WO2016129806A2 - 치아염소산을 선택적으로 검출하기 위한 이미다졸린 -2-티온 구조 기반의 프로브 - Google Patents

치아염소산을 선택적으로 검출하기 위한 이미다졸린 -2-티온 구조 기반의 프로브 Download PDF

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WO2016129806A2
WO2016129806A2 PCT/KR2015/014311 KR2015014311W WO2016129806A2 WO 2016129806 A2 WO2016129806 A2 WO 2016129806A2 KR 2015014311 W KR2015014311 W KR 2015014311W WO 2016129806 A2 WO2016129806 A2 WO 2016129806A2
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윤주영
슈큉링
김경미
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이화여자대학교 산학협력단
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D235/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings
    • C07D235/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
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    • C07D241/36—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
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    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
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    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators

Definitions

  • the present invention relates to an imidazoline® 2-thiene structure based probe for the selective detection of chychloric acid.
  • Reactive Oxygen Species ROS
  • RNS Reactive Nitrogen Species
  • ROS Reactive Oxygen Species
  • RNS Reactive Nitrogen Species
  • OCr major chlorine acid
  • hypochlorous acid (0C1—) can cause damage to cells and surrounding tissues, and as a result can be associated with various disorders such as cardiovascular, inflammatory and neurological diseases.
  • occhloric acid it is important to observe and detect the presence and presence of occhloric acid at the cellular, tissue and organism level.
  • Low molecular fluorescence probes in imaging studies may be useful because of their low steric hindrance, fast labeling speed, and easily manipulated properties. Specifically, fluorescent probes for detecting H 2 O 2 , NO, 0N00—, Q> 2, o 2 , ocr have been developed.
  • TPM two-photon microscopy
  • ocr occhloric acid
  • the present inventors are working to develop a probe for selectively detecting occhloric acid (ocr), and according to the present invention, a probe based on imidazoline-2-thione structure is used as a hypochlorite (among the Oc) was selectively reacted with fluorescence or emission spectroscopy, and the change in the number of spectral species was induced, confirming that it can be easily detected and completed the invention.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting hypochlorite (0C1) using the chemical sensor.
  • the present invention provides a compound labeled ' to the formula (1).
  • n R 5 are independently -H, -0H, halogen, straight or branched chain alkyl of 10, ( ⁇ linear or branched alkoxy or eu 10
  • R 5 is a heterocycle of 5-10 atoms including one or more heteroatoms selected from the group consisting of N, 0 and S, n is an integer of 1 ⁇ 10; 3 and R 4 are independently —0H, halogen, — straight or branched alkyl of — or straight or branched alkoxy of d- 10 ;
  • R 3 and R 4 are together with the atom to which they are attached ⁇ : 6 - 10 aryl, and come to form the;
  • step 1 Reacting the compound represented by Chemical Formula 2 and the compound represented by Chemical Formula 3 to prepare a compound represented by Chemical Formula 4 (step 1); Reacting the compound represented by Chemical Formula 4 prepared in Step 1 with the compound represented by Chemical Formula 5 to prepare a compound represented by Chemical Formula 6 (step 2); And
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , E and Q are independently as defined in Formula 1 above;
  • X is halogen.
  • the present invention provides a chemical sensor for detecting chlorine acid (ocr) containing the compound.
  • the present invention provides a method for detecting hypochlorous acid (0C1—) using the chemical sensor.
  • the compound based on imidazoline-2-thione structure according to the present invention is maintained in the cellular environment, and selectively reacts with exogenous or endogenous chlorochloric acid (ocr) to change the fluorescence or absorbance spectrum, so that the tooth in the cell It can be usefully used for detecting chloric acid (ocr).
  • Example 1 is an image observing the change in the fluorescence spectrum when the compound prepared in Example 1 and hypochlorous acid (0C1 0-10 ⁇ ) reacted.
  • Figure 2 is an image observing the change in absorption spectrum when the compound prepared in Example 1 and hypochlorous acid (0C1 0-30 ⁇ ) reacted.
  • Example 3 is an image showing a reaction mechanism when the compound prepared in Example 1 reacts with hypochlorous acid (OCr).
  • Figure 4 is was observed for the compound and hypochlorous acid side "Chemistry of the fluorescent spectrum of the time when the banung (OCr, ⁇ ⁇ , 5 ⁇ ⁇ , ⁇ ⁇ , 15 ⁇ ) prepared in Example 1
  • Image Figure 5 shows the fluorescence intensity (fluorescence intensity around 505 nm) observed when reacting reactive oxygen species (ROS) or reactive nitrogen species (React ive Nitrogen Species, RNS) with the compound prepared in Example 1, respectively.
  • ROS reactive oxygen species
  • RNS reactive nitrogen species
  • Au is an image representing all.
  • Example 6 represents the compound prepared in Example 2 and the hypochlorous acid (ocr 0-
  • Example 7 shows the compound prepared in Example 2 and hypochlorous acid (0C1 0-
  • FIG. 9 shows fluorescence spectra (fluorescence intensity near 450 nm, au) observed when reacting reactive oxygen species (R0S) or reactive nitrogen species (Reactive Nitrogen Species, RNS) with compounds prepared in Example 2, respectively. ).
  • Example 10 is an image observing the change in the fluorescence spectrum when the compound prepared in Example 1 and the hypochlorous acid (0C1 0-50 ⁇ ) reacted.
  • FIG. 11 is an image of changes in absorption spectra when the compound prepared in Example 1 and hypochlorous acid (QC1 0- ⁇ ) reacted.
  • 12 is a fluorescence intensity (fluorescence intensity around 493 nm) observed when reacting reactive oxygen species (ROS) or reactive nitrogen species (Reactive Nitrogen Species, RNS) with a compound prepared in Example 1, respectively. Image representing au.
  • ROS reactive oxygen species
  • RNS reactive Nitrogen Species
  • Figure 13 is an image showing the results of evaluating the cytotoxicity of the compound prepared in Example 1 for Hela cells (Hel a cell).
  • Figure 14 is an image showing the results of evaluating the cytotoxicity of the compound prepared in Example 1 on RAW 264.7 cells (macrophage line).
  • FIG. 15 (a) is an image [top: fluorescent channel; bottom: differential interference channel] observed when HeLa cell ⁇ the compound prepared in Example 1 was treated:
  • FIG. 15 (b) is an image observed when Hela cells were treated with 100 ⁇ M NaOCl and 10 ⁇ M of the compound prepared in Example 1 (upper part: fluorescent channel lower part: undifferentiated channel).
  • FIG. 15 (c) shows an image observed in the case of HeLa cells treated with NaOCl 200 ⁇ M and the compound ⁇ prepared in Example 1 (upper: lower fluorescent channel: non-interfering channel).
  • FIG. 16 (b) shows lipopolysaccharide (1 ipopolysacchar ide, LPS) in RAW 264.7 cells at 100 ng / ml for 16 hours, interferon at 50 ng / ml for 4 hours, phorbol 12-myristate 13-acetate ( phor bo 1 12-myristate 13-acetate (PMA) was treated with 10 nM for 30 minutes to induce endogenous hypochlorous acid (ocr) production, and the image observed when 10 ⁇ M of the compound prepared in Example 1 was treated [upper : Fluorescent channel, lower part: differential channel.
  • LPS lipopolysaccharide
  • FIG. 16 (c) shows lipopolysaccharide (LPS) at 100 ng / ml for 16 hours, interferon- ⁇ at 50 ng / ml for 4 hours, and Phorbul 12-myristate 13-acetate (264.7 cells).
  • the compound prepared in Example 1 was treated with 10 nM of phor bo 1 12-myristate 13-acetate (PMA) for 30 minutes and additionally treated with 50 ⁇ M of 4-ABAH (4-Aminobenzoicacid hydrazide), an MP0 inhibitor. This is the image observed when the 10 ⁇ M-Ol treatment was performed (upper: fluorescent channel, lower: differential channel).
  • FIG. 16 (d) shows lipopolysaccharide (LPS) in RAW 264.7 cells at 100 ng / ml for 16 hours, interferon- ⁇ at 50 ng / ml for 4 hours, and phorbol 12-myristate 13-acetate ( phorbo 1 12-myristate 13-acetate (PMA) was treated with 10 nM for 30 minutes, additionally treated with 50 ⁇ of FFA (flufenamic acid), an MP0 inhibitor, and then treated with 10 ⁇ of the compound prepared in Example 1 Image [upper: fluorescent channel, lower: differential channel].
  • LPS lipopolysaccharide
  • FIG. 17 (a) shows images observed when Hela cells and RAW 264.7 cells were treated with 10 ⁇ of the compound prepared in Example 1.
  • FIG. 17 (c) shows 100 ng / ml of lipopolysaccharide (LPS) for 16 hours, interferon- ⁇ for 50 hours in Hela cells and RAW 264.7 cells.
  • Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) was treated with 10 nM for 30 minutes and additionally, the MP0 inhibitor 4-ABAH (4-Aminobenzoicacid).
  • hydrazide) after treatment with 50 ⁇ Mol of the compound ⁇ prepared in Example 1 [upper: fluorescent channel, middle: differential channel, lower: fluorescent channel + differential channel].
  • FIG. 18 (b) shows pretreatment of NaOCl 200 ⁇ M in RAW 264.7 cells for 30 minutes, followed by washing with 10 ⁇ M of the compound prepared in Example 1, using two-photon fluorescence microscopy. The fluorescence imager observed.
  • FIG. 18 (c) shows 100 ng / ml of lapopolysaccharide (1 ipopolysacchar ide, LPS) in RAW 264.7 cells, 50 ng / ml of interferon for 4 hours, phorbol 12-myristate 13-acetate ( phorbol 12-myr istate 13-acetate (PMA) was treated with 10 nM for 30 minutes to induce endogenous hypochlorous acid (0CD production, followed by incubation with 10 ⁇ of the compound prepared in Example 1, followed by two-photon fluorescence microscopy ( Fluorescence image observed using Two-Photon Fluorescence Microscopy.
  • LPS lapopolysaccharide
  • FIG. 18G is an image showing graphs in which fluorescence intensities of the groups corresponding to FIGS. 18A to 18F are measured, respectively.
  • Figure 19 (a) is a fluorescence image of a group of NaOCl 200 ⁇ M not treated in RAW 264.7 cells labeled with the compound prepared in Example 1.
  • Figure 19 (b) is a fluorescence image of a group treated with NaOCl 200 ⁇ to RAW 264.7 cells labeled with the compound prepared in Example 1.
  • Figure 19 (c) is a RAW 264.7 cell labeled with a compound prepared in Example 1 Na0C1 20 (group not treated with iM [Fig. 19 (a)], R 264.7 labeled with the compound prepared in Example 1 It is an image observing the change of Photon-Excited Fluorescence (TPEF Tw) with respect to the group treated with 200 ⁇ M NaOCl [Fig. 19 (b)].
  • TPEF Tw Photon-Excited Fluorescence
  • (A) is an image which observed the fluorescence of the CA1 part of the hippocampal slice in the group which treated the compound ⁇ prepared in Example 1 to the hippocampal slice.
  • Figure 20 (b) is a pretreatment of ⁇ 10 ng / mL in hippocampal sections to induce the generation of hypochlorous acid (OCT), in the group treated with 100 ⁇ compound prepared in Example 1, CA1 portion of the hippocampal section This is an image of fluorescence observed.
  • OCT hypochlorous acid
  • FIG. 20 (c) shows an image of fluorescence of the CA1 portion of the hippocampal sections in the hippocampal sections treated with Example 1 step 2 compound IMO.
  • Fig. 20 (d) shows the fluorescence of the CA3 portion of the hippocampal sections in the group in which the hippocampus sections were treated with the compound ⁇ prepared in Example 1. '
  • FIG. 20 (e) shows that CA3 portion of the hippocampal section was treated in the group treated with the compound ⁇ prepared in Example 1 after pretreatment with ⁇ 10 ng / mL of the hippocampus section to induce the generation of hypochlorous acid (OCT). This is an image of fluorescence observed.
  • Figure 20 (f) shows Example 1 step 2 100 ⁇ compound in hippocampal sections. In one group, the fluorescence of the CA3 portion of the hippocampal section was observed.
  • Figure 20 (g) is a bright-field image of the hippocampal sections CA1 and CA3 sections.
  • FIG. 20 (h) is a group in which the hippocampal sections prepared in Experimental Example 12-1 were treated with 100 ⁇ of the compound prepared in Example 1 [Fig. 20 (a) and 20 (d)], Experimental Example 12-1 Hepatic chlorine acid was prepared by pretreatment with ⁇ 10 ng / mL in the hippocampal sections prepared in the group treated with the compound ⁇ prepared in Example 1 after inducing 0CD generation [FIG. 20 (b), FIG. 20 (e)], It is an image which shows the graph which measured the fluorescence intensity of the group [FIG. 20 (c), FIG. 20 (f)] which processed the Example 1 step 2 compound ⁇ to the hippocampus slice prepared in the said Experimental Example 12-1, respectively. Best Mode for Implementation
  • the present invention provides a compound represented by the following formula (1)
  • R 1 and R 2 are independently -0H, halogen, du ⁇ straight or branched chain
  • R 5 is a 5-10 membered heterocycle containing one or more heteroatoms selected from the group consisting of N, 0 and S, n is an integer from 1-10;
  • R 3 and R 4 are independently —H, —0H, halogen, straight or branched chain alkoxy of ( ⁇ ⁇ straight or branched chain alkyl or;
  • R '3 and R 4 are C 6 together with the atom to which they are connected, it can form an aryl group of 10, and;
  • E and Q are independently C or N.
  • E and Q are independently C or N.
  • R 1 and R 2 are independently straight or branched alkyl of Cwo R 3 and R 4 are independently hydrogen;
  • R 3 and R 4 are C 6 together with the atom to which they are connected, it can form an aryl group of 10, and; E and Q are independently C or N. More preferably,
  • R 1 and R 2 are independently methyl; R 3 and R 4 are independently hydrogen;
  • R 3 and R 4 together with the atoms to which they are linked may form phenyl
  • E and ⁇ Q are independently C or N.
  • Preferred examples of the compound represented by Formula 1 according to the present invention include the following compounds.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , E and Q are independently as defined in Formula 1 above;
  • Step 1 is a system for preparing a compound represented by Chemical Formula 4 by reacting the compound represented by Chemical Formula 2 with the compound represented by Chemical Formula 3. Specifically, after adding and stirring mineral oil to the compound represented by Formula 2 dissolved in a solvent, the compound represented by Formula 3 is added and further stirred to prepare a compound represented by Formula 4 It's a step to get into.
  • reaction solvent tetrahydrofuran; Dioxane; Ether solvents containing ethyl ether, 1, 2-dimethoxyethane and the like; Lower alcohols including methane, ethane, propane and butanol; Dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMS0), dichloromethane (DCM), dichloroethane, water, acetonitrile acetonizensulfonate, toluenesulfonate, chlorobenzenesulfonate, xylenesulfonate, phenylacetate , Phenylpropionate, Phenylbutyrate, Citrate, Lactate, ⁇ -hydroxybutyrate, Glycolate, Maleate, Tartrate, Methanesulfonate, Propane sulfonate, Naphthalene-1-sulfonate, Naphthalene-2 Sulfonates, mandesates, etc.
  • DMF dimethyl
  • Step 2 is a compound represented by Formula 5 by reacting the compound represented by Formula 4 prepared in Step 1 with the compound represented by Formula 5, Preparing a compound.
  • the reaction temperature is preferably carried out between the boiling point of the solvent at 0 ° C, the reaction time is not particularly limited, it is preferable to react for 0.5-10 hours.
  • the step 3 is a compound represented by Chemical Formula 1 by adding sulfur (sulfur) to the compound represented by Chemical Formula 6 prepared in Step 2 and reacting To prepare a compound, and more specifically, to the compound represented by the formula (6), sulfur (sulfur) and base to the solvent and stirred to prepare a compound represented by the formula (1).
  • reaction solvent tetrahydrofuran; Dioxane; Ether solvents including ethyl ether, 1,2-dimethoxyethane and the like; Lower alcohols including methanol, ethane, propanol and butane; Dimethyl formamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMS0), dichloromethane (DCM), dichloroethane, water, acetonitrile, acetonizensulfonate, toluenesulfonate, chlorobenzenesulfonate, xylenesulfonate, phenyl Acetate, Phenylpropionate, Phenylbutyrate, Citrate, Lactate, ⁇ -hydroxybutyrate, Glycolate, Maleate, Tartrate, Methanesulfonate, Propane sulfonate, Naphthalene-1-sulfonate , Naphthalene-2′sulfonate, mande
  • reaction temperature is preferably carried out between the boiling point of the solvent at (C, reaction time is not particularly limited, it is preferable to react for 0.5-10 hours.
  • a compound represented by Provided is a chemical sensor for detecting occhloric acid (ocr).
  • the chemical sensor is characterized in that for detecting the chlorine acid (ocr) in the biological sample
  • the present invention comprises the steps of adding the chemical sensor to the sample (step irradiating the light source to the sample prepared in step 1 (step 2); measuring the change in fluorescence or absorption characteristics alone or mixed (step 3) provides a method for detecting chlorine acid (0C1—) containing;
  • step 1 is a step of adding the chemical sensor to the sample, wherein the sample is preferably a biological sample, He la cell and RAW Most preferred is 264.7 cells.
  • step 2 is a step of irradiating a light source to the sample prepared in step 1.
  • the light source is preferably irradiated using a fluorescence spectrophotometer or UV absorption spectroscopy.
  • step 3 is a step of measuring the change in fluorescence or absorbance characteristics alone or in combination. That is, the sulfur atom bonded to the pentagonal ring of the compound represented by Chemical Formula 1 specifically reacts with chlorine chloride (OCr) to oxidize and fall off, thereby generating a positively charged imidazolium. It is possible to detect dental chloric acid (ocr) alone or in combination with changes in fluorescence or absorption characteristics due to changes in the JI-conjugation system based on the imidazoline-2-thione structure according to the present invention.
  • the compound maintains its structure even in the cellular environment, and reacts selectively with endogenous or endogenous hypochlorite (ocr) to change its fluorescence or absorption spectrum.
  • ocr endogenous or endogenous hypochlorite
  • Example 1 dissolved in PBS (50 mM, pH 7.4) and hypochlorous acid (OCr) reacted in a neutral environment to evaluate whether the increased mold strength remained stable over time.
  • the compound prepared in Example 1 and the chlorine acid (ocr) reacted with increased 505 nm and fluorescence intensity were found to remain stable for 2.5 hours, the tooth of the compound prepared in Example 1 It was confirmed that the lower limit of detect ion concentration value for chloric acid (ocr) was 0.071 ⁇ M (see FIG. 4 of Experimental Example ⁇ 1-1>).
  • the compound prepared in Example 1 increased the fluorescence intensity near 505 nm when reacted only with chirochloric acid (OCr). It was confirmed that (see FIG. 5 of Experimental Example 2). Furthermore, when the compound prepared in Example 2 and the chlorine acid (ocr) reacted in a neutral environment, an experiment was conducted to observe the change in the fluorescence spectrum, and as the concentration of the chlorine acid (ocr) was increased, the fluorescence was increased. It was shown that the fluorescence intensity near 450 nm of the spectrum was increased (see FIG. 6 of Experimental Example ⁇ 3-1>).
  • Example 13 of Experimental Example ⁇ 2> In addition, as a result of the experiment to evaluate the cytotoxicity of RAW 264.7 cells (macrophage) of the compound prepared in Example 1, Example 1 The compound prepared in was found to have a significantly lower cytotoxicity against RAW 264.7 cells (macrophage lines). Specifically, when the compound prepared in Shirsey Example 1 was treated with 100 ⁇ , the viability of RAW 264.7 cells (macrophage line) was 80% or higher, confirming that the compound was applicable to living cells (Experimental Example ⁇ 7-3). > Of FIG. 14).
  • FIG. 15 (a) Fluorescence was not observed when Hela cells were treated with only Compound 10y M prepared in Example 1.
  • FIGS. 15 (b) and 15 (c) Increasing the concentration of NaOCl was shown to increase the fluorescence intensity, from which it can be seen that the compound prepared in Example 1 remains intact in the cytoplasm of Hela cells. It can be seen that the compound prepared in Example 1 has an excellent ratiometric reaction according to the change in the concentration of hypochlorous acid (0C1—) in Hela cells (experimental) ⁇ 8-1> Fig. 15.
  • Example 1 the compound prepared in Example 1 It can be seen that in the cytoplasm of RAW 264.7 cells is maintained in a cryptic form, as shown in Figure 16 (c) and Figure 16 (d), the addition of an additional MP0 inhibitor showed a significant decrease in fluorescence. From this, hypochlorite (induction of 0CD production is due to the H 2 0 2 It was again confirmed that the conversion to occhloric acid (ocr) through catalytic reaction by myelperoxidase (MPO) present in 264.7 cells (see FIG. 16 of Experimental Example ⁇ 8-2>). Furthermore, symbiotic-culture of Hela cells and RAW 264.7 cells
  • Step 1 Preparation of 1,3-dimethyl-1H-naphtho [2,3-d] imidazole-3iumium iodide
  • Phosphate buffered saline (PBS) buffer pH 7.4
  • hypochlorous acid 0-10 ⁇ : varying fluorescence spectra at 25 ° C. was measured using an RF-5301 / PC (Shimada) fluorescence spectrophotometer and the results are shown in FIG. 1.
  • 1 is a compound prepared in Example 1 and hypochlorous acid (ocr, 0-
  • FIG. 4 Fluorescence spectra over time were measured using RF-5301 / PC (Shimada) fluorescence spectrophotometer at 25 t using 0 ⁇ M, 5 ⁇ , 10 ⁇ , 15 ⁇ and the results are shown in FIG. 4.
  • Figure 4 is a compound prepared in Example 1 and hypochlorous acid (OCr, ⁇ , 5 ⁇ M, ⁇ , is observing the side "Chemistry of the fluorescence spectrum with time image when the reaction 15 ⁇ ).
  • the fluorescence intensity near 505 nm which was increased by reaction of the compound prepared in Example 1 and the tooth chloric acid (OCr), was shown to remain stable for 2.5 hours. It was confirmed that the lower limit of detection concentration value of the compound of hypochlorous acid (OCr) was 0.071 ⁇ .
  • FIG. 3 is an image showing a reaction mechanism when the compound prepared in Example 1 and hypochlorous acid (OCr) reacted.
  • the compound based on the imidazoline-2vthion structure according to the present invention reacted with hypochlorite (0C1—) under neutral conditions, fluorescence and absorption spectra As the rum changes, it can be usefully used for the detection of occhloric acid (ocr).
  • PBS Phosphate buffered saline
  • reactive oxygen species reactive Oxygen Species, R0S
  • reactive nitrogen species React ive Nitrogen Species, RNS
  • TBHP lmM, tert-butyl hyperoxide, NO-(ImM)
  • the results were performed in the same manner as in Experimental Example ⁇ 1-1>, and the results are shown in Fig.
  • Fig. 5 shows Reactive Oxygen Species (ROS) or Reactive Nitrogen Species (RNS), respectively. It is an image showing the fluorescence spectrum (fluorescence intensity near 505 n, au) observed when reacting with the compound prepared in Example 1. As shown in FIG. The fluorescence intensity was increased around 505 nm when reacted with only hypochlorous acid (OCr), therefore, the compound based on imidazoline -2-2-ion structure according to the present invention was hypochlorite under neutral conditions. Since the fluorescence spectrum changes in response to (OCr) selectively, it can be usefully used for the detection of occhloric acid (ocr).
  • ROS Reactive Oxygen Species
  • RNS Reactive Nitrogen Species
  • Example 2 The compound prepared in Example 1 instead of using ', in Example 2 Using the compound prepared; Instead of using hypochlorite (OCr) 0-10 ⁇ , except using hypochlorous acid (OCr) 0-50 ⁇ ; The experiment was carried out in the same manner as in Experimental Example ⁇ 1-1>, and the results are shown in FIG. 6.
  • Figure 6 is an image of the change in the fluorescence spectrum when the compound prepared in Example 2 and the hypochlorous acid (OCr, 0-50 ⁇ M) reaction. As shown in FIG. 6, the fluorescence intensity near 450 kHz of the fluorescence spectrum increased as the concentration of the addition of hypochlorous acid (OCr) was increased.
  • FIG. 7 is an image illustrating changes in absorption spectra when the compound prepared in Example 2 and hypochlorous acid (OCr, 30 ⁇ ) reacted. As shown in FIG. 7, as the concentration of the addition of hypochlorous acid (OCr) was increased, the absorption peak intensity near 342 nm of the absorption spectrum was decreased, and the absorption gok remained near 325 nm.
  • FIG. 8 is an image showing a reaction mechanism when the compound prepared in Example 2 and hypochlorous acid (OCr) react. Therefore, the imidazoline- 2-thione structure-based compound according to the present invention reacts with hypochlorite (OCr) in neutral conditions and changes its fluorescence and absorption spectrum, which is useful for detecting hypochlorite (ocr).
  • OCr hypochlorite
  • FIG. 9 is a fluorescence intensity (fluorescence intensity around 450 nm) observed when reacting reactive oxygen species (ROS) or reactive nitrogen species (Reactive Nitrogen Species, RNS) with a compound prepared in Example 2; au).
  • ROS reactive oxygen species
  • RNS reactive nitrogen species
  • the compound prepared in Example 2 was found to increase around 450nm and fluorescence intensity when only reacted with chloric acid (OCr).
  • the imidazoline-2—thione structure-based compound according to the present invention selectively reflects with hypochlorous acid (ocr) under neutral conditions, and thus changes its fluorescence spectrum, which is useful for detecting hypochlorous acid (ocr). Can be used.
  • FIG. 12 is a fluorescence intensity (fluorescence intensity near 493 Hz) observed when reacting reactive oxygen species (R0S) or reactive nitrogen species (Reactive Nitrogen Species, RNS) with a compound prepared in Example 1; au).
  • R0S reactive oxygen species
  • RNS reactive nitrogen species
  • FIG. 12 the compound prepared in Example 1 was found to increase in fluorescence intensity near 493 nm when reacted with only hypochlorous acid (OCr).
  • the imidazoline-2-thine structure-based compound according to the present invention selectively reacts with hypochlorous acid (ocr) under acidic conditions, and thus changes its fluorescence spectrum, and thus is useful for detecting hypochlorous acid (OCr). Can be used.
  • Experimental Example 7 Cytotoxicity Evaluation
  • Hela cells and RAW 264.7 cells were obtained from American Type Culture Collect ion (Manassas, VA) '' 371. 10X culture medium [1% proteose peptone (5% proteose) under 5% C0 2 environment. peptone), 0.2% glucose, 0.1% yeast extract (yeast ext ract), 0.003% Ethylenediaminetetraacet ic acid (EDTA) ferric (f err ic) sodium salt]. Specifically, cells were cultured by scraping and attaching in 6-well plates according to the manufacturer and instructions. ⁇ 7-2> Cytotoxicity Assessment 1
  • Hela cells prepared in Experimental Example ⁇ 7-1> were seeded in 96-well plates in a culture medium. After 24 hours, the compounds prepared in Example 1 were incubated with the cells for 6 hours at concentrations of ⁇ , 5 ⁇ , 10 ⁇ and 20 ⁇ , respectively. After 6 hours, the cells were incubated for 3 hours in a cell culture medium containing 0.5 mg / ml MTT (thiazolyl blue tetrazol ium bromide) and the medium was removed. The resulting formazan was dissolved in 0.1 ml of DMS0 (d imethy 1 su 1 f oxi de), and 0D 650 nm was measured using a Spectramax Mi crowel 1 pi ate reader. The results are shown in FIG.
  • Figure 13 is an image showing the results of evaluating the cytotoxicity of the compound prepared in Example 1 for Hela cells (Hela cells). As shown in FIG. 13, the compound prepared in Example VIII was found to have a significantly low cytotoxicity against HeLa cells in the concentration range of 0-20 ⁇ M. Specifically, even when the compound prepared in Example 1 was treated at a concentration of 20 ⁇ M, the survival rate of Hela cells was found to be 80% or higher, confirming that it is applicable to living cells. ⁇ 7-3> Cytotoxicity Assessment 2
  • FIG. 14 is an image showing the results of evaluating the compound prepared in Example 1 and cytotoxicity on RAW 264.7 cells (macrophage line). As shown in FIG. 14, the compound prepared in Example 1 was found to have a significantly low cytotoxicity against R 264.7 cells (macrophage lines). Specifically, when the compound prepared in Example 1 was treated with 100 ⁇ , the viability of RAW 264.7 cells (macrophage line) was 80% or higher, confirming that it was applicable to living cells.
  • the confocal microscope is a confocal laser scanning biological microscope (Olympus, FV1200, Japan) and a high-resolution STED laser ball.
  • a focusing microscope (super resolution st imulated emission depletion) laser confocal microscopy (Leica TCS SP8, Germany) was used (here: 405I diode laser, luminescence: 490-590nm).
  • FIG. 15 (a) is an image [top: fluorescent channel, lower: differential interference channel] observed when a Hela cell is treated with 10 ⁇ M of the compound prepared in Example 1 in Salsi.
  • FIG. 15 (c) is an image [upper: fluorescent channel, lower: non-interference channel] observed when Hela cells were treated with NaOCl 200 ⁇ M and the compound ⁇ ⁇ prepared in Example 1.
  • FIG. 15 (a) when only the compound ⁇ ⁇ prepared in Example 1 was treated to Hela cell without NaOCl treatment, no fluorescence was observed. On the contrary, as shown in FIGS. 15B and 15C, the fluorescence intensity was increased as the concentration of NaOCl was increased. From this, it can be seen that the compound prepared in Example 1 remains intact in the cytoplasm of Hela cells, and the compound prepared in Example 1 is 3 ⁇ 4 cell (Hela cel l). It can be seen that the ratio of chlorine acid (ratiometric reaction with the change of concentration of OCD) is excellent.
  • Lipopolysaccharide was added to RAW 264.7 cells at 100 ng / ml for 16 hours, interferon ⁇ at 50 ng / ml for 4 hours, and phorbol 12-myristate 13-. acetate, PMA) was treated with 10 nM for 30 minutes to induce endogenous chlorochloric acid (0CD production). Specifically, the chlorine acid (0CD production induction was induced by MI in H 2 0 2 generated in RAW 264.7 cells.
  • lipopolysaccharide LPS was added to RAW 264.7 cells for 16 hours at 100 ng / ml and interferon ⁇ . 50 ng / ml for 4 hours, phorbol 12-myri state 13-acetate (PMA) for 10 minutes with 10 nM for 30 minutes, additionally the ⁇ 0 inhibitory gain 4-ABAH (4-Aminobenzoicacid hydrazide ), FFA (f lufenamic acid) was treated with 50 ⁇ Rl, respectively.
  • PMA phorbol 12-myri state 13-acetate
  • FFA f lufenamic acid
  • FIG. 16 (a) is an image observed when RAW 264.7 cells were treated with 10 ⁇ M of the compound prepared in Example 1 (upper: fluorescent channel, lower: undifferentiated channel).
  • FIG. 16 shows lipopolysaccharide (LPS) in RAW 264.7 cells at 100 ng / ml for 16 hours, interferon at 50 ng / ml for 4 hours, phorbol 12-myristate 13-acetate (phor bo 1 12-myristate 13-acetate (PMA) was treated with 10 nM for 30 minutes to induce endogenous hypochlorous acid (0CD production), the image observed when 10 ⁇ compound prepared in Example 1 [top: fluorescent channel , Lower part: differentiation channel].
  • LPS lipopolysaccharide
  • FIG. 16 shows lipopolysaccharide (LPS) in RAW 264.7 cells at 100 ng / ml for 16 hours, interferon at 50 ng / ml for 4 hours, and phorbol 12-myristate 13-acetate (phorbo 1 12-myristate 13-acetate (PMA) was treated with 10 nM for 30 minutes and additionally treated with MP0 inhibitor 4-ABAH (4-Am i nobenzoic ac id hydrazide) 50 ⁇ M, prepared in Example 1 Images observed when 10 ⁇ M of one compound were treated [top: fluorescent channel, bottom: differential channel].
  • LPS lipopolysaccharide
  • FIG. 16 (d) shows lipopolysaccharide (LPS) in RAW 264.7 cells for 16 hours at 100 ng / ml, interferon- ⁇ at 4 hours, 50 ng / ml, phorbol 12-myristate 13-acetate ( When phorbo 1 12-myristate 13-acetate (PMA) was treated with 10 nM for 30 minutes, additionally treated with 50 ⁇ M of FFA (flufenamic acid), an MP0 inhibitor, and then treated with 10 ⁇ of the compound prepared in Example 1 Observed image [upper: fluorescent channel, lower: differential channel]. As shown in FIG. 16 (a), the compound prepared in Example 1 was prepared without inducing RAW 264.7 cells to generate hypochlorous acid (0C1). Fluorescence was not observed when treated. On the contrary,
  • the compound based on the imidazoline-2-thione structure according to the present invention is maintained in the cell, and since the fluorescence spectrum changes due to selective reaction with exogenous or endogenous chlorine acid (0CD), It can be usefully used for detecting hypochlorous acid (0CD) in cells.
  • TAMs Tumor Associated Macrophages
  • I eu tumorigenesis pro-tumorigenesis
  • anti-known to have antitumor activity anti ⁇ tumor activity.
  • FIG. 17 (a) shows images observed when Hela cells and RAW 264.7 cells were treated with 10 ⁇ of the compound prepared in Example 1.
  • FIG. 17 (b) shows 100 ng / ml of lipopolysaccharide (LPS) in Hela cells and RAW 264.7 cells for 16 hours, 50 ng / ml for interferon-Y for 4 hours. 10 ⁇ M of the compound prepared in Example 1 after inducing endogenous hypochlorous acid (ocr) production by treating phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) with 10 nM for 30 minutes. Image observed when processed [Upper: Fluorescent channel, middle Sub: differential channel, lower channel: fluorescent channel + differential channel.
  • LPS lipopolysaccharide
  • FIG. 17 (c) shows lipopoly saccharide (1 ipopolysacchar ide, LPS) in Hela cells and RAW 264.7 cells for 16 hours lOO ng / ml, interferon for 4 hours 50 ng / ml, Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) was treated with 10 nM for 30 minutes and additionally treated with 50 ⁇ M of 4-ABAH (4-Aminobenzoicacid hydrazide), an MP0 inhibitor. Thereafter, the image observed when the 10 ⁇ M compound prepared in Example 1 was treated [upper: fluorescence channel, middle: differential interference channel, lower: fluorescent channel + differential interference channel].
  • PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate
  • TPM Two-photon microscopy
  • Two-photon fluorescence microscopic images of probe-labeled cells and tissues were obtained using spectral confocal and multiphoton microscopes (Leica TCS SP8 MP) (xiO dry, x40 oil and x 100). oi 1 objectives, numerical aperture (NA): 0.30, 1.30 and 1.30).
  • Mode-locked titanium-sapphire laser source Mai Tai HP; Spectra Physics, 80 MHz pulse frequency, 100 with wavelength of 800 nm and output power of 3110 mW for an average power of approximately 15 mW excitation together with fs pulse width).
  • Lipopolysaccharide was added to RAW 264.7 cells at 100 ng / ml for 16 hours, interferon at 50 ng / ml for 4 hours, phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA) was treated with 10 nM for 30 minutes to induce endogenous hypochlorous acid (0CD production. Specifically, the induction of hypochlorous acid (0CD production was induced by myoperoxy containing H 2 0 2 in RAW 264.7 cells. Hypochlorite Through Catalytic Reaction with Multielastase (myeloperoxidase, MP0) (Converted to OCD.
  • Multielastase myeloperoxidase, MP0
  • Fluorescence images and fluorescence intensities were measured using two-photon fluorescence microscopy. Furthermore, as confirmed in FIG. 3 of Experimental Example 1, after labeling 10 ⁇ of a compound containing fluorescence of imadazolium (Step 2 compound of Example 1) with RAW 264.7 cells pretreated with 200 ⁇ of NaOCl, Using two-photon fluorescence microscopy prepared in Experimental Example ⁇ 10-1> ; Fluorescence images and fluorescence intensities were measured. The results are shown in FIG. 18 (a) is a fluorescence image observed using Two-Photon Fluorescence Microscopy without performing any treatment on RAW 264.7 cells.
  • FIG. 18 (b) shows pretreatment with NaOCl 200 ⁇ M in RAW 264.7 cells for 30 minutes, followed by incubation with 10 ⁇ of the compound prepared in Example 1, followed by two-photon fluorescence microscopy. Fluorescence image observed using.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Figure 18 (d) shows the rappopolysaccharide (1 ipopolysacchar ide, LPS) in RAW 264.7 cells 100 ng / ml for 16 hours, interferon- ⁇ 50 ng / ml for 4 hours, phorbol 12-myristate 13- After treatment with phor bo 1 12-myri state 13—acetate (PMA) for 10 minutes at 10 nM and additionally 50 MP of 4-ABAH (4-Aminobenzoicacid hydrazide), an MP0 inhibitor, 10 ⁇ M of the prepared compound was incubated together and then observed using a two-photon fluorescence microscopy.
  • PMA phorbol 12-myristate 13- After treatment with phor bo 1 12-myri state 13—acetate
  • 4-ABAH 4-ABAH (4-Aminobenzoicacid hydrazide
  • FIG. 18 (f) shows 10 ⁇ of a compound containing imidazolium (the compound of Example 1) representing a fluorescer, and labeled with RAW 264.7 cells pretreated with 200 ⁇ of NaOCl. Fluorescence images were obtained using two-photon fluorescence microscopy (Tw) .
  • FIG. 18G is an image showing graphs in which fluorescence intensities of the groups corresponding to FIGS. 18A to 18F are measured, respectively.
  • FIG. 18 (a) no fluorescence was observed when RAW 264.7 cells were treated with the compound prepared in Example 1 without inducing generation of dental chloric acid (ocr).
  • FIGS. 18 (b) and 18 (c) RAW 264.7 cells were pretreated with 200 ⁇ M of NaOCl for 30 minutes or R 264.7 cells were induced to generate hypochlorite (OCD) and in Example 1 Fluorescence was observed when the prepared compound was treated, indicating that the compound prepared in Example 1 was maintained in a secret form in the cytoplasm of RAW 264.7 cells.
  • OCD hypochlorite
  • FIG. 19 (a) is a fluorescence image of the group not treated with NaOCl 200 ⁇ M RAW 264.7 cells labeled with the compound prepared in Example 1.
  • Figure 19 (b) is a fluorescence image of a group treated with NaOCl 200 ⁇ to RAW 264.7 cells labeled with the compound prepared in Example 1.
  • Figure 19 (c) is a group of untreated NaOCl 200 ⁇ M in RAW 264.7 cells labeled with a compound prepared in Example 1 [Fig. 19 (a)], labeled with a compound fire prepared in Example 1 Group treated with NaOCl 200 ⁇ M in RAW 264.7 cells
  • Figure 20 (b) shows the hypochlorite by pretreatment of ⁇ 10 ng / mL in hippocampal sections
  • FIG. 20 (c) shows the fluorescence of the CA1 portion of the hippocampal section in the hippocampal section of the Example 1 step 2 compound 100 ⁇ M.
  • Fig. 20 (d) shows an image of fluorescence of the CA3 portion of the hippocampal sections observed in the group in which the hippocampus sections were treated with the compound ⁇ prepared in Example 1.
  • Fig. 20 (f) shows the fluorescence of the CA3 portion of the hippocampal sections in the hippocampal sections treated with 100 ⁇ M of Example 1 Step 2 compound.
  • Figure 20 (g) is a bright-field image of the hippocampal sections CA1 and CA3 sections. ⁇ '
  • FIG. 20 (h) is a group in which the compound ⁇ prepared in Example 1 was treated to the hippocampus prepared in Experimental Example ⁇ 12-1> [FIG. 20 (a), FIG. 20 (d)], Experimental Example Compound prepared in Example 1 after induction of chlorine acid ⁇ by pretreatment of ⁇ 10 ng / mL of hippocampus sections prepared in ⁇ 12-1> 20 ⁇ B-treated group [FIG. 20 (b), 20 (e)], Example 1 step 2 compound 100 ⁇ treated group in the hippocampus sections prepared in Experimental Example ⁇ 12-1> [Fig. c) and Fig. 20 (f)] are images showing graphs in which the fluorescence intensities are measured, respectively.
  • the compound of the imidazoline-2-thione structure-carrying compound according to the present invention is maintained in the cell and selectively reacts with the exogenous or endogenous chlorine acid (ocr) to change the fluorescence spectrum, thereby causing the tooth in the cell. It can be usefully used for the purpose of detecting chloric acid (0c ).

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Abstract

본 발명은 치아염소산을 선택적으로 검출하기 위한 이미다졸린-2-티온 구조 기반의 프로브에 관한 것으로， 본 발명에 따른 이미다졸린 -2-티온 구조 기반의 화합물은 세포 내 환경에서도 그 구조가 유지되며, 외인성 또는 내인성 치아염소산 (OC1-)과 선택적으로 반응하여 형광 또는 흡광 스펙트럼이 변화하므로， 세포 내에서 치아염소산 (OC1-)을 검출하는 용도로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

【명세서 ]
【발명의 명칭】
치아염소산을 선택적으로 검출하기 위한 이미다졸린 -2-티은 구조 기반의 프로브
【기술분야】
본 발명은 치마염소산을 선택적으로 검출하기 위한 이미다졸린ᅳ 2-티은 구조 기반의 프로브에 관한 것이다. 【배경기술】
활성산소종 (Reactive Oxygen Species, R0S)과 활성질소종 (React ive Nitrogen Species, RNS)은 생리학 (physiology)과 병리학 (pathology)에서 매우 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다 (J. D. Lambeth, Free. Radic. Biol. Med. 2007， 43, 332-347.). 일례로， 뇌는 상기 R0S의 과형성과 산화 방지제로 인하여 제공되는 상기 R0S 과형성에 대웅하는 방어 사이에 균형이 무너질 때 잔여 신진대사 에너 지의 약 20%를 소비하며 산화 스트레스 (oxidative stress) 상태에 놓 이게 된다. 상기 R0S 종류들 중， 주요한 구성요소인 치아염소산 (OCr)은 면 역세포 (i画 unocytes)에서 H202와 C1—의 미엘로퍼옥시다제
(myeloperoxidase, MP0) 촉매반웅으로 인하여 주로 생산되며 (N. M. Domigan , T.. S. Char 1 ton, M. W . Duncan , C . C . Winterbourn, A. J. J Kettle, Biol. Chem. 1995, 270, 16542-16548. ) , 침입한 세균을 조절 하는데 주요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다 (S. L. Hazen, F. F. Hsu, K. Duff in, J. W. Heinecke, J. Biol. Chem. 1996, 271, 23080-23088. ) . 또한， 치아염소산 (OCr)은 다양한 생체 분자 (biomolecule)에 대 하여 재빠르게 반웅하는 것으로 알려져 있다 (A. rasowska, G. ff. Konat , Brain Res. 2004, 997, 176-184. ) . 이에， 과량의 치아염소산 (0C1— )이 생산되는 경우， 세포와 주변 조직에 손상을 유발할 수 있기 때문에 , 결과적으로 심혈관계 질환， 염증성 질환, 신경 질환 등의 다 양한 장애와 관련지을 수 있다. 즉， 치아염소산 (ocr)의 생리적 및 병 리학적인 역할을 이해하기 위해서는 세포， 조직， 유기체 수준에서 치 아염소산 (ocr)의 위치와 존재 여부를 관찰하고 검출하는 것이 중요하 다. 검출 연구 (imaging study)에서 저 분자 형광 프로브는 이의 낮 은 입체장애， 빠른 라벨 (labeling) 속도, 용이하게 조작 가능한 특성 으로 인하여 유용하게 사용될 수 있다. 구체적으로 , H202, NO, 0N00—， Q>2, · o2, ocr를 검출하기 위한 형광 프로브가 개발되고 있다. 하지만， 상기 프로브들은 UV 내지 가시 범위에서 짧은 여기 파장으로 인하여 얕은 조직투과깊이 (shal low tissue penetration depths) , 자가 형광 (autof luorescence) 및 인공 R0S 발생 (artificial R0S generation)이 나타나는 문제점이 있다. 한편， 두 깨의 근 적외선 (Near-IR)과 저 에너지 광자 (low energy photons)를 여기 원 (excitation source)으로써 사용하는 이一광 자 현미경 (Two-Photon Microscopyᅳ TPM)은 살아있는 세포나 조직에서 치아염소산 (ocr)을 검출하기 위한 용도로 유용하게 사용된다. 일- 자 현미경 (One-Photon Microscopy)과 비교하여， TPM은 더 깊은 조직 과깊이 (>500 μ ηι), 우수한 공간 해상도 (spatial resolution) , 낮은 독성 (phototoxicity) 등 우수한 특성을 갖는다. 하지만, 살아있는 포 및 조직에서 생산되는 내인성 치아염소산 (OCr)을 직접적으로 검 하기 위한, TPM 기반 프로브는 알려진 바가 없다. 이에， 본 발명자들은 치아염소산 (ocr)을 선택적으로 검출하기 위한 프로브를 개발하기 위하여 연구하던 중， 본 발명에 따 이미다졸린 -2-티온 구조 기반의 프로브가 세포 내 다양한 활성 산소 중에서 치아염소산 (ocr)과 선택적으로 반응하여 형광 또는 흡투출광세광른본종수 스펙트럼 변화가 유도되어 용이하게 검출이 가능함을 확인하고 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명 ]
[기술적 과제】
본 발명의 목적은 치아염소산을 선택적으로 검출하기 위한 이미 다졸린 -2-티은 구조 기반의 화합물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 화합물의 제조방법을 제공하는 것 이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 치아염소산
(0CD 검출용 화학센서를 쩨공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 화학센서를 이용한 치아염소산 (0C1 검출방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 하기 화학식 1로 표入' 되는 화합물을 제공한다.
Figure imgf000004_0001
상기 화학식 1에서，
R1 및 R2는 독립적으로 -H, -0H, 할로겐， 10의 직쇄 또는 측쇄 알킬 , (^ᅳ10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시 또는 — (CH2)nR5이고，
여기서， 상기 R5는 N, 0 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되 는 해테로 원자를 하나 이상 포함하는 5-10원자의 해테로고리이고， n 은 1ᅳ 10의 정수이고; 3 및 R4는 독립적으로 -0H, 할로겐， - 의 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 d-10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이고;
여기서， 상기 R3 및 R4는 이들이 연결된 원자들과 함께 <：6-10의 아릴올 형성할 수 있고 ;
E 및 Q는 독립적으로 C 또는 N이다 또한， 본 발명은 하기 반웅식 1에 나타난 바와 같이，
화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반웅시켜， 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계 (단계 1); 상기 단계 1에서 제조한 화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜， 화학삭 6으로 표시되는 화합물을 제 조하는 단계 (단계 2); 및
상기 단계 2에서 제조한 화학식 6으로 표시되는 화합물에 황 (sulfur)을 첨가하고 반웅시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하 는 단계 (단계 3) ;를 포함하는 상기 화학삭 1로 표시되는 화합물의 제 조방법을 제공한다.
[반웅식 1]
Figure imgf000005_0001
B계' 3
Figure imgf000005_0002
상기 반응식 1에 있어서，
R1, R2, R3, R4, E 및 Q는 독립적으로 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같고;
X는 할로겐이다. 나아가， 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 치아염소산 (ocr) 검출용 화학센서를 제공한다. 또한， 본 발명은 상기 화학센서를 이용한 치아염소산 (0C1— )의 검출방법을 제공한다.
【유리한 효과]
본 발명에 따른 이미다졸린 -2-티온 구조 기반의 화합물은 세포 내 환경에서도 그 구조가 유지되며 , 외인성 또는 내인성 치아염소산 (ocr)과 선택적으로 반응하여 형광 또는 흡광 스펙트럼이 변화하므로 세포 내에서 치아염소산 (ocr)을 검출하는 용도로 유용하게 사용할 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (0C1 0- 10μ Μ)이 반웅할 때 형광 스펙트럼의 변화를 관찰한 이미지이다.
도 2는 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (0C1 0- 30μ Μ)이 반웅할 때 흡수 스펙트럼의 변화를 관찰한 이미지이다.
도 3은 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (OCr)이 반응 할 때 반응 메커니즘을 나타내는 이미지이다.
도 4는 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (OCr, Ομ Μ, 5μ Μ, ΙΟμ Μ, 15μΜ)을 반웅시킬 때 시간에 따른 형광 스펙트럼의 변 '화를 관찰한 이미지이다 도 5는 활성산소종 (React ive Oxygen Species, ROS) 또는 활성질 소종 (React ive Nitrogen Species, RNS)을 각각 실시예 1에서 제조한 화합물과 반웅시켰을 때 관찰되는 형광 스펙트럼 (505nm 부근의 형광강 도， a.u.)올 나타내는 이미지이다.
6은 실시예 2에서 제조한 화합물과 치아염소산 (ocr 0-
50 μ Μ)이 반웅할 때 형광 스펙트럼의 변화를 관찰한 이미지이다.
도 7은 실시예 2에서 제조한 화합물과 치아염소산 (0C1 0-
30 μ Μ)이 반웅할 때 흡수 스펙트럼의 변화를 관찰한 이미지이다.
도 8은 실시예 2에서 제조한 화합물과 치아염소산 (OCDo 반응 할 때 반응 메커니즘을 나타내는 이미지이다.
도 9는 활성산소종 (Reactive Oxygen Species, R0S) 또는 활성질 소종 (Reactive Nitrogen Species, RNS)을 각각 실시예 2에서 제조한 화합물과 반웅시켰을 때 관찰되는 형광 스펙트럼 (450nm 부근의 형광강 도， a.u.)을 나타내는 이미지이다.
도 10은 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (0C1 0- 50μΜ)이 반웅할 때 형광 스펙트럼의 변화를 관찰한 이미지이다.
도 11은 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (QC1 0- ΙΟΟμΜ)이 반웅할 때 흡수 스펙트럼의 변화를 관찰한 이미지이다. 도 12는 활성산소종 (React ive Oxygen Species, ROS) 또는 활성 질소종 (Reactive Nitrogen Species, RNS)을 각각 실시예 1에서 제조한 화합물과 반웅시켰을 때 관찰되는 형광 스펙트럼 (493nm 부근의 형광강 도, a.u 을 나타내는 이미지이다.
도 13은 헬라 세포 (Hel a cell)에 대한 실시예 1에서 제조한 화 합물의 세포독성을 평가한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 14는 RAW 264.7 세포 (대식세포주)에 대한 실시예 1에서 제조 한 화합물의 세포 독성을 평가한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 15(a)는 헬라 세포 (Hela cell)^ 실시예 1에서 제조한 화합 물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널， 하부:미분 간섭 채널]이다:
도 15(b)는 헬라 세포 (Hela cell)에 NaOCl 100 μ Μ 및 실시예 1 에서 제조한 화합물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널 하부 :미분간섭 채널]이다.
도 15(c)는 헬라 세포 (He la cell)에 NaOCl 200 μ Μ 및 실시예 1 에서 제조한 화합물 ΙΟμΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널 하부 :미분간섭 채널]이다.
도 16(a)는 R 264.7 세포에 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널 , 하부 :미분간섭 채널]이다.
도 16(b)는 RAW 264.7 세포에 리포폴리사카라이드 (1 ipopolysacchar ide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml , 인터페론 를 4시간 동안 50 ng/ml , 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phor bo 1 12-myristate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하여 내인성 치아염소산 (ocr) 생성을 유도한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 10μ Μ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널， 하부 :미분간섭 채널]이다.
도 16(c)는 讀 264.7 세포에 리포폴라사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml, 인터페론 -γ를 4시간 동안 50 ng/ml , 포르불 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phor bo 1 12-myristate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하고， 추가적 으로 MP0 억제제인 4-ABAH(4-Aminobenzoicacid hydrazide) 50 μ M을 처 리한 후, 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ올 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널， 하부:미분간섭 채널]이다.
도 16(d)는 RAW 264.7 세포에 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml， 인터페론 - γ를 4시간 동안 50 ng/ml , 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phorbo 1 12-myristate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하고， 추가적 으로 MP0 억제제인 FFA(flufenamic acid) 50 μΜ을 처리한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널， 하부:미분간섭 채널]이다.
도 17(a)는 헬라 세포 (Hela cell) 및 RAW 264.7 세포에 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널， 중부 :미분간섭 채널 , 하부：형광 채널+미분간섭 채널]이다.
도 17(b)는 헬라 세포 (Hela cell) 및 R 264.7 세포에 리포폴 리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml, 인 터페론 를 4사간 동안 50 ng/ml , 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테 이트 (phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리 하여 내인성 치아염소산 (ocr) 생성을 유도한 후， 실시예 1에서 제조 한 화합물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널， 중 부:미분간섭 채널， 하부:형광 채널+미분간섭 채널]이다.
도 17(c)는 헬라 세포 (Hela cell) 및 RAW 264.7 세포에 리포폴 리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml , 인 터페론 - γ를 4시간 동안 50 ng/ml， 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테 이트 (phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리 하고, 추가적으로 MP0 억제제인 4-ABAH(4-Aminobenzoicacid hydrazide) 50 μ M올 처리한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 ΙΟμΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널 , 중부:미분간섭 채널， 하부:형광 채널+미분간섭 채널]이다.
도 17(d)는 헬라 세포 (He la cell) 및 RAW 264.7 세포에 리포폴 리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml, 인 터페론 를 4시간 동안 50 ng/ml , 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테 이트 (phorbol 12-myr istate 13— acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리 하고, 추가적으로 MP0 억제제인 FFA(f lufenamic acid) 50 μ M을 처리한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미 지 [,상부:형광 채널， 중부:미분간섭 채널 하부:형광 채널 +미분간섭 채 널]이다.
도 18(a)는 RAW 264.7 세포에 어떤 처리도 수행하지 않고 이-광 자 형광 현미경 (Tw으 Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하여 관 찰한 형광 이미지이다.
도 18(b)는 RAW 264.7 세포에 NaOCl 200 μ M을 30분 동안 전처리 하고， 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ을 함께 쎄양한 후， 이 -광자 형광 현미경 (Two一 Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하여 관찰한 형광 이미자이다.
도 18(c)는 RAW 264.7 세포에 라포폴리사카라이드 ( 1 ipopolysacchar ide, LPS)를 16시챤 동안 100 ng/ml , 인터페론 를 4시간 동안 50 ng/ml, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phorbol 12-myr istate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하여 내인성 치아염소산 (0CD 생성을 유도한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ을 함께 배양한 후， 이 -광자 형광 현미경 (Two-Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 18(d)는 RAW 264.7 세포에 리포폴리사카라이드 (1 ipopolysacchar ide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml , 인터페론 -γ를 4시간 동안 50 ng/ml, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phorbo 1 12-myr istate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하고, 추가적 으로 MP0 억,제제인 4-ABAH(4-Aminobenzoicacid hydrazide) 50 μ M을 처 리한 후， 질시예 1에서 제조한 화합물 10 μ M을 함께 배양한 후， 이 -광 자 형광 현미경 (Two-Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하여 관 찰한 형광 이미지이다.
도 18(e)는 RAW 264.7 세포에 리포폴리사카라이드 (1 ipopolysacchar ide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml , 인터페론 -γ를 4시간 동안 50 ng/ml, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phorbo 1 12-myr istate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하고, 추가적 으로 MPO 억제제인 FFA(f lufenamic acid) 50 μΜ을 처리한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 10 μ Μ을 함께 배양한 후， 이 -광자 형광 현미경 (Two-Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하여 '관찰한 형광 이미 지이다 .
도 18(f)는 형광을 나타내는 이미다졸리움을 포함하는 화합물
(실사예 1의 단계 2 화합물 ) ΙΟμΜ을 , NaOCl 200 μ M로 전처리한 RAW 264.7 세포에 라벨한 후， 실험예 10-1에서 준비한 이 -광자 형광 현미 경 (Two一 Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하여 형광 이미지이다. 도 18(g)는 상기 도 18(a-f)에 해당하는 군의 형광 강도를 각각 측정한 그래프를 나타내는 이미지이다.
도 19(a)는 실시예 1에서 제조한 화합물이 라벨된 RAW 264.7 세 포에 NaOCl 200 μΜ을 처리하지 않은 군의 형광 이미지이다.
도 19(b)는 실시예 1에서 제조한 화합물이 라벨된 RAW 264.7 세 포에 NaOCl 200 μΜ을 처리한 군의 형광 이미지이다.
도 19(c)는 실사예 1에서 제조한 화합물이 라벨된 RAW 264.7 세 포에 Na0C1 20( iM을 처리하지 않은 군 [도 19(a)], 실시예 1에서 제조 한 화합물이 라벨된 R 264.7 세포에 NaOCl 200 μΜ를 처리한 군 [도 19(b)]에 대하여 TPEF Tw으 Photon-Excited Fluorescence)의 변화를 관 찰한 이미지이다.
도 20(a)는 해마 절편에 실시예 1에서 제조한 화합물 ΙΟΟμΜ을 처리한 군에 있어서 , 상기 해마 절편의 CA1 부분의 형광을 관찰한 이 .미지이다 ·
도 20(b)는 해마 절편에 ΡΜΑ 10 ng/mL를 전처리하여 치아염소산 (OCT) 발생을 유도한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 100 μΜ을 처리 한 군에 있어서， 상기 해마 절편의 CA1 부분의 형광을 관찰한 이미지 이다.
도 20(c)는 해마 절편에 실시예 1 단계 2 화합물 ΙΟΟμΜ을 처리 한 군에 있어서 , 상기 해마 절편의 CA1 부분의 형광을 관찰한 이미지 이다.
도 20(d)는 해마 절편에 실시예 1에서 제조한 화합물 ΙΟΟμΜ을 처리한 군에 있어서， 상기 해마 절편의 CA3 부분의 형광을.관찰한 이 미지이다. '
도 .20(e)는 해마 절편에 ΡΜΑ 10 ng/mL를 전처리하여 치아염소산 (OCT) 발생을 유도한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 ΙΟΟμΜ을 처리 한 군에 있어서， 상기 해마 절편의 CA3 부분의 형광을 관찰한 이미지 이다.
도 20(f )는 해마 절편에 실시예 1 단계 2 화합물 100 μΜ을 처리 한 군에 있어서， 상기 해마 절편의 CA3 부분의 형광을 관찰한 이미지 이다.
도 20(g)는 해마 절편 CA1 및 CA3 부분의 명시야 (bright-field) 이미지이다ᅳ
도 20(h)는 실험은 실험예 12-1에서 준비한 해마 절편에 실시예 1에서 제조한 화합물 100 μΜ을 처리한 군 [도 20(a), 도 20(d)], 실험 예 12-1에서 준비한 해마 절편에 ΡΜΑ 10 ng/mL를 전처리하여 치아염소 산 (0CD 발생을 유도한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 ΙΟΟμΜ을 처 리한 군 [도 20(b), 도 20(e)], 상기 실험예 12-1에서 준비한 해마 절 편에 실시예 1 단계 2 화합물 ΙΟΟμΜ을 처리한 군 [도 20(c), 도 20(f)]의 형광 강도를 각각 측정한 그래프를 나타내는 이미지이다. 명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다 .
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다
Figure imgf000010_0001
상기 화학식 1에서，
R1 및 R2는 독립적으로 -0H, 할로겐， d-u^ 직쇄 또는 측쇄
(：1-10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시 또는 -(CH2)nR5이 고ᅳ
여기서， 상기 R5는 N, 0 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되 는 헤테로 원자를 하나 이상 포함하는 5-10원자의 헤테로고리이고， n 은 1-10의 정수이고; ' R3 및 R4는 독립적으로 -H, -0H, 할로겐 , ( -^의 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이고;
여기서， 상기 R'3 및 R4는 이들이 연결된 원자들과 함께 C6-10의 아릴을 형성할 수 있고;
E 및 Q는 독립적으로 C 또는 N이다 바람직하게는，
R1 및 R2는 독립적으로 Cwo의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고 R3 및 R4는 독립적으로 수소이고;
여기서， 상기 R3 및 R4는 이들이 연결된 원자들과 함께 C6— 10의 아릴을 형성할 수 있고; E 및 Q는 독립적으 C 또는 N이다. 더욱 바람직하게는，
R1 및 R2는 독립적으로 메틸이고; R3 및 R4는 독립적으로 수소이고;
여기서， 상기 R3 및 R4는 이들이 연결된 원자들과 함께 페닐을 형성할 수 있고;
E 및■ Q는 독립적으로 C 또는 N이다.
~
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 바람직한 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다.
(1) 1,3-디메틸 -1H-이미다조 [4,5-b]페나진 -2(3H)-티온
(2) 1，3-디메틸 -1H-나프토 [2,3-d]이미다졸 -2(3H)-티온 상기 화합물은 세포 내 존재하는 0NO0—， · NO, · 02, H202, OCT, • OH, t-BuOO - 등의 활성 산소들 중， 오직 외인성 또는 내인성 치아 염소산 (ocr)만을 선택적으로 검출하가 위한 용도로 사용할 수 있다. 또한， 본 발명은 하기 반웅식 1에 나타난 바와 같이，
화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반웅시켜， 화학식 4로 표시되는 화합물올 제조하는 단계 (단계 1); 상기 단계 1에서 제조한 화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜， 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제 조하는 단계 (단계 2); 및
상기 단계 2에서 제조한 화학식 6으로 표시되는 화합물에 황 (sulfur)을 첨가하고 반웅시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하 는 단계 (단계 3);를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제 조방법올 제 Ϋ한다 .
[반응식 1]
Figure imgf000012_0001
&계 3
Figure imgf000012_0002
상기 반웅식 1에 있어서，
R1, R2, R3, R4, E 및 Q는 독립적으로 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같고;
X는 할로겐이다. . 이하， 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법 을 단계별로 상세히 설명한다 . 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 있 서， 상기 단계 1은 화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표 되는 화합물을 반웅시켜， 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 계이며 보다 구체적으로는 용매에 용해된 화학식 2로 표시되는 화 물에 광유 (mineral oil)를 첨가 교반한 후， 화학식 3으로 표시되는 합물을 첨가하고 추가로 교반하여 화학식 4로 표시되는 화합물을 제 조어시단합화 하는 단계이다.
이때 , 상기 반웅 용매로는 테트라하이드로퓨란; 다이옥산; 에틸 에테르， 1， 2-다이메톡시에탄 등올 포함하는 에테르용매 ; 메탄을， 에탄 을, 프로판을 및 부탄올을 포함하는 저급 알코올; 디메틸포름아미드 (DMF) , 디메틸설폭사이드 (DMS0)， 디클로로메탄 (DCM) , 디클로로에탄， 물， 아세토나이트릴 아세토나젠설포네이트， 를루엔설포네이트, 클로 로벤젠설포네이트， 크실렌설포네이트， 페닐아세테이트, 페닐프로피오 네이트， 페닐부티레이트， 시크레이트， 락테이트， β -하이드록시부티레 이트， 글리콜레이트， 말레아트， 타트레이트， 메탄설포네이트， 프로판 설포네이트, 나프탈렌 -1-설포네이트， 나프탈렌 -2-설포네이트， 만델레 이트 등을 사용할 수 있으며 , 테트라하이드로퓨란을 사용하는 것이 바 람직하다 .
또한， 상기 광유 (mineral oil)는 NaH를 사용하는 것이 바람직하 다. 나아가， 반웅온도는 . o°c에서 용매의 비등점 사이에서 수행하는 것이 바람직하고ᅳ 반웅시간은 특별한 제약은 없으나， 0.5-10시간 동안 반웅하는 것이 바람직하다 . 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 있어 서， 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 제조한 화학식 4로 표시되는 화합 물과 화학식 5로 표사되는 화합물을 반응시켜， 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계이다.
이때， 상기 반응온도는 0°C에서 용매의 비등점 사이에서 수행하 는 것이 바람직하고， 반옹시간은 특별한 제약은 없으나， 0.5-10시간 동안 반웅하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 있어 서， 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 제조한 화학식 6으로 표시되는 화 합물에 황 (sulfur)을 첨가하고 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물 을 제조하는 단계이며， 보다 구체적으로는 용매에 화학식 6으로 표시 되는 화합물 , 황 (sulfur) 및 염기를 첨가하고 교반하여 화학식 1로 표 시되는 화합물을 제조하는 단계이다.
이때， 상기 반웅 용매로는 테트라하이드로퓨란; 다이옥산; 에틸 에테르， 1,2-다이메톡시에탄 등을 포함하는 에테르용매 ; 메탄올， 에탄 을， 프로판올 및 부탄을을 포함하는 저급 알코올 ; 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸설폭사이드 (DMS0), 디클로로메탄 (DCM), 디클로로에탄， 물， 아세토나이트릴， 아세토나젠설포네이트, 를루엔설포네이트， 클로 로벤젠설포네이트， 크실렌설포네이트， 페닐아세테아트， 페닐프로피오 네이트， 페닐부티레이 ， 시크레이트， 락테이트， β -하이드록사부티레 이트， 글리콜레이트， 말레이트， 타트레이트， 메탄설포네이트， 프로판 설포네이트， 나프탈렌 -1-설포네이트， 나프탈렌 -2ᅳ설포네이트， 만델레 이트 등을 사용할 수 있으며， 무수 메탄올을 사용하는 것이 바람직하 다- 또한， 상기 염기로는 포타슘 tert-부록사이드, 포타슴하이드록 사이드， 소듐하이드록사이드, 리튬하이드록사이드 등을 사용할 수 있 으며， 포타슘 tert-부톡사이드를 사용하는 것이 바람직하다 .
나아가， 이때， 상기 반응온도는 ( C에서 용매의 비등점 사이에 서 수행하는 것이 바람직하고， 반웅시간은 특별한 제약은 없으나， 0.5-10시간 동안 반웅하는 것이 바람직하다. 또한， 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 치아염소산 (ocr) 검출용 화학센서를 제공한다. 여기서， 상기 화학센 서는 생체시료 중에서 치아염소산 (ocr)을 검출하는 것을 특징으로 한
나아가， 본 발명은 시료에 상기 화학센서를 첨가하는 단계 (단계 상기 단계 1에서 준비한 시료에 광원을 조사하는 단계 (단계 2); 형광 또는 흡광 특징의 변화를 단독으로 또는 혼합하여 측정하 단계 (단계 3);를 포함하는 치아염소산 (0C1— )의 검출방법을 제공한
이하， 본 발명에 따른 치아염소산 (ocr)의 검출방법을 단계별로 상세히 설명한다. 본 발명에 따른 치아염소산 (ocr)의 검출방법에 있어서， 상기 단계 1은 시료에 상기 화학센서를 첨가하는 단계아다 여기서， 상기 시료는 생체시료인 것이 바람직하고， 헬라 세포 (He la cell) 및 RAW 264.7 세포인 것이 가장 바람직하다. 본 발명에 따른 치아염소산 (ocr)의 검출방법에 있어서， 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 준비한 시료에 광원을 조사하는 단계이다. 여기서 , 상기 광원은 형광 분광광도계 또는 UV 흡수 분광법을 사용하 여 조사하는 것이 바람직하다 . 본 발명에 따른 치아염소산 (ocr)의 검출방법에 있어서， 상기 단계 3은 형광 또는 흡광 특징의 변화를 단독으로 또는 흔합하여 측정 하는 단계이다. 즉 , 구체적으로 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 5 각형 고리에 결합돠어 있는 황 (sulfur) 원자가 치아염소산 (OCr)과 반 웅함으로써 산화되어 떨어져 나가， 양전하를 띄는 이미다졸리움이 생 성됨으로써 발생하는 JI -공액계 (JI -conjugation system) 변화에 기인 하는 형광 또는 흡광 특징의 변화를 단독으로 또는 흔합함으로써 치아 염소산 (ocr)을 검출할 수 있다 본 발명에 따른 이미다졸린 -2-티온 구조 기반의 화합물은 세포 내 환경에서도 그 구조가 유지되며 , 꾀인성 또는 내인성 치아염소산 (ocr)과 선택적으로 반응하여 형광 또는 흡광 스펙트럼이 변화할 것 이라 예상되었으며， 이를 증명하기 위하여 하기 일련의 실험을 수행하 였다. 먼저 , 중성 환경에서 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (ocr)이 반응할 때 형광 스펙트럼의 변화를 관찰하기 위하여 실험을 수행한 결과， 치아염소산 (ocr)의 첨가 농도를 증가시킬수록 형광 스 펙트럼의 505nm 부근의 형광 강도가 증가하는 ¾으로 나타났다 (실험예 <1-1>의 도 1 참조 ) . 또한, 중성 환경에서 PBS(50 mM, pH 7.4)에 용해된 실시예 1 서 제조한 화합물 (2μ Μ)과 치아염소산 (OCr)이 반응하여 증가된 형 강도가 시간에 따라 안정하게 유지되는지 평가하기 위하여 실험을 행한 결과， 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (ocr)이 반응 여 증가된 505nm 부근와 형광 강도는 2.5시간 동안 안정하게 유지되 것으로 나타났으며， 실시예 1에서 제조한 화합물의 치아염소산 (ocr) 에 대한 검출하한 (lower limit of detect ion) 농도값이 0.071μ Μ이라 는 것을 확인하였다 (실험예 <1— 1>의 도 4 참조). ' 나아가ᅳ 증성 환경에서 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소 산 (OCr)이 반웅할 때 흡수 스펙트럼의 변화를 관찰하기 위하여 실험 을 수행한 결과， 치아염소산 (ocr)와 첨가 농도를 증가시킬수록 흡수 스펙트럼의 420nm 부근의 흡수 피크 강도가 감소하고， 378nm 부근의 흡수 피크 강도가 증가하는 것으로 나타났다 (실험예 <1-2>의 도 2 참 조). , 수는에광하 또한， 중성 환경에서 형광 스펙트럼 변화를 통해 치아염소산
(ocr)에 대하여， 실시예 1에서 제조한 화합물의 선택성을 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과， 실시예 1에서 제조한 화합물은 오직 치아 염소산 (OCr)과 반응하였을 때 505nm 부근의 형광강도가 증가하는 것 으로 확인되었다 (실험예 2의 도 5 참조). 나아가， 중성 환경에서 실시예 2에서 제조한 화합물과 치아염소 산 (ocr)이 반웅할 때 형광 스펙트럼의 변화를 관찰하기 위하여 실험 을 수행한 결과, 치아염소산 (ocr)의 첨가 농도를 증가시킬수록 형광 스펙트럼의 450nm 부근의 형광 강도가 증가하는 것으로 나타났다 (실험 예 <3-1>의 도 6 참조). 또한， 중성 환경에서 실시예 2에서 제조한 화합물과 치아염소산 (ocr)이 반응할 때 흡수 스펙트럼의 변화를 관찰하기 위하여 실험을 수행한 결과， 치아염소산 (0C1— )의 첨가 농도를 증가시킬수록 흡수 스 펙트럼의 342nm 부근의 흡수 피크 강도가 감소하고， 325nm 부근의 흡 수 피크 강도가 증가하는 것으로 나타났다 (실험예 <3-2>의 도 7 참조). 나아가， 중성 환경에서 형광 스펙트럼 변화를 통해 치아염소산 (OCr)에 대하여， 실시예 2에서 제조한 화합물의 선택성을 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과， 실시예 2에서 제조한 화합물은 오직 치아 염소산 (OCr)과 반응하였을 때 450nm 부근의 형광강도가 증가하는 것 으로 확인되었다 (실험예 4의 도 9 참조). 또한, 산성 환경에서 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (ocr)이 반웅할 때 형광 스펙트럼의 변화를 관찰하기 위하여 실험을 수행한 결과， 차아염소산 (OCr)와 첨가 농도를 증가시킬수록 형광 스 꿰트럼의 493nm 부근의 형광 강도가 증가하는 것으로 나타났다 (실험예 <5-1>의 도 10 참조 ) . 나아가， 산성 환경에서 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소 산 (OCr)이 반웅할 때 흡수 스펙트럼의 변화를 관찰하기 위하여 실험 을 수행한 결과， 치아염소산 (0C1— )의 첨가 농도를 증가시킬수록 흡수 스펙트럼의 425nm 부근의 흡수 피크 강도가 감소하고， 376nm 부근의 흡수 피크 강도가 증가하는 것으로 나타났다 (실험예 <5-2>의 도 11 참 조 )· 또한， 산성 환경에서 형광 스펙트럼 변화를 통해 치아염소산 (0C1— )에 대하여， 실시예 1에서 제조한 화합물의 선택성올 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 실시예 1에서 제조한 화합물은 오직 치아 염소산 (OCr)과 반웅하였을 때 493nm 부근의 형광강도가 증가하는 것 으로 확인되었다 (실험예 6의 도 12 참조). 나아가， 실시예 1에서 제조한 화합물의 헬라 세포 (Hela cell)에 대한 세포독성을 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과， 실시예 1에서 제조한 화합물은 0-20μΜ 농도 범위에서 헬라 세포 (Hela cell)에 대한 세포 독성이 현저히 낮은 것으로 나타났다. 구체적으로， 실시예 1에서 제조한 화합물을 20μΜ 농도로 처리한 경우에도 헬라 세포 (Hela cell) 의 생존도가 80% 이상인 것으로 나타나 살아있는 세포에 적용 가능함 을 확인하였다 (실험예 <그2>의 도 13 참조) 또한, 실시예 1에서 제조한 화합물의 RAW 264.7 세포 (대식세포 주)에 대한 세포독성을 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과， 실시예 1에서 제조한 화합물은 RAW 264.7 세포 (대식세포주 )에 대한 세포 독성 이 현저히 낮은 것으로 나타났다. 구체작으로， 셜시예 1에서 제조한 화합물을 100 μΜ로 처리한 경우 RAW 264.7 세포 (대식세포주)의 생존도 가 80% 이상인 것으로 나타나 살아있는 세포에 적용 가능함을 확인하 였다 (실험예 <7-3>의 도 14 참조). 나아가， 헬라 세포 (Hela eel 1) 내 외인성 치아염소산 (0CD에 대하여， 실시예 1에서 제조한 화합물의 검출능력의 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과， 도 15(a)에 나타난 바와 같이， NaOCl을 처리하지 않고 헬라 세포 (Hela cell)에 실시예 1에서 제조한 화합물 10y M만을 처리한 경우 형광이 관찰되지 않는 것으로 나타났다. 이에 반하여， 도 15(b) 및 도 15(c)에 나타난 바와 같이 , NaOCl의 첨가 농도를 증가시 킬수록 형광 강도가 증가하는 것으로 나타났다. 이로부터， 실시예 1에 서 제조한 화합물이 헬라 세포 (Hela cell)의 세포질 내에 온전한 형태 로 유지되는 것을 알 수 있을 뿐만 아니라， 실시예 1에서 제조한 화합 물이 헬라 세포 (Hela cell) 내에서 치아염소산 (0C1— )의 농도 변화에 따른 비율계량적인 (ratiometric) 반응이 우수하다는 것을 확인할 수 있다 (실험예 <8-1>의 도 15 참조). 또한， RAW 264.7 세포 (대식세포주) 내 내인성 치아염소산 (OCD 에 대하여， 실시예 1에서 제조한 화합물의 검출능력의 평가하기 위하 여 실험을 수행한 결과, 도 16(a)에 나타난 바와 같이 , RAW 264.7 세 포가 치아염소산 (OCD올 발생시키도록 유도하지 않고 실시예 1에서 제조한 화합물을 처리한 경우 형광이 관찰되지 않는 것으로 나타났다. 이에 반하여， 도 16(b)에 나타난 바와 같이 , RAW 264.7 세포가 치아염 소산 (OCD을 발생시키도록 유도하고 실시예 1에서 제조한 화합물을 처리한 경우 형광이 관찰되었다. 이로부터， 실시예 1에서 제조한 화합 물이 RAW 264.7 세포의 세포질 내에 은전한 형태로 유지되는 것을 알 수 있다. 또한， 도 16(c) 및 도 16(d)에 나타난 바와 같이 , MP0 억제제를 추가로 첨가한 경우 형광이 현저히 감소한 것으로 나타났다. 이로부터， 치아염소산 (0CD 생성 유도는 PMA로 인하여 발생하는 H202가 RAW 264.7 세포 내 존재하는 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase, MPO)에 의한 촉매반웅을 통해 치아염소산 (ocr)으로 전환됨을 다시 확인하였 다 (실험예 <8-2>의 도 16 참조). 나아가， 헬라 세포 (Hela cell) 및 RAW 264.7 세포를 공생 -배양
(co-culture)하며， 내인성 치아염소산 (OCD에 대하여 실시예 1에서 제조한 화합물의 검출능력의 평가하기 위하여 실함을 수행한 결과， 도 17(a)에 나타난 바와 같이， 헬라 세포 (Hela cell) 및 RAW 264.7 세포 가 치아염소산 (ocr)을 발생시키도록 유도하지 않고 실시예 1에서 제 조한 화합물을 처리한 경우 형광이 관찰되지 않는 것으로 나타났다. 이에 반하여， 도 17(b)에 나타난 바와 같이， 헬라 세포 (Hela cell) 및 RAW 264.7 세포가 치아염소산 (OCr)을 발생시키도록 유도하고 실시예' 1에서 제조한 화합물을 처리한 경우 형광이 관찰되었다. 또한， 미분간 섭 채널에 나타난 바와 같이 헬라 세포 (Hela cell)와 RAW 264.7 세포 는 서로 다른 모양인 것으로 확인하였다. 구체적으로， 축 모양 세포 (빨간색 화살표)는 헬라 세포 (Hela cell)를 나타내고, 등근 모양 세포 (파란색 화살표)는 RAW 264.7 세포를 나타낸다. 이로부터， 실시예 1에 서 제조한 화합물이 RAW 264.7 세포의 세포질 내에 온전한 형태로 유 지되는 갓을 알 수 있다. 또한, 도 17(c) 및 도 17(d)에 나타난 바와 같이， MP0 억제제를 추가로 첨가한 경우 형광이 현저히 감소한 것으로 나타났다. 이로부터， 치아염소산 (OCr) 생성 유도는 PMA로 인하여 발생하는 H202가 헬라 세 포 (Hela cell) 및 R 264.7 세포 내 존재하는 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase, MPO)에 의한 촉매반웅을 통해 치마염소산 (OCD으 로 전환됨을 다시 확인하였다 (실험예 9의 도 17 참조). 나아가 , 이 -광자 현미경 (Two-Photon Microscopy, TPM)을 사용하 여 실시예 1에서 제조한 화합물의 치아염소산 검출능력을 평가하기 위 하여 실험을 수행한 결과， 도 18(a)에 나타난 바와 같이 , RAW 264.7 세포가 치아염소산 (ocr)을 발생시키도록 유도하지 않고 실시예 1에서 제조한 화합물을 처리한 경우 형광이 관찰되지 않는 것으로 나타났다. 이에 반하여， 도 18(b) 및 도 18(c)에 나타난 바와 같이， RAW 264.7 세포에 NaOCl 200 μΜ을 30분 동안 전처리하거나 RAW 264.7 세포가 치 아염소산 (OCD을 발생시키도록 유도하고 실시예 1에서 제조한 화합물 을 처리한 경우 형광이 관찰되었다 . 이로부터， 실시예 1에서 제조한 화합물이 R 264.7 세포의 세포질 내에 온전한 형태로 유지'되는 것을 알 수 있다 또한， 도 18(d) 및 도 18(e)에 나타난 바와 같이， MP0 억제제를 추가로 첨가한 경우 형광이 현저히 감소한 것으로 나타났다. 이로부터， 치아염소산 (OCr) 생성 유도는 PMA로 인하여 발생하는 H202가 RAW 264.7 세포 내 존재하는 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase, MP0)에 의한 촉매반웅을 통해 치아염소산 (0C1— )으로 전환됨을 다시 확인하였 다ᅳ 나아가， 도 18(f)에 나타난 바와 같이， 이미다졸리움을 포함하 는 화합물 (실시예 1의 단계 2 화합물) ΙΟμΜ을, NaOCl 200 μ M로 전처 리한 RAW 264.7 세포에 라벨한 경우 형광이 관찰되는 것으로 확인함으 로써， 상기 형광 변화는， 상기 실험예 1의 도 3에서 확인한 바와 같이， 실시예 1에서 제조한 화합물의 5각형 고리에 결합되어 있는 황 (sulfur) 원자가 치아염소산 (OCr)과 반웅함으로써 산화되어 떨어져 나가 양전하를 띄는 이마다졸리움이 생성됨으로써 발생하는 Ji -공액 겨 Ji -conjugation system) 변화에 기인하는 것을 확인하였다. 또한， 도 18(g)에 나타난 바와 같이， RAW 264.7 세포에 NaOCl을 전처리하지 않거나 [도 18(a)], MP0 억제제를 추가로 첨가하여 치아염 소산 (OCr)의 발생을 억제시킨 군 [도 18(d)， 도 18(e)]의 경우 형광 강도가 매우 약하게 관찰되밌다. 이에 반하여， RAW 264.7 세포에 NaOCl을 전처리하거나 [도 18(b)], 치아염소산 (0CD의 발생을 유도하 거나 [도 18(c)]， 실시예 1의 화합물이 치아염소산 (OCr)과 반응하여 형성되는 화합물 (실시예 1의 단계 2 화합물)을 NaOCl로 전처리한 세포 에 처리한 군 [도 18(f)]의 경우 강한 형광 강도가 관찰되는 것으로 나 타났다 (실험예 10의 도 18 참조). 나아가， 실시예 1에서 제조한 화합물의 광 안정성 (Photostabi lity)를 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 도 19(a)에 나타난 바와 같이， NaOCl을 처리하지 않은 군은 형광이 관찰되지 않았 으며， 도 19(b)에 나타난 바와 같이 NaOCl을 처리한 경우 형광이 관찰 되는 것으로 나타났다. 또한， 상기 각 군에 대하여 TPEF(Two-Photon- Excited Fluorescence)의 변화를 관찰한 경우 약 1시간 동안 형광 강 도가 유지되는 것으로 나타나 광 안정성 (photostability)이 우수함을 확인하였다 (실험예 11의 도 19 참조). 또한， 래트 해마 절편 (rat hippocampal si ice) 내 치아염소산 검출능력을 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 도 20(a) 및 도 20(d)에 나타난 바와 같이， 해마 절편에 실시예 1에서 제조한 화합물 100 μΜ을 처리한 군에서 관찰 가능한 정도인 형광이 나타났다. 이와 비교하여， 도 20(b) 및 도 20(e)에 나타난 바와 같이 , 해마 절편에 ΡΜΑ 10 ng/mL를 전처리하여 치아염소산 (0CD 발생을 유도한 후， 실시 예 1에서 제조한 화합물 100 μΜ을 처리한 군에서는 보다 더욱 강한 형 광이 관찰되었다. 또한， 도 20(c) 및 도 20(f)에 나타난 바와 같이 , 실시예 1의 화합물이 치아염소산 (ocr)과 반웅하여 형성되는 화합물 (실시예 1의 단계 2 화합물) 100 μΜ을 처리한 군에서도 강한 형광이 관찰되었다 (실험예 12의 도 20 참조). 따라서， 본 발명에 따른 이미다졸린 -2-티온 구조 기반의 화합물은 세포 내에서도 그 구조가 유지되며， 외인성 또는 내인성 치아염소산 (OCr)과 선택적으로 반응하여 형광 스펙트럼이 변화하므로 세포 내에서 치아염소산 (ocr)을 검출하는 용도로 유용하게 사용할 수 있다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 1，3-디메틸 -1H-이미다조 [4,5-b]페나진 -2(3H)-티은의 제조
Figure imgf000020_0001
단계 1 ： 1ᅳ메틸 -1H-이미다조 [4,5-b]페나진의 제조
얼음 조 하， 1H-이미다조 [4,5-b]페나진 (2.0 g, 9.08 mmol) 및 테트라하이드로퓨란 (20 mL) 흔합물에 NaH (광유 (mineral oil) 내 70%, 544.9 mg, 13.62 mmol)를 첨가하고， 상기 흔합물을 30초 동안 교반하 였다. 이후, CH3I (1 mL, 16.06 隱 ol)를 첨가하고 얼음 조를 제거한 후, 상기 흔합물을 상온에서 하루 동안 교반하였다. 용매를 제거한 후, 물을 첨가하고 CHC13로 세척하였다. 유기층을 수집하고, 무수 MgS04로 건조하였다. 이동상으로서 CH2C12/CH30H (30/1， v/v)를 사용하는 실리 카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 표제 화합물을 노란색의 고체 형태로 제조하였다 (1.161 g, 4.96 mmo 1 , 54.6%) .
¾ 匪 R (CDCls, 300 MHz) δ (ppm)： 8.72 (d, IH) , 8.30-8.19 (m, 4H) , 7.84-7.78 (m, 2H) , 4.01 (s, 3H). 3C NMR (CDC13, 75 MHz) δ (ppm)： 151.25, 148.01, 143.01, 142.74, 140.44, 140.11， 139.47, 130.15， 129.71， 129.68， 129.31,118.14, 105.29， 31.51. FAB-MS： ml z = 234.0908 [M] + , calc for C14H10N4 =234.0905； ml z = 235.0982 [M+H] + , calc. for Ci4HuN4 =235.0984. 단계 2 ： 1,3-디메틸 -IH-이마다조 [4,5-b]페나진 -3-이움 아이오 다이드의 제조
봉인된 튜브 (tube) 내에서， 상기 단계 1에서 제조한 1-메틸 -1H- 이미다조 [4,5-b]페나진 (21.7 mg, 0.119 mmol) 및 CH3I (200 i L)를 70°C에서 17시간 동안 교반하였다. 상온으로 냉각한 후 , 상기 잔여물 을, 이동상으로서 CH2C12/CH30H (50/1 내지 15/1， v/v)를 사용하는 실 리카쌜 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 표제 화합물을 적색의 고체 형태로 제조하였다 (12.8 mg, 0.034 mmol , 28.7%).
JH NMR (CDC13 > 300 MHz) δ (ppm)： 8.05-7.98 (m, 2H) ,7.63- 7.58 (m, 2H) , 6.19 (s, 2H)， 6.10(s, IH) , 2.88(s, 6H) . 13C 丽 R (DMSO-ie, 75 MHz) δ (ppm)： 145.29, 144.07， 140.22, 128.08, 127.18, 98.85， 93.47, 29.18. FAB-MS: ml z =249.1137 [M] + , calc. for 015Η13Ν4=249.1135. 단계 3 ： 1,3-디메탈 -IH-이미다조 [4,5-b]페나진 -2(3H)-티온의 제조
상기 단계 2에서 제조한 1，3ᅳ디메틸 -1H-이미다조 [4,5-b]페나진- 3-이움 아이오다이드 (24.9 mg, 0.0662 mmol) , 황 (41.9 mg, 1.307 mmol) 및 무수 메탄올 (6 mL)에 용해된 포타슘 tert-부톡사이드 (0.1479 g, 1.318 誦 ol)를 65°C에서 15시간 동안 교반하였다. 용매를 제거한 후， CH2C12¾ 첨가하고 물로 세척하였다. 유기층을 수집하고， MgS04로 건조하였다. 이동상으로서 에틸 아세테이트 /핵산 (1/2， v/v) 을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 표제 화합물을 오 렌지 색의 고체 형태로 제조하였다 (11.4 mg, 0.0407 mmol , 61.5%) .
¾ NMR (CDCl3 l 300 MHz) δ (ppm)： 8.22-8.16 (m, 2H) , 7.84- 7.78 (m, 2H) , 7.76 (s, 2H) , 3.89 (s, 3H) . 13C NMR (CDC13 ) 75 MHz) δ (ppm)： 142.65, 141.32, 137.36, 130.02, 129.19， 103.95, 31.50. FAB-MS: ml z =281.0858 [M+H] + , calc. for Ci5H13N4S=281.0861. <실시예 2> 1,3-디메틸 -1H-나프토 [2,3-d]이미다졸 -2(3H)-티온의 제조
Figure imgf000022_0001
단계 1 ： 1，3-디메틸 -1H-나프토 [2,3-d]이미다졸 -3ᅳ이움 아이오 다이드의 제조
1-메틸 -1H-나프토 [2,3-d]이미다졸 (107.7 mg, 0.591 mmol) 및 CH3CN에 용해된 CH3I (150 μ L, 2.409 麵 ol)를 환류 하 12시간 동안 교반하였다. 상온으로 넁각한 후， 용매를 제거하였다. 상기 잔여물은， 이동상으로서 CH2C12/CH30H (20/1 내지 15/1， v/v)를 사용하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 장제하여 표제 화합물을 흰색의 고체 형태로 제조하였다 (0.1699 g, 0.524 mmol , 88.7%) .
ΧΗ 匪 R (DMS0-G¾, 300 MHz) δ (ppm)： 9.82 (s, 1H) , 8.60 (s, 2H) , 8.24-8.19 (m, 2H) , 7.70-7.65 (m, 2H)， 4.15 ( s , 6H) . 13C 匪 R (MSO-de, 75 MHz) δ (ppm)： 147.17, 13.88, 130.82, 128.23, 126.54 110.71， 33.33. FAB-MS:
Figure imgf000022_0002
[M] + , calc for C13H13N2 =197.1073. 단계 2 3-디메틸 -IH-나프토 [2， 3-d]이미다졸 -2(3H)-티은의 제조
황 (50 mg, 1.56 睡 ol) , 상기 단계 1에서 제조한 1，3-디메틸 -1H- 나프토 [2,3-d]이미다졸 -3-이움 아이오다이드 (100.3 mg, 0.309 mmol) 및 소듐 메록사이드 (83.6 mg, 1.55 mmol) 흔합물에 메탄올 (무수， 4 mL)를 첨가하였다. 하루 동안 교반한 후, 용매를 제거하였다. CH2C12 를 첨가하고， 물로 세척하였다. 유기층을 수집한 후， MgS04로 건조하 였다. 이동상으로서 CH2C12/핵산 (1/1， v/v)를 사용하는 실리카겔 컬 럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 표제 화합물을 흰색의 고체 형태 로 제조하였다 (65.6 mg, 0.278 mmol , 93.0%) .
:H NMR (CDCls, 300 MHz) δ (ppm): 7.92-7.89 (q, 2H) , 7.49 (s, 2H) , 7.47-7.44 (q, 2H), 3.87 (s, 6H). 13C 匪 R (CDC13, 75 MHz) δ (ppm)： 173.36, 132.50, 130.20, 127.60, 124.87, 104.54, 31.21. FAB-MS: ml z =228.0722 [M] + , calc for C13H12N2S =228.0721； ml z =229.0799 [M+H] + , calc. for Ci3H13N2S =229.0799. 하기 표 1에 실시예 1-2에서 제조한 화합물의 화학구조식을 정 리하여 나타내었다
【표 1】
Figure imgf000023_0001
<실험예 1> 치아염소산 농도에 따른 형광 및 흡수 스펙트럼 변 화 평가 1
<!-!> 형광 스펙트럼 변화 평가
실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (ocr)이 반웅할 때 형광 스펙트럼의 변화를 관찰하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하 였다.
PBS(Phosphate buffered saline) 완충액 (pH 7.4) 50 mM 내 실시 예 1에서 제조한 화합물 2.0 μΜ에 치아염소산 (0C1— )을 0-10 μΜ의 농도 별로 첨가함에 따리: 변화하는 형광 스펙트럼을 25 °C에서 RF- 5301/PC(Shimada) 형광 분광광도계를 사용하여 측정하였으며 그 결과 를 도 1에 나타내었다. 도 1은 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (ocr, 0-
ΙΟμΜ)이 반웅할 때 형광 스펙트럼의 변화를 관찰한 이미지이다. 도 1에 나타난 바와 같이， 치아염소산 (ocr)의 첨가 농도를 증 가시킬수록 형광 스펙트럼의 505nm 부근의 형광 강도가 증가하는 것으 로 나타났다. 또한， PBS(50 mM, pH 7.4)에 용해된 실시예 1에서 제조한 화합 물 (2μΜ)과 치아염소산 (OCr)이 반응하여 증가된 형광 강도가 시간에 따라 안정하게 유지되는지 평가하기 위하여， 치아염소산 (ocr)을 각각
0μ M, 5μΜ, 10 μ Μ, 15 μ Μ로 사용하여 시간에 따른 형광 스펙트럼을 25t에서 RF-5301/PC(Shimada) 형광 분광광도계를 통해 측정하였으며 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (OCr, ΟμΜ, 5μ M, ΙΟμΜ, 15μΜ)을 반응시킬 때 시간에 따른 형광 스펙트럼의 변 ' 화를 관찰한 이미지이다. 도 4에 나타난 바와 같이， 실사예 1에서 제조한 화합물과 치아 염소산 (OCr)이 반웅하여 증가된 505nm 부근의 형광 강도는 2.5시간 동안 안정하게 유지되는 것으로 나타났으며 , 실시예 1에서 제조한 화 합물의 치아염소산 (OCr)에 대한 검출하한 (lower limit of detection) 농도값이 0.071 μ Μ이라는 것을 확인하였다 . <1-2> 흡수 스펙트럼 변화 평가
실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (ocr)이 반웅할 때 흡수 스펙트럼의 변화를 관찰하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하 였다. PBS(Phosphate buffered saline) 완층액 (pH 7.4) 50 mM 내 실시 예 1에서 제조한 화합물 2.0μΜ에 치아염소산 (OCr)을 0-30μΜ의 농도 별로 첨가함에 따라 변화하는 흡수 스펙트럼을 25°C에서， 1cm의 광행 로 길이 (optical path length) 셀을 사용하는 Scinco S-3100를 통해 UV 흡수 분광법 측정을 수행하였으며 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (OCr, 0- 30μΜ)이 반웅할 때 흡수 스펙트럼의 변화를 관찰한 이미지이다. 도 2에 나'타난 바와 같이， 치아염소산 (OCr)의 첨가 농도를 증 가시킬수록 흡수 스펙트럼의 420nm 부근의 흡수 피크 강도가 감소하고 378薩 부근의 흡수 피크 강도가 증가하는 것으로 나타났다. 상기 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (ocr)이 반웅할 때 유도되는 형광 및 흡수 스펙트럼의 변화는 도 3과 같은 메커니즘을 통해 반웅하여 양이은을 띄는 이미다졸리움이 형성됨으로써 유도되는 것으로 예상할 수 있다. 도 3은 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (OCr)이 반웅 때 반웅 메커니 을 나타내는 이미지이다. 따라서， 본 발명에 따른 이미다졸린 -2ᅳ티온 구조 기반의 화합물 중성 조건에서 치아염소산 (0C1— )과 반웅하여 형광 및 흡수 스펙트 럼이 변화하므로， 치아염소산 (ocr)을 검출하는 용도로 유용하게 사용 할 수 있다
<실험예 2> 치아염소산 선택성 평가 1
형광 스펙트럼 변화를 통해 치아염소산 (ocr)에 대하여， 실시예
1에서 제조한 화합물의 선택성을 평가하기 위,하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. '
PBS(Phosphate buffered saline) 완충액 (pH 7.4) 50 mM 내 실사 예 1에서 제조한 화합물의 선택성을 평가하기 위하여 치아염소산 (ocr
)올 으 ΙΟμΜ의 농도로 사용하는 대신에， 활성산소종 (Reactive Oxygen Species, R0S) 또는 활성질소종 (React ive Nitrogen Species, RNS) , 보 다 구체적으로는 H202(lmM), TBHP(lmM, tert-butyl hyperoxide) , NO - (ImM) , R00 - [ ImM , 2， 2 '-아조비스 (2ᅳ아미디노프로판)디하이드로클 로라이드인 ΑΑΡΗ(2 , 2 ' -azobi s(2-amidinopropane) dihydro一 chlor ide)로 부터 Ιί00 · (페록실 라디칼, peroxyl radical)을 얻음]， 0N00 - (100 μ M) , - 0H(200 y M) , 0(:Γ(10μΜ)를 사용하며 상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 활성산소종 (Reactive Oxygen Species, R0S) 또는 활성질 소종 (Reactive Nitrogen Species, RNS)을 각각 실시예 1에서 제조한 화합물과 반웅시켰을 때 관찰되는 형광 스펙트럼 (505 n 부근의 형광강 도， a.u.)을 나타내는 이미지이다. 도 5에 나타난 바와 같이， 실시예 1에서 제조한 화합물은 오직 치아염소산 (OCr)과 반웅하였을 때 505nm 부근의 형광강도가 증가하는 것으로 확인되었다. 따라서， 본 발명에 따른 이미다졸린ᅳ2-티온 구조 기반의 화합물 은 중성 조건에서 치아염소산 (OCr)과 선택적으로 반웅하여 형광 스펙 트럼이 변화하므로， 치아염소산 (ocr)을 검출하는 용도로 유용하게 사 용할 수 있다.
<실험예 3> 치아염소산 농도에 따른 형광 및 홉수 스펙트럼 변 화 평가 2 \,
<3-1> 형광 스펙트럼 변화 평가
실시예 1에서 제조한 화합물을' 사용하는 대신에， 실시예 2에서 제조한 화합물을 사용하고; 치아염소산 (OCr)을 0-10μΜ을 사용하는 대신에， 치아염소산 (OCr)을 0-50 μΜ로 사용하는 것을 제외하고 ; 상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 수행하였으며， 그 결과를 도 6에 나 타내었다.
*251
도 6은 실시예 2에서 제조한 화합물과 치아염소산 (OCr, 0- 50μ M)이 반웅할 때 형광 스펙트럼의 변화를 관찰한 이미지이다. 도 6에 나타난 바와 같이， 치아염소산 (OCr)의 첨가 농도를 증 가시킬수록 형광 스펙트럼의 450腿 부근의 형광 강도가 증가하는 것으 로 나타났다.
<3-2> 흡수 스펙트럼 변화 평가
실시예 1에서 제조한 화합물을 사용하는 대신에， 실시예 2에서 제조한 화합물을 사용하는 것을 제외하고 상기 실험예 <1-2>와 동일한 방법으로 수행하였으며 , 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7은 실시예 2에서 제조한 화합물과 치아염소산 (OCr， 으 30 μΜ)이 반웅할 때 흡수 스펙트럼의 변화를 관찰한 이미지이다. 도 7에 나타난 바와 같이， 치아염소산 (OCr)의 첨가 농도를 증 가시킬수록 흡수 스펙트럼의 342nm 부근의 흡수 피크 강도가 감소하고 325nm 부근의 흡수 괴크가 남아있는 것으로 나타났다. 상기 실시예 2에서 제조한 화합물과 치아염소산 (OCr)이 반웅할 때 유도되는 형광 및 흡수 스펙트럼의 변화는 도 8과 같은 메쩌니즘을 통해 반웅하여 양아온을 띄는 이미다졸리움이 형성됨으로써 유도되는 것으로 예상할 수 있다.
ᅳ
도 8은 실시예 2에서 제조한 화합물과 치아염소산 (OCr)이 반웅 할 때 반웅 메커니즘을 나타내는 이미지이다. 따라서 , 본 발명에 따른 이미다졸린— 2—티온 구조 기반의 화합물 은 중성 조건에서 치아염소산 (OCr)과 반웅하여 형광 및 흡수 스펙트 럼이 변화하므로, 치아염소산 (ocr)을 검출하는 용도로 유용하게 사용 할 수 있다. <실험예 4> 치아염소산 선택성 평가 2
실시예 1에서 제조한 화합물을 사용하는 대신에， 실시예 2에서 제조한 화합물을 사용하는 것을 제외하고 상기 실험예 2와 동일한 방 법으로 수행하였으며， 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9는 활성산소종 (React ive Oxygen Species, ROS) 또는 활성질 소종 (Reactive Nitrogen Species , RNS)을 각각 실시예 2에서 제조한 화합물과 반응시켰을 때 관찰되는 형광 스펙트럼 (450nm 부근의 형광강 도， a. u.)을 나타내는 이미지이다. 도 9에 나타난 바와 같이， 실시예 2에서 제조한 화합물은 오직 치아염소산 (OCr)과 반웅하였을 때 450nm 부근와 형광강도가 증가하는 것으로 확인되었다. 따라서 , 본 발명에 따른 이미다졸린 -2—티온 구조 기반의 화합물 은 중성 조건에서 치아염소산 (ocr)과 선택적으로 반옹하여 형광 스펙 트럼이 변화하므로， 치아염소산 (ocr)을 검출하는 용도로 유용하게 사 용할 수 있다.
<실험예 5> 치아염소산 농도께 따른 형광 및 흡수 스펙트럼 변 화 평가 3
<5-1> 형광 스펙트럼 변화 평가
치아염소산 (OCr)을 으 ΙΟμΜ올 사용하는 대신에 , 치아염소산 (OCr)을 0-50 μΜ을 사용하고; PBS(Phosphat e buffered saline) 완충 액 (pH 7.4)을 사용하는 대신에， KH2P04 완충액 (pH 5.0)을 사용하는 것 을 제외하고; 상기 실험예 <1-1>과 동알한 방법으로 수행하였으며， 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10은 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (ocr, 0-
50μΜ)이 반웅할 때 형광 스펙트럼의 변화를 관찰한 이미지이다. 도 10에 나타난 바와 같이， 치아염소산 (ocr)의 첨가 농도를 증 가시킬수톡 형광 스펙트럼의 493nm 부근의 형광 강도가 증가하는 것으 로 나타났다.
<5-2> 흡수 스펙트럼 변화 평가
은할럼
이수산치아염소산 (OCr)을 0-30 μΜ을 사용하는 대신에， 치아염소산 (OCr)을 0-100μΜ을 사용하고; PBS(Phosphate buffered saline) 완층 액 (pH 7.4)을 사용하는 대신에， KH2P04 완충액 (PH 5.0)을 사용하는 것 을 제외하고; 상기 실험예 <1-2>와 동일한 벵ᅳ법으로 수행하였으며 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11은 실시예 1에서 제조한 화합물과 치아염소산 (ocr, 0-
ΙΟΟμΜ)이 반웅할 때 흡수 스펙트럼의 변화를 관찰한 이미지이다. 도 11에 나타난 바와 같이， 치아염소산 (ocr)의 첨가 농도를 증 가시킬수록 흡수 스펙트럼의 425nm 부근의 흡수/피크 강도가 감소하고 , 376nm 부근의 흡수 피크 강도가 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 , 본 발명에 따른 이미다졸린 -2-티온 구조 기반의 화합물 성 조건에서 치아염소산 (ocr)과 반응하여 형광 및 흡수 스펙트 변화하므로, 치아염소산 (ocr)을 검출하는 용도로 유용하게 사용 있다.
<실험예 6> 치아염소산 선택성 평가 3
PBSCPhosphate buffered saline) 완층액 (pH 7.4)을 사용하는 대 신에 , KH2P04 완충액 (pH 5.0)을 사용하는 것을 제외하고; 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 수행하였으며， 그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12는 활성산소종 (Reactive Oxygen Species, R0S) 또는 활성 질소종 (Reactive Nitrogen Species, RNS)을 각각 실시예 1에서 제조한 화합물과 반웅시켰을 때 관찰되는 형광 스펙트럼 (493讓 부근의 형광강 도， a.u.)을 나타내는 이미지이다. 도 12에 나타난 바와 같이， 실시예 1에서 제조한 화합물은 오직 치아염소산 (OCr)과 반웅하였을 때 493nm 부근의 형광강도가 증가하는 것으로 확인되었다. 따라서， 본 발명에 따른 이미다졸린 -2-티은 구조 기반의 화합물 은 산성 조건에서 치아염소산 (ocr)과 선택적으로 반웅하여 형광 스펙 트럼이 변화하므로， 치아염소산 (OCr)을 검출하는 용도로 유용하게 사 용할 수 있다. <실험예 7> 세포독성 평가
실시예 1에서 제조한 화합물의 세포독성을 평가하기 위하여 하 기와 같은 실험을 수행하였다. <7-1> 세포 배양
헬라 세포 (Hela cell) 및 RAW 264.7 세포 (대식세포주)는 American Type Culture Col lect ion (Manassas , VA)으로부터 얻었고'' 371. 5% C02 환경하에서 10X 배양 배지 [1% 프로티오스 펩톤 (proteose peptone) , 0.2% 글루코스， 0.1% 효모 추출물 (yeast ext ract ) , 0.003% Ethylenediaminetetraacet ic acid(EDTA) 페릭 ( f err i c )소듐염 ] 내 유리 슬라이드 (glass slide) 표면에서 배양하였다. 구체적으로, 세포들은 제조업자와 지시사항에 따라 6-웰 플레이트 내에 스크랩핑 (Scraping) 하고 부착시켜 배양하였다. <7-2> 세포독성 평가 1
상기 실험예 <7-1>에서 준비한 헬라 세포 (Hela cell)를 배양 배 지에서 96-웰 플레이트에 시드 (seeded)하였다. 24시간 후， 실시예 1에 서 제조한 화합물을 각각 Ομ Μ, 5 μ Μ, 10 μ Μ , 20 μ Μ 농도로 6시간 동 안 상기 세포와 함께 배양하였다. 6시간 후 상기 세포를 0.5 mg/ml MTT(thiazolyl blue tetrazol ium bromide)를 함유하는 세포 배양 배지 에서 3시간 동안 배양하고ᅳ 배지를 제거하였다. 생성된 포르마잔 (forniazan)을 0.1 ml의 DMS0(d imethy 1 su 1 f oxi de)에 용해시키고， Spectramax Mi crowel 1 pi ate reader를 사용하여 0D 650 nm를 측정하였 다. 그 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13은 ¾라 세포 (Hela cell)에 대한 실시예 1에서 제조한 화 합물의 세포독성을 평가한 결과를 나타내는 이미지이다. 도 13에 나타난 바와 같이， 실시예 ᅳ 1에서 제조한 화합물은 0- 20 μ M 농도 범위에서 헬라 세포 (Hela cel l)에 대한 세포 독성이 현저 히 낮은 것으로 나타났다. 구체적으로， 실시예 1에서 제조한 화합물을 20 μ M 농도로 처리한 경우에도 헬라 세포 (Hela cell)의 생존도가 80% 이상인 것으로 나타나 살아있는 세포께 적용 가능함을 확인하였다. <7-3> 세포독성 평가 2
상기 실험예 <7- 1>에서 준비한 RAW 264.7 세포 (대식세포주 )를 배양 배지에서 96-웰 플레이트에 시드 (seeded)하였다. 24시간 후， 실 시예 1에서 제조한 화합물 100 μΜ을 2시간 동안 상기 세포와 함께 배 양하였다. 이후 상기 실험예 <7-2>와 동일한 방법으로 수행하였으며 , 그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14는 RAW 264.7 세포 (대식세포주 )에 대한 실시예 1에서 제조 한 화합물와 세포 독성을 평가한 결과를 나타내는 이미지이다. 도 14에 나타난 바와 같이 , 실시예 1에서 제조한 화합물은 R 264.7 세포 (대식세포주)에 대한 세포 독성이 현저히 낮은 것으로 나파 났다. 구체적으로， 실시예 1에서 제조한 화합물을 100 μΜ로 처리한 경 우 RAW 264.7 세포 (대식세포주 )의 생존도가 80% 이상인 것으로 나타나 살아있는 세포에 적용 가능함을 확인하였다.
<실험예 8> 생체세포 내 치아염소산 검출능력 평가 1
생체세포 내 외인성 및 내인성 치아염소산 (OCr)에 대하여 , 실 시예 1에서 제조한 화합물의 검출능력의 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<8-1> 생체세포 내 외인성 치아염소산 (0C1— ) 검출능력 평가 상기 실험예 <7-1>에서 준비한 헬라 세포 (He la cell)에 NaOCl올 각각 ΟμΜ, ΙΟΟμΜ, 200 μ Μ로 20분 동안 처리하고, DPBS(pH 7.4， Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 세척한 후, 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ을 처리하였다. 20분 동안 배양한 후， DPBS로 세 척하여 세포의 형광 이미지를 얻었다. 여기서 상기 세포의 형광 이미 지는 공초점 현미경 (confocal microscope)올 사용하였으며， 구체적으 로 상기 공초점 현미경은 공초점 레이저 스케닝 생물 현미경 (confocal laser scanning biological microscope, Olympus , FV1200 , Japan) 및 고해상도 STED 레이저 공초점 현미경 (super resolution STED(st imulated emission depletion) laser confocal microscopy, Leica TCS SP8 , Germany)을 사용하였다 (여기 원 ： 405I 다이오드 레 이저， 발광 ： 490-590nm). 그 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15(a)는 헬라 세포 (Hela cell)에 살시예 1에서 제조한 화합 물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널， 하부 :미분 간섭 채널]이다.
도 15(b)는 헬라 세포 (Hela cell)에 NaOCl 100 μ M 및 실시예 1 에서 제조한 화합물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널， 하부:미분간섭 채널]이다.
도 15(c)는 헬라 세포 (Hela cell)에 NaOCl 200 μ Μ 및 실시예 1 에서 제조한 화합물 ΙΟμ Μ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널， 하부 :미분간섭 채널]아다 . 도 15(a)에 나타난 바와 같이， NaOCl을 처리하지 않고 헬라 세 포 (Hela cell)에 실시예 1에서 제조한 화합물 ΙΟμ Μ만을 처리한 경우 형광이 관찰되지 않는 것으로 나타났다. 이에 반하여， 도 15(b) 및 도 15(c)에 나타난 바와 같이 , NaOCl의 첨가 농도를 증가시킬수록 형광 강도가 증가하는 것으로 나타났다. 이로부터， 실시예 1에서 제조한 화 합물이 헬라 세포 (Hela cell)의 세포질 내에 온전한 형태로 유지되는 것을 알 수 있을 뿐만 아니라， 실시예 1에서 제조한 화합물이 ¾라 세 포 (Hela cel l) 내에서 치아염소산 (OCD의 농도 변화에 따른 비율계량 적인 (ratiometric) 반웅이 우수하다는 것을 확인할 수 있다 .
<8-2> 생체세포 내 내인성 치아염소산 (OCD 검출능력 평가 헬라 세포 (Hela cel l)는 자체적으로 치아염소산 (0C1— )을 생산하 는 것으로 알려져 있으나 (H. Zhu, J. Fan, J. Wang, H. Muᅳ X. Peng, J. Am. Chem. Soc. 2014， 136, 12820-12823. ) , 그 농도가 매우 낮아 (약 8.23 nM) 살시예 1에서 제조한 화합물로는 검출이 힘든 것으로 나 타났다 (실험예 <8-1>， 도 15(a) 참조). 이에， 내인성 치아염소산 (0C1 ) 발생을 유도하기 용이한 RAW 264.7 세포를 사용하였다.
RAW 264.7 세포에 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml , 인터페론ᅳ γ를 4시간 동안 50 ng/ml , 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phorbol 12-myristate 13- acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하여 내인성 치아염소산 (0CD 생성올 유도하였다. 구체적으로， 상기 치아염소산 (0CD 생성 유도는 PMA로 인하여 발생하는 H202가 RAW 264.7 세포 내 존재하는 미엘로퍼 옥시다제 (myeloperoxidase, MP0)에 의한 촉매반응을 통해 치아염소산 (0CD으로 전환된다. 이후， 상기 RAW 264.7 세포에 실시예 1에서 제 조한 화합물 10μ Μ를 20분 동안 처리한 후， Dulbecco's Phosphate Buffered Sal ine(DPBS)으로 세 차례에 걸쳐 세척하고 상기 실험예 <8- 2>에서 사용한 공초점 현미경을 사용하여 이미지화하였다 (도 16(b)).
'
또한, 상기와 같이 RAW 264.7 세포에 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml , 인터페론ᅳ γ를 4시간 동안 50 ng/ml , 포르볼 12 미리스테이트 13-아세테이트 (phorbol 12-myri state 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하고， 추가적 으로 ΜΡ0 억제게인 4-ABAH(4-Aminobenzoicacid hydrazide) , FFA(f lufenamic acid)를 각각 50 μ Rl씩 처리하였다. 이후， 상기 RAW 264.7 세포에 실시예 1에서 제조한 화합물 10 μΜ를 20분 동안 처리한 후， Dulbecco's Phosphate Buffered Sal ine(DPBS)으로 세 차례에 걸쳐 세척하고 상기 실험예 <8-2>에서 사용한 공초점 현미경을 사용하여 이 미지화하였다 (도 16(c):4-ABAH 처리군， 도 16(d) :FFA 처리군) . 그 결 과를 도 16에 나타내었다. 도 16(a)는 RAW 264.7 세포에 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널 , 하부 :미분간섭 채널]이다.
도 16(b)는 RAW 264.7 세포에 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml, 인터페론 를 4시간 동안 50 ng/ml , 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phor bo 1 12-myristate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하여 내인성 치아염소산 (0CD 생성을 유도한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널， 하부 :미분간섭 채널]이다.
도 16(c)는 RAW 264.7 세포에 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml , 인터페론 를 4시간 동안 50 ng/ml , 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phorbo 1 12-myristate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하고 , 추가적 으로 MP0 억제제인 4-ABAH ( 4-Am i nobenzo i c ac i d hydrazide) 50 μ M을 처 리한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널， 하부:미분간섭 채널]이다.
도 16(d)는 RAW 264.7 세포에 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml， 인터페론 -γ를 4시간 등안 50 ng/ml , 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phorbo 1 12-myristate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하고， 추가적 으로 MP0 억제제인 FFA(flufenamic acid) 50 μ M을 처리한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널， 하부:미분간섭 채널]아다. 도 16(a)에 나타난 바와 같이， RAW 264.7 세포가 치아염소산 (0C1 )을 발생시키도록 유도하지 않고 실시예 1에서 제조한 화합물을 처리한 경우 형광이 관찰되지 않는 것으로 나타났다. 이에 반하여， 도
16(b)에 나타난 바와 같이， RAW 264.7 세포가 치아염소산 ΧΓ)을 발 생시키도록 유도하고 실시예 1에서 제조한 화합물을 처리한 경우 형광 이 관찰되었다. 이로부터， 실시예 1에서 제조한 화합물이 RAW 264.7 세포의 세포질 내에 온전한 형태로 유지되는 것을 알 수 있다. 또한， 도 16(c) 및 도 16(d)에 나타난 바와 같이， MPQ 억제제를 추가로 첨가한 경우 형광이 현저히 감소한 것으로 나타났다. 이로부터 , 치아염소산 (0C1— ) 생성 유도는 PMA로 인하여 발생하는 H202가 RAW 264.7 세포 내 존재하는 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase, MP0)에 의한 촉매반웅을 통해 치아염소산 (0CD으로 전환됨을 다시 확인하였 다. 따라서， 본 발명에 따른 이미다졸린 -2-티온 구조 기반의 화합물 은 세포 내에서도 그 구조가 유지되며， 외인성 또는 내인성 치아염소 산 (0CD과 선택적으로 반웅하여 형광 스펙트럼이 변화하므로, 세포 내에서 치아염소산 (0CD을 검출하는 용도로 유용하게 사용할 수 있다.
<실험예 9> 생체세포 내 치아염소산 검출능력 평가 2
종양 조직에서 대식세포는 TAMs (Tumor Associated Macrophages) 라고 불리며， 전ᅳ종양형성 (pro-tumorigenesis) 및 항-종양 활성 (anti¬ tumor activity)을 갖는 것으로 알려져 있다. 즉， 종양 조직에서 암세 포 및 TAMs와 연결되는 상호작용 네트워크 (network)를 명확하게 하는 것이 필요하다. 이에， 상기 실험예 <7— 1>에서 준비한 헬라 세포 (He la cell) 및 RAW 264.7 세포를 공생—배양 ( co-cul t ur e)하였으며， 이후 살 험은 상기 실험예 <8-2>와 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17(a)는 헬라 세포 (Hela cell) 및 RAW 264.7 세포에 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널， 중부:미분간섭 채널， 하부:형광 채널+미분간섭 채널]이다.
도 17(b)는 헬라 세포 (Hela cell) 및 RAW 264.7 세포에 리포폴 리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml, 인 터페론 - Y를 4시간 동안 50 ng/ml， 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테 이트 (phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리 하여 내인성 치아염소산 (ocr) 생성을 유도한 후， 실시예 1에서 제조 한 화합물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널， 중 부:미분간섭 채널， 하부:형광 채널+미분간섭 채널】이다.
도 17(c)는 헬라 세포 (Hela cell) 및 RAW 264.7 세포에 리포폴 리사카라이드 ( 1 ipopolysacchar ide, LPS)를 16시간 동안 lOO ng/ml, 인 터페론 를 4시간 동안 50 ng/ml , 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테 이트 (phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리 하고, 추가적으로 MP0 억제제인 4-ABAH(4-Aminobenzoicacid hydrazide) 50 μ M을 처리한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 10 μ M을 처리한 경우 관찰되는 이미지 [상부：형광 채널 , 중부:미분간섭 채널， 하부 :형광 채널+미분간섭 채널]이다.
도 17(d)는 헬라 세포 (Hela cell) 및 RAW 264.7 세포에 리포폴 리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml， 인 터페론 를 4시간 동안 50 ng/ml , 포르블 12-미리스테이트 13-아세테 이트 (phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리 하고 ᅳ 추가적으로 MP0 억제제인 FFA(fhifenamic acid) 50 μ M을 처리한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ을 처리한 경우 관찰되는 이미 지 [상부：형광 채널， 중부:미분간섭 채널 , 하부:형광 채널 +미분간섭 채 널]이다. 도 17(a)에 나타난 바와 같이， 헬라 세포 (Hela cell) 및 RAW 264.7 세포가 치아염소산 (OCr)을 발생시키도록 유도하지 않고 실시예 1에서 제조한 화합물을 처리한 경우 형광이 관찰되지 않는 것으로 나 타났다. 이에 반하여， 도 17(b)에 나타난 바와 같이， 헬라 세포 (Hela cell) 및 RAW 264.7 세포가 치아염소산 (OCD을 발생시키도록 유도하 고 실시예 1에서 제조한 화합물을 처리한 경우 형광이 관찰되었다. 또 한， 미분간섭 채널에 나타난 바와 같이 헬라 세포 (Hela cell)와 RAW 264.7 세포는 서로 다른 모양인 것으로 확인하였다. 구체적으로， 축 모양 세포 (빨간색 화살표)는 헬라 세포 (Hela cell)를 나타내고， 등근 모양 세포 (파란색 화살표)는 RAW 264.7 세포를 나타낸다. 이로부터， 실시예 1에서 제조한 화합물이 RAW 264.7 세포의 세포질 내에 은전한 형태로 유지되는 것을 알 수 있다. 또한， 도 17(c) 및 도 17(d)에 나타난 바와 같이， MP0 억제제를 추가로 첨가한 경우 형광이 현저히 감소한 것으로 나타났다. 이로부터， 치아염소산 (OCr) 생성 유도는 PMA로 인하여 발생하는 H202가 헬라 세 포 (He la cell) 및 RAW 264.7 세포 내 존재하는 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase, MP0)에 의한 촉매,반웅을 통해 치아염소산 (0C1— )으 로 전환됨을 다시 확인하였다. 따라서， 본 발명에 따른 이미다졸린 -2-티온 구조 기반의 화합물 은 세포 내에서도 그 구조가 유지되며， 외인성 또는 내인성 치아염소 산 (0CD과 선택적으로 반응하여 형광 스펙트럼이 변화하므로， 세포 내에서 치아염소산 (0CD을 검출하는 용도로 유용하게 사용할 수 있다.
<실험예 10> 이 -광자 현미경 (Two-Photon Microscopy, TPM)을 사 용한 치아염소산 검출능력 평가
이ᅳ광자 현미경 (Two-Photon Microscopy, TPM)을 사용하여 실시 예 1에서 제조한 화합물의 치아염소산 검출능력을 평가하기 위하여 하 기와 같은 실험을 수행하였다.
<10-1> 이 -광자 형광 현미경 (Two-Photon Fluorescence Microscopy) 준비
프로브 -라벨 세포 및 조직의 이 -광자 형광 현미경 이미지는 분 광 공초점 (spectral confocal) 및 다광자 현미경 (mul t iphoton microscopes, Leica TCS SP8 MP)을 사용하여 얻었다 (xiO dry, x40 oil 및 x 100 oi 1 objectives, 개구수 (Numerical Aperture, NA) :0.30, 1.30 및 1.30). 상기 이—광자 형광 현미경 이미지는 DMI6000B 현미경 (Leica)와 함께， 상기 프로브를 초점면 (laser source)에서 . 대략 15 mW의 평균 전력에 대웅하는 파장 800nm, 출력 전력 3110 mW으로 세팅 한 모드 -고정 티타늄 -청옥 레이저원 (mode-locked titanium-sapphire laser source , Mai Tai HP; Spectra Physics, 80 MHz pulse frequency , 100 fs pulse width)과 함께 여기 (exciting) 시켜 얻었다. 400-500nm 범위의 이미지를 얻고， 400 Hz 스캔 속도 (scan speed)에서 8비트 무부 호 (unsigned) 512X512 및 1024x 1024 픽셀 (pixels) 내 신호를 수집하 기 위하여 내부 PMTs(Predetermined Motion Time system)를 사용하였 다. <10-2> 치아염소산 검출능력 평가
RAW 264.7 세포에 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml , 인터페론 를 4시간 동안 50 ng/ml , 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phorbol 12-myristate 13- acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하여 내인성 치아염소산 (0CD 생성을 유도하였다. 구체적으로， 상기 치아염소산 (0CD 생성 유도는 PMA로 인하여 발생하는 H202가 RAW 264.7 세포 내 존재하는 미엘로퍼 옥시다제 (myeloperoxidase, MP0)에 의한 촉매반응을 통해 치아염소산 (OCD으로 전환된다. 이후， 상기 RAW 264.7 세포에 실시예 1에서 제 조한 화합물 ΙΟμΜ를 20분 동안 처라한 후， Dulbecco 's Phosphate Buffered Saline(DPBS)으로 세 차례에 쳐 세척하고 상기 실험예 <10— 1>에서 준비한 이ᅳ광자 형광 현미경 (Two-Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하여 형광 이미지와 형광 강도를 측정하였다. 또한， 상기와 같이 RAW 264.7 세포에 뫼포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100'ng/ml, 인터페론 를 4시간 동안 50 ng/ml , 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테미트 (phorbo 1 12-myristate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하고， 추가적 으로 MP0 억쩨제인 4-ABAH(4-Ami nobenzoi cac id hydrazide) , FFMflufenamic acid)를 각각 50 μ M씩 처리하였다. 이후 상기 RAW 264.7 세포에 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ를 20분 동안 처리한 후， Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline(DPBS)으로 세 차례에 걸쳐 세척하고 상기 실험예 <10-1>에서 준비한 이—광자 형광 현미경 (Two- Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하여 형광 이미지와 형광 강 도를 측정하였다. 나아가, 상기 실험예 1의 도 3에서 확인한 바와 같이， 형광을 나타내는 이마다졸리움을 포함하는 화합물 (실시예 1의 단계 2 화합물) 10μΜ을， NaOCl 200 μ M로 전처리한 RAW 264.7 세포에 라벨한 후， 실험 예 <10-1>에서 준비한 이 -광자 형광 현미^ (Two-Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하여; 형광 이미지와 형광 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18(a)는 RAW 264.7 세포에 어떤 처리도 수행하지 않고 이-광 자 형광 현미경 (Two-Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하여 관 찰한 형광 이미지이다.
도 18(b)는 RAW 264.7 세포에 NaOCl 200 μ M을 30분 동안 전처리 하고， 실시예 1에서 제조한 화합물 10 μ Μ을 함께 배양한 후 , 이 -광자 형광 현미경 (Two-Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 18(c)는 RAW 264.7 세포에 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml , 인터페론 를 4시간 동안 50 ng/ml, 포르볼 12—미리스테이트 13-아세테이트 (phor bo 1 12-myristate 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하여 내인성 치아염소산 (OCD 생성을 유도한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 ΙΟμΜ을 함께 배양한 후， 이 -광자 형광 현미경 (Two-Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 18(d)는 RAW 264.7 세포에 라포폴리사카라이드 ( 1 ipopolysacchar ide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml , 인터페론 -γ를 4시간 동안 50 ng/ml , 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phor bo 1 12-myri state 13— acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하고, 추가적 으로 MP0 억제제인 4-ABAH(4-Aminobenzoicacid hydrazide) 50 μ M을 처 리한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 10μΜ을 함께 배양한 후 이-광 자 형광 현미경 (Two-Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하여 관 찰한 형광 이미지이다 .
도 18(e)는 R 264.7 세포에 리포폴리사카라이드 ( 1 ipopolysacchar ide, LPS)를 16시간 동안 100 ng/ml, 인터페론 를 4시간 동안 50 ng/ml，- 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phor bo 1 12-myri state 13-acetate, PMA)를 30분 동안 10 nM 처리하고， 추가적 으로 MP0 억제제인 FFA(f lufenamic acid) 50 μ M을 처리한 후， 실시예 1에서 제조한 화합물 10 μΜ을 함께 배양한 후， 이 -광자 형광 현미경 (Two-Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하여 관찰한 형광 이미 지이다
도 18(f)는 형광올 나타내는 이미다졸리움을 포함하는 화합물 (실시예 1의 단계 2 화합물 ) 10μΜ을， NaOCl 200 μ M로 전처리한 RAW 264.7 세포에 라벨한 후, 실험예 <10-1>에서 준비한 이 -광자 형광 현 미경 (Tw으 Photon Fluorescence Microscopy)을 사용하아 형광 이미지이 다,
도 18(g)는 상기 도 18(a-f)에 해당하는 군의 형광 강도를 각각 측정한 그래프를 나타내는 이미지이다. 도 18(a)에 나타난 바와 같이， RAW 264.7 세포가 치아염소산 (ocr)을 발생시키도록 유도하지 않고 실시예 1에서 쩨조한 화합물을 처리한 경우 형광이 관찰되지 않는 것으로 나타났다. 이에 반하여， 도 18(b) 및 도 18(c)에 나타난 바와 같이 , RAW 264.7 세포에 NaOCl 200 μΜ을 30분 동안 전처리하거나 R 264.7 세포가 치아염소산 (OCD 을 발생시키도록 유도하고 실시예 1에서 제조한 화합물을 처리한 경우 형광이 관찰되었다. 이로부터， 실시예 1에서 제조한 화합물이 RAW 264.7 세포의 세포질 내에 은전한 형태로 유지되는 것을 알 수 있다.
' 또한， 도 18(d) 및 도 18(e)에 나타난 바와 같이， MP0 억제제를 추가로 첨가한 경우 형광이 현저히 감소한 것으로 나타났다. 이로부터 치아염소산 (OCr) 생성 유도는 PMA로 인하여 발생하는 H202가 RAW 264.7 세포 내 존재하는 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase, MP0)에 의한 촉매반웅을 통해 치아염소산 (ocr)으로 전환됨을 다시 확인하였 다. 나아가， 도 18(f)에 나타난 바와 같이， 이미다졸리움을 포함하 는 화합물 (실시예 1의 단계 2 화합물) ΙΟμΜ을， NaOCl 200 μ M로 전처 리한 RAW 264.7 세포에 라벨한 경우 형광이 관찰되는 것으로 확인함으 로써 , 상기 형광 변회 "는， 상기 실험예 1의 도 3에서 확인한 바와 같이， 실시예 1에서 체조한 화합물의 5각형 고리에 결합되어 있는 황 (sulfur) 원자가 치아염소산 (OCr)과 반웅함으로써 산화되어 떨어져 나가， 양전하를 띄는 이미다졸리움이 생성됨으로써 발생하는 ji-공액 겨 -conjugation system) 변화에 기인하는 것을 확인하였다. 또한， 도 18(g)에 나타난 바와 같이 , RAW 264.7 세포에 NaOCl을 전처리하지 않거나 [도 18(a)], MP0 억제제를 추가로 참가하여 치아염 소산 (OCr)의 발생을 억제시킨 군 [도 18(d), 도 18(e)]의 경우 형광 강도가 매우 약하게 관찰되었다. 이에 반하여ᅳ RAW 264.7 세포에 NaOCl을 전처리하거나 [도 18(b)], 치아염소산 (OCr)의 발생을 유도하 거나 [도 18(c)], 실시예 1의 화합물이 치아염소산 (OCr)과 반응하여 형성되는 화합물 (실시예 1의 단계 2 화합물)을 NaOCl로 전처리한 세포 에 처리한 군 [도 18(f)]의 경우 강한 형광 강도가 관찰되는 것으로 나 타났다. 따라서， 본 발명에 따른 이미다졸린— 2-티온 구조 기반의 화합물 은 세포 내에서도 그 구조가 유지되며， 외인성 또는 내인성 차아염소 산 (ocr)과 선택적으로 반응하여 형광 스펙트럼이 변화하므로， 세포 내에서 치아염소산 (0Cr)올 검출하는 용도로 유용하게 사용할 수 있다. <실험예 11> 광 안정성 (photostability) 평가
RAW 264 7 세포에서 실시예 1에서 제조한 화합물의 광 안정성은 프로브-라벨된 RAW 264.7 세포의 세 위치 (three designated posi t ions)어]서 TPEF(Two—Phot on—Exc i t ed F 1 uor escence)의 변화를 관 찰함으로써 측정하였다 . 구체적으로， xyt 모드를 사용하여 한시간 동 안 2.00 sec 간격으로 디지털화된 (digitized) 강도를 기록하였다. 상 기 TPEF 강도는 팸토초 (femto second, fs) 필스 (pulse)와 함께 400- 500薩에서 수질하였으며， 800nm로 여기하였다 (실험 반복횟수 n = 3). 실험은 실시예 1에서 제조한 화합물이 라밸된 RAW 264.7 세포에 NaOCl 200 μΜ을 처리하지 않은 군 [도 19(a)], 실시예 1에서 제조한 화 합물이 라벨된 RAW 264.7 세포에 NaOCl 200 μ M를 처리한 군 [도 19(b)] 으로 나누어 수행하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다. 도 19(a)는 실시예 1에서 제조한 화합물이 라벨된 RAW 264.7 세 포에 NaOCl 200 μ M을 처리하지 않은 군의 형광 이미지이다 .
도 19(b)는 실시예 1에서 제조한 화합물이 라벨된 RAW 264.7 세 포에 NaOCl 200 μΜ을 처리한 군의 형광 이미지이다.
도 19(c)는 실시예 1에서 제조한 .화합물이 라벨된 RAW 264.7 세 포에 NaOCl 200 μ M을 처리하지 않은 군 [도 19(a) ] , 실시예 1에서 제조 한 화합불이 라벨된 RAW 264.7 세포에 NaOCl 200 μ M를 처리한 군 [도
19(b)]에 대하여 TPEF(Two-Photon-Excited Fluorescence)의 변화를 관 찰한 이미지이다 · ' 도 19(a)에 나타난 바와 같이， NaOCl을 처리하지 않은 군은 형 광이 관찰되지 않았으며 , 도 19(b)에 나타난 바와 같이 NaOCl을 처리 한 경우 형광이 관찰되는 것으로 나타났다. 또한， 상기 각 군에 대하 여 TPEF(Two-Phot on-Excited Fluorescence)의 변화를 관찰한 경우 약 1시간 동안 형광 강도가 유지되는 것으로 나타나 광 안정성 (photostabi lity)이 우수함을 확인하였다.
<실험예 12> 래트 해마 절편 (rat hippocampal slice) 내 치아염 소산 검출능력 평가
래트 해마 절편 (rat hippocampal si ice) 내 치아염소산 검출능 력을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<12-1> 실험 준비
해마 절편 (hippocampal slice)올 30분 동안 PMA(10 ng/ml ,
Sigma)로 처리하였다. 이후, 상기 절편을 4% 포름알데하이드로 고정하 고， PBS(Phosphate-buf fered saline)에 용해된 0.2¾> 트리톤 (Triton) X-100으로 투과하였다. 상기 절편을 lba-1 항체 (소교세포의 일차 항체， 1:200， Wako pure Chemical lndus.tr ies)와 함께 25°C에서 24시간 동안 배양하였다. 이후， 상기 절편은 Alexa Fluor 555(1:500， Invitrogen) 으로 결합된 이차 항체와 함께 25°C에서 1시간 동안' 배양하였다. <12-2> 래트 해마 절편 내 치아염소산 검출능력 평가
실험은 상기 실험예 <12-1>에서 준비한 해마 절편에 실시예 1에 서 제조한 화합물 100 μΜ을 처리한 군 [도 20(a), 도 20(d)], 상기 실 험예 <12-1>에서 준비한 해마 절편에 ΡΜΑ 10 ng/mL를 전처리하여 치아 염소산 (OCr) 발생을 유도한 후, 실시예 1에서 제조한 화합물 100 μΜ 흘 처리한 군 [도 20(b), 도 20(e)], 상기 실험예 <12ᅳ1>에서 준비한 해마 절편에 실시예 1 단계 2 화합물 100 μΜ을 처리한 군 [도、 20(c), 도 20(f)]으로 나누어 수행하였으며 , 형광 이미지와 형광 강도는 상기 실험예 11과 동일한 방법으로 수행하여 측정하였다. 그 결과를 도 20 에 나타내었다. 도 20(a)는 해마 절편에 실시예 1에서 제조한 화합물 100 μΜ을 처리한 군에 있어서， 상기 해마 절편의 CA1 부분의 형광을 관찰한 이 미지이다 ᅳ
도 20(b)는 해마 절편에 ΡΜΑ 10 ng/mL를 전처리하여 치아염소산
(0C1 ) 발생을 유도한 후, 실시예 1에서 제초한 화합물 100 μΜ을 처리 한 군에 있어서 , 상기 해마 절편의 CA1 부분의 형광을 관찰한 이미지 이다.
도 20(c)는 해마 절편에 실시예 1 단계 2 화합물 100 μ Μ을 처리 한 군에 있어서 , 상기 해마 절편의 CA1 부분의 형광을 관찰한 이미지 이다.
도 20(d)는 해마 절편에 실시예 1에서 제조한 화합물 ΙΟΟμΜ을 처리한 군에 있어서， 상기 해마 절편의 CA3 부분의 형광올 관찰한 이 미지이다..
도 20(e)는 해마 절편에 ΡΜΑ 10 ng/mL를 전처리하여 치아염소산
(OCr) 발생을 유도한 후 , 실시예 1에서 제조한 화합물 ΙΟΟμΜ을 처리 한 군에 있어서， 상기 해마 절편의 CA3 부분의 형광을 관찰한 이미지 이다.
도 20(f)는 해마 절편에 실시예 1 단계 2 화합물 100 μ M을 처리 한 군에 있어서 , 상기 해마 절편의 CA3 부분의 형광을 관찰한 이미지 이다 .
도 20(g)는 해마 절편 CA1 및 CA3 부분의 명시야 (bright-field) 이미지 '이다 . ■ '
도 20(h)는 실험은 상기 실험예 <12-1>에서 준비한 해마 잘편에 실시예 1에서 제조한 화합물 ΙΟΟμΜ을 처리한 군 [도 20(a), 도 20(d)], 상기 실험예 <12-1〉에서 준비한 해마 절편쌔 ΡΜΑ 10 ng/mL를 전처리하 여 치아염소산 ΧΓ) 발생을 유도한 후, 실시예 1에서 제조한 화합물 100 μΜ을 처리한 군 [도 20(b), 도 20(e)]， 상기 실험예 <12-1>에서 준 비한 해마 절편에 실시예 1 단계 2 화합물 100 μΜ을 처리한 군 [도 20(c), 도 20(f)]의 형광 강도를 각각 측정한 그래프를 나타내는 이미 지이다 . ' ' 도 20(a) 및 도 20(d)에 나타난 바와 같이 , 해마 절편에 실시예 1에서 제조한 화합물 ΙΟΟμΜ을 처리한 군에서 관찰 가능한 정도인 형 광이 나타났다. 아와 비교하여 , 도 20(b) 및 도 20(e)에 나타난 바와 같이， 해마 절편에 ΡΜΑ 10 ng/mL를 전처리하여 치아염소산 (0C1— ) 발생 을 유도한 후， 실사예 1에서 제조한 화합물 100 μΜ을 처리한 군에서는 보다 더욱 강한 형광이 관찰되었다. 또한， 도 20(c) 및 도 20(f)에 나 타난 바와 같이， 실시예 1의 화합물이 치아염소산 (ocr)과 반웅하여 형성되는 화합물 (실시예 1의 단계 2 화합물) ΙΟΟμΜ을 처리한 군에서 도 강한 형광이 관찰되었다. 따라서， 본 발명에 따른 이미다졸린 -2-티온 구조 가반의 화합물 은 세포 내에서도 그 구조가 유지되며， 외인성 또는 내인성 치아염소 산 (ocr)과 선택적으로 반웅하여 형광 스펙트럼이 변화하므로， 세포 내에서 치아염소산 (0c 을 검출하는 용도로 유용하게 사용할 수 있다.
【산업상 이용가능성】
본 발명에 따른 이미다졸린 -2-티은 구조 기반의 화합물은 세포 내 환경에서도 그 구조가 유지되며， 외인성 또는 내인성 치아염소산 (ocr)과 선택적으로 반웅하여 형광 또는 흡광 스펙트럼이 변화하므로， 세포 내에서 치아염소산 (OCr)을 검출하는 용도로 유용할 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
Figure imgf000042_0001
(상기 화학식 1에서，
R1 및 R2는 독립적으로 -0H, 할로겐， d-io의 직쇄 또는 측쇄 안 ¾ d-K)의 직쇄 또는 측쇄 알콕시 또는 -(CH2)nR5이고，
여기서， 상기 R5는 N, 0 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되 는 헤테로 원자를 하나 이상 포함하는 5-10원자의 헤테로고리이고， n 은 1-10의 정수이고;
R3 및 R4는 독립적으로 -H, -0H, 할로겐， 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 (^-10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이고;
여기서， 상기 R3 및 R4는 이들이 연결된 원자들과 함께 (：6-10의 아릴을 형성할 수 있고;
E 및 Q는 독립적으로 C 또는 N이다)
[청구항 2】
제 1항에 있어서，
R1 및 R2는 독립적으로 의 직쇄 또는. 측쇄 알킬이고;
R3 및 R4는 독립적으로 수소이고;
여기서， 상기 R3 및 R4는 이들이 연결된 원자들과 함께 (：6-10의 아릴을 형성할 수 있고;
E 및 Q는 독립적으로 C 또는 N인 것을 특징으로 하는 화합물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서，
R1 및 R2는 독립적으로 메틸이고 ;
R3 및 R4는 독립적으로 수소이고 여기서， 상기 R3 및 R4는 이들이 연결된 원자들과 함께 페닐을 형성할 수 있고;
E 및 Q는 독립적으로 C 또는 N인 것을 특징으로 하는 화합물.
[청구항 4】
제 1항에 있어서，
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선 택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물:
(1) 1,3-디메 ¾-1Η-이미다조 [4,5-b]페나진 -2(3H)-티은 ; 및
(2) 1,3-디쩨틸 -1H—나프토 [2,3-d]이미다졸 -2(3H)-티온.
[청구항 5】
하기 반웅식 1에 나타난 바와 같이，
화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜， 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계 (단계 1); 상기 단계 1에서 제조한 화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 5로 표시되는 화합물을 반웅사켜， 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제 조하는 단계 (단계 2); 및
상기 단계 2에서 제조한 화학식 6으로 표시되는 화합물에 황
(sulfur)을 첨가하고 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하 는 단계 (단계 3) ;를 포함하는 제 1항의 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법 :
Figure imgf000043_0001
a계 3
R
II I 丄 >=s
R4人 Q쯔^
1 R2
(상기 반웅식 1에 있어서，
R1, R2, R3, R4, E 및 Q는 독립적으로 제 1항의 화학식 1에서 정 의한 바와 같고;
X는 할로겐이다) .
[청구항 6】
제 1항의 화합물을 포함하는 치아염소산 (ocr) 검출용 화학센서 .
[청구항 7】
제 6항에 있어서，
상기 화학센서는 생체시료 중에서 치아염소산 (ocr)을 검출하는 것을 특징으로 하는 화학센서 .
【청구항 8】
시료에 제 6항의 화학센서를 첨가하는 단계 (단계 1);
상기 단계 1에서 준비한 시료에 광원을 조사하는 단계 (단계 2); 및 '
형광 또는 흡광 특징의 변화를 단독으로 또는 흔합하여 측정하는 단계 (단계 3);를 포함하는 치아염소산 (0C1 )의 검출방법 .
【청구항 9】
제 8항에 있어서，
상기 검출방법은 생체시료 중에서 치아염소산 (ocr)을 검출하는 것을 특징으로 하는 검출방법 .
[청구항 10】
제 8항에 있어서 '
상기 검출방법은 계 1항의 화학식 1로 표시되는 화합물의 5각형 고리에 결합되어 있는 황 (sulfur) 원자가 치아염소산 (OCr)과 반응함으로써 산화되어 떨어져 나가， 양전하를 띄는 이미다졸리움이 생성됨으로써 발생하는 JI -공액계 ( JI -conjugation system) 변화에 기인하는 형광 또는 흡광 특징의 변화를 단독으로 또는 흔합하여 측정하는 것을 특징으로 하는 검출방법 .
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