CN114656453A - 七甲川吲哚花菁-tempo化学偶链小分子和制备方法及其制备辐射防护制剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种七甲川吲哚花菁‑TEMPO化学偶链小分子和制备方法及其制备辐射防护制剂的应用，所述小分子将具有高效清除自由基(ROS)的2,2,6,6‑四甲基哌啶氧化物(TEMPO)化学连接到线粒体靶向的七甲川吲哚花菁小分子结构中，使TEMPO能特异性蓄积到线粒体，并高效清除因辐射诱导细胞线粒体产生的大量ROS，减轻正常细胞的辐射损伤。同样条件下，其优先防护于正常细胞，而对肿瘤细胞无此作用。本发明中所述小分子，辐射防护效果优于现有抗辐射药物氨磷汀(Amifostine)，并且还有合成方法简单，反应条件温和，易于操作的优点。

Description

七甲川吲哚花菁-TEMPO化学偶链小分子和制备方法及其制备 辐射防护制剂的应用
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，特别涉及一种七甲川吲哚花菁-TEMPO化学偶链小分子和制备方法及制备辐射防护制剂的应用。
背景技术
电离辐射已经广泛用于工业和医学设施。如果操作不当或遭遇蓄意破坏，将给社会带来严重的健康灾难。电离辐射的暴露可导致生物体的细胞或组织的损伤，尤其是当长时间低剂量暴露或短时间内的高剂量暴露于电离辐射，将大大增加患癌的几率。放射治疗，是临床癌症治疗最主要的方法之一，同样面临着对癌旁正常组织损害的潜在风险。因此，研究辐射防护药物用来预防和治疗因电离辐射可能引起的严重放射损伤，在当今显得尤为重要。
活性氧(Reactiveoxygen species,ROS),包括电离辐射水分子所产生的一类活性自由基，以及ROS某些活泼中间体进一步与细胞成分(例如蛋白质、核酸、磷脂等)形成的次级自由基，在电离辐射诱导的细胞损伤被认为起着关键作用。线粒体作为细胞的能源工厂，在细胞生存、诱导凋亡，以及近年来认识到在细胞自噬等方面都发挥着重要作用。同时，ROS的主要来源也是产生于线粒体。当细胞暴露于电离辐射的几分钟后，ROS的产生便可以在线粒体中检测得到。接着在24h以后，线粒体ROS的次级产物被发现显著升高。这些次级产物与电子呼吸链复合物的损伤以及线粒体DNA的氧化紧密相关，是造成持续爆发性氧化应激的潜在因素。高剂量辐射引起的严重氧化应激，已经被证实可进一步导致一系列细胞凋亡蛋白释放到细胞浆，从而诱导细胞凋亡和死亡。
虽然线粒体在辐射诱导损伤被广泛证实发挥着重要作用，然而目前临床上尚无特异性靶向清除线粒体ROS的辐射保护药物。氨磷汀(Ami)是临床上广泛应用于肿瘤放疗、化疗病人的细胞保护辅助药物，其作用原理是通过体内碱性磷酸酶水解脱磷酸，成为具有活性的代谢产物WR-1065，因裸露的巯基具有广谱清除组织中自由基的作用，从而发挥辐射保护效应。然而，Ami的水解效率不高，临床上的辐射防护效果不好，针对放疗病人常见的副作用，例如脱发、恶心、呕吐、造血功能低下等辐射诱导机体损伤，其保护作用仍十分有限。
近年来有研究者将稳定的2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)化学连接到线粒体靶向的短杆菌肽S的片段上，或者三苯基磷基团(TPP)，发现可以提高拮抗辐射诱导的细胞凋亡。这是因为TEMPO被靶向递送至线粒体中，并发挥ROS清除和辐射保护作用。因此，前期初步研究表明，靶向清除线粒体ROS开发具有辐射防护的药物具有可行性。然而，线粒体靶向的短杆菌肽S的制备、纯化以及质量控制等成本高，而三苯基磷基团潜在毒性大，都严重地限制它们作为线粒体靶向的药物载体应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种七甲川吲哚花菁-TEMPO化学偶链小分子和制备方法及制备辐射防护制剂的应用，所述小分子，能特异性蓄积到线粒体，并在自由基(ROS)捕获基团-TEMPO的作用下，高效清除由于辐射诱导细胞线粒体产生的大量ROS，减轻正常细胞由于辐射引起的氧化损伤。本发明所述小分子可选择性辐射防护于正常细胞，对肿瘤细胞无此作用，所述小分子具有低细胞毒性，同时还具有线粒体靶向蓄积、荧光成像和ROS清除特性，可用于制备辐射防护药物，具有良好的转化和应用前景。
本发明的技术方案如下：
七甲川吲哚花菁-TEMPO化学偶链小分子，具有以下结构通式：
Figure BDA0003616222260000031
其中，n＝1-6；R为氢、卤代烃、甲基、甲氧基、羧基、羧酸盐、磺酸基、磺酸盐、羟基、氨基、芳香基、含氮杂环中的任意一种；X－为卤素离子、烷基磺酸根、四氟硼酸根、高氯酸根中任意的一种。
所述卤代烃为溴代烷基或碘代烷基；所述羧酸盐为羧酸钠；所述磺酸盐为磺酸钠；所述芳香基为苯甲氧基；所述含氮杂环为嘧啶环；
优选地，所述卤素离子为碘离子、氯离子、溴离子。
上述的七甲川吲哚花菁-TEMPO化学偶链小分子的制备方法，有以下步骤：
Figure BDA0003616222260000032
1)乙腈(MeCN)为反应溶剂，2,3,3-三甲基3H吲哚和R-X在氮气保护下110℃加热回流反应16h，反应液浓缩得到残留物，经柱层析分离得到吲哚季铵盐1a；
2)N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为反应溶剂，0℃下依次缓慢滴加氯氧磷(POCl3)和环己酮，滴加完毕后，撤去冰浴，待反应体系恢复至室温，再升温于45℃下反应6h，反应液经过冰水沉淀，抽滤，滤饼经乙酸乙酯重结晶后得缩合剂2a；
3)无水乙醇为反应溶剂，乙酸钠为碱性添加剂，将步骤1)所得吲哚季铵盐1a与步骤2)所得缩合剂2a在氮气保护下，于70℃反应3-5h，反应液减压浓缩得到残留物，经柱层析分离得到七甲川吲哚花菁染料3a；
4)N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，将步骤3)所得七甲川吲哚花菁染料3a和4-胺-2,2,6,6-四甲基二苯哌酯在氮气保护下，75℃加热反应4h，反应液减压浓缩得到残留物，经柱层析分离得到七甲川吲哚花菁-TEMPO化学偶链小分子CY-TMP。
步骤2)中所述环己酮：POCl3：DMF的摩尔比为3:1:2。
步骤3)中所述吲哚季铵盐1a与缩合剂2a的摩尔比为2:1-3:1。
步骤4)中所述柱层析的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇混合溶剂。
所述二氯甲烷：甲醇的体积比为＝30:1-4:1。
上述的七甲川吲哚花菁-TEMPO化学偶链小分子在制备用于辐射防护制剂中的应用。
所述辐射防护是指降低因辐射诱导线粒体内产生的活性氧(ROS)以及细胞内产生的总ROS水平，提高细胞的存活率。
本发明所述小分子将具有高效清除自由基(ROS)的2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)化学连接到线粒体靶向的七甲川吲哚花菁小分子结构中，使TEMPO能特异性蓄积到线粒体，并高效清除因辐射诱导细胞线粒体产生的大量ROS，减轻正常细胞的辐射损伤。本发明所述小分子具有低细胞毒性，同时还具有线粒体靶向蓄积、荧光成像和ROS清除的性能。所述小分子对辐射引起的线粒体ROS水平以及细胞内产生的总ROS水平有显著降低作用，起到辐射防护作用。更重要的是，其选择性辐射防护于正常细胞，而对肿瘤细胞无此作用。据此，该偶联物可望用于肿瘤放疗病人的辐射防护。
申请人实验表明，所述七甲川吲哚花菁-TEMPO化学偶链小分子具有荧光成像和线粒体靶向蓄积特性，能显著降低辐射诱导线粒体内的ROS水平以及细胞内产生的总ROS水平从而发挥抗辐射作用，有作为由辐射引起损伤的防护潜能。
本发明所述小分子，与目前临床使用的阳性药物氨磷汀(Ami)相比较，具有更好的辐射防护作用。
本发明所述制备方法，反应条件温和，容易操作，原料经济，易于实施。
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解。任何本领域人员根据本发明的技术方案及其发明构思进行等同替换或改变均属于本发明保护范畴。
附图说明
图1为化合物CY-TMP1、CY-TMP2、CY-TMP3与氨磷汀(Ami)的细胞毒性比较；其中CY-TMP1毒性显著低于对照药物氨磷汀；
图2为化合物CY-TMP1的辐射防护细胞评价；其中，L-02为人正常肝细胞，B10-F16为人黑色素瘤细胞，说明化合物CY-TMP1具有选择性对L-02细胞辐射防护，而对B10-F16无保护作用，且具有放疗增敏杀伤作用；
图3为化合物CY-TMP1细胞总ROS清除能力；其表明，其清除ROS作用明显优于对照药氨磷汀(Ami)；
图4为化合物CY-TMP1线粒体共定位实验；
图5为化合物CY-TMP1线粒体ROS清除能力。
具体实施方式
实施例中所采用的试剂与仪器：
除了试剂无水乙醇和DMF需经过蒸馏纯化与干燥处理以外，其他所涉及的化学试剂和溶剂购买于sigma-aldrich或阿拉丁等试剂公司并直接使用。
所有反应在氮气及避光条件下进行，用硅胶薄层层析监测至反应结束。硅胶薄层层析板使用百灵威科技所生产的高效薄层层析硅胶板(型号GF-254)，采用254nm荧光或日光下目视直接进行检测。
柱层析用于染料分子的最终纯化，采用烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂所生产的层析硅胶(200-300目)。层析用有机溶剂均为分析纯，且经过重蒸干燥处理。
所有化合物1H NMR和13C NMR由美国Agilent公司生产的600MHz核磁共振谱仪测定，TMS作内标，用CDCl3和CD3OD作溶剂，δ值单位为ppm。
质谱由德国Bruker Ultraflextreme MALDI-TOF质谱仪测定；紫外吸收光谱由日本SHIMADZU公司紫外可见荧光分光光度计UV-3600采集；荧光光谱由美国Thermo Fisher的Lumina Fluorescence Spectrometer测定。
实施例1化合物1a的合成
Figure BDA0003616222260000061
与100mL圆底烧瓶中加入2,3,3-三甲基吲哚(25mmol)和丁磺酸内酯(3.47g，25.2mmol)，20mL乙腈作溶剂，氮气保护下110℃加热回流反应16h。反应完成后，反应液减压浓缩得到残留物，经柱层析分离得到5.29g丁磺酸吲哚季铵盐(1a)，产率72％。
实施例2化合物2a的合成
Figure BDA0003616222260000071
于250mL圆底烧瓶中加入50mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，冰浴下依次缓慢滴加34mL三氯氧磷(POCl3)和环己酮(10g，0.1mol)，滴毕，使反应体系恢复至室温，然后缓慢升温至45℃反应6h。反应结束后，冷却至室温，将反应液分批倒入150mL冰水中，搅拌过夜。停止搅拌，大量红色固体析出，减压过滤，固体以乙酸乙酯重结晶，过滤，真空抽干得13.5g黄色固体缩合剂(2a)，产率78％，所得产物不需要进一步纯化即可进行下一步反应。
实施例3化合物3a的合成
Figure BDA0003616222260000072
25mL反应瓶中加入500mg实施例1的1a(1.79mmol)粗品，154mg实施例2的缩合剂2a(0.9mmol)和147mg乙酸钠(0.9mmol)，以10mL无水乙醇作溶剂，氮气保护下于70℃下加热回流反应3h。反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂得暗红色粘稠物，经柱层纯化得400mg七甲川吲哚花菁染料(3a)，产率65％。
1H NMR(600MHz,CD3OD)δ8.44(d,J＝14.4Hz,2H),7.52(d,J＝7.2Hz,2H),7.43(t,J＝7.8Hz,2H),7.38(d,J＝7.8Hz,2H),7.28(t,J＝7.2Hz,2H),6.34(d,J＝14.4Hz,2H),4.23(t,J＝7.2Hz,4H),2.90(t,J＝7.2Hz,4H),2.76(t,J＝6.0Hz,4H),2.04–1.92(m,10H),1.74(s,12H)ppm；13C NMR(151MHz,CD3OD)δ172.77,149.67,144.17,142.18,141.17,128.50,126.85,125.06,122.05,110.96,101.06,50.35,49.22,43.62,26.92,25.94,25.90,22.18,20.73.
实施例4代表化合物CY-TMP1的合成
Figure BDA0003616222260000081
以2mL DMF为溶剂，将110mg实施例3的3a(0.15mmol)和75.5mg 4-胺-2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(0.44mmol)在氮气保护下75℃加热反应4h，反应液减压浓缩得到残留物，经柱层析分离得到93mg蓝色固体CY-TMP1，产率72％。
1H NMR(600MHz,CD3OD)δ7.92(d,J＝10.8Hz,2H),7.37(d,J＝44.4Hz,4H),7.19–7.14(m,4H),6.05–5.99(m,2H),4.04(s,4H),2.88(s,4H),2.56(s,4H),2.05–1.84(m,14H),1.77–1.57(m,13H),1.42–1.08(m,11H),0.89–0.87(m,1H)；MALDI-TOF-MS质谱分析理论分子量861.429,实测分子量861.3.
实施例5代表化合物CY-TMP2的合成
Figure BDA0003616222260000091
以2mL DMF为溶剂，将IR-780(0.15mmol)和75.5mg 4-胺-2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(0.44mmol)在氮气保护下75℃加热反应8h，反应液减压浓缩得到残留物，经柱层析分离得到86mg蓝色固体CY-TMP2，产率85％；MALDI-TOF-MS质谱分析理论分子量674.49；实测分子量674.40.
实施例6代表化合物CY-TMP3的合成
Figure BDA0003616222260000092
以2mL DMF为溶剂，将780-5Fu(0.15mmol)和75.5mg 4-胺-2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(0.44mmol)在氮气保护下75℃加热反应12h，反应液减压浓缩得到残留物，经柱层析分离得到106mg蓝色固体CY-TMP3，产率76％；MALDI-TOF-MS质谱分析理论分子量930.5；实测分子量930.4.
实施例5代表化合物CY-TMP(1-3)的细胞毒性评价
将L-02细胞(正常肝细胞)培养至指数生长期，0.25％胰蛋白酶消化，DMEM完全培养基重悬，用细胞计数仪计数，每孔接种2000个细胞于96孔板中，置于细胞培养箱中培养24h至细胞贴壁。用DMEM完全培养基配制0，0.01，0.1，1，10，25μM浓度的CY-TMP(1-3)药液，替换孔中液体。72h后，用DMEM完全培养基配制10％的CCK-8药液，替换孔中培养基，37℃孵育2h，在450nm下检测OD值，然后计算细胞生存率。
实施例6代表化合物CY-TMP1的辐射防护细胞评价
将L-02细胞(正常肝细胞)或B16-F10细胞(人黑色素瘤细胞)消化计数，以每孔2000个接种到96孔板中，37℃培养过夜。用DMEM完全培养基配制0，0.01，0.1，1，10，25μM浓度的CY-TMP1药液，替换孔中液体。6小时后，给与6Gy的X射线照射。照射3天后，用DMEM完全培养基配制10％的CCK-8药液，替换孔中培养基，37℃孵育2h，在450nm下检测OD值，然后计算细胞生存率。结果表明，化合物CY-TMP1具有选择性辐射防护于正常细胞而非肿瘤细胞(参见图2)，CY-TMP1选择性对人肝正常细胞L-02的辐射保护作用，而对人黑色素瘤B16-F10细胞不但无保护效应，且具有放疗增敏作用。
实施例7代表化合物CY-TMP1细胞总ROS清除能力评价
将L-02细胞消化计数，以每孔3×105个接种到6孔板中，37℃培养过夜。分别给药PBS、25μM CY-TMP1和5μM氨磷汀(Amifostine,AMI)，给药孵育12h后用DMEM基础培养基稀释DCFH-DA(比例为1:1000)孵育细胞，然后用6Gy X射线进行辐照。辐照后立即用PBS清洗细胞，荧光显微镜拍照，用软件ImageJ计算荧光强度作图。结果表明，与6Gy单纯PBS辐照组比较，化合物CY-TMP1能明显降低辐射引起的细胞内ROS水平，且明显优于阳性对照药氨磷汀(AMI)(参见图3)。
实施例8代表化合物CY-TMP1线粒体蓄积特性
将L-02细胞消化计数，以每孔2×105个接种到激光共聚焦小皿中，37℃培养过夜。向细胞中加入浓度为25μM的化合物CY-TMP1，孵育6h后用线粒体探针Mito-tracker green处理细胞，再孵育30分钟用PBS洗涤3次，用4％多聚甲醛固定10min，再用PBS洗涤3次后用激光共聚焦显微镜观察化合物CY-TMP1的荧光信号(红色)、Mito-traker-green(绿色)。结果表明，化合物CY-TMP1在体外培养条件下可被L-02细胞高效摄取，显示出很强的红色荧光信号；红色荧光信号可与来自线粒体的绿色荧光信号完全重合，表明化合物CY-TMP1进入细胞后，能蓄积到细胞线粒体内(参见图4)。
实施例9化合物CY-TMP1线粒体ROS清除能力
将L-02细胞消化计数，以每孔2×105个接种到6孔板中，37℃培养过夜。分别给药PBS和25μM CY-TMP1，给药孵育6h后用6GyX射线进行辐照，然后用1mL Mito-Tracker RedCMXRos工作液孵育30min。PBS清洗细胞3次后用荧光显微镜拍照，用软件ImageJ计算荧光强度作图。结果表明，辐照后，与PBS空白对照组相比，化合物CY-TMP1能明显降低线粒体中的ROS含量(参见图5)。

Claims (10)

1.一种七甲川吲哚花菁-TEMPO化学偶链小分子，其特征在于，具有以下结构通式：
Figure FDA0003616222250000011
其中，n＝1-6；R为氢、卤代烃、甲基、甲氧基、羧基、羧酸盐、磺酸基、磺酸盐、羟基、氨基、芳香基、含氮杂环中的任意一种；X－为卤素离子、烷基磺酸根、四氟硼酸根、高氯酸根中任意的一种。
2.根据权利要求1所述的小分子，其特征在于：所述卤代烃为溴代烷基或碘代烷基；所述羧酸盐为羧酸钠；所述磺酸盐为磺酸钠；所述芳香基为苯甲氧基；所述含氮杂环为嘧啶环。
3.根据权利要求1所述的小分子，其特征在于：所述卤素离子为碘离子、氯离子、溴离子。
4.权利要求1-3任一所述的七甲川吲哚花菁-TEMPO化学偶链小分子的制备方法，其特征在于，有以下步骤：
Figure FDA0003616222250000012
1)MeCN为反应溶剂，2,3,3-三甲基3H吲哚和R-X在氮气保护下110℃加热回流反应16h，反应液浓缩得到残留物，经柱层析分离得到吲哚季铵盐1a；
2)DMF为反应溶剂，0℃下依次缓慢滴加POCl3和环己酮，滴加完毕后，撤去冰浴，待反应体系恢复至室温，再升温于45℃下反应6h，反应液经过冰水沉淀，抽滤，滤饼经乙酸乙酯重结晶后得缩合剂2a；
3)无水乙醇为反应溶剂，乙酸钠为碱性添加剂，将步骤1)所得吲哚季铵盐1a与步骤2)所得缩合剂2a在氮气保护下，于70℃反应3-5h，反应液减压浓缩得到残留物，经柱层析分离得到七甲川吲哚花菁染料3a；
4)DMF为溶剂，将步骤3)所得七甲川吲哚花菁染料3a和4-胺-2,2,6,6-四甲基二苯哌酯在氮气保护下，75℃加热反应4h，反应液减压浓缩得到残留物，经柱层析分离得到七甲川吲哚花菁-TEMPO化学偶链小分子CY-TMP。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述环己酮：POCl3：DMF的摩尔比为3:1:2。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述吲哚季铵盐1a与缩合剂2a的摩尔比为2:1-3:1。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤4)中所述柱层析的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇混合溶剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述二氯甲烷：甲醇的体积比为＝30:1-4:1。
9.权利要求1-3任一所述的七甲川吲哚花菁-TEMPO化学偶链小分子在制备用于辐射防护制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述辐射防护是指降低因辐射诱导线粒体内产生的活性氧以及细胞内产生的总活性氧水平，提高细胞的存活率。
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