CN104230836A - 苯基恶唑类化合物及在制备治疗癌症的药中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了两种新的苯基恶唑类化合物及其在预防防治癌症药物中的应用，同时还提供了两种化合物的制备方法。本发明中的两种化合物均可通过抑制microRNA-21癌症因子的表达以及抑制肿瘤细胞的生长与迁移来达到预防防治宫颈癌、结肠癌、肝癌和乳腺癌等癌症疾病的效果。同时，本发明所使用的小分子药物易于获取，价格低廉，性质稳定，便于保存和运输。

Description

苯基恶唑类化合物及在制备治疗癌症的药中的应用
技术领域
本发明涉及苯基恶唑类化合物及其制备方法，以及该类化合物在治疗各类癌症药物中的应用，具体涉及两种新的苯基恶唑类化合物及其应用。属于药物合成、药物化学和生物医药技术领域。
背景技术
癌症在中国城市已成为首位死因，在农村为第二位死因。随着生活方式的转变，环境污染等问题，如何预防和治疗癌症相关疾病将成为未来影响我国人民身体健康水平和医疗卫生事业发展的关键问题。虽然我国把抗癌药物的研发作为优先项目进行发展，但是西方式的传统药物研发的高投入和低产出的现状限制了包括中国在内的创新药物的发展。目前世界范围内对西方的药物研发模式存在诸多质疑，其困境主要有两个原因所造成。一是药物靶点过少：目前临床上市的两千多个药物的靶点仅为三百个左右，主要分布于激素受体和GPCR等七类基因家族。二是对疾病的发生以及蛋白质信号网络了解的不清楚，导致药物的临床开发失败，成本过高。
许多癌症的发生是多个基因发生突变导致的复杂疾病，过去单一靶点药物常常会导致耐药性或者疗效不高，因此目前迫切需要能同时调控多个靶点的新型药物，从而调控整个癌症发生的网络。基于miRNA在体内的重要功能，miRNA的表达异常会导致诸多疾病的发生，因此近年来成为在癌症治疗中日益关注的新药靶点以及诊断标志物。目前，国外针对miRNA已经开发出几十种miRNA的模拟物或抑制物进行临床试验，增强或抑制相关miRNA在体内的表达，但是这些药物均为核酸类药物，因此这些核酸类药物在体内的稳定性、细胞穿透性和靶向特异性等问题将可能重复过去几十年反义核酸类药物的临床失败问题。化学小分子相对于核酸类药物具有更高的安全性和临床效果，可以成为调控miRNA表达进行疾病治疗的新型药物，但是目前国内外尚无相关化学小分子类药物进入临床试验。
5-甲基-2-(4-甲氧基苯基)-4-噁唑甲酸乙酯是目前已知的一种苯基恶唑类化合物，其结构式如式(I)所示：
该化合物分子式为C14H15NO4，分子量为261.2，浅黄色固体，熔点为79-80℃。目前关于该化合物的研究仅限于其合成方法的研究，没有关于其应用的研究；而且关于苯基恶唑类化合物的研究也仅限于其合成方法的研究。因此发现新的苯基恶唑类化合物并发掘其用途是本领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的在于提供两种新的苯基恶唑类化合物(Ⅱ)、(III)。
所述化合物(Ⅱ)为：5-甲基-2-(4-苄氧基苯基)-4氯甲基噁唑，其结构式如下：
所述化合物(III)为：2-(4-甲氧基-N-(2-(4-苄氧基苯基)-5-甲基恶唑-4-取代)甲基)苯基磺酰胺)-3-甲基丁酸，其结构式如下：
化合物(Ⅱ)可以采用两种制备方法，即方法一或方法二均可制得化合物(Ⅱ)。方法一的工艺流程如下：
方法一主要包括如下步骤：以乙酰乙酸乙酯为起始原料，通过亚硝化反应，得到α-羟亚氨基化合物；然后在氯化氢气体饱和的醋酸溶液中，α-羟亚氨基化合物与4-苄氧基苯甲醛缩合，生成不稳定的中间体氮氧化合物；还原中间体氮氧化合物，制得化合物：5-甲基-2-(4-苄氧基苯基)-4-噁唑甲酸乙酯；用氢化铝锂还原化合物5-甲基-2-(4-苄氧基苯基)-4-噁唑甲酸乙酯得化合物5-甲基-2-(4-苄氧基苯基)-4-羟甲基噁唑，再通过二氯亚砜或三氯氧磷氯代得到化合物(Ⅱ)。
本发明所述的苯基恶唑类化合物(Ⅱ)的合成方法二的工艺流程如下：
方法二主要包括如下步骤：以二丁酮单肟为起始原料，在氯化氢气体饱和的醋酸溶液中，二丁酮单肟与4-苄氧基苯甲醛缩合，乙醚溶液沉淀，抽滤分离得不稳定的中间体氮氧化合物；中间体氮氧化合物直接用二氯亚砜或三氯氧磷在干燥的氯仿溶液中回流，同时发生还原氯代反应，一步合成化合物(Ⅱ)：5-甲基-2-(4-苄氧基苯基)-4氯甲基噁唑。
由于方法一合成路线长，导致最终产物收率较方法二要低，因此通常优选方法二合成化合物(Ⅱ)。
本发明的另一目的是提供了苯基恶唑类化合物(III)的合成方法，本发明所述的苯基恶唑类化合物(III)的合成工艺流程如下：
以L-缬氨酸为起始原料，采用氯化亚砜法合成缬氨酸甲酯盐酸盐；缬氨酸甲酯盐酸盐在弱碱条件下与对甲氧基苯磺酰氯反应得中间体N-对甲氧苯磺酰L-缬氨酸甲酯；将化合物N-对甲氧苯磺酰L-缬氨酸甲酯、化合物(II)溶于无水DMF中，搅拌下加入相转移催化剂四正丁基氯化铵、无水K2CO3，室温搅拌2～3天，至反应完毕，采用TLC跟踪反应；加入饱和食盐水，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，依次用饱和食盐水、蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸去溶剂，残留物用硅胶柱分离纯化可得化合物2-(4-甲氧基-N-(2-(4-苄氧基苯基)-5-甲基恶唑-4-取代)甲基)苯基磺酰胺)-3-甲基丁酸甲酯；将化合物2-(4-甲氧基-N-(2-(4-苄氧基苯基)-5-甲基恶唑-4-取代)甲基)苯基磺酰胺)-3-甲基丁酸甲酯溶于甲醇水溶液中，搅拌下缓慢滴加NaOH水溶液，室温搅拌至反应完毕，TLC跟踪反应；减压蒸去甲醇溶剂，搅拌下缓慢滴加HCl溶液，调节PH值到6-7，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，再依次用饱和食盐水、蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸去溶剂，残留物用硅胶柱分离纯化或重结晶得化合物(III)：2-(4-甲氧基-N-(2-(4-苄氧基苯基)-5-甲基恶唑-4-取代)甲基)苯基磺酰胺)-3-甲基丁酸。
本发明的另一个目的在于提供上述化合物(Ⅱ)、(III)分别在制备治疗癌症的药物中的应用，如在制备治疗宫颈癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌等癌症疾病的药物中的应用。其原理在于：两种苯基恶唑类化合物均可以通过抑制microRNA-21在体内的表达，以及抑制肿瘤细胞的生长和迁移来达到治疗癌症的效果。苯基恶唑类化合物作为化学小分子药物候选分子在制备和治疗宫颈癌、结肠癌，肝癌和乳腺癌等癌症疾病中有着非常重要的作用。
本发明分别对化合物(Ⅱ)和(III)进行了活性试验，并在肿瘤动物模型中对肿瘤细胞的生长抑制影响进行了研究，以评价其对不同肿瘤细胞生长的抑制作用。另外用人体肿瘤转移模型，包括：对人宫颈癌细胞HeLa淋巴结转移模型、人结肠癌细胞HCT116肝脏转移模型、人肝癌细胞HCCMLL3肺转移模型、人乳腺癌细胞MDA-MB-435s肺转移模型，以及划痕试验来考察了两种化合物对多种肿瘤细胞迁移能力的影响，表明了该药物对肿瘤细胞的迁移能力具有明显的抑制作用。
此外，本发明还对化合物(Ⅱ)和(III)进行了细胞毒性试验，结果表明这两种化合物在细胞水平均没有毒副作用。
本发明所述的化合物(Ⅱ)和(III)均可直接作为药物使用，其余辅料为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的药用载体。分别以化合物(Ⅱ)、(III)为有效成份，以单位体重使用量的形式使用。通过实验可以看出，化合物(Ⅱ)、(III)用量为5mg/kg～50mg/kg时，均对肿瘤生长和迁移有明显的抑制作用。
本发明的优点在于：
1.本发明中化合物(Ⅱ)、(III)为新化合物，提供了合成化合物(Ⅱ)、(III)的方法，同时对化合物(Ⅱ)、(III)发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
2.化合物(Ⅱ)、(III)易于获取，价格低廉，性质稳定，便于保存和运输。
3.化合物(Ⅱ)、(III)在细胞水平没有毒副作用。
4.化合物(Ⅱ)、(III)可以通过抑制microRNAs在体内的表达，以及抑制肿瘤细胞的生长和迁移来达到治疗癌症的效果。
附图说明
图1是化合物(Ⅱ)、(III)的细胞毒试验。
图2是化合物(Ⅱ)、(III)对瞬时转染和稳定转染细胞中致癌microRNA表达的抑制作用。
图3是化合物(Ⅱ)、(III)在动物实验中对肿瘤生长的抑制作用。
图4是化合物(Ⅱ)、(III)在划痕试验中对肿瘤细胞迁移能力的抑制作用。
图5是化合物(Ⅱ)、(III)在动物实验中对人宫颈癌细胞HeLa淋巴结转移能力的抑制作用。
图6是化合物(Ⅱ)、(III)在动物实验中对人结肠癌细胞HCT116肝脏转移能力的抑制作用。
图7是化合物(Ⅱ)、(III)在动物实验中对人肝癌细胞HCCMLL3肺转移能力的抑制作用。
图8是化合物(Ⅱ)、(III)在动物实验中对人乳腺癌细胞MDA-MB-435s肺转移能力的抑制作用。
具体实施方式
实施例1
5-甲基-2-(4-苄氧基苯基)-4氯甲基噁唑的合成方法一如下：
将乙酰乙酸乙酯(10mmol)溶于NaNO2(10mmol)的醋酸溶液(10mL)中，搅拌冷却到5-7℃条件下，进行亚硝化反应，反应完成后加入乙醚(50mL)，过滤收集析出的结晶，用甲醇-乙醚按体积比1:5再重结晶，得到α-羟亚氨基化合物；然后在氯化氢气体饱和的醋酸溶液(50mL)中，α-羟亚氨基化合物(5.0mmol)与4-苄氧基苯甲醛(5.0mmol)缩合，生成不稳定的中间体氮氧化合物；运用催化加氢还原中间体氮氧化合物，制得化合物：5-甲基-2-(4-苄氧基苯基)-4-噁唑甲酸乙酯；用氢化铝锂还原化合物5-甲基-2-(4-苄氧基苯基)-4-噁唑甲酸乙酯得化合物5-甲基-2-(4-苄氧基苯基)-4-羟甲基噁唑，再通过二氯亚砜或三氯氧磷氯代得到化合物(Ⅱ)：5-甲基-2-(4-苄氧基苯基)-4氯甲基噁唑(0.53mmol，0.159g)，产率53％。
5-甲基-2-(4-苄氧基苯基)-4氯甲基噁唑的合成方法二如下：
将丁二酮单肟(1.0g,9.9mmol)，4-苄氧基苯甲醛(9.9mmol)溶于冰醋酸(10mL)中，搅拌下冷却到0℃，通入干燥的氯化氢气体，至到反应完毕(TLC跟踪)，搅拌下加入乙醚(30mL)，白色沉淀立即析出，过滤，少量乙醚(2×10mL)洗涤，真空抽干，得白色粉粉末状固体，再将所得的白色固体溶于干燥的氯仿(50mL)中，搅拌下滴入POCl3(1.0mL)，然后加热回流30min，转入分液漏斗中，依次用NaHCO3水溶、蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸去溶剂，残留物用重结晶[石油醚(bp 60-90℃)/丙酮]纯化得化合物(Ⅱ)：5-甲基-2-(4-苄氧基苯基)-4氯甲基噁唑(8.019mmol，2.403g)，产率90％。
化合物(Ⅱ)的理化参数：无色立方晶体；熔点：99.7-100.3℃；核磁共振氢谱数据(600兆赫，氘代氯仿):化学位移＝2.40(s,3H),4.54(s,2H),5.11(s,2H),7.02(d,J＝8.8Hz,2H),7.34(t,J＝7.3Hz,1H),7.39(t,J＝7.6Hz,2H),7.44(d,J＝7.5Hz,2H),7.94(d,J＝8.7Hz,2H)；核磁共振碳谱数据(150兆赫,氘代氯仿):化学位移＝160.5,160.1,146.0,136.5,132.6,128.6,128.1,127.9,127.5,120.3,115.0,70.1,37.4,10.3；高分辨率电喷雾电离质谱数据：m/z:314.0944[M+H]+(分析结果为：C18H17 35ClNO2:314.0870),316.0921[M+H]+(分析结果为：C18H17 37ClNO2:316.0840)。
按本例的方法一制得化合物(Ⅱ)0.159g，将产物5mg溶解于0.5mLDMSO中制成10mg/mL的母液，混合均匀后，待后续活性试验用。将剩余产物溶于2.5％乙醇、2.5％蓖麻油的生理盐水中，混合均匀后分装成1mg/mL/支和10mg/mL/支浓度的注射液装入药瓶中密封，消毒制成产品备用。
按本例的方法二制得化合物(Ⅱ)2.403g，将产物10mg溶解于1mLDMSO中制成10mg/mL的母液，混合均匀后，待后续活性试验用。将剩余产物溶于2.5％乙醇、2.5％蓖麻油的生理盐水中，混合均匀后分装成5mg/mL/支和20mg/mL/支浓度的注射液装入药瓶中密封，消毒制成产品备用。
实施例2 化合物(III)的制备
2-(4-甲氧基-N-(2-(4-苄氧基苯基)-5-甲基恶唑-4-取代)甲基)苯基磺酰胺)-3-甲基丁酸的合成方法如下：
将无水甲醇(100mL)冷却到-10℃，搅拌下缓慢加入SOCl2(4mL)，10分钟后，加入L-缬氨酸(5.0g，43mmol)，室温搅拌2天后，减压浓缩，再加入无水甲醇(2×40mL)，反复浓缩两次。加入乙醚(50mL)，过滤收集析出的结晶，用甲醇-乙醚(1:5)再重结晶，得缬氨酸甲酯盐酸盐(6.9g，96％)，mp 154～155.2℃。将L-缬氨酸甲酯盐酸盐(5.0g，30mmol)，对甲氧苯磺酰氯(30.0mmol)溶于无水乙腈(100mL)中，冷却到0℃，搅拌下缓慢滴入N-甲基吗啉(2.0mL)，再室温搅拌至反应完毕(TLC跟踪反应)。过滤，减压浓缩，残留物溶于乙酸乙酯(100mL)中，依次用稀盐酸(1N)、饱和NaHCO3水溶、水洗、无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸去溶剂，得到白色固体，再用石油醚-乙酸乙酯(1:8)重结晶得纯品N-对甲氧苯磺酰L-缬氨酸甲酯。将化合物N-对甲氧苯磺酰L-缬氨酸甲酯(3.0mmol)、化合物(Ⅱ)5-甲基-2-(4-苄氧基苯基)-4氯甲基噁唑(3.0mmol)溶于无水DMF(20mL)中，搅拌下加入10mg(0.09mmol)相转移催化剂四正丁基氯化铵，480mg(3.5mmol)无水K2CO3，室温搅拌2～3天，至反应完毕(TLC跟踪反应)，加入饱和食盐水(50mL)，乙酸乙酯(3×40mL)萃取，合并乙酸乙酯萃取液，依次用饱和食盐水、蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸去溶剂，残留物用硅胶柱分离纯化[石油醚(bp60-90℃)/乙酸乙酯]可得化合物2-(4-甲氧基-N-((2-(4-苄氧基苯基)-5-甲基恶唑-4-取代)甲基)苯基磺酰胺)-3-甲基丁酸甲酯。将化合物2-(4-甲氧基-N-((2-(4-苄氧基苯基)-5-甲基恶唑-4-取代)甲基)苯基磺酰胺)-3-甲基丁酸甲酯(2.0mmol)溶于40mL甲醇水溶液(3:1)中，搅拌下缓慢滴加1N NaOH水溶液(4.0mL)。室温搅拌至反应完毕(TLC跟踪反应)，减压蒸去甲醇溶剂，搅拌下缓慢滴加1N HCl溶液，调节PH值到6-7，乙酸乙酯(3×30mL)萃取，合并乙酸乙酯萃取液，再依次用饱和食盐水、蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸去溶剂，残留物用硅胶柱分离纯化[石油醚(bp 60-90℃)/乙酸乙酯]得化合物(III)：2-(4-甲氧基-N-(2-(4-苄氧基苯基)-5-甲基恶唑-4-取代)甲基)苯基磺酰胺)-3-甲基丁酸(28.2mmol，16.53g)，产率90％。
化合物(III)的理化参数：白色固体；核磁共振氢谱数据(600兆赫，氘代氯仿):化学位移＝1.09(d,J＝6.6Hz,3H),1.15(d,J＝6.7Hz,3H),2.47(s,3H),2.52(m,1H),3.48(s,3H),4.14(br.s,1H),4.43(s,2H),5.12(s,2H),6.69(d,J＝8.6Hz,2H),6.98(d,J＝8.6Hz,2H),7.35(t,J＝7.2Hz,1H),7.40(t,J＝7.6Hz,2H),7.44(d,J＝7.6Hz,2H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.68(d,J＝8.8Hz,2H)；核磁共振碳谱数据(150兆赫,氘代氯仿):化学位移＝170.8,162.7,161.0,160.0,144.4,136.3,131.6,130.5,129.2,128.7,128.2,127.9,127.5,118.6,115.2,113.5,70.1,55.2,30.9,29.7,20.6,20.4,10.1；高分辨率电喷雾电离质谱数据：m/z:587.1813[M+Na]+(分析结果为：C30H32N2NaO7S:587.1822)。
按本例的方法制得化合物(III)16.53g，将产物5mg溶解于0.5mLDMSO中制成10mg/mL的母液，混合均匀后，待后续活性试验用。将剩余产物溶于2.5％乙醇、2.5％蓖麻油的生理盐水中，混合均匀后分装成1mg/mL/支和10mg/mL/支浓度的注射液装入药瓶中密封，消毒制成产品备用。
实施例3
按实施例2的方法制得化合物(III)16.55g，与实施例2相同之处不再赘述，不同之处在于，残留物用重结晶[石油醚(bp 60-90℃)/丙酮]得化合物(III)：2-(4-甲氧基-N-(2-(4-苄氧基苯基)-5-甲基恶唑-4-取代)甲基)苯基磺酰胺)-3-甲基丁酸，产率90％。
将产物5mg溶解于0.5mL DMSO中制成10mg/mL的母液，混合均匀后，待后续活性试验用。将剩余产物溶于2.5％乙醇、2.5％蓖麻油的生理盐水中，混合均匀后分装成5mg/mL/支和20mg/mL/支浓度的注射液装入药瓶中密封，消毒制成产品备用。
实施例4
化合物(Ⅱ)、(III)的细胞毒性试验。
将长满的细胞经过PBS清洗，胰酶消化后，均匀接种于96孔板。待其贴壁汇合度达到80％以上，将化合物(Ⅱ)、(III)母液分别按1μM、10μM、25μM、50μM浓度梯度分别加入培养基中，设置复孔3个，作为实验组，DMSO作为对照组。继续分别培养24h、72h以后，每孔加入10μl Am-blue检测试剂(上海生博生物医药有限公司)，继续放置在培养箱中，待其培养基颜色由蓝色转变为粉红色以后，在波长为530-560nm下检测吸光值。
试验结果如图1，说明化合物(Ⅱ)、(III)没有细胞毒性作用。
实施例5
以化合物(Ⅱ)、(III)在宫颈癌药物中的应用为例，进行活性试验。
首先，通过分子克隆把目的片段microRNA(以microRNA-21为例)连接在含有荧光素酶报告基因的pCI-neo载体上。将宫颈癌肿瘤细胞接种于24孔板，待其贴壁汇合度达到80％以上把克隆完成的去内毒素质粒0.5μg和内参质粒0.3μg(质粒和50μl OPTI-MEM均匀混合)通过脂质体转染试剂(2μl TransEasy和50μl OPTI-MEM均匀混合)，总体积约100μl进入宫颈癌细胞进行表达，6小时后换液并加药对细胞进行处理，分别给予化合物(Ⅱ)、(III)母液10μM作为实验组，DMSO作为对照组。24小时后用裂解液裂解细胞得到蛋白，离心后取上清50μl，再加入50μl荧光素酶底物，用黑色96孔板在多功能读数仪上分析结果。另取60μl蛋白上清测定β-gal的表达量来校正各个荧光素酶的表达量。然后观察对照组与加药组的荧光素酶报告基因的表达变化从而来说明小分子药物是否对microRNA-21的表达有影响。因为microRNA-21的表达异常会导致诸多疾病的发生，因此近年来成为在癌症治疗中日益关注的新药靶点以及诊断标志物。
试验结果如图2，说明化合物(Ⅱ)、(III)对致癌microRNA-21表达具有抑制作用。紧接着通过构建具有稳定表达microRNA-21的含有荧光素酶报告基因的稳定细胞系来再次验证化合物(Ⅱ)、(III)对microRNA-21的表达的影响。把上述克隆完成的去内毒素质粒0.8μg(质粒和50μl OPTI-MEM均匀混合)通过脂质体转染试剂(2μl TransEasy和50μl OPTI-MEM均匀混合)，进入宫颈癌细胞进行表达，6小时后换成含有新霉素的培养基，培养细胞2-3周，直到只剩下具有稳定表达的单克隆为止。然后将新霉素浓度减半，对单克隆进行培养扩大。将具有稳定表达的细胞接种于96孔板100μl，然后分别加入化合物(Ⅱ)、(III)母液10μM作为实验组，DMSO作为对照组，表达24小时后用裂解液裂解细胞得到蛋白，离心后取上清50μl，再加入50μl荧光素酶底物，用黑色96孔板在多功能读数仪上分析结果。试验结果如图2，说明microRNA-21基因在细胞体内稳定表达以后，给予化合物(Ⅱ)或(III)均能够抑制体内microRNA-21的表达，从而阻止体内microRNA-21互补配对通过转染进入体内稳定表达的microRNA-21基因，通过荧光素酶的表达量来反应出化合物(Ⅱ)、(III)对致癌microRNA-21的表达的抑制作用强弱，实验结果说明化合物(Ⅱ)、(III)抑制作用能分别达到4.8、2.5倍左右。
实施例6 动物试验例
以化合物(Ⅱ)、(III)在肿瘤动物模型中抑制肿瘤细胞裸鼠异体移植肿瘤的生长为例。
选择6-8周，体重20±1g的雌性Balb/C nunu裸鼠(SPF清洁级)作为试验对象。试验前在实验室动物房饲养两周，待其适应环境后开始试验。收集对数生长期的肿瘤细胞，包括宫颈癌、结肠癌、肝癌和乳腺癌细胞，在保持无菌状态下将肿瘤细胞分别注射到小鼠右侧Flank部位皮下，当80％小鼠皮下肿瘤体积大于等于100mm3时，淘汰肿瘤体积在100±10mm3范围之外的小鼠，将其余小鼠进行随机分成8组，每组6只。
实验组隔天分别静脉注射给药化合物(Ⅱ)、(III)，分为高剂量组50mg/kg，中剂量组25mg/kg，低剂量组5mg/kg。将第一次给药作为第0天，隔天观察小鼠状态，包括进食量、进水量、活动状态等，记录肿瘤体积。试验结果如图3，可以看出，化合物(Ⅱ)、(III)对肿瘤细胞裸鼠异体移植肿瘤的生长有明显的抑制作用。
实施例7 划痕试验例
在6孔板中每孔加入500μl 0.1％的明胶溶液，振摇至明胶溶液均匀铺在板底。将6孔板放在孵箱，37℃孵育30分钟，使明胶均匀覆盖在板底，利于细胞生长。在每孔中接入适量细胞，在37℃、5％CO2条件下培养过夜，第二天观察待到细胞达到80％汇合，用灭菌的10μl枪头在每孔中划一道宽度均匀的直线。弃去孔中培养基，分别加入不同浓度母液：1μM、10μM、20μM的化合物(Ⅱ)、(III)处理宫颈癌、结肠癌、肝癌和乳腺癌肿瘤细胞。0小时和24小时在划痕的同一位置观察并记录细胞的迁移情况。试验结果如图4所示，可以看出，化合物(Ⅱ)、(III)对肿瘤细胞的迁移具有明显的抑制作用。
实施例8 动物试验例
以化合物(Ⅱ)、(III)在人宫颈癌细胞HeLa淋巴结转移模型药物中的应用为例。
为了确认化合物(Ⅱ)、(III)在体内的抗肿瘤转移活性，发明人建立了人宫颈癌细胞HeLa淋巴结转移模型。
裸鼠选用5-6周，体重20±1g的雌性Balb/C nunu裸鼠(SPF清洁级)，实验前在实验室动物房饲养两周，待其适应实验室环境后再开始试验。首先收集对数生长期的肿瘤细胞，离心去上清，用无血清培养基洗涤沉淀三次去除残余的胰酶和血清，调整细胞浓度至1×108个/mL，然后将肿瘤细胞加到无菌的EP管中，放置在冰上送往动物房。期间应不断轻轻颠倒EP管，保持均一的单细胞状态。裸鼠接种部位为右侧肋腹部皮下，常规碘伏消毒接种部位，针头水平刺下皮下，挑起皮肤，缓慢将细胞悬液注入皮下，注射剂量200μl每只，含细胞总量2×107。每日观察裸鼠成瘤情况和裸鼠状态。待皮下肿瘤生长到长径0.7cm时，随机把裸鼠分为10组，每组4只。对照组隔天肿瘤周皮下注射生理盐水200μl，实验组隔天肿瘤周皮下分别注射化合物(Ⅱ)、(III)，给予浓度为1mg/mL/支的注射剂，化合物(Ⅱ)、(III)的用量均为5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg。治疗4周后，实验结束，解剖裸鼠时在肿瘤的附近可以发现转移的淋巴结，而给药组数量明显低于对照组。实验结果如图5，说明化合物(Ⅱ)、(III)具有明显的抑制宫颈癌细胞转移的能力。
实施例9
以化合物(Ⅱ)、(III)在人结肠癌细胞HCT116肝脏转移模型药物中的应用为例。
为了确认化合物(Ⅱ)、(III)在体内的抗肿瘤转移活性，发明人建立了人结肠癌细胞HCT116肝脏转移模型。模型采用脾脏注射法。该方法应用广泛，成功率高，转移程度均一。
裸鼠选用6-8周，体重20±1g的雌性Balb/C nunu裸鼠(SPF清洁级)，实验前在实验室动物房饲养两周，待其适应实验室环境后再开始试验。首先收集对数生长期的肿瘤细胞，离心去上清，用无血清培养基洗涤沉淀三次去除残余的胰酶和血清，调整细胞浓度至1×108个/mL，然后将肿瘤细胞加到无菌的EP管中，放置在冰上送往动物房。期间应不断轻轻颠倒EP管，保持均一的单细胞状态。裸鼠腹腔注射150μl水合氯醛生理盐水溶液(10％)麻醉，用酒精棉球消毒小鼠左侧皮肤。透过裸鼠皮肤可以看见左侧肋骨下缘有深色条状器官，也就是脾脏。在脾脏处切开皮肤和肌肉，将脾脏挤压到体外。然后用胰岛素针注射100μl肿瘤细胞悬液，注射不能穿透脾脏，注射完成可以看见脾脏泛白，轻轻拔出针尖。肿瘤细胞进入脾脏后沿毛细血管进入脾脏静脉，在肝门静脉处与肠系膜上静脉汇合进入肝脏。5分钟后切除脾脏并缝合腹腔，排除了脾脏内残留肿瘤细胞成瘤后对肝转移肿瘤的影响。待小鼠体温恢复后放回笼子饲养。接种第二天，小鼠随机分为10组，每组4只，空白对照组隔天给予静脉注射200μl生理盐水注射液，实验组采用浓度为5mg/mL/支的注射剂，隔天分别静脉注射给药，化合物(Ⅱ)、(III)用量均为5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg。10天后对照组小鼠体重减轻，进食量减少。处死小鼠后取出肝脏观察，对肝脏上肿瘤结节的数量进行统计。实验结果如图6，说明化合物(Ⅱ)、(III)给药组肿瘤结节数明显少于对照组，化合物(Ⅱ)、(III)对结肠癌的肝转移有很好的治疗效果。
实施例10
以化合物(Ⅱ)、(III)在人肝癌细胞HCCMLL3肺转移模型药物中的应用为例。
为了确认化合物(Ⅱ)、(III)在体内的抗肿瘤转移活性，发明人建立了人肝癌细胞HCCMLL3肺转移模型。做肺转移模型，一般用尾静脉注射，这样肿瘤细胞进入循环系统后能很快到达肺部。
裸鼠选用6-8周，体重20±1g的雌性Balb/C nunu裸鼠(SPF清洁级)，实验前在实验室动物房饲养两周，待其适应实验室环境后再开始试验。首先收集对数生长期的肿瘤细胞，离心去上清，用无血清培养基洗涤沉淀三次去除残余的胰酶和血清，调整细胞浓度至1×108个/mL，然后将肿瘤细胞加到无菌的EP管中，放置在冰上送往动物房。期间应不断轻轻颠倒EP管，保持均一的单细胞状态。通过尾静脉注射肿瘤细胞到动物体内，接种第二天，小鼠随机分为10组，每组4只，空白对照组隔天给予静脉注射200μl生理盐水注射液，实验组采用浓度为5mg/mL/支的注射剂，隔天分别静脉注射给药，化合物(Ⅱ)、(III)的用量均为5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg。10天后对照组小鼠体重减轻，进食量减少。处死小鼠后取出肺部观察，对肺部上肿瘤结节的数量进行统计。实验结果如图7，说明化合物(Ⅱ)、(III)给药组肿瘤结节数明显少于对照组，化合物(Ⅱ)、(III)对肝癌细胞的肺转移有很好的治疗效果。
实施例11
以化合物(Ⅱ)、(III)在人乳腺癌细胞MDA-MB-435s肺转移模型药物中的应用为例。
为了确认化合物(Ⅱ)、(III)在体内的抗肿瘤转移活性，发明人建立了人乳腺癌细胞MDA-MB-435s肺转移模型。做肺转移模型，一般用尾静脉注射，这样肿瘤细胞进入循环系统后能很快到达肺部。
裸鼠选用6-8周，体重20±1g的雌性Balb/C nunu裸鼠(SPF清洁级)，实验前在本实验室动物房饲养两周，待其适应本实验室环境后再开始试验。首先收集对数生长期的肿瘤细胞，离心去上清，用无血清培养基洗涤沉淀三次去除残余的胰酶和血清，调整细胞浓度至1×108个/mL，然后将肿瘤细胞加到无菌的EP管中，放置在冰上送往动物房。期间应不断轻轻颠倒EP管，保持均一的单细胞状态。通过尾静脉注射肿瘤细胞到动物体内，接种第二天，小鼠随机分为10组，每组4只，空白对照组隔天给予静脉注射200μl生理盐水注射液，实验组采用浓度为5mg/mL/支的注射剂，隔天分别静脉注射给药，化合物(Ⅱ)、(III)的用量均为5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg。10天后对照组小鼠体重减轻，进食量减少。处死小鼠后取出肺部观察，对肺部上肿瘤结节的数量进行统计。实验结果如图8，说明化合物(Ⅱ)、(III)给药组肿瘤结节数明显少于对照组，化合物(Ⅱ)、(III)对乳腺癌细胞的肺转移有很好的治疗效果。

Claims (5)

1.一种苯基恶唑类化合物，其结构式如式(II)所示。 
。
2.如权利要求1所述的化合物(II)在制备治疗癌症的药中的应用。 
3.一种苯基恶唑类化合物，其结构式如式(III)所示。 
。
4.如权利要求3所述化合物(III)的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 
(a)以L-缬氨酸为起始原料，采用氯化亚砜法合成缬氨酸甲酯盐酸盐； 
(b)缬氨酸甲酯盐酸盐在弱碱条件下与对甲氧基苯磺酰氯反应得中间体N-对甲氧苯磺酰L-缬氨酸甲酯； 
(c)将化合物N-对甲氧苯磺酰L-缬氨酸甲酯、权利要求1所述的化合物(II)溶于无水DMF中，搅拌下加入相转移催化剂四正丁基氯化铵、无水K2CO3，室温搅拌2～3天，至反应完毕，采用TLC跟踪反应；加入饱和食盐水，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，依次用饱和食盐水、蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸去溶剂，残留物用硅胶柱分离纯化可得化合物2-(4-甲氧基-N-(2-(4-苄氧基苯基)-5-甲基恶唑-4-取代)甲基)苯基磺酰胺)-3-甲基丁酸甲酯； 
(d)将化合物2-(4-甲氧基-N-(2-(4-苄氧基苯基)-5-甲基恶唑-4-取代)甲基)苯基磺酰胺)-3-甲基丁酸甲酯溶于甲醇水溶液中，搅拌下缓慢滴加NaOH水溶液，室温搅拌至反应完毕，TLC跟踪反应；减压蒸去甲醇溶剂，搅拌下缓慢滴加HCl溶液，调节PH值到6-7，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，再依次用饱和食盐水、蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸去溶剂，残留物用硅胶柱分离纯化或重结晶得化合物(III)：2-(4-甲氧基-N-(2-(4-苄氧基苯基)-5-甲基恶唑-4-取代)甲基)苯基磺酰胺)-3-甲基丁酸。 
5.如权利要求3所述的化合物(III)在制备治疗癌症的药中的应用。 
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