar que contiene un grupo funcional, tal como se ha descrito anteriormente. Los derivados de fosfatidil-etanolamina y, en particular, la diesteraril-fosfatidil etanolamina, constituyen un grupo de fosfolípidos de este tipo, dado que contienen un grupo amino reactivo. Otro lípido anfífilo apropiado tiene como grupo o cabeza polar hidrófila una amina primaria o secundaria y dos restos apolares de cadena ramificada o lineal C_{5}-C_{80} saturada o insaturada. Ejemplos de los mismos son compuestos que contienen 1-heptadecil-octadecilamina y diestearilamina tales como diestearilamina y N-succinil dioctadecilamina (también designados en este documento como DODASuc).

Los liposomas representativos para utilizar en este documento comprenden:

HSPC (aproximadamente 10 hasta aproximadamente 90% en moles), colesterol (0 hasta aproximadamente 60% en moles, ó 30 hasta 50% en moles), conjugado copolímero-DSPE (0 a 20% en moles, ó 0 hasta aproximadamente 5% en moles); o

DSPC (aproximadamente 10 hasta aproximadamente 90% en moles), colesterol (0 hasta aproximadamente 60% en moles, o aproximadamente 30 hasta 50% en moles), conjugado copolímero-DSPE (0 hasta aproximadamente 20% en moles, también 0 hasta aproximadamente 5% en moles); o

POPC (aproximadamente 10 hasta aproximadamente 90% en moles), colesterol (0 hasta aproximadamente 60% en moles, o aproximadamente 30 hasta aproximadamente 50% en moles), conjugado copolímero-DSPE (0 hasta aproximadamente 20% en moles, también 0 hasta aproximadamente 5% en moles); o

Esfingomielina (aproximadamente 10 hasta aproximadamente 90% en moles), colesterol (0 hasta aproximadamente 60% en moles, o aproximadamente 30 hasta aproximadamente 50% en moles), conjugado copolímero-DSPE (0 hasta aproximadamente 20% en moles, también 0 hasta aproximadamente 5% en moles); o

POPC (aproximadamente 80 hasta aproximadamente 99,5% en moles), conjugado copolímero-DSPE (0 hasta aproximadamente 20% en moles, ó 0 hasta aproximadamente 5% en moles); o

DSPC (aproximadamente 10 hasta aproximadamente 90% en moles), colesterol (0 hasta aproximadamente 60% en moles, o aproximadamente 30 hasta aproximadamente 50% en moles), conjugado copolímero-colesterol (0 hasta aproximadamente 20% en moles, ó 0 hasta aproximadamente 5% en moles).

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La membrana del liposoma puede contener también conservantes tales como, por ejemplo, tocoferol como antioxidante. El liposoma puede contener también conjugados de azúcares y componentes hidrófobos tales como, por ejemplo, ésteres de ácido palmítico o esteárico de dextrano.

En otra realización, se seleccionan los componentes del liposoma para alcanzar un grado determinado de fluidez o rigidez para controlar la estabilidad del, liposoma en el suero y/o para controlar la velocidad de liberación del agente incluido en el liposoma. Es posible lograr liposomas con una bicapa lipídica más rígida, o una bicapa lipídica cristalina, mediante la incorporación de un lípido relativamente rígido, por ejemplo, un lípido que tenga una temperatura de transición de fase relativamente elevada, por ejemplo, mayor que la temperatura ambiente tal como, por ejemplo, mayor que la temperatura corporal y de hasta 80ºC. Los lípidos rígido, es decir, saturados contribuyen a una mayor rigidez de membrana de la bicapa lipídica. Es sabido también que otros componentes lipídicos tales como el colesterol contribuyen a la rigidez y estabilidad de membrana en estructuras de bicapa lipídicas.

Por otra parte, se puede lograr la fluidez del lípido mediante la incorporación de un lípido relativamente fluido, típicamente uno que tenga una fase lipídica con una temperatura de transición de fase cristalina de líquido a líquido relativamente baja, por ejemplo equivalente a temperatura ambiente o menor.

Los lípidos formadores de vesículas que tienen una temperatura de transición de fase principal desde aproximadamente 2ºC-80ºC se pueden utilizar como componentes principales de los liposomas de la presente composición. En una realización de la invención, se utiliza un lípido formador de vesículas que tiene una temperatura de transición de fase principal mayor que aproximadamente 37ºC como componente lipídico principal de los liposomas. En otra realización, se usa un lípido que tiene una temperatura de transición de fase entre aproximadamente 37 y 70ºC. A modo de ejemplo, el lípido diestearoil-fosfatidilcolina (DSPC) tiene una temperatura de transición de fase principal de 55,1ºC y el lípido fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) tiene una temperatura de transición de fase de 58ºC. Las temperaturas de transición de fase de numerosos lípidos se recogen en forma de tabla en múltiples documentos tales como el catálogo de Avantim Polar Lipids y la Base de Datos de Transición de Fase Termotrópica de Lípidos (LIPIDAT, Base de Datos de Referencia Estándar NIST 34).

Opcionalmente, se pueden incorporar características de liberación térmica o dependiente del pH en los liposomas, mediante la inclusión de lípidos termosensibles o sensibles al pH como un componente de la bicapa (por ejemplo, mezclas basadas en dipalmitoil-fosfatidilcolina:diestearil-fosfatidilcolina (DPPC:DSPC)). El uso de lípidos sensibles a la temperatura o al pH permite la degradación controlada de la membrana de la vesícula lipídica.

Los componentes del liposoma analizados se encuentran disponibles en el comercio, o se pueden preparar usando métodos conocidos en la técnica.

B. Preparación de Liposomas a partir de Componentes de Liposomas

La preparación de liposomas es bien conocida en la técnica y en la presente invención se pueden utilizar dichos métodos conocidos. En general, la formación de liposomas implica preparar una mezcla de lípidos formadores de vesículas, en forma pulverulenta, disolver la mezcla en un disolvente orgánico, liofilizar la solución, retirar las trazas de disolvente, reconstituir la solución con una solución tampón para formar vesículas multi-laminares y, opcionalmente, extruir la solución a través de un filtro para formar vesículas unilaminares grandes o pequeñas. El pH, la temperatura y la relación total de lípidos se seleccionan de acuerdo con principios bien conocidos en la técnica para formar las bicapas lipídicas. Ejemplos de métodos para formar liposomas, apropiados para utilizar en la invención, incluyen los que se describen en L.D. Mayer et al., Vesicles of Variable Sizes Produced by a Rapid Extrusion Procedure, B.B.A. 858(I); 161-8, 1986; Szoka, F. Jr. et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980); y Patentes de EE.UU. No. 5.077.056; 5.013.556; 5.631.018 y 5.395.619.

Para facilitar la fabricación, el conjugado copolímero-lípido se puede incorporar en los liposomas durante su preparación, es decir, el conjugado se halla presente durante la formación de la bicapa. En esta realización, el conjugado se incluye en la mezcla de materiales lipídicos pulverulentos usados para preparar los liposomas como se ha descrito anteriormente. Los liposomas resultantes tienden a tener el antagonista receptor presente en la superficie tanto interior como exterior de la bicapa lipídica.

De manera alternativa, el conjugado copolímero-lípido se puede incorporar en los liposomas después de su formación, es decir, el conjugado copolímero-lípido se inserta en la bicapa después de la formación de ésta. En esta realización, el copolímero tiende a estar presente solamente en la superficie exterior de la bicapa lipídica. En esta realización, el conjugado copolímero-lípido se disuelve en un disolvente apropiado, y la solución resultante se incuba con los liposomas bajo condiciones suaves de mezclado (por ejemplo, de forma inmóvil) durante un período de tiempo eficaz para que el conjugado copolímero-lípido se ensamble en la bicapa lipídica del liposoma.

En otro ejemplo de procedimiento de formulación, un agente terapéutico activo tal como un medicamento u otro compuesto, que se debe incluir en el liposoma, se dispersa, en primer lugar, por ultrasonidos en un tensioactivo (que incluye, opcionalmente, lípidos injertados con copolímero) que solubiliza fácilmente las moléculas hidrófobas. La suspensión micelar resultante del medicamento o compuesto se utiliza, entonces, para rehidratar una muestra lipídica desecada que contiene un porcentaje en moles apropiado de lípido injertado con copolímero o colesterol. A continuación, la suspensión forma liposomas por técnicas de extrusión conocidas en la técnica y los liposomas resultantes, opcionalmente se separan de la solución no encapsulada por separación de columna convencional.

En un aspecto de la presente invención, los liposomas se preparan para que tengan tamaños sustancialmente homogéneos dentro de un intervalo de tamaños seleccionado. Un método eficaz para establecer el tamaño comprende extruir una suspensión acuosa de liposomas a través de una serie de membranas de policarbonato que tienen un tamaño de poro uniforme seleccionado; el tamaño de poro de la membrana corresponderá aproximadamente con el tamaño máximo de los liposomas producidos por la extrusión a través de dicha membrana; véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 4.737.323.

Después de la formación del liposoma, es posible adaptar el tamaño de las vesículas para alcanzar una distribución de tamaños de los liposomas dentro de un intervalo determinado, tal como desde 0,03 hasta 0,05 \mum, según métodos conocidos. Se pueden preparar pequeñas vesículas unilaminares (SUVs, siglas en inglés), típicamente dentro del intervalo de 0,04 hasta 0,08 \mum, mediante tratamiento intensivo de ultrasonidos o por homogeneización de los liposomas. Se pueden producir liposomas de tamaño homogéneo, con tamaños dentro de un intervalo seleccionado entre aproximadamente 0,08 y 0,4 \mum, por ejemplo, mediante extrusión a través de membranas de policarbonato u otras membranas de tamaños de poro definidos, que poseen tamaños de poro uniformes, seleccionados y comprendidos dentro del intervalo de 0,03 hasta 0,5 \mum tales como, por ejemplo, 0,05, 0,08, 0,1 ó 0,2 \mum. El tamaño de poro de la membrana se corresponde aproximadamente con el tamaño máximo de los liposomas producidos por extrusión a través de esas membranas, especialmente cuando la preparación se extruye dos o múltiples veces a través de la misma membrana. La adaptación del tamaño se puede llevar a cabo en la solución tampón original utilizada para hidratar los lípidos,
de manera que los espacios interiores retengan este medio durante las fases iniciales de procesamiento del liposoma.

Las suspensiones de liposomas que se obtienen de acuerdo con esta invención se pueden conservar directamente, o tras la adición de adyuvantes, o sólo después de haber sido procesados adicionalmente (por ejemplo, liofilización o desecación por pulverización).

C. Definiciones

Con el fin de facilitar la comprensión de la presente invención, se definen seguidamente ciertos términos y expresiones. A lo largo de la descripción detallada aparecen definiciones adicionales.

El término "anticuerpo", tal como se usa en este documento, se refiere a una inmunoglobulina, o a un fragmento o derivado de la misma, y comprende todo polipéptido que incluya un sitio de unión para antígenos, independientemente de la fuente, método de producción (in vitro o in vivo), y otras características. El término incluye, pero no se limita a anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespecíficos, poliespecíficos, no específicos, humanizados, de cadena sencilla, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, e injertados con CDR. A menos que sea modificado por el término "intacto", como en "anticuerpos intactos", a los efectos de esta descripción, el término "anticuerpo" incluye también fragmentos de anticuerpos tales como Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb y otros fragmentos de anticuerpos que conservan la función de fijación de antígenos, es decir, la capacidad de fijar específicamente un antígeno. Típicamente, estos fragmentos comprenden un dominio de fijación de antígenos. La expresión "dominio de fijación de antígeno" se refiere a la parte de una molécula de anticuerpo que comprende la zona que fija específicamente o que es complementaria a una parte o la totalidad de un antígeno.

Un "copolímero" es un polímero que se forma enlazando al menos dos tipos de moléculas pequeñas (o monómeros) entre sí, en comparación con un homopolímero, que se forma uniendo solamente un tipo de pequeñas moléculas (o monómeros) entre sí. Los copolímeros se pueden utilizar como copolímeros alternantes, aleatorios, en bloque, de injerto, o híper-ramificados. En un copolímero alternante, los monómeros están dispuestos de manera alternante. En un copolímero aleatorio, las diversas unidades monómeras están dispuestas al azar. En un copolímero en bloque, las unidades monómeras se disponen agrupando, en primer lugar, todas las del primer tipo, y uniéndolas con un grupo de todas las del segundo tipo de monómeros. En un copolímero de injerto, cadenas de un monómero están injertadas en una cadena polímera del otro monómero. En un copolímero híper-ramificado, las cadenas de monómeros están dispuestas de forma ramificada, en comparación con el modo exclusivamente lineal. Los copolímeros híper-ramificados se pueden describir, adicionalmente, como copolímeros aleatorios híper-ramificados, copolímeros alternantes híper-ramificados, etc.

"Liposoma" significa una vesícula artificial, compuesta por una o múltiples bicapas que contienen fosfolípidos.

"Micela polímera" es una estructura auto-ensamblada formada por un copolímero anfífilo, compuesto por segmentos polímeros hidrófobos e hidrófilos. Durante el auto-ensamblaje del copolímero anfífilo en medio acuoso, se forma una estructura central de cubierta de micela polímera. El núcleo interno está compuesto por polímero hidrófobo, en tanto que la cubierta exterior deriva del polímero hidrófilo.

"Fosfolípido" señala un lípido que contiene fósforo con una cola hidrófoba compuesta por dos cadenas de ácidos grasos y un grupo o cabeza polar hidrófila que contiene el fosfato.

La expresión "ácido nucleico" hace referencia a ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), o ácido nucleico peptídico (PNA, un análogo de ADN en el que el esqueleto de fosfato ha sido sustituido por un esqueleto similar al peptídico, exento de carga). Se debe entender que la expresión incluye también análogos nucleótidos, y polinucleótidos de cadena sencilla o doble (por ejemplo, ARNsi). Los ejemplos de polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a ADN plasmídico o fragmentos del mismo, ADN o ARN viral, ARN antisentido, etc. La expresión "ADN plasmídico" se refiere a un ADN de doble cadena que es circular. "Antisentido", tal como se usa en este documento, hace referencia a un ácido nucleico capaz de hibridar con una porción de una región codificadora y/o no codificadora de ARNm gracias a la complementariedad de secuencia, interfiriendo de esta forma con la traducción desde el ARNm. Los términos "ARNsi" y "ARNi" se refieren a un ácido nucleico que es ARN de doble cadena que tiene la capacidad de inducir la degradación de ARNm, "silenciando", de este modo, la expresión génica. Típicamente, el ARNsi tiene una longitud de al menos 15-50 nucleótidos, por ejemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud.

"Resto dianizador" se refiere a un resto que ayuda en el suministro del liposoma a una porción particular del organismo, una célula o un tipo de tejido particular, o una región enferma particular. Los restos dianizadores que se unen a un tejido enfermo, tipo de célula particular, tipo de tejido, o que están dirigidos a una porción particular del organismo se pueden utilizar para ayudar en la localización del liposoma hacia la zona deseada con fines terapéuticos o diagnósticos. Los restos dianizadores incluyen, pero no se limitan a anticuerpos; agentes químicos; citoquinas; enzimas; haptenos; hormonas; moléculas no proteicas que confieren una característica de reconocimiento enzimático o de superficie particular al liposoma; péptidos; proteínas; y moléculas pequeñas.

"Agente activo terapéutico" incluye, pero no se limita a medicamentos, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, agentes nutricionales, tal como se describe en este documento. Esta expresión incluye agentes farmacéuticamente aceptables, agentes bioactivos, agentes terapéuticos, proteínas terapéuticas, agentes de diagnóstico, o medicamento(s) como se han definido en este documento, y sigue las directrices de las Normas de Buena Fabricación de la Unión Europea. Estas sustancias deben desarrollar actividad farmacológica u otro efecto directo en el diagnóstico, curación, alivio, tratamiento o prevención de enfermedades, o afectar a la estructura y función del cuerpo. La sustancia puede incluir también un agente de diagnóstico tal como un agente para la obtención de imágenes y/o un compuesto marcado radiactivamente. Su uso puede llevarse a efecto en un mamífero o en un ser humano. La actividad farmacológica puede ser profiláctica, o para el tratamiento de un estado patológico. Los presentes agentes incluyen productos terapéuticos tanto de moléculas pequeñas, como péptidos y proteínas. Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden comprender, opcionalmente, uno o múltiples agentes activos farmacéuticamente aceptables, agentes bioactivos, agentes activos, agentes terapéuticos, proteínas terapéuticas, agentes de diagnóstico o medicamento(s) o ingredientes distribuidos en ellos.

"Lípido formador de vesículas", tal como se usa en este documento, significa, por lo general, cualquier lípido anfífilo que tiene restos hidrófobos y de cabeza (ya sea polares o no polares), y que pueden formar espontáneamente vesículas bicapas en agua (como en el ejemplo de los fosfolípidos), o lípidos que se incorporan de manera estable en bicapas lipídicas en combinación con otros lípidos tales como fosfolípidos. Cuando se conforman en vesículas, el resto hidrófobo de un lípido formador de vesículas está en contacto con la región hidrófoba interior de la membrana de la bicapa, y el resto de cabeza está orientado hacia la superficie de la membrana.

D. Carga de Compuestos en el Interior del Liposoma 1. Compuestos que se pueden Cargar en el Interior de los Liposomas

En otra realización de la presente invención, los liposomas comprenden un agente terapéutico o de diagnóstico que está incluido en el liposoma, para ser suministrado a un sitio enfermo deseado. Evidentemente, la selección de un agente particular se hará en función de la enfermedad que se quiera tratar o diagnosticar. La selección del agente terapéutico o de diagnóstico se realizará en base a la naturaleza del sitio donde se localice la enfermedad y a la actividad del agente hacia dicho sitio, que se puede determinar, por ejemplo, mediante ensayos de quimiosensibilidad según métodos conocidos en la técnica, o mediante información de la historia médica y/o la práctica clínica aceptada.

El o los agentes pueden estar conjugados con el copolímero heterofuncional de la presente invención, o estar incorporados en composiciones coloidales portadoras, derivadas del copolímero heterofuncional, en una cantidad suficiente para alcanzar el efecto deseado.

Los agentes terapéuticos se pueden seleccionar, por ejemplo, de compuestos naturales o sintéticos que tienen las siguientes actividades: anti-angiogénica, anti-artrítica, anti-arrítmica, antibacteriana, anti-colinérgica, anticoagulante, anti-diurética, antiepiléptica, antifúngica, antiinflamatoria, antimetabólica, anti-migrañosa, antineoplásica, antiparasitaria, antipirética, anticonvulsivante, anti-sérica, antiespasmódica, analgésica, anestésica, beta-bloqueante, modificadora de la respuesta biológica, reguladora del metabolismo óseo, cardiovascular, diurética, enzimática, potenciadora de la fertilidad, estimulante del crecimiento, hemostática, hormonal, supresora hormonal, paliativa de la hipercalcemia, paliativa de la hipocalcemia, paliativa de la hipoglucemia, paliativa de la hiperglucemia, inmunosupresora, inmunopotenciadora, músculo-relajante, neurotransmisora, parasimpatomimética, simpatomimética expansora del plasma, expansora del plasma, psicotrópica, trombolítica y vasodilatadora. Los agentes terapéuticos citotóxicos son una clase de agentes que se ha utilizado extensamente en invenciones de liposomas.

Los ejemplos representativos de estos agentes terapéuticos se pueden suministrar en esta invención incluyen, pero no están limitados a: inhibidores de la topoisomerasa I, inhibidores de la topoisomerasa III, antraciclinas, alcaloides de la vinca, compuestos de platino, agentes antimicrobianos, inhibidores de la timidilato sintasa de los antifolatos de quinazolina, inhibidores de receptores de factores de crecimiento, inhibidores de la metionina aminopeptidasa-2, inhibidores de la angiogénesis, coagulantes, agentes líticos de la superficie celular, genes terapéuticos, plásmidos que comprenden genes terapéuticos, inhibidores de la Cox, inhibidores de la ARN-polimerasa, inhibidores de la ciclooxigenasa, esteroides y AINEs (antiinflamatorios no esteroides).

Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen:

Camptotecinas inhibidoras de la topoisomerasa I y sus análogos o derivados tales como SN-38 ((+)-(4S)-4,1,1-dietil-4,9-dihidroxi-IH-pirano[3',4':6,7]-indolizina[1,2-b]quinolina-3,14(4H,12H)-diona); 9-aminocaptotecina; topotecán (hicamptina; 9-dimetil-aminometil-10-hidroxicamptotecina); irinotecan (CPT-11; 7-etil-10-[4-(I-piperidino)-I-piperidino]-carboniloxi-camptotecina), que se hidroliza in vivo para dar SN-38); 7-etilcamptotecina y sus derivados (Sawada, S. et al., Chem. Pharma. Bull. 41(2):310-313 (1993)); 7-clorometil-10,11-metilen-dioxi-camptotecina; y otros (SN-22, Kunimoto T. et al., J. Pharmacobiodyn., 10(3):148-151 (1987); N-formilanilino-12,13-dihidro-I,1 25 dihidroxi-13-(beta-D-glucopiranosil)-5H-indolo[2,3-a]pirrolo[3,4-c]carbazol-5,7(6H)-diona (NB-506, Kanzawa, G. et al., Cancer Res. 55(13):2806-2813 (1995); DX-895if y lurtotecan (GW-211 o 7-(4-metilpiperazino-metilen)-10,11-etilendioxi-20(S)-camptotecina) (Rothenberg, M.L., Ann. Oncol. 8(9): 837-855 (1997)); y 7-(2-(N-isopropilamino(etil-(20S)-camptotecina (CKD602, Chong Kun Dang Corporation, Seúl, Corea).

Compuestos inhibidores de la topoisomerasa I/II tales como hidrocloruro de 6-[[2-(dimetilamino)etil]amino]-3-hidroxi-7H-inden[2,1-c]quinolin-7-ona (TAS 103, Utsugi, T. et al., Jpn. J. Cancer Res. 88(10): 992-1002 (1997)); 3-metoxi-11H-pirido[3',4-4,5]pirrolo[3,2-c]quinolino-1,4-diona (AzalQD, Riou, J.F. et al., Mol. Pharmacol. 40(5): 699-706 (1991)).

Antraciclinas tales como doxorubicina, daunorrubicina, epirabicina, pirarubicina e idarubicina; alcaloides de la vinca tales como vinblastina, vincristina, vinleurosina, vinrodisina, vinorelbina y vindesina.

Compuestos de platino tales como cisplatino, carboplatino, ormaplatino, oxaliplatino, zeniplatino, enloplatino, lobaplatino, espiroplatino, ((-)-®-2-aminometilpirrolidina (1,1-ciclobutano dicarboxilato)platino), (SP-4-3(R)-1,1-ciclobutano dicarboxilato-(2)-(2-metil-1,4-butanodiamina-N,N)platino), nedaplatino y (bis-acetato-amino-dicloro-ciclohexilamino-platino (IV).

Agentes antimicrobianos tales como gentamicina y nistatina; inhibidores de la timidilato sintasa de los antifolatos de quinazolina tales como los descritos por Hennequin et al., Quinazoline Antifolates Thymidilate Synthase Inhibitors: Lipophilic Analogues with Modification to the C2-Methyl Substituent (1996), J. Med. Chem. 39, 695-704; inhibidores de los receptores de los factores de crecimiento tales como los descritos por: Sun L. et al., Identification of Substituted 3-[(4,5,6,7-Tetrahydro-IH-indol-2-yl)methylene]-1,3-20 dihydroindol-2-ones as Growth Factor Receptor Inhibitors por VEGF-R2 (Flk I/KDR), FGF-RI and PDGF-Rbeta Tyrosine Kinases (2000), J. Med. Chem. 43:2655-2663; y Bridges A.J. et al., Tyrosine Kinase Inhibitors. An Unusually Steep Structure-Activity Relationship for Analogues of 4-(3-Bromoanilino)-6,7 dimethylquinazoline (PD 153035): a Potent Inhibitor of the Epidermal Growth Factor Receptor (1996), J. Med. Chem. 39:267-276; inhibidores de la angiogénesis tales como angiostatina, endostatina, equistatina, trombospondina, plásmidos que contienen genes que expresan proteínas anti-angiogénicas, e inhibidores de la metionina aminopeptidasa-2 tales como fumagilina, TNP-140 y sus derivados, y otros compuestos terapéuticos tales como 5-fluorouracilo (5-FU), mitoxantrona, ciclofosfamida, mitomicina, estreptozina, hidrocloruro de mecloroetamina, melfalan, ciclofosfamida, trietilen-tiofosfaramida, carmustina, lomustina, semustina, hidroxiurea, tioguanina, decarbazina, procarbazina, mitoxantrona, esteroides, citosina arabinósido, metotrexato, aminopterina, mitomicina C, demecolcina, etopósido, mitramicina, veneno de víbora Russell, factor IX activado, factor X activado, trombina, fosfolipasa C, factor de veneno de cobra [CVF] y ciclofosfamida.

Los agentes de obtención de imágenes en su estado gaseoso, tales como oxígeno, y excipientes marcados radiactivamente tales como éter oleico de 3H-colesterilo.

En otra realización, el agente terapéutico se puede seleccionar de: agentes antineoplásicos tales como topotecán, doxorubicina, daunorubicina, vincristina, mitoxantrona, carboplatino, inhibidores de la ARN polimerasa y sus combinaciones; agentes antiinflamatorios tales como inhibidores de la ciclooxigenasa, esteroides y AINEs; agentes anti-angiogénesis tales como fumagilina, tnp-140, inhibidores de la ciclooxigenasa, angiostatina, endostatina y equistatina; anti-infecciosos; y mezclas o combinaciones de los mismos.

En otra realización, el principio activo terapéutico se puede seleccionar de topotecán, doxorubicina, daunorubicina, vincristina, mitoxantrona, inhibidores de la ARN-polimerasa, y sus mezclas o combinaciones. En ciertas realizaciones, el principio activo terapéutico es topotecán. Asimismo, otras camptotecinas y análogos de la camptotecina son principios activo terapéuticos útiles.

Se pueden incorporar ácidos nucleicos en el liposoma de la invención, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido nucleico peptídico (PNA), oligonucleótidos, análogos nucleotídicos, polinucleótidos de cadena sencilla o doble, ADN plasmídico o fragmentos del mismo, ADN viral, ARN antisentido y ARNsi o ARNi (en referencia a un ácido nucleico que es un ARN de doble cadena, dotado de la capacidad de inducir la degradación de ARNm, "silenciando" de este modo la expresión génica y que, típicamente, tiene una longitud de 15-50 nucleótidos, por ejemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 nucleótidos de longitud).

Agentes nutricionales aptos para ser incorporados en los liposomas de la presente invención incluyen aminoácidos, azúcares, proteínas, carbohidratos, vitaminas hidro- o liposolubles (tales como vitamina C y vitamina E), o grasa. También son apropiadas las combinaciones de agentes nutricionales.

Los ejemplos de agentes de diagnóstico incluyen agentes de contraste para la obtención de imágenes, incluidos iones paramagnéticos, radiactivos o fluorogénicos. Los agentes específicos para la obtención de imágenes incluyen, adicionalmente, agentes de radiocontraste (tales como radioisótopos como Tc o In, o compuestos que contienen radioisótopos, incluyendo yodo-octanos, halocarbonos y renografina), agentes de obtención de imágenes por rayos X (tales como bario o plomo), agentes de obtención de imágenes ópticas (tales como cromóforos), agentes de obtención de imágenes por resonancia magnética (tales como iones paramagnéticos o compuestos paramagnéticos), y agentes de contraste para ultrasonidos. Ejemplos específicos de estos agentes de diagnóstico incluyen los que se describen en la Patente de EE.UU. No. 5.855.865, concedida a Thorpe et al. en 5 de enero de 1999.

2. Carga de Compuestos en el Interior del Liposoma o Conjugación de los Compuestos con Liposomas

Los métodos para incorporar agentes terapéuticos y de diagnóstico en liposomas son bien conocidos en la técnica y resultan útiles en la presente invención. Los métodos apropiados incluyen atrapamiento pasivo mediante la hidratación de una película lipídica con una solución acuosa de un agente hidrosoluble, o hidratando una película lipídica que contiene un agente lipofílico, carga/retención por gradiente de iones de pH (denominado, a menudo, carga remota y que emplea gradientes tales como de sulfato de amonio), carga/retención por gradiente de polímeros, y preparación de liposomas por evaporación de fase inversa. Por ejemplo, se describen métodos de utilidad para cargar dichos agentes en Haran, G. et al., Transmembrane Ammonium Sulfate Gradients in Liposomes Produce Efficient and Stable Entrapment of Amphipathic Weak Bases, Biochim Biophys Acta, Vol. 15 1, págs. 201-215 (1993); Patente de EE.UU. No. 5.077.056, concedida a Bally et al. en 31 de diciembre de 1991; 30 Publicación PCT No. WO 98/17256, publicada el 30 de abril de 1998; Zhu et al., The Effect of Vincristine-Polyanion Complexes IN STEALTH Liposomes on Pharmacokinetics, Toxicity and Anti-Tumor Activity, Cancer Chemother. Pharmacol. (1986) 39:138-142; y Publicación PCT No. WO 00/23052. Los agentes se pueden incorporar en uno o múltiples compartimentos del liposoma, o pueden estar unidos a la membrana liposómica.

La incorporación del agente activo por conjugación, tal como en el extremo terminal de un polímero anfífilo, se puede encontrar en Zalipsky et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 1995, 16, 157-182, y en Eur. Polym. J. 19(12), 1177-1183 (1983). Véanse, también, Zhang, Yuan-Peng; Ceh, Boris; Lasic, Danilo D. Liposomes in drug delivery, Polymeric Biomaterials (2ª edición) (2002), 783-821; Berg, Hermann. Medical applications of liposomes, D. Lasic, D. Papahadjopoulos, Bioelectrochemistry and Bioenergetics (1999), 48(2), 490; Lasic, Dan D., Novel Applications of Liposomes, Trends in Biotechnology (1998), 16(7), 307-321; y Lasic, Danilo G. Liposomes in drug delivery, Surfactant Science Series (1996), 62 (Vesicles), 447-476.

a. Procedimientos de Carga

Los métodos para incorporar agentes terapéuticos y de diagnóstico en liposomas son bien conocidos en la técnica y son de utilidad en la presente invención. Los métodos apropiados incluyen atrapamiento pasivo mediante la hidratación de una película lipídica con una solución acuosa de un agente hidrosoluble, o hidratando una película lipídica que contiene un agente lipofílico, carga/retención por gradiente de iones de pH (denominado, a menudo, carga remota y que emplea gradientes tales como de sulfato de amonio), carga/retención por gradiente de polímeros, y preparación de liposomas por evaporación de fase inversa. Por ejemplo, se describen métodos de utilidad para cargar dichos agentes en Haran, G. et al., Transmembrane Ammonium Sulfate Gradients in Liposomes Produce Efficient and Stable Entrapment of Amphipathic Weak Bases, Biochim Biophys Acta, Vol. 15 1, págs. 201-215 (1993); Patente de EE.UU. No. 5.077.056, concedida a Bally et al. en 31 de diciembre de 1991; 30 Publicación PCT No. WO 98/17256, publicada el 30 de abril de 1998; Zhu et al., The Effect of Vincristine-Polyanion Complexes IN STEALTH Liposomes on Pharmacokinetics, Toxicity and Anti-Tumor Activity, Cancer Chemother. Pharmacol. (1986) 39:138-142; y Publicación PCT No. WO 00/23052. Los agentes se pueden incorporar en uno o múltiples compartimentos del liposoma, o pueden estar unidos a la membrana liposómica.

E. Incorporación del Resto Dianizador al Liposoma 1. Descripción del Resto Dianizador

Opcionalmente, el liposoma puede incluir un resto dianizador para contribuir a su suministro a una parte determinada del organismo, una célula o tipo de tejido particular, o a una región enferma establecida. Los restos dianizadores que se unen a un tejido enfermo, tipo particular de célula, tipo de tejido o que están direccionados a una parte determinada del organismo, se pueden usar para contribuir a dirigir el liposoma a la zona deseada de tratamiento, diagnóstico u obtención de imágenes. Los restos dianizadores incluyen, pero no están limitados a anticuerpos; agentes químicos; citoquinas; enzimas; haptenos; hormonas; moléculas no proteicas que confieren una característica particular de reconocimiento enzimático o de superficie al liposoma; péptidos; proteínas; y moléculas pequeñas.

Estos restos dianizadores incluyen anticuerpos de los que se sabe que fijan antígenos cancerosos tales como los presentes en tumores o células cancerosas, o del epitelio vascular del tumor. Incluyen anticuerpos que se unen contra HER-2 (tales como los que se describen en el documento PCT WO 99/55637), y las integrinas \alpha_{v}\beta_{3}.

2. Conjugación del Resto Dianizador con el Fosfolípido e Incorporación en el Liposoma Incorporación en el Liposoma

El resto dianizador puede unirse a la superficie de un liposoma por medio covalente o no covalente. Para fijar de forma covalente un resto dianizador a la superficie del un liposoma, se puede incorporar al liposoma un lípido derivatizado que contiene una cadena de polietilenglicol funcionalizada en sus extremos. Después de la formación del liposoma, el grupo funcionalizado en los extremos puede reaccionar con un resto dianizador para acoplarse a la superficie del liposoma.

De manera alternativa, el resto dianizador se puede combinar, en primer lugar, con un lípido para formar un derivado resto dianizador-lípido, que se incorpora posteriormente al liposoma. Por ejemplo, se puede acoplar un resto dianizador con un grupo maleimida de una molécula de DSPE-copolímero. El conjugado resultante de resto dianizador-DSPE-copolímero se puede utilizar para formar liposomas, o se puede combinar con liposomas pre-formados.

Si el resto dianizador es un anticuerpo tal como con fragmento de anticuerpo scFv, se le puede expresar en un sistema recombinante adecuado tal como células de E. coli. La construcción expresada puede tener una secuencia C-terminal artificial: GGGC. Esta secuencia C-terminal proporciona un grupo tiol para la conjugación conveniente con el liposoma. Las células de expresión recombinante se lisan y se aísla el scFv usando cromatografía de afinidad de la proteína A, reducción de la cisteína terminal, y cromatografía de intercambio iónico.

A continuación, los fragmentos de anticuerpo scFv purificados se conjugan con la molécula enlazadora maleimido-copolímero-DSPE en una solución acuosa a pH 6,2 y una relación molar de enlazador/proteína de aproximadamente 4. El conjugado resultante se purifica por cromatografía de exclusión de tamaño. El conjugado purificado (en forma micelar) se incuba con liposomas pre-formados y cargados con el medicamento en una relación de aproximadamente 1 scFv por 1.300-2.600 fosfolípidos liposómicos, típicamente durante 1 hora a 55-65ºC.

En otro método de la invención, los restos dianizadores se pueden acoplar sin necesidad de grupos reactivos especiales para el acoplamiento. Es posible diseñar brazos espaciadores o enlazadores para obtener relaciones óptimas de acoplamiento y construcciones de restos dianizadores en el liposoma. Estas técnicas son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 4.762. 915).

III. Métodos de Uso del Liposoma

Los liposomas de la presente invención se pueden utilizar con una variedad de propósitos que incluyen, pero no están limitados a diagnóstico de una enfermedad o trastorno, obtención de imágenes y tratamiento de una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, se pueden incorporar medicamentos u otros agentes activos en el liposoma de la forma descrita, administrándolos a un paciente. Los medicamentos encapsulados pueden estar protegidos por el liposoma y, en ciertos casos, se pueden administrar a dosificaciones más bajas que los medicamentos no encapsulados. En otra realización, es posible incorporar agentes de obtención de imágenes en el liposoma, y administrarlos posteriormente a un paciente. Estos agentes de obtención de imágenes se pueden utilizar para la obtención de diversos tipos de imágenes, tal como se ha señalado anteriormente. Los agentes de obtención de imágenes se pueden usar para diagnosticar una enfermedad o trastorno. En una realización, un agente de obtención de imágenes está encapsulado en un liposoma recubierto con un resto dianizador. El resto dianizador puede ser, por ejemplo, un anticuerpo contra un antígeno canceroso. Los liposomas de este tipo se pueden usar para obtener imágenes y detectar una forma particular de cáncer. Los métodos para el uso de liposomas están plenamente reconocidos y han sido analizados detalladamente en la
técnica.

IV. Formas de Dosificación Farmacéutica

Para utilizar los liposomas de la invención, se les formulará normalmente en una composición farmacéutica de acuerdo con la práctica farmacéutica habitual. Por lo tanto, la invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva y atóxica de los liposomas descritos en este documento, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En otra realización, el liposoma incorporará también el agente activo terapéutico y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Los liposomas de la invención y las composiciones farmacéuticas que los incorporan se pueden administrar, de manera conveniente, por cualquiera de las vías usadas convencionalmente para la administración de medicamentos, por ejemplo, parenteral, oral, tópica, por inhalación (por ejemplo, intratraqueal), subcutánea, intramuscular, intralesional (por ejemplo, en los tumores), intranasal, intraocular y por inyección directa a los órganos, e intravenosa. En ciertas realizaciones, se puede utilizar la administración parenteral tal como, por ejemplo, la administración intravenosa, para administrar los liposomas de la invención y las composiciones farmacéuticas que los incorporan. Cuando los liposomas se diseñan, por ejemplo, para proporcionar actividad anti-angiogénica, la administración se llevará a cabo por alguna vía que implique la circulación de los liposomas por el torrente sanguíneo, incluida la administración intravenosa.

Los liposomas se pueden administrar en formas convencionales de dosificación, preparadas combinando los liposomas con vehículos farmacéuticos habituales, y según procedimientos convencionales. Asimismo, los liposomas se pueden administrar en dosificaciones convencionales, combinados con uno o múltiples compuestos terapéuticos o de diagnóstico adicionales. Estos procedimientos pueden comprender mezclar, granular y comprimir o disolver los ingredientes según sea apropiado para la preparación deseada.

Se podrá apreciar que la forma y carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable queda establecida por la cantidad de liposomas y de otros ingredientes activos con los que combinan, la vía de administración y otras variables bien conocidas. El o los vehículos deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los restantes ingredientes de la formulación, y no se perjudiciales para su receptor. Típicamente, los liposomas se suministrarán en forma de suspensión en un vehículo líquido tal como solución salina fisiológica o solución tampón. En general, la forma farmacéutica comprenderá los liposomas en cantidad suficiente para aportar los liposomas o el compuesto cargado en la cantidad de dosificación y régimen deseados.

Los liposomas se administran en una cantidad suficiente para aportar los liposomas o el compuesto cargado en la dosificación deseada, de acuerdo con el régimen establecido, para mejorar o prevenir el estado patológico que se está tratando, o para la obtención de imágenes del sitio enfermo que se está diagnosticando o controlando.

El experto en la técnica reconocerá que la cantidad óptima y la separación entre las dosis individuales de liposomas estarán determinadas por la naturaleza y el grado del trastorno tratado, diagnosticado o controlado, la forma, la vía y el punto de administración, así como por el paciente concreto que esté siendo tratado, y que dichos parámetros óptimos se pueden determinar por técnicas convencionales. El experto en la técnica deberá reconocer, igualmente, que el curso óptimo del tratamiento, es decir, el número de dosis de liposomas administradas al día durante un número definido de días, puede ser determinado por los expertos en la técnica, usando los ensayos de determinación convencionales de duración de los tratamientos.

Una vez administrados, los liposomas se asocian con el tejido que actúa como diana, o son transportados por el sistema circulatorio hasta dicho tejido diana, en donde se asocian con el mismo. En el sitio del tejido diana, los antagonistas del receptor pueden exhibir una eficacia por sí mismos, es decir, los propios liposomas pueden ser útiles para tratar la enfermedad presente en los receptores diana. Tal como podrá apreciar el experto en la técnica, la selección del liposoma se puede basar en la expresión del receptor cognado del conjugado sobre las células enfermas del paciente, lo cual se puede determinar por métodos conocidos, o que se pueden basar en la información histórica disponible para la enfermedad.

Adicional o alternativamente, se produce la liberación o difusión del agente terapéutico o de diagnóstico asociado con los liposomas hacia el tejido diana, en donde lleva a cabo su función prevista.

V. Métodos de Preparación Preparación por el método del aldehído de \alpha-formil-\omega-hidroxilo óxido de polietileno-co-poliglicidol

La síntesis del polímero implica estos dos pasos: polimerización, usando un alcohol que contiene un aldehído protegido, y eliminación del grupo protector para dar el aldehído.

a) Se agregan THF, 20 ml, 3,3-dietoxipropanol 0,15 g, y una solución de naftaleno de potasio 0,5 mol/l-tetrahidrofurano, 2 ml, a un recipiente de reacción, y se agitan durante 3 min en una atmósfera de argón; se produce un compuesto de 3,3-dietoxipropanol (óxido de 3,3-dietoxipropano potásico).

b) Se agrega una mezcla de 8,8 g de óxido de etileno y glicidol a esta mezcla de solución, y se agita a temperatura ambiente y 1 atm. Después de reaccionar durante 12 horas, la mezcla de reacción se vierte sobre éter de petróleo frío para precipitar el copolímero.

c) Se agregan 2,0 mol/l de 50 ml de HCl a 50 ml de THF, en donde se disuelve la muestra de copolímero de la etapa b), y esta mezcla se agita durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se neutraliza esta solución con una solución acuosa de NaOH, se somete a diálisis durante 4 horas (peso molecular fraccional 1000) contra 20 veces la cantidad de agua, y se refina por liofilización.

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Ejemplo 2 Preparación de un \alpha-carboxil-\omega-hidroxil óxido de polietileno-co-poliglicidol

Iniciador: ácido 4-hidroxibutírico-sal sódica/potásica

(K/NaOC-CH2CH2CH2OK/Na)

Síntesis del polímero en una etapa:

a) La copolimerización de óxido de etileno y glicidol se lleva a cabo en un reactor de alta presión (reactor Par) equipado con un agitador mecánico de funcionamiento magnético. En el reactor se producen burbujas de argón anhidro.

b) El iniciador se prepara por separado en un matraz de tres cuellos de 1 l, equipado con agitador magnético y un condensador con un cronómetro de tres vías. Se agrega al matraz ácido 4-hidroxibutírico sal sódica (5,7 g, 0,045 mol) (Fluka Chemical Co.), seguido de la adición de potasio recién cortado (1,8 g, 0,046 mol). Tras la adición del contenido sólido, se evacúa el matraz, seguido de presurización (30 psi) con argón. Se agregan 400 ml de tetrahidrofurano (THF) anhidro y la solución se somete a reflujo durante aproximadamente 12 horas. Se forma una solución homogénea. Esta solución se transfiere a un reactor Par de alta presión, bajo flujo de argón, usando una aguja de acero inoxidable de punta doble de calibre 12. La temperatura del reactor se reduce a -10ºC. Se agregan óxido de etileno (50 ml) recién destilado (destilado sobre n-butil-litio) y glicidol (Aldrich Chemical Co), usando un capilar de acero inoxidable. La solución se agita a 50ºC durante aproximadamente 24 horas. Se deja bajar la temperatura del reactor a la temperatura del baño de agua, y se vierte el contenido del reactor en un vaso de precipitado de vidrio, que contiene HCl (5 ml de una solución acuosa al 35%). Se forma una solución de ligero color amarillo con la precipitación de la sal (KCl). La solución se filtra y el filtrado precipita en 2-propanol frío que contiene 20% de hexanos, dando el producto deseado como precipitado de color amarillo claro, que se seca al vacío durante la noche.

c) En un matraz de Erlenmeyer equipado con barra de agitación magnética, se agrega el polímero obtenido de la etapa anterior (etapa b) a 500 ml de agua destilada y desionizada, y agita a disolución, seguido de la adición de diclorometano para extraer el polímero y retirar el iniciador que no ha reaccionado y la cantidad residual de sal presente. La solución se lava dos veces con agua desionizada y, a continuación, se concentra la solución de diclorometano en un evaporador rotatorio.

El peso molecular del copolímero se determinará por cromatografía de exclusión de tamaño, usando THF como fase móvil. La detección se lleva a cabo usando un detector de dispersión de luz angular Dawn 18 (Wyatt Technology Corporation).

El contenido carboxílico del copolímero se puede determinar por titulación de ácido base, usando hidróxido sódico 0,02 N.

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Ejemplo 3 Preparación de un óxido de polietileno \alpha-carboxílico-\omega-hidroxilo-co-poliglicidol

Iniciador: ácido 4-hidroxibutírico- sal sódica/potásica

(K/NaOCO-CH2CH2CH2OK/Na)

a) La copolimerización de óxido de etileno y glicidol se lleva a cabo del modo descrito en el Ejemplo 2 anterior. Un iniciador basado en alcoholato potásico de ácido 4-hidroxibutírico sal sódica, y se agita ácido 4-hidroxibutírico (4,2 g, 0,033 mol) en tetrahidrofurano (THF) anhidro, y la solución se lleva a 40ºC. La solución se trata con 1,3 g de potasio (0,033 mol) y se somete a reflujo durante aproximadamente 12 horas. Se formará una solución heterogénea. Esta solución se transfiere a un reactor Par de alta presión, bajo caudal de argón, usando una aguja de acero inoxidable de doble punta de calibre 12. Se reduce la temperatura del reactor a -10ºC. Se agregan óxido de etileno recién destilado (80 ml, 70 g() (destilado sobre n-butil-litio), y glicidol, usando un capilar de acero inoxidable. La solución se agita a 50ºC durante aproximadamente 24 horas. Se deja bajar la temperatura del reactor a la del baño de agua y el contenido del reactor se vierte en un vaso de precipitado de vidrio que contiene HCl (5 ml de una solución acuosa al 35%). Se forma una solución de ligero color amarillo con la precipitación de la sal (KCl). Se filtra la solución y el filtrado precipita en 2-propanol frío que contiene 20% de hexanos, dando el producto deseado en forma de un precipitado de color amarillo claro, que se seca al vacío durante la noche.

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Ejemplo 4 Preparación de un óxido de polietileno \alpha-carboxílico \omega-hidroxilo-co-poliglicidol

a) La copolimerización de óxido de etileno y glicidol se lleva a cabo del modo descrito en el Ejemplo 2 anterior. El iniciador se basa en alcoholato potásico de ácido 4-hidroxibutírico sal sódica y se agita ácido 4-hidroxibutírico (4,2 g, 0,033 mol) en 400 ml de tetrahidrofurano (THF) anhidro, se mezcla con éter 18-corona 6 (8,7 g, 0,033 mol) y potasio (1,3 g, 0,033 mol), y la solución se lleva a 40ºC y se agita. Se forma un color azul-violeta oscuro, que desaparece simultáneamente. Finalmente, se formará una solución heterogénea y el metal potasio desaparecerá por completo.

b) La solución de la parte a) se transfiere a un reactor Par de alta presión bajo caudal de argón, usando una aguja de acero inoxidable de doble punta, calibre 12. Se reduce la temperatura del reactor a -10ºC. Se agrega óxido de etileno recién destilado (95 ml, 83,6 g) (destilado sobre n-butil-litio), usando un capilar de acero inoxidable. La solución se agita a 50ºC durante aproximadamente 24 horas. Se reduce la temperatura del reactor a la del baño de agua, y el contenido del reactor se vierte en un vaso de precipitado de vidrio que contiene HCl (5 ml de una solución acuosa al 35%). Con la precipitación de la sal (KCl) se forma un ligero color amarillo. La solución se filtra y el filtrado precipita en 2-propanol frío que contiene 20% de hexanos, dando el producto deseado en forma de precipitado de color amarillo claro, que se seca al vacío durante la noche.

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Ejemplo 5 Preparación de un óxido de polietileno \alpha-carboxílico \omega-hidroxilo-co-poliglicidol Formación, en primer lugar, de poliglicidol híper-ramificado y subsiguiente polimerización de óxido de etileno

a) Se prepara el iniciador del Ejemplo 2 anterior y se transfiere a un reactor Par de alta presión, bajo un caudal de argón, usando una aguja de acero inoxidable de doble punta, calibre 12. Se reduce la temperatura del reactor a -10ºC. Se agrega lentamente glicidol en THF, usando un capilar de acero inoxidable. La solución se agita a 50ºC durante aproximadamente 12 horas. A continuación, se agrega óxido de etileno recién destilado (95 ml, 83,6 g) (destilado sobre n-butil-litio), usando un capilar de acero inoxidable. La solución se agita a 50ºC durante aproximadamente 24 horas. Se deja rebajar la temperatura del reactor a la del baño de agua, y el contenido del reactor se vierte en un vaso de precipitado de vidrio que contiene HCl (5 ml de una solución acuosa al 35%). Con la precipitación de una sal (KCl) se forma una solución de ligero color amarillo. Se filtra la solución, y el filtrado precipita en 2-propanol frío que contiene 20% d hexanos, dando el producto deseado en forma de precipitado de color amarillo claro, que se seca al vacío durante la noche.

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Ejemplo 6 Preparación de un óxido de polietilenglicol \alpha-carboxílico \omega-hidroxilo-co-poliglicidol Formación de un bloque de polietilenglicol, en primer lugar, y subsiguiente polimerización de poliglicidol

a) Se prepara el iniciador del Ejemplo 2 anterior y se transfiere a un reactor Par de alta presión, bajo un caudal de argón, usando una aguja de acero inoxidable de doble punta, calibre 12. Se reduce la temperatura del reactor a -10ºC y se agrega óxido de etileno recién destilado (95 ml, 83,6 g) (destilado sobre n-butil-litio), usando un capilar de acero inoxidable. La solución se agita a 50ºC durante aproximadamente 12 horas. Se deja rebajar la temperatura del reactor a la del baño de agua, y el contenido del reactor se vierte en un vaso de precipitado de vidrio que contiene HCl (5 ml de una solución acuosa al 35%). Con la precipitación de una sal (KCl) se forma una solución de ligero color amarillo. Se filtra la solución, y el filtrado precipita en 2-propanol frío que contiene 20% d hexanos, dando el producto deseado en forma de precipitado de color amarillo claro, que se seca al vacío durante la noche.

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Ejemplo 7 Síntesis de un \alpha-hidroxi-\omega-succinimidil-PEG-co-poliglicidol

a) En un matraz de fondo redondo equipado con una barra de agitación magnética y un cronómetro de 3 vías con separación de caucho, añadido a una línea de nitrógeno y un burbujeador, se disuelve el copolímero del Ejemplo 6 (10,00 g; 0,011 mol), N,N'-diclorohexil-carbodiimida (exceso de 1,5 veces; 3,64 g; 0,0176 mol) y N-hidroxisuccinimida (1,5 veces; 2,03 g; 0,0176 mol) en 150 ml de diclorometano. El matraz se mantiene a temperatura ambiente y la solución se agita durante la noche. Precipita una solución heterogénea turbia de color blanco. Se filtra la mezcla de reacción y el filtrado se concentra bajo presión reducida, se filtra y precipita en éter dietílico frío y, por último, cristaliza la solución resultante en etanol anhidro.

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Ejemplo 8 Conjugación de un \alpha-hidroxi-\omega-succinimidil-PEG-co-poliglicidol con una proteína

Se agrega alfa-hidroxi-omega-succinimidil-PEG-co-poliglicidol sólido (obtenido del Ejemplo 7) a una solución de 2,5 mg/ml de Grob-t en solución de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS) a pH 7,0. El copolímero NHS se agrega a la solución de proteína en una relación molar de copolímero NHS a proteína de 2:1, 4:1 ó 10:1. La reacción se deja continuar a 40ºC durante aproximadamente 3 horas. Al término de la reacción, se agregan cantidades en exceso de glicina (0,5 M) para extinguir la reacción, y se ajusta el pH de la mezcla de reacción a aproximadamente pH 4,5 con HCl 3N. El compuesto/producto del título se purifica por diafiltración.

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Ejemplo 9 Conjugación de un \alpha-hidroxi-\omega-succinimidil-PEG-co-poliglicidol con un lípido

Se agrega una solución en cloroformo (10 ml) de copolímero de N-hidroxi succinimidilo (0,8 mmol) a diestearoil fosfatidil-etanolamina, DSPE (0,52 g, 0,70 mmol) que contiene trietanolamina (0,2 ml, 1,4 mmol). La mezcla se mantiene en un baño de aceite calentado a 40-45ºC durante 2 horas. Al finalizar la reacción, se aísla el compuesto/producto del título y se purifica por diafiltración.

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Ejemplo 10 Incorporación de lípidos conjugados con copolímero en liposomas

Se preparan liposomas que comprenden el conjugado copolímero-lípido del Ejemplo 9 de la forma siguiente. La composición de los materiales lipídicos se muestra en la Tabla 1 siguiente:

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TABLA 1

7

Los materiales lipídicos se pesan de manera individual y se combinan en un recipiente de tamaño adecuado. Los lípidos se disuelven por completo en disolvente orgánico tal como CHCl_{3}/MeOH 95/5 en volumen, benceno:MeOH 70/30 en volumen, o etanol. El disolvente se elimina por evaporación (o se liofiliza, en el caso de benceno:metanol) y se retiran las trazas de disolvente a alto vacío. La película lipídica se resuspende en solución tampón acuosa que contiene Hepes 20 mM, NaCl 150 mM a pH 7,4 (HBS) a 65ºC con aplicación de vórtex. La suspensión de lípidos se adapta al tamaño apropiado por extrusión a través de filtros de policarbonato con un diámetro de 2-100 nm, para formar vesículas de 100 nm de diámetro.

Se pueden preparar liposomas adicionales a partir de los componentes que se muestran en la Tabla 1, que reflejan la composición en % en moles diana y los pesos diana de cada componente utilizado.

Todas las cifras que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción, etc. que se usan en la especificación y reivindicaciones se deben entender como modificadas, en todos los casos, con el término "aproximadamente". Por lo tanto, y salvo que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la especificación y reivindicaciones adjuntas on aproximaciones que pueden variar en función de las propiedades deseadas que se pretenden obtener con la presente invención. Por último, y sin pretender limitar la aplicación de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro debe ser interpretado a la luz del número de dígitos significativos y aproximaciones por redondeo convencionales.

Todas las publicaciones, incluidas, pero no limitadas a patentes y solicitudes de patente, citadas en esta especificación han sido incorporadas a este documento como referencias, como si cada publicación individual tuviera la indicación específica e individual de ser incorporada como referencia en este documento y recogida en su totalidad.

La descripción anterior revela por completo la invención, incluidas sus realizaciones preferidas. Dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas se encuentras las modificaciones y mejoras de las realizaciones descritas específicamente en este documento. Sin una elaboración adicional, se considera que un experto en la técnica podrá, aplicando la descripción anterior, utilizar la presente invención en su grado máximo. Por lo tanto, los Ejemplos incluidos se deben interpretar como únicamente ilustrativos y, en ningún caso, como limitaciones del alcance la presente invención. Las realizaciones de la invención en las que se reivindica una propiedad o privilegio exclusivo se definen de la forma siguiente.

Claims

1. Un compuesto representado por la estructura:

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8

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en la cual

l es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

m es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

n es un número entero que tiene un valor de 1 a 100;

p es un número entero que tiene un valor de 1 a 100; y

x es un número entero que tiene un valor de 1 a 100.

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2. Un compuesto representado por la estructura:

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9

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en la cual

l es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

m es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

n es un número entero que tiene un valor de 1 a 100;

p es un número entero que tiene un valor de 1 a 100; y

x es un número entero que tiene un valor de 1 a 100.

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3. Un compuesto representado por la estructura:

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10

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en la cual

l es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

m es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

n es un número entero que tiene un valor de 1 a 100;

p es un número entero que tiene un valor de 1 a 100; y

x es un número entero que tiene un valor de 1 a 100.

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4. Un compuesto representado por la estructura:

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11

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en la cual

l es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

m es un número entero que tiene un valor de 0 a 10.000;

n es un número entero que tiene un valor de 1 a 100;

p es un número entero que tiene un valor de 1 a 100; y

x es un número entero que tiene un valor de 1 a 100.

\newpage

5. Un compuesto representado por la estructura:

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12

en la cual

X es NH_{2}, COOH, CHO; y

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6. Un compuesto representado por la estructura:

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13

en la cual

X es NH2, CHO, COOH; y

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7. Un conjugado que comprende el compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 5 ó 6, con al menos un agente seleccionado de un medicamento, una proteína, un agente de diagnóstico, un agente de obtención de imágenes, y un polipéptido.

8. Un conjugado que comprende el compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 5 ó 6, con al menos un lípido.

9. Un conjugado que comprende el compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 5 ó 6 con al menos un polímero hidrófobo, que da como resultado un copolímero anfífilo capaz de formar una micela polímera.

10. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 5 ó 6, con un polímero hidrófobo, que da como resultado un copolímero anfífilo capaz de formar una micela polímera.

11. Un vehículo de suministro que comprende al menos un conjugado según la reivindicación 8, en donde el vehículo suministra un agente activo terapéutico en un animal que lo requiere.

12. Un vehículo de suministro que comprende al menos un conjugado según la reivindicación 9, en donde el vehículo suministra un agente activo terapéutico en un animal que lo requiere.

13. Un vehículo de suministro que comprende al menos un conjugado según la reivindicación 7, en donde el vehículo suministra al menos un agente seleccionado de medicamento, proteína, agente de diagnóstico, agente de obtención de imágenes, y polipéptido a un ser humano que lo requiere.

14. Un liposoma que comprende:

(a): al menos una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 5 ó 6;

(b): al menos un lípido formador de vesículas;

c): opcionalmente, al menos un resto dianizador;

d): y, opcionalmente, al menos un agente activo terapéutico seleccionado de medicamentos, proteínas, péptidos, agentes de obtención de imágenes, agentes radiactivos, y ácidos nucleicos.

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15. Un procedimiento para fabricar un copolímero heterofuncional, derivatizado y de arquitectura aleatoria, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ajustar entre sí la relación de los monómeros glicidol y óxido de etileno; y/o ajustar el orden de adición en el que se agregan los monómeros a un medio de polimerización; y/o ajustar la velocidad de adición de los monómeros glicidol y óxido de etileno a la mezcla de polimerización, con el fin de lograr la presencia de dos grupos funcionales diferentes en los extremos terminales del copolímero híper-ramificado resultante de óxido de polietileno y poliglicidol.

16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que uno de los grupos funcionales terminales es un grupo ácido carboxílico.

17. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que uno de los grupos funcionales terminales es un grupo amino.

18. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que uno de los grupos funcionales terminales es un aldehído.

19. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que uno de los grupos funcionales terminales es un grupo hidroxilo.