CN101831065A - 一种含单一活性功能基团的多臂星型聚乙二醇及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属高分子合成化学领域，涉及一种含单一活性功能基团的多臂星型聚乙二醇(AB_n)及其制备方法。本发明首先制备含有n个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物。再用该化合物上的n个活性羟基和二苯甲基钾为共引发体系引发环氧乙烷开环聚合，然后用溴乙烷封端，得n臂星型聚乙二醇，再将连接点被保护羟基的保护基团在酸性环境中脱除，得含有一个活性羟基的n臂星型聚乙二醇，再把活性羟基和二苯甲基钾作为引发体系，第二次引发环氧乙烷聚合，得到多臂星型聚乙二醇(AB_n)。最后，将第n+1臂末端的羟基官能团进行选择性修饰，制备多种含单一活性功能基团的多臂聚乙二醇衍生物(AB_n)。

Description

一种含单一活性功能基团的多臂星型聚乙二醇及其制备方法

技术领域

本发明属高分子合成化学领域，具体涉及一种含单一活性功能基团的多臂星型聚乙二醇(AB_n)及其制备方法。

背景技术

在生物药物载体材料的研究中，由单端羟基聚乙二醇(mPEO)或双端羟基聚乙二醇端基进行修饰转化成高反应活性的官能团，如琥珀酰亚胺琥珀酸酯、醛基、酰肼等是目前研究较多的材料。文献报道(Biomaterials，2001，22，405-417)，在和蛋白药物如干扰素α-2A偶合的过程中，两臂PEO会比线型的PEO即单臂PEO有更好的效果，而这类PEO往往都是用偶合的方法制备的。

1995年，Monfardini等将mPEO偶合到赖氨酸的两个氨基上得到树枝型聚乙二醇，然后将聚乙二醇连接处赖氨酸的羧基活化成琥珀酰亚胺活性酯，并用于蛋白质修饰研究(Bioconjugate Chemistry，1995，6，62-69.)。1996年，Veronese等人报道了天冬酰胺酶与线形mPEO(5000)或树枝型聚乙二醇((mPEO)₂)结合后的比较研究。数据结果表明，在肿瘤患者的治疗中，若对天冬酰胺酶有反应特别是患者不能忍受天然天冬酰胺酶时，使用(mPEO)₂修饰的天冬酰胺酶将十分有利(Journal of Controlled Release，1996，40，199-209.)。可以看出，支链PEO修饰药物比线形mPEO更具有优越性，这可能是由于支链PEO会减慢被修饰蛋白质在肾小球中的滤过从而延长药效。因此，除了分叉型PEO以外，制备含单一活性功能基团的多臂PEO将是目前急需解决的问题。

Huang等通过多官能团小分子化合物和相应的偶合化学反应将一定分子量的mPEO结合在一起，即每条臂都采用偶合的方法得到只含一个活性功能基团的多臂星型聚乙二醇(2002，CN 1381512 A.)。该路线的优点是可以控制终产物中每条臂的分子量，但其缺点在于线路太长、步骤繁琐，且在偶合过程中难于分离纯化和不能保证星型聚合物结构的规整性。

另一方面，文献报道的多臂星型聚乙二醇PEO的合成往往是由多活性官能团小分子同时引发制备得到，这些聚合物的结构都具有很好的规整性，较低的分子量单分散性。例如，以丙三醇、季戊四醇等多羟基小分子都可以作为引发剂得到多臂星型PEO(Macromolecules，2000，33，5418-5426.)，Gnanou等则制备了Dendrimer结构的聚乙二醇(Polymer，2003，44，5067-5074)。然而，这些多臂PEO中每条臂的端基往往含有相同的羟基官能团，它们不能进行特异性反应。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种具有多种用途的含单一活性功能基团的多臂星型聚乙二醇(AB_n)。

本发明通过可控聚合的方法合成仅含一个活性羟基的单分散性多臂聚乙二醇，可以解决传统多臂星型聚乙二醇在药物修饰应用中的缺陷，而解决问题的关键就是设计更合理的小分子引发剂，使该引发剂引发生成多臂PEO后仍有单一活性功能基团的存在。

本发明的另一目的是提供制备上述含单一活性功能基团的多臂星型聚乙二醇(AB_n)的方法。

本发明中，一种含单一活性功能基团的多臂星型聚乙二醇(AB_n)，其特征是所述聚乙二醇(AB_n)具有式I的化学结构：

其中，聚乙二醇PEO_A和PEO_B的数均分子量在500-30,000之间；n＝2，3，4，6，8，是聚合物PEO_B的的数目，R是PEO_A的端基活性功能基团，代表下列功能基团之一：-OH，-CN，-COOH，-NH₂，-CHO，

本发明中，同时含有n个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物的特征结构如下：

其中，其中HO_P代表被保护的羟基，HO_A代表活性羟基。含有n个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物分别通过下列反应得到：

(1)同时含有两个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物的制备过程：用氢氧化钾使1-乙氧基乙基2，3-环氧丙醚的环氧基团开环得到小分子目标产物，反应温度为40℃，反应时间为24h，反应溶剂为四氢呋喃(THF)。反应过程为：

(2)同时含有三个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物的制备过程：用2，2-亚胺基双乙醇上的-NH基团使1-乙氧基乙基2，3-环氧丙醚的环氧基团开环得到小分子目标产物，反应温度为25℃，反应时间为24h，反应溶剂为甲醇。反应过程为：

(3)同时含有四个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物的制备过程：用上述(1)制备的同时含有两个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物和烯丙基溴反应，反应温度为45℃，反应时间为24h，反应溶剂为KOH的水溶液，催化剂为四丁基硫酸氢胺(TBAHS)。然后，在四氧化锇(OsO₄)、4-甲基吗啉-N-氧基(NMO)和叔丁醇的存在下使环氧基团开环得到小分子目标产物，反应温度为25℃，反应时间为24h，反应溶剂为丙酮/水(V/V＝1/1)混和溶剂。反应过程为：

(4)同时含有六个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物的制备过程：用上述(2)制备的同时含有三个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物为起始物，其它步骤同(3)。反应过程为：

(5)同时含有八个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物的制备过程：用上述(3)制备的同时含有四个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物为起始物，其它步骤同(3)。反应过程为：

本发明中，利用小分子化合物上的n个活性羟基和二苯甲基钾(DPMK)作为共引发体系引发环氧乙烷进行开环聚合(ROP)，聚合结束后，用溴乙烷将活性聚环氧乙烷链封端即得到了在连接点处含一个被保护羟基的n臂星型聚乙二醇。然后，将羟基的保护基团在酸性环境中脱除得到在连接点仅含一个活性羟基的n臂星型聚乙二醇(B_n)。利用n臂星型聚乙二醇上脱保护后的活性羟基和二苯甲基钾作为引发体系，可以第二次引发环氧乙烷聚合，得到多臂星型聚乙二醇(AB_n)。最后，将聚乙二醇第n+1臂末端的羟基功能基团进行选择性修饰，可以得到多种含单一活性功能基团的多臂星型聚乙二醇衍生物(AB_n)。其反应过程如下图所示：

本发明中，环氧乙烷进行开环聚合时，以四氢呋喃(THF)/二甲基亚砜(DMSO)(v/v＝1/1)为共溶剂，反应温度为40-60℃，反应时间为48-120h。

本发明中，由PEO_A端羟基与H₂C＝CH-CN反应制备-CN官能时，溶剂为二氧六环，氢氧化钾为催化剂，反应温度为0-5℃，反应时间为3-5h。所生成的-CN官能团还可在酸性(盐酸)环境中于室温下水解12h后，继续在碱性(氢氧化钾)环境中于室温下水解24h水解可以制得-COOH。

本发明中，由PEO_A端羟基与反应制备-CHO官能团时，以四氢呋喃或甲苯为溶剂，二苯甲基钾(DPMK)为质子化试剂，反应温度为0-5℃，反应时间为12-24h；反应产物最后在酸性(盐酸)环境中水解脱除保护基团得到-CHO。

本发明中，由PEO_A端羟制备-NH₂时，首先使羟基与

反应制备

溶剂为二氯甲烷-三乙胺体系或吡啶，反应温度为0-5℃，反应时间为12-24h。所生成的

与叠氮化钠(NaN₃)在25-45℃下反应24-48h生成-N₃基团；最后，-N₃基团在室温下于四氢呋喃溶剂中被LiAlH₄还原为-NH₂。

本发明中，由PEO_A端羟基与

反应制备

时，溶剂为乙腈，三乙胺为催化剂，反应温度为0-10℃，反应时间为12-24h。

也可以由PEO端羧基与

反应制备，溶剂为二氯甲烷，N，N-二环己基羰化二亚胺(DCC)为催化剂，反应温度为0-10℃，反应时间为12-24h。

本发明中，由PEO端氨基与

反应制备

时，第一步：以二氯甲烷为溶剂，反应温度为70-90℃，反应时间为30-60min；第二步：以醋酸酐为溶剂，乙酸钠为催化剂，反应温度为95-105℃，反应时间为1h。

本发明中，所制备的多臂星型聚乙二醇(AB_n)及中间产物可以通过溶解沉淀的方法进行多次纯化，具有很高的收率。

本发明中，所制备的多臂星型聚乙二醇(AB_n)具有较窄的分子量分布，且结构明确，可以通过MALDI-TOF MS、SEC和¹H NMR手段进行详细表征。

本发明制备方法简便、通用，具有良好的应用价值和产业前景。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

具体实施方式

实施例1

制备同时含有三个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物

在氮气环境下，向250ml干燥洁净的圆底烧瓶中依次加入20g 2，2-亚胺基双乙醇和150ml THF，在室温下通过滴液漏斗缓慢地将28g 1-乙氧基乙基2，3-环氧丙醚加入，约在2.0h内滴加完毕。然后继续搅拌反应24后，在45℃下旋蒸除去THF溶剂。用乙醚和水萃取分离，并用薄层层析检测产物的纯度，最后得到粘稠状无色透明液体，密封保存备用。

¹H NMR(CD₃OD)d(ppm)：1.2(m，CH₃CH₂O-)，1.3(m，CH₃-CH-)，2.5-2.8(m，6H(-CH₂)₂-N-CH₂-)，3.5-3.65(m-CH₂-)，3.8(m(-CH₂)₂CH-OH)，4.7(m，-OCH(CH₃)O-).

实施例2连接处含一个活性羟基的三臂星型聚乙二醇的制备(B₃)

将0.50g上述小分子化合物、30ml DMSO和30ml THF、2.8mlDPMK、10ml环氧乙烷依次加入一带搅拌磁子的干燥洁净的300ml安瓿瓶中，在40℃下反应48h。然后，继续加入过量的DPMK，充分搅拌之后再加入2倍于DPMK摩尔量的溴乙烷，并继续在40℃反应24h。反应结束后将聚合物浓缩，在加入100ml甲醇溶剂溶解之后再加9ml浓盐酸进行水解反应；室温下反应3.0h后旋转蒸出溶剂并用大量的二氯甲烷进行萃取，有机层除水之后进行浓缩，最后用大量的无水乙醚沉淀、过滤，真空干燥即得连接处含一个活性羟基的三臂星型聚乙二醇。

¹H NMR(CD₃OD)d(ppm)：1.13(m，CH₃CH₂O-)，2.5-2.8(m，(-CH₂)₂-N-CH₂-)，3.51-3.77(m，-CH₂CH₂O-of PEO).

实施例3第四臂端基为羟基的多臂星型聚乙二醇的制备(AB₃)

将7.0g上述连接处含一个活性羟基的三臂星型聚乙二醇溶于60mlDMSO和60mlTHF混和溶剂体系中，并转入带有搅拌子的干燥洁净的500ml安瓿瓶，然后在搅拌下慢慢加入3.5mlDPMK。最后加入10ml环氧乙烷，升温至50℃反应48h。反应结束后用甲醇终止反应，粗产物用无水乙醚沉淀、过滤，真空干燥即得第四臂端基为羟基的多臂星型聚乙二醇(AB₃)。

¹H NMR(CD₃OD)d(ppm)：1.13(m，CH₃CH₂O-)，2.5-2.8(m，(-CH₂)₂-N-CH₂-)，3.51-3.77(m，-CH₂CH₂O-of PEO).

实施例4第四臂端基为氰基的多臂星型聚乙二醇的制备(AB3)

将4.0g实施例一中的第四臂端基为羟基的多臂星型聚乙二醇(AB₃)加入150ml圆底烧瓶中，甲苯共沸除水，加入约60ml二氧六环，搅拌使PEO溶解。加入研成粉末的KOH 2.0g，冰水浴至0℃，0.5h内缓慢滴加4ml丙烯腈，撤掉冰水浴，室温反应3h，加盐酸溶液调至中性，旋去二氧六环和水，加入二氯甲烷溶解产物，用去离子水洗涤3次，二氯甲烷层浓缩之后用乙醚沉淀出，得黄色粉末，真空烘箱干燥既得第四臂端基为氰基的多臂星型聚乙二醇的制备(AB₃)。

¹H NMR(CD₃OD)d(ppm)：1.13(m，CH₃CH₂O-)，2.40(CNCH₂-)，2.5-2.8(m，(-CH₂)₂-N-CH₂-)，3.51-3.77(m，-CH₂CH₂O-of PEO).

实施例5第多臂端基为羧基的多臂星型聚乙二醇的制备(AB3)

将3.0g实施例二中的第四臂端基为氰基的多臂星型聚乙二醇(AB3)加入150ml圆底烧瓶中，加入20ml浓HCl溶解后，室温下搅拌48h；然后加入20ml去离子水稀释，并用120ml二氯甲烷萃取两次。油相浓缩之后，用50ml去离子水溶解后，再加入5.0g KOH，室温下搅拌24h后溶液用盐酸调至中性，并用100ml二氯甲烷萃取两次，油相浓缩之后用乙醚沉淀出，真空烘箱干燥既得第四臂端基为羧基的多臂星型聚乙二醇的制备(AB₃)。

¹H NMR(CD₃OD)d(ppm)：1.13(m，CH₃CH₂O-)，2.60(-CH₂COOH)，2.5-2.8(m，(-CH₂)₂-N-CH₂-)，3.51-3.77(m，-CH₂CH₂O-of PEO).

实施例6第多臂端基为醛基的多臂星型聚乙二醇的制备(AB3)

将3.0g实施例一中的第四臂端基为羟基的多臂星型聚乙二醇(AB3)加入一干燥洁净的150ml圆底烧瓶中，再加入80干燥的四氢呋喃；待PEO溶解之后，加入6.0ml二苯甲基钾溶液，40℃下反应1h后，将体系用冰水浴冷却，并在1h内缓慢地加入2.0ml溴乙醛缩二乙二醇，体系反应过夜，浓缩蒸除四氢呋喃后再用50ml去离子水溶解后，再加入6ml浓盐酸室温下搅拌12h。待反应结束之后，将体系直接用二氯甲烷萃取两次，油相浓缩之后用乙醚沉淀出，真空烘箱干燥既得第四臂端基为醛基的多臂星型聚乙二醇的制备(AB₃)。

¹H NMR(CD₃OD)d(ppm)：1.13(m，CH₃CH₂O-)，2.5-2.8(m，(-CH₂)₂-N-CH₂-)，3.51-3.77(m，-CH₂CH₂O-of PEO)，4.60(-CH₂CHO).

实施例7

制备第四臂端基为琥珀酰亚胺碳酸酯基基的多臂星型聚乙二醇(AB3)

将3.0g实施例一中的第四臂端基为羟基的多臂星型聚乙二醇的制备(AB₃)加入一干燥洁净的150ml圆底烧瓶中，再加入40ml干燥的乙腈，待PEO溶解之后，再加入8ml三乙胺和1.6g N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯。体系于室温下反应24h后，浓缩蒸除溶剂后用二氯甲烷萃取两次，油相浓缩之后用乙醚沉淀出，真空烘箱干燥即得第四臂端基为琥珀酰亚胺碳酸酯基团的多臂星型聚乙二醇的制备(AB₃)。

¹H NMR(CD₃OD)d(ppm)：1.13(m，CH₃CH₂O-)，2.4(-CH₂COO-)，2.5-2.8(m，(-CH₂)₂-N-CH₂-，-C(O)CH₂CH₂C(O)-)，3.51-3.77(m，-CH₂CH₂O-of PEO).

Claims (8)

1.一种含单一活性功能基团的多臂星型聚乙二醇(AB_n)，其特征是所述的多臂星型聚乙二醇(AB_n)具有式I的化学结构：

其中，聚乙二醇PEO_A和PEO_B的数均分子量在500-30,000之间；

n＝2，3，4，6，8，是聚合物PEO_B的的数目；

R是PEO_A的端基活性功能基团，代表下列功能基团之一：

-OH，-CN，-COOH，-NH₂，-CHO，

2.权利要求1的含单一活性功能基团的多臂星型聚乙二醇(AB_n)的制备方法，其特征在于，首先用同时含有n个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物上的n个活性羟基和二苯甲基钾(DPMK)作为共引发体系，引发环氧乙烷开环聚合，聚合结束后用溴乙烷将活性聚环氧乙烷链封端，得到在连接点处含一个被保护羟基的n臂星型聚乙二醇；将羟基的保护基团在酸性环境中脱除后得到在连接点含一个活性羟基的n臂星型聚乙二醇(B_n)；再用该活性羟基和DPMK作为引发体系，第二次引发环氧乙烷ROP聚合，得到第n+1臂端基为羟基的多臂星型聚乙二醇(AB_n)；最后，将聚乙二醇第n+1臂末端的羟基功能基团进行选择性修饰制备得到多种含单一活性功能基团的多臂星型聚乙二醇衍生物(AB_n)。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述的同时含有n个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物的特征结构：

其中HO_P代表被保护的羟基，HO_A代表活性羟基；

通过下述步骤制备：在四氢呋喃溶剂中，用氢氧化钾或2，2-亚胺基双乙醇使1-乙氧基乙基2，3-环氧丙醚开环，得到同时含有二或三个活性羟基和一个被保护羟基的小分子化合物，其特征化学结构为：

用所制备的小分子化合物上的活性羟基和烯丙基溴反应，在四氧化锇的存在下使一个双键转化为两个活性羟基进而得到含四个或六个活性羟基的小分子化合物，其特征化学结构为：

对含四个活性羟基的小分子化合物进行第二次循环修饰得到含八个活性羟基的小分子化合物，其特征化学结构为：

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述环氧乙烷开环聚合时，以四氢呋喃/二甲基亚砜v/v＝1/1为共溶剂，反应温度为40-60℃，反应时间为48-120h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征为，所述的连接点处含一个被保护羟基的n臂星型聚乙二醇的制备过程为：用权利要求3所述小分子化合物上的三个活性羟基和DPMK作为共引发体引发环氧乙烷ROP聚合，聚合结束后聚合物上的活性羟基引发点用溴乙烷封端。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征为，所述的连接点处含一个活性羟基的n臂星型聚乙二醇(B_n)的制备过程为：将权利要求5所述连接点处含一个被保护羟基的n臂星型聚乙二醇在含盐酸的甲醇溶液中进行保护基团的脱除反应。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征为，所述的第多臂端基为羟基的多臂星型聚乙二醇(AB_n)的制备过程为：用权利要求6所述连接点处含一个活性羟基的n臂星型聚乙二醇(B_n)上的活性羟基和DPMK作为共引发体引发环氧乙烷ROP聚合，并用甲醇终止聚合反应。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，通过下列途径对权利要求7所述多臂星型聚乙二醇(AB_n)的第多臂聚乙二醇端基羟基功能基团进行选择性的修饰：

(1)PEO_A端-CN官能团由羟基与H₂C＝CH-CN反应制得，所生成的-CN官能团依次在酸性环境和碱性环境中水解制得-COOH；

(2)PEO_A端-CHO官能团由羟基与

反应，后在酸性环境中脱除保护基团得到-CHO；

(3)PEO_A端-NH₂官能团由羟基与

反应制备，然后在叠氮化钠的存在下将所生成的

转化为-N₃基团，最后将-N₃基团用LiAlH₄还原为-NH₂；

(4)PEO_A端

由羟基与

反应制备，或由羧基与

反应制备；

(5)PEO_A端

由氨基与

反应制备。