CN102367291A - 含单官能团的多级支化聚乙二醇及其合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了含单功能基团的多级支化聚乙二醇及其合成方法，其分子量为2,000～1,000,000，并具有以下的结构通式：
其中，R为OH或OCH2CH2CN或OCH2CH2CH2NH2或Br或N3或OCH2CHO或OCH2CH2COOH或OCH2CH2CONH2或OCH2CH＝CH2或OCH2C≡CH或 
X为甲基或乙基，z为X基团的数目，n1、n2、n3......分别为1、2、3......级分枝链的聚合度且为10～500的整数，其中分枝级数不小于2且各级分枝上的分枝链数量不小于2。该含单官能团的多级支化聚乙二醇的单功能基团设置在端点，可以简单并精确地调节确切支化结构和分子量，并节约支化聚乙二醇的合成时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种支化聚乙二醇及其制备方法，具体是指含单官能团的多级支化聚乙二醇及其合成方法。
背景技术
目前，在生物药物载体的研究中，研究最多的是对线性单羟基聚乙二醇的羟基进行修饰转化成高反应活性的官能团，如活性酯，醛基，氨基等。相比较于相同分子量的线性聚乙二醇，含单官能团的支化(双臂及多臂)聚乙二醇具有更大的分子体积，因而更有利于对小分子药物的修饰与改性。同时，由于特殊的分子形态，这种支化聚乙二醇可以在药物的表层形成一层伞形的保护层，增大了药物分子周围的空间位阻，比之线性聚乙二醇更有效的阻止了体内其它大分子物质对药物的进攻，进而减少了药物在生物体内失活或被酶水解的程度。
最早的含单官能团的支化聚乙二醇是在1988年由Yamsuki等制得。他们首先将线性甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯与正亮氨酸偶合，然后将产物的羧酸端基活化后再分别与赖氨酸的α及ε位的胺基反应，制备了带有羧酸基团的双臂聚乙二醇。但该产物由于在骨架结构上存在着酯键，容易发生水解，在作为修饰剂使用时会降低聚乙二醇化的效率(Agric.Biol.Chem.，1988，52，2185-2196)。
1990年Wada等以线性甲氧基聚乙二醇取代三氯代三嗪的两个氯原子制备了双臂聚乙二醇，并利用第三个氯原子为反应官能团对蛋白质进行了改性。但由于三氯代三嗪的潜在毒性，未能得到广泛应用(Ann.N.Y.Acad.Sci.，1990，613，95-108)。
1995年Monfardini连接将2根线性甲氧基聚乙二醇接到到赖氨酸的两个氨基上得到带两臂的分叉型聚乙二醇，然后将赖氨酸的羧基活化成琥珀酰亚胺活化酯，并用于蛋白质修饰研究(Bioconjugate Chemistry，1995，6，62-69)，此方法是目前推广最普遍的制备含单官能团的支化聚乙二醇及其药物衍生物的方法，并已经在三种商业化的药物中得到运用。其中，两个是蛋白质，分别为α-interferon(α-干扰素)和anti-TNF-receptor(TNF受体-抗体)；另外一个为核酸适体，anti-VEGF(血管内皮生长因子抗体)。但该方法也有以下三种主要的缺点：
1.合成周期长，因为该方法是通过两步偶合的方法将线性聚乙二醇接入到赖氨酸的两个氨基上，因此，其通常要花费大量时间在线性聚合物和支化聚合物的分离上，并且往往产率低，所得产品也为这两者的混合物；
2.由于同α位的氨基偶合的线性聚乙二醇生成的是不稳定的氨基甲酸酯键，在碱性条件下容易水解断裂，从而影响试剂的使用(Bioorg.Med.Chem.，2004，12，5031-5037)；
3.该支化聚乙二醇的活性基团位于该聚合物的中点，由于位阻效应在同药物分子偶合时，效率极低，通常需要过量5～50倍的支化聚乙二醇才能使反应充分。
此外，由于各种蛋白质之间的结构差异性，因而，为了使得蛋白质受到聚乙二醇更充分的保护，需要精细设计不同支化度、分子量的聚乙二醇来更好地将蛋白质药物保护起来。而目前上述最经典的制备支化聚乙二醇的偶合反应难以满足这种精细合成的要求。
发明内容
本发明提供了含单官能团的多级支化聚乙二醇，用以解决现有技术中存在的上述问题，该含单官能团的多级支化聚乙二醇的单功能基团设置在端点，可以简单并精确地调节确切支化结构和分子量，并节约支化聚乙二醇的合成时间。
本发明提供的技术方案如下：
含单功能基团的多级支化聚乙二醇，其分子量为2,000～1,000,000，并具有以下的结构通式：
......
其中，R为OH或OCH2CH2CN或OCH2CH2CH2NH2或Br或N3或OCH2CHO或OCH2CH2COOH或OCH2CH2CONH2或OCH2CH＝CH2或OCH2C≡CH或
R’为任意合适的基团，X为甲基或乙基，z为X基团的数目，n1、n2、n3......分别为1、2、3......级分枝链的聚合度且为10～500的整数，其中分枝级数不小于2且各级分枝上的分枝链数量不小于2。上述结构的含单官能团的多级支化聚乙二醇可作为缓释制剂的载体广泛运用于生物医学制药领域中，具有非常优异的产业化前景。由于不同的蛋白质药物的结构差异大，而目前通常使用的聚乙二醇载体结构单一的，修饰点位于中点的两臂聚乙二醇。对于结构不同的蛋白质药物，不能将其充分有效的保护。而上述含单官能团的支化聚乙二醇的出现，由于其灵活可控的分子量和支化度，大大提高了对于蛋白质药物的选择性和契合度，更有效的保护了蛋白质药物，从而降低制作药物的成本，并延长了蛋白质药物在体内的半衰期，增强对蛋白水解的保护。
本发明的另一目的是提供一种上述含单功能基团的支化聚乙二醇的合成方法。
本发明中，在催化剂的存在下，用乙烯基乙醚对二醇一端的活性羟基进行保护，制备得到两端分别为保护羟基和活性羟基的引发剂(initiator)，其制备过程如下：
向干燥洁净的容器中依次加入摩尔比为1∶1的二醇和乙烯基乙醚，以及作为反应溶剂的四氢呋喃，随后加入对甲苯磺酸作为催化剂，在0℃反应3～5小时，搅拌过夜后，滴加饱和碳酸钠水溶液至pH＝7，然后用无水硫酸镁干燥，过滤，在75℃下旋蒸除去未反应的乙烯基乙醚以及四氢呋喃，以乙醚为洗脱剂，通过柱层析提纯产物，旋蒸去乙醚后，即得到两端分别为保护羟基和未保护羟基的二醇衍生物。
其中，R’为任意合适的基团。
引发剂和环氧乙烷的聚合步骤如下：
将引发剂和二苯甲基钾的二甲基亚砜溶液加入至无水无氧的密闭反应釜中，并将反应釜置于0℃冰水浴中，引发剂和二苯甲基钾的摩尔比为1∶1；
加入计算量的环氧乙烷，升高温度至0～50℃，反应24～48小时；
(1)随后在不改变反应釜密闭性的前提下，用蠕动泵缓慢滴加入缩水甘油的二甲基亚砜溶液，同时将反应温度提高至100～120℃，反应时间为4～12小时；
(2)加入计算量的环氧乙烷，升高温度至0～50℃，反应24～48小时；
按照需要，重复步骤(1)和(2)多次；
最后加入过量的二苯甲基钾溶液，然后加入过量的溴乙烷或者碘甲烷，反应温度在0～50℃，反应时间为12～48小时；将反应釜打开，溶剂浓缩后，在0℃无水乙醚中沉淀，过滤，干燥，即得端部为保护基的多级支化聚乙二醇；
......
e、在干燥洁净的容器中加入步骤d中制得的多级支化聚乙二醇、作为反应溶剂的四氢呋喃和作为酸解剂的浓盐酸，反应15分钟后旋干四氢呋喃和浓盐酸，即得到R为OH的多级支化聚乙二醇。
......
本发明中，在使用R为OH、X为甲基或乙基的支化聚乙二醇与CH2＝CH-CN反应制备OCH2CH2CN官能团时，所使用的溶剂为二氧六环，氢氧化钾为催化剂，其所生成的R为OCH2CH2CN、X为甲基或乙基的支化聚乙二醇则可以在无机酸性条件下如盐酸中于室温水解24小时制得R为OCH2CH2CONH2、X为甲基或乙基的支化聚乙二醇，R为OCH2CH2CONH2、X为甲基或乙基的支化聚乙二醇继续在无机碱性条件下如氢氧化钾中于室温水解24小时可以制得R为OCH2CH2COOH、X为甲基或乙基的支化聚乙二醇；另外，R为OCH2CH2CN、X为甲基或乙基的支化聚乙二醇还可以在室温下避光由氢化锂铝还原得到R为OCH2CH2CH2NH2、X为甲基或乙基的支化聚乙二醇。
本发明中，R为羟基、X为甲基或乙基的支化聚乙二醇与Br-CH2-CH＝CH2、Br-CH2-C≡CH、
Br2或
(n＝1～5)
反应制备获得R为OCH2CH＝CH2、OCH2C≡CH、
Br或OCH2CHO的支化聚乙二醇时，溶剂为四氢呋喃或甲苯，二苯甲基钾为质子试剂。其中R为Br的支化聚乙二醇可以和叠氮化钠在二甲基甲酰胺中在室温和避光下继续反应制得R为N3。本发明中，R为羟基、X为甲基或乙基的支化聚乙二醇与
反应制备
官能团时，所使用的溶剂为乙腈，三乙胺为催化剂。
本发明中，R为NH2、X为甲基或乙基的支化聚乙二醇与
反应制备官能团时分两步进行：第一步：R为OCH2CH2CH2NH2的支化聚乙二醇使
开环生成酰胺键和一个羧酸基团，该步骤以二氯甲烷为溶剂，反应温度在70～85℃，反应时间为0.5～2小时；第二步：酰胺键和羧酸闭环生产
官能团，该步以乙酸酐为溶剂，乙酸钠为催化剂，反应温度在90～110℃，反应时间为0.5～2小时。
本发明中，该含单官能团的支化聚乙二醇的单功能基团设置在端点，可以简单并精确地调节确切支化结构和分子量，并节约支化聚乙二醇的合成时间。
本发明中制备的含单官能团的支化聚乙二醇可以通过正沉淀，反沉淀，萃取等方法进行多次纯化，且都具有很高的收率。
本发明中制备的含单官能团的支化聚乙二醇都具有较窄的分子量分布，且结构明确，都可以通过MALDI-TOF MS，SEC或1H NMR手段进行详细表征。
本发明的制备方法制备时间周期短，并且链长和链数都可以通过调节环氧乙烷和缩水甘油的投料量进行精确控制，同普通制备支化型的聚乙二醇方法相比极为简便和通用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
1.1引发剂的制备
在0℃，500mL的干燥洁净的圆底烧瓶中依次加入82.3g乙二醇，100.4g乙烯基乙醚和作为反应溶剂的85mL四氢呋喃，随后分批加入2.43g对甲苯磺酸作为催化剂，在0℃反应3～5小时，搅拌过夜后，滴加饱和碳酸钠水溶液至pH＝7。然后用无水硫酸镁干燥，过滤，在75℃下旋蒸除去未反应的乙烯基乙醚以及四氢呋喃。以乙醚为洗脱剂，通过柱层析提纯产物。旋蒸去乙醚后，即得到两端分别为保护羟基和未保护羟基的二醇衍生物(引发剂)。
引发剂的氢谱数据如下：
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：1.20(CH3CH2-)，1.35(-OCH(CH3)O-)，3.70(CH3CH2-)，3.85(HOCH2CH2O-)，4.00(HOCH2CH2O-)，4.75(-OCH(CH3)O-)。
1.2环氧乙烷和缩水甘油的连续聚合
将引发剂和二苯甲基钾(DPMK)的二甲基亚砜(DMSO)溶液加入至无水无氧的密闭反应釜中，并将反应釜置于0℃冰水浴中，引发剂和二苯甲基钾的摩尔比为1∶1。
加入计算量的环氧乙烷(EO)，升高温度至0～50℃，反应24～48小时。
(1)随后在不改变反应釜密闭性的前提下，用蠕动泵缓慢滴加入缩水甘油(glycidol)的二甲基亚砜(DMSO)溶液，同时将反应温度提高至100～120℃，反应时间为4～12小时。
(2)加入计算量的环氧乙烷(EO)，升高温度至0～50℃，反应24～48小时。
按照需要，重复步骤(1)和(2)1次。
最后加入过量的二苯甲基钾(DPMK)溶液，然后加入过量的溴乙烷(Et-Br)或者碘甲烷(Me-I)，反应温度在0～50℃，反应时间为12～48小时。将反应釜打开，溶剂浓缩后，在大量0℃无水乙醚中沉淀，过滤，干燥，即得到端基为保护羟基的精确三级支化结构聚乙二醇。
其中，n1、n2和n3均为50，并选用碘甲烷封端的支化聚乙二醇(X为甲基)的氢谱如下：
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：1.20(CH3CH2-)，1.35(-OCH(CH3)O-)，3.35(CH3O-)，3.40-3.80(-CH2CH2O-，CH3CH2-，glycidol)，4.75(-OCH(CH3)O-)。
n1、n2、和n3均为50，并选用溴乙烷封端的支化聚乙二醇(X为乙基)的氢谱如下：
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：1.20(CH3CH2-)，1.35(-OCH(CH3)O-)，3.40-3.80(-CH2CH2O-，CH3CH2-，glycidol)，4.75(-OCH(CH3)O-)。
实施例2
R为OH、X为CH3的三级支化聚乙二醇的制备：
在干燥洁净的50mL圆底烧瓶中加入1g实施例1中制得的碘甲烷封端的聚合物、20mL四氢呋喃和0.5mL浓盐酸，反应15分钟后旋干四氢呋喃和浓盐酸，即得到R为OH、X为CH3的支化聚乙二醇。R为OH、X为CH3的支化聚乙二醇的氢谱数据如下：
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：3.35(CH3O-)，3.40-3.80(-CH2CH2O-，glycidol)。
实施例3
R为OCH2CH2CN、X为CH3的三级支化聚乙二醇的制备：
在干燥洁净的50mL圆底烧瓶中加入1g实施例2中制得的R为OH、X为CH3的支化聚乙二醇、20mL二氧六环和0.2g氢氧化钾，在0℃时缓慢滴加1mL丙烯腈。在室温下继续反应8小时后，旋蒸除去二氧六环，将产物溶解在氯仿中用水洗涤三次后，将氯仿相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，沉淀，得到R为OCH2CH2CN、X为CH3的支化聚乙二醇。R为OCH2CH2CN、X为CH3的支化聚乙二醇的氢谱数据如下：
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：2.40(-CH2CN)，3.35(CH3O-)，3.40-3.80(-CH2CH2O-，glycidol)。
实施例4
R为OCH2CH2CONH2、X为CH3的三级支化聚乙二醇的制备：
在干燥洁净的50mL圆底烧瓶中加入1g实施例3中制得的R为OCH2CH2CN、X为CH3的支化聚乙二醇和15mL浓盐酸，在室温下反应48小时后，加入水稀释，并用氯仿萃取两次。将氯仿相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，沉淀，得到R为OCH2CH2CONH2、X为CH3的支化聚乙二醇。R为OCH2CH2CONH2、X为CH3的支化聚乙二醇的氢谱数据如下：
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：2.55(-CH2CONH2)，3.35(CH3O-)，3.40-3.80(-CH2CH2O-，glycidol)。
实施例5
R为OCH2CH2COOH、X为CH3的三级支化聚乙二醇的制备：
在干燥洁净的50mL圆底烧瓶中加入1g实施例4中制得的R为OCH2CH2CONH2、X为CH3的支化聚乙二醇、30mL水和2g氢氧化钾。在室温下反应24小时后，并用氯仿萃取两次。将氯仿相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，沉淀，得到R为OCH2CH2COOH、X为CH3的支化聚乙二醇。R为OCH2CH2COOH、X为CH3的支化聚乙二醇的氢谱数据如下：
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：2.60(-CH2COOH)，3.35(CH3O-)，3.40-3.80(-CH2CH2O-，glycidol)。
实施例6
R为OCH2C≡CH、X为CH3的三级支化聚乙二醇的制备：
在干燥洁净的50mL圆底烧瓶中加入1g实施例2中制得的R为OH、X为CH3的支化聚乙二醇、20mL四氢呋喃和2mL二苯甲基钾(DPMK)的二甲亚砜(DMSO)溶液，在室温下反应2小时后，缓慢加入2.0mL溴丙炔并继续反应12小时。之后浓缩，沉淀，得到R为OCH2C≡CH、X为CH3的支化聚乙二醇。R为OCH2C≡CH、X为CH3的支化聚乙二醇的氢谱数据如下：
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：3.35(CH3O-)，3.40-3.80(-CH2CH2O-，glycidol)，4.05(-OCH2CΞCH)。
实施例7
R为OCH2CHO、X为CH3的三级支化聚乙二醇的制备：
在干燥洁净的50mL圆底烧瓶中加入1g实施例2中制得的R为OH、X为CH3的支化聚乙二醇、20mL四氢呋喃和2mL二苯甲基钾(DPMK)的二甲亚砜(DMSO)溶液，在室温下反应2小时后，缓慢加入2.0mL溴乙醛缩二乙二醇并继续反应12小时。之后浓缩，沉淀，并将沉淀产物重新溶解于30mL 10％的盐酸溶液中反应12小时，之后用氯仿萃取两次。将氯仿相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，沉淀，得到R为OCH2CHO、X为CH3的支化聚乙二醇。R为OCH2CHO、X为CH3的支化聚乙二醇的氢谱数据如下：
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：3.35(CH3O-)，3.40-3.80(-CH2CH2O-，glycidol)，4.65(-OCH2CHO)。
实施例8
R为
X为CH3的三级支化聚乙二醇的制备：
在干燥洁净的50mL圆底烧瓶中加入1g实施例2中制得的R为OH、X为CH3的支化聚乙二醇、20mL乙腈、4mL三乙胺和1.0g N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，在室温下反应24小时后，浓缩，沉淀，得到R为
X为CH3的支化聚乙二醇。R为
X为CH3的支化聚乙二醇的氢谱数据如下：
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：2.80(-(O＝)CCH2CH2C(＝O)-)，3.35(CH3O-)，3.40-3.80(-CH2CH2O-，glycidol)，4.15(-CH2OCO-)。
实施例9
R为
X为CH3的三级支化聚乙二醇的制备：
在干燥洁净的50mL圆底烧瓶中加入1g实施例2中制得的R为OH、X为CH3的支化聚乙二醇、20mL吡啶和0.5g对甲苯磺酰氯，在室温下反应24小时后，浓缩，沉淀，得到R为
X为CH3的支化聚乙二醇。R为
X为CH3的支化聚乙二醇的氢谱数据如下：
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：2.42(CH3C6H4SO2-)，3.35(CH3O-)，3.40-3.80(-CH2CH2O-，glycidol)，7.50-7.90(CH3C6H4SO2-)。
实施例10
R为
X为CH3的三级支化聚乙二醇的制备：
在干燥洁净的50mL圆底烧瓶中加入1g实施例2中制得的R为OH、X为CH3的支化聚乙二醇、20mL四氢呋喃和2mL二苯甲基钾的二甲亚砜溶液，在室温下反应2小时后，缓慢加入2.0mL环氧氯丙烷并继续反应12小时。之后浓缩，沉淀即得到R为
X为CH3的支化聚乙二醇。R为
X为CH3的支化聚乙二醇的氢谱数据如下：
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：2.50-2.90(-CH2OCH-)，3.35(CH3O-)，3.40-3.80(-CH2CH2O-，glycidol，-OCH2CH＜)。
本发明还包括制备这种单功能基团的支化聚乙二醇和抗肿瘤药物顺铂的结合物的方法，该方法包括，使用上述带各种可与顺铂上两个氨基反应的活性基团的单功能基团的支化聚乙二醇与顺铂反应。
为了得到单功能基团的支化聚乙二醇-顺铂结合物，我们采用了官能团为R为OCH2CH2COOH、X为CH3的支化聚乙二醇为原料，进一步和氨基丙酸二乙酯(DEAM)反应，经过水解得到可以和顺铂反应的支化聚乙二醇；最后同顺铂反应得到支化聚乙二醇化的抗肿瘤顺铂药物。
关于线性聚乙二醇连接顺铂的方法在本领域中已有描述，例如Yuichi等，Macromol.Biosci.2001，1，No.8，355-363。
试验例
支化聚乙二醇-顺铂的制备
称取0.7g氨基丙酸二乙酯(DEAM)(3.3mmol)，溶于60mL无水二氯甲烷中，加入三乙胺1.2mL，冰水浴下搅拌3小时。将10.0g实施例5中制得的羧基支化聚乙二醇(分子量20,000，支化度10和分子量40,000，支化度20)溶于70mL无水二氯甲烷中，滴加三乙胺调节pH至8～9(将溶液滴加至湿润的精密pH试纸测得)。冰水浴下将DEAM的溶液缓慢滴加到PEG的溶液中。保持在冰水浴下反应12小时后，过滤、浓缩，并在无水乙醚中沉淀。得到的产物溶解于氢氧化钠的甲醇溶液中(甲醇90mL，1mol/L氢氧化钠水溶液13mL)，搅拌2小时。用1mol/L的盐酸调节pH至6，将溶剂旋干，加入二氯甲烷重新溶解，加入无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，在无水乙醚中沉淀。再用二氯甲烷和无水乙醚溶解沉淀两次，真空干燥，得到产物9.2g，产率92％。其氢谱数据如下：
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：3.35(CH3O-)，3.40-3.80(-CH2CH2O-，glycidol)，5.10(-NH-CH(COOH))。
将顺铂1.0g(3.3mmol)溶于200mL去离子水，加热至60℃使之完全溶解。再加入硝酸银1.5g(9mmol)，于60℃避光搅拌反应6小时后滤掉生成的氯化银沉淀。向滤液中加入9.0g支化聚乙二醇丙二酸，继续60℃避光反应24小时，用二氯甲烷萃取产物三次，合并浓缩，于无水乙醚中沉淀。再用二氯甲烷/无水乙醚溶解沉淀两次，真空干燥，得到产物支化聚乙二醇-顺铂。产率86％。经原子吸收光谱法测定，产物中顺铂的摩尔含量分别为89.1％，87.8％。
线性聚乙二醇-顺铂的制备按照文献Macromol.Biosci.2001，1，No.8，355-363，采用聚乙二醇的分子量为20,000和40,000，顺铂的摩尔含量分别为85.2％，88.3％。
细胞毒性的测试
将C6人乳腺癌细胞株用含10％胎牛血清的DMEM培养液(Dulbecco’s modifiedEagle’s minimum essential medium)在37℃，5％CO2条件下培养，传代。将生长旺盛的C6细胞经0.25％胰蛋白酶消化后，配成终浓度为70000个细胞/mL的细胞悬液，将该悬液按100μL/孔均匀加入96孔平底培养板中。每孔细胞数为7000个。在37℃，5％CO2，湿度100％的条件下孵育24小时。将上述各大分子药物溶于DMEM培养液，用0.22um微孔滤膜过滤。所得药物溶液以大分子药物中顺铂的含量为基准，稀释成不同浓度，折算成小分子顺铂分别为0.02ug/mL，0.2ug/mL，2ug/mL，20ug/mL，200ug/mL，2mg/mL。向上述96孔平底培养板中加入不同浓度的药物100uL/孔，培养2天，换液，培养一天。每孔加入20uL 0.5％四氮唑(MTT)溶液，4小时后，吸出上清液，加入150uL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min。用酶标仪检测各孔570nm处的吸光值(OD值)，记录结果，按下列公式计算细胞存活率：
细胞存活率＝实验组OD值/对照组OD值×100％
支化聚乙二醇-顺铂与线性聚乙二醇-顺铂系列药品的IC50值
从表中可以看出，在同系列药物中，相对于未修饰的顺铂，聚乙二醇修饰过的药物的细胞毒性都降低了。但支化聚乙二醇-顺铂系列药物的IC50值却远低于相同分子量的线性聚乙二醇-顺铂系列药物。这说明了相同分子量的支化聚乙二醇-顺铂药物比线性聚乙二醇-顺铂药物体现了更好的体外抗肿瘤活性。
急性毒性的测试
为了检验顺铂经PEO修饰后的急性毒性变化，测定了上述高分子药物的LD50。TA1小白鼠随机分成5组，每组20只，雌雄各半，分别用顺铂，接了线型和支化聚乙二醇的顺铂给药，用ip×1治疗方案，设五个计量组，给药后观察即时反应。记录二周内小鼠的死亡分布。以24小时为死亡高峰。死亡动物尸检未发现肉眼可见的，明显的实质性的病变。二周后存活动物一般情况良好。实验结果用Bliss方法计算。
支化聚乙二醇-顺铂与线性聚乙二醇-顺铂系列药品的LD50值
表中可以看到所有聚合物药物的半数致死量均比未修饰的顺铂要高得多，最少也为顺铂的60倍。由此可见，经聚乙二醇的修饰后，顺铂的急性毒性明显降低，聚合物药物急性毒性的降低完全可以弥补细胞毒性降低带来的损失。另外，我们从表中不能看出聚合物结构(支化或是线型)对急性毒性的影响，只能看到聚合物分子量对其产生的影响。对于相同结构的聚合物，分子量越大，急性毒性越小。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.含单功能基团的多级支化聚乙二醇，其分子量为2,000～1,000,000，并具有以下的结构通式：
......
其中，R为OH或OCH2CH2CN或OCH2CH2CH2NH2或Br或N3或OCH2CHO或OCH2CH2COOH或OCH2CH2CONH2或OCH2CH＝CH2或OCH2C≡CH或
R’为任意合适的基团，X为甲基或乙基，z为X基团的数目，n1、n2、n3......分别为1、2、3......级分枝链的聚合度且为10～500的整数，其中分枝级数不小于2且各级分枝上的分枝链数量不小于2。
2.根据权利要求1中所述的含单功能基团的多级支化聚乙二醇，其特征在于：R为OH。
3.权利要求2的含单功能基团的多级支化聚乙二醇的合成方法，其特征在于，包括以下的步骤：
a、向干燥洁净的容器中依次加入摩尔比为1∶1的二醇和乙烯基乙醚，以及作为反应溶剂的四氢呋喃，随后加入对甲苯磺酸作为催化剂，在0℃反应3～5小时，搅拌过夜后，滴加饱和碳酸钠水溶液至pH＝7，然后用无水硫酸镁干燥，过滤，在75℃下旋蒸除去未反应的乙烯基乙醚以及四氢呋喃，以乙醚为洗脱剂，通过柱层析提纯产物，旋蒸去乙醚后，即得到两端分别为保护羟基和未保护羟基的二醇衍生物，反应式如下：
b、将引发剂和二苯甲基钾的二甲基亚砜溶液加入至无水无氧的密闭反应釜中，并将反应釜置于0℃冰水浴中，引发剂和二苯甲基钾的摩尔比为1∶1；
c、加入计算量的环氧乙烷，升高温度至0～50℃，反应24～48小时；
(1)随后在不改变反应釜密闭性的前提下，用蠕动泵缓慢滴加入缩水甘油的二甲基亚砜溶液，同时将反应温度提高至100～120℃，反应时间为4～12小时；
(2)加入计算量的环氧乙烷，升高温度至0～50℃，反应24～48小时；
根据需要，重复步骤(1)和(2)多次；
d、最后加入过量的二苯甲基钾溶液，然后加入过量的溴乙烷或者碘甲烷，反应温度在0～50℃，反应时间为12～48小时；将反应釜打开，溶剂浓缩后，在0℃无水乙醚中沉淀，过滤，干燥，即得端部为保护基的多级支化聚乙二醇；
......
e、在干燥洁净的容器中加入步骤d中制得的支化聚乙二醇、作为反应溶剂的四氢呋喃和作为酸解剂的浓盐酸，反应15分钟后旋干四氢呋喃和浓盐酸，即得到R为OH的多级支化聚乙二醇。
......
4.根据权利要求3的含单功能基团的多级支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于：其中的R基团OH可以继续修饰为OCH2CH2CN或OCH2CH2CH2NH2或Br或N3或OCH2CHO或OCH2CH2COOH或OCH2CH2CONH2或OCH2CH＝CH2或OCH2C≡CH或
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