CN117169182A - 一种干细胞治疗制剂体外效力检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种干细胞治疗制剂体外效力检测方法及其应用。干细胞治疗制剂体外效力检测方法具体为使用化合物A对干细胞进行染色。本发明采用化合物A进行细胞染色,该染料水溶性好,在近红外荧光检测中成像好,光稳定性高。
Description
技术领域
本发明涉及细胞标记领域,具体为一种干细胞治疗制剂体外效力检测方法及其应用。
背景技术
细胞示踪技术是对细胞的生物行为进行检测的有效手段并大量的应用于生物医学研究。主要利用荧光探针染料标记细胞,在特定的环境中发光显影。
现有的染料需要具备多样的分子结构、较高的吸光系数、好的生物相容性,以致能应用于生物医学成像的染料不多。在对细胞的生物性能进行长时间不间断的生物行为研究时,需要具有良好稳定性的染料,现有染料的稳定性不高,达不到长时间的细胞行为检测需求。
发明内容
本发明为了解决现有技术中存在的缺陷,提供一种光稳定性好、成像清晰的干细胞治疗制剂体外效力检测方法及其检测方法和应用。
本发明为了达到此目的,采用如下的技术方案:
一种干细胞治疗制剂体外效力检测方法,使用化合物A对干细胞进行染色,所述化合物A结构式为:
化合物A为七甲川花菁类染料。
七甲川花菁作为一种优良的近红外荧光成像染料,其分子结构的复杂度高,吸光系数好,生物相容性也高,是常用的近红外荧光探针,但是其光稳定性不是很好,氧化速度过快,导致其需要长时间追踪时影像容易丢失。
本发明还提供如下优选方案:
优选的,Y为卤素取代基。卤素取代基包括:氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)、砹(At)、石田(Ts)。更优选的Y为Br。
本发明公开了一种干细胞治疗制剂体外效力检测方法,包括如下步骤:
S1取干细胞接种在加入了培养基的细胞培养皿中培养;
S2用权利要求1所述的化合物A溶液浸染治疗制剂治疗后的干细胞培育;
S3培育后使用PBS缓冲液洗涤;
S4显微镜下近红外荧光采集图像。
步骤S1具体为:对干细胞进行培育,取干细胞接种在加入了培养基的细胞培养皿中培养,细胞浓度为2×105个/mL。
步骤S2具体为:取生长良好的干细胞,放置在细胞培养皿中,滴加入干细胞治疗制剂体外效力检测方法溶液进行浸染培育,浸染培育时间优选的为5-120min;所述化合物A的溶液滴加量为1-5mL,浓度为2-50umol/L,更优选的为10-50umol/mL。培育时优选为避光培育。
步骤S3具体为:将培育后的细胞培养皿中多余的化合物A溶液吸掉后,再用PBS缓冲液进行洗涤,洗掉剩余的化合物A溶液。
步骤S4具体为:使用近红外荧光显微镜观察细胞并采集图像。
步骤S3中,所述PBS缓冲液洗涤次数为2-3次。
本发明还公开了一种干细胞治疗制剂体外效力检测方法在制备的干细胞治疗制剂体外效力检测方法中的应用。
本发明采用化合物A进行细胞染色,该七甲川花菁染料水溶性好,在近红外荧光检测中成像好,光稳定性高。
附图说明
图1为本发明的化合物A的浸染时长的近红外成像图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解发明的技术方案,下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
本发明的干细胞治疗制剂体外效力检测方法,使用化合物A对干细胞进行染色,所述化合物A结构式为:
化合物A为七甲川花菁类染料。
化合物A的合成是对化合物B:中的Cl-进行亲核取代反应合成而得。
具体的合成方法为:取化合物B和环己胺在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的作用下,于110-130℃发生亲核取代反应得到化合物A。
Y为卤素取代基,如氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)、砹(At)、石田(Ts)。更优选的Y为Br。
本发明公开了的干细胞治疗制剂体外效力检测方法,包括如下步骤:
S1取干细胞接种在加入了培养基的细胞培养皿中培养;
对干细胞进行培育时,优选的选择脐带干细胞进行培养,并且接种后保持细胞浓度为2×105个/mL,置于细胞培养箱里过夜。
S2用权利要求1所述的化合物A溶液浸染治疗制剂治疗后的干细胞培育;
将细胞培养皿中生长良好的干细胞进行浸染染色时,选择在细胞培养箱中滴加,细胞培养箱保持37℃,并避光培育。
S3培育后使用PBS缓冲液洗涤;
培育后的细胞培养皿中多余的干细胞治疗制剂体外效力检测方法溶液吸掉后,再用PBS缓冲液洗涤2-3次。
S4显微镜下近红外荧光采集图像。
以上为本发明的具体内容,下面结合具体的实施例进行进一步的说明。
一、干细胞治疗制剂体外效力检测方法中工艺参数的选择
先按步骤进行干细胞治疗制剂体外效力的检测。
S1取干细胞接种在加入了培养基的细胞培养皿中培养;并且接种后保持细胞浓度为2×105个/mL,置于细胞培养箱里过夜。
S2将细胞培养皿中生长良好的干细胞进行浸染染色时,选择在细胞培养箱中滴加化合物A溶液,细胞培养箱保持37℃,并避光培育。
S3培育后的细胞培养皿中多余的化合物A溶液吸掉后,再用PBS缓冲液洗涤2-3次。
S4显微镜下近红外荧光采集图像。
设置多组平行实验,其区别在于S2步骤中化合物A浓度选择2umol/L、5umol/L、10umol/L、20umol/L、40umol/L、50umol/L。
并选择化合物A的溶液滴加量为1mL、2mL、4mL、5mL。具体的配比见表1。
表1化合物A添加浓度和添加量表
按表1实施例进行荧光强度和标记时间的检测,最终选定实施例14为最佳的实施例配比。
二、光稳定性检测
按本发明中干细胞治疗制剂体外效力检测方法进行检测,取实施例14的化合物A添加量和添加浓度进行浸染,然后设置多组浸染时长不同的细胞组用于检测光稳定性,具体的浸染时长见表2。
浸染时长 | |
实施例A | 5min |
实施例B | 10min |
实施例C | 20min |
实施例D | 30min |
实施例E | 60min |
实施例F | 120min |
将六个实施例浸染后的细胞进行荧光强度检测,得到附图1,从左到右依次为实施例A、实施例B、实施例C、实施例D、实施例E、实施例F。
从图1中我们可以看出,本发明的化合物A染色剂光稳定性好,120min后依然具有良好的荧光强度,适合于干细胞治疗制剂的体外效力检测。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种干细胞治疗制剂体外效力检测方法,其特征在于:
使用化合物A对干细胞进行染色,所述化合物A结构式为:
2.根据权利要求1所述的干细胞治疗制剂体外效力检测方法,其特征在于:Y为卤素取代基。
3.根据权利要求2所述的干细胞治疗制剂体外效力检测方法,其特征在于:Y为Br。
4.根据权利要求1所述的干细胞治疗制剂体外效力检测方法,其特征在于:包括如下步骤:
S1取干细胞接种在加入了培养基的细胞培养皿中培养;
S2用权利要求1所述的化合物A的溶液浸染治疗制剂治疗后的干细胞培育;
S3培育后使用PBS缓冲液洗涤;
S4显微镜下近红外荧光采集图像。
5.根据权利要求4所述的干细胞治疗制剂体外效力检测方法,其特征在于:S1步骤中细胞浓度为2×105个/mL。
6.根据权利要求4所述的干细胞治疗制剂体外效力检测方法,其特征在于:S2步骤中化合物A的溶液浓度为10-50umol/mL。
7.根据权利要求4所述的干细胞治疗制剂体外效力检测方法,其特征在于:S2步骤中化合物A的溶液浸染时间为5-120min。
8.根据权利要求4所述的干细胞治疗制剂体外效力检测方法,其特征在于:所述PBS缓冲液洗涤次数为2-3次。
9.权利要求1所述的干细胞治疗制剂体外效力检测方法应用于干细胞治疗制剂体外效力检测。
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