CN105272933B - 5‑萘基‑2‑氨基‑苯并[d]噁唑衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了5‑萘基‑2‑氨基‑苯并[d]噁唑衍生物，其特征在于如下通式(Ⅰ)结构所示：其中，R1‑R10表示氢、氟、氯、溴、(C1‑C10)烷烃、取代的(C1‑C10)烷烃，烷氧基，杂环基、取代的杂环基、芳基或取代的芳基；R11和R12表示氢、(C1‑C10)烷烃、取代的(C1‑C10)烷烃，烷氧基，杂环基、取代的杂环基、芳基或取代的芳基。本发明的有效效果：一方面，经过体外相关细胞试验，发现本发明化合物对结肠癌，胃癌，肝癌、肾癌等细胞具有明显抑制作用；另一方面，与苯并[d]噁唑跟卤代烃反应合成硫醚类的杂环化合物相比较，本发明化合物不易被氧化，所以具有药效持续作用时间较长等优点。
Description
技术领域
本发明属于化学合成药技术领域，具体地讲是涉及5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物及其制备方法和用途。
技术领域
根据相关资料报道，以噁唑，苯并[d]噁唑与卤代烃反应合成硫醚类的杂环化合物对肿瘤细胞具有抑制活性作用。例如美国Intellikine公司研制的3-异丙基(2-氨基-5苯并恶唑基)-4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶。同样是以苯并噁唑为基础，在治疗人前列腺癌模式小鼠时发现肿瘤细胞不能发生转移，同时还发现这种新药对人前列腺癌细胞有着较好的治疗效果。如今，这种化合物正在用于治疗不同类型癌症的临床试验中，如宫颈癌，乳腺癌等方面就具有极强的抑制活性作用。
我们通过合理的药物设计和动物药效学实验，发现取代的5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑在胃癌、肝癌、肾癌、结肠癌等方面有非常好的抑制活性作用。目前，经查阅和检索相关资料，关于5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑、5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物及其制备方法和用途没有相关的文献记载和报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物及其制备方法和用途。
本发明解决技术问题所采用的技术方案为：
5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物，其特征在于如下通式(Ⅰ)结构所示：
其中，R1-R10表示氢、氟、氯、溴、(C1-C10)烷烃、取代的(C1-C10)烷烃，烷氧基，杂环基、取代的杂环基、芳基或取代的芳基；R11、R12表示氢、(C1-C10)烷烃、取代的(C1-C10)烷烃，烷氧基，杂环基、取代的杂环基、芳基或取代的芳基。
优选是R1-R12表示氢、(C1-C10)烷烃、取代的(C1-C10)烷烃，烷氧基，杂环基、取代的杂环基、芳基或取代的芳基。
进一步优选是R1、R2、R3、R11、R12表示氢，如下通式(Ⅱ)结构所示：
R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10表示氢、氟、氯、溴、(C1-C10)烷烃、取代的(C1-C10)烷烃，烷氧基，杂环基、取代的杂环基、芳基或取代的芳基。
进一步优选是R4、R5、R6、R9、R10表示氢，其特征在于如下通式(Ⅲ)结构所示：
R7、R8表示氢、氟、氯、溴、(C1-C10)烷烃、取代的(C1-C10)烷烃，烷氧基，杂环基、取代的杂环基、芳基或取代的芳基。
本发明更进一步优选是的方案结构如下：
5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物的制备方法，其特征在于制备方法步骤如下：
(1)以DCM和正庚烷按体积比2:3为反应溶剂、常温为反应条件，在浓硫酸作用下2-溴-6-萘酚和1-金刚烷醇发生反应生成7-(金刚烷胺-1-基)-2-溴-6-萘酚(化合物5)；
(2)以DMF为反应溶剂，常温为反应条件，在碳酸钾作用下7-(金刚烷胺-1-基)-2-溴-6-萘酚(化合物5)和乙氧基甲氧基氯甲烷发生反应生成7-(金刚烷胺-1-基)-2-溴-6-甲氧乙氧基甲氧基萘(化合物6)；
(3)以1,4-二氧六环和水按体积比3:1为反应溶剂，在回流和氮气保护状态下，2-氨基-5-苯并[d]噁唑硼酸盐酸盐(化合物4)、7-(金刚烷胺-1-基)-2-溴-6-甲氧乙氧基甲氧基萘(化合物6)、四三苯基膦钯和碳酸钠发生反应生成5-{[7-(金刚烷胺-1-基)-6-(2-甲氧乙氧基甲氧基)]-萘-2-基}-苯并[d]噁唑-2-胺(化合物A)；
(4)以1,4-二氧六环和水按体积比3:1为反应溶剂，在回流和氮气保护状态下，2-氨基-5-苯并[d]噁唑硼酸盐酸盐(化合物4)、7-(金刚烷胺-1-基)-2-溴-6-萘酚(化合物5)、四三苯基膦钯和碳酸钠发生反应生成5-{[7-(金刚烷胺-1-基)-6-(2-羟基)]-萘-2-基}-苯并[d]噁唑-2-胺(化合物B)；
(5)以1,4-二氧六环和水按体积比3:1为反应溶剂，在回流和氮气保护状态下，2-氨基-5-苯并[d]噁唑硼酸盐酸盐(化合物4)、7-(金刚烷胺-1-基)-2-溴-6-甲氧基萘(化合物7)、四三苯基膦钯和碳酸钠发生反应生成5-{[7-(金刚烷胺-1-基)-6-(2-甲氧基)]-萘-2-基}-苯并[d]噁唑-2-胺(化合物C)；
(6)以1,4-二氧六环和水按体积比3:1为反应溶剂，在回流和氮气保护状态下，2-氨基-5-苯并[d]噁唑硼酸盐酸盐(化合物4)、7-乙酰基-2-溴-6-甲氧乙氧基甲氧基萘(化合物9)、四三苯基膦钯和碳酸钠发生反应生成5-[(7-乙酰基-6-(2-甲氧乙氧基甲氧基)-萘-2-基)]-苯并[d]噁唑-2-胺(化合物D)；
(7)以DMF为反应溶剂，常温为反应条件，在碳酸钾作用下7-异丙基-2-溴-6-萘酚和乙氧基甲氧基氯甲烷发生反应生成7-异丙基-2-溴-6-甲氧乙氧甲氧基萘(化合物11)；
(8)以1,4-二氧六环和水按体积比3:1为反应溶剂，在回流和氮气保护状态下，2-氨基-5-苯并[d]噁唑硼酸盐酸盐(化合物4)、7-异丙基-2-溴-6-甲氧乙氧甲氧基萘(化合物11)、四三苯基膦钯和碳酸钠发生反应生成5-{[7-异丙基-6-(2-甲氧乙氧基甲氧基)]-萘-2-基}-苯并[d]噁唑-2-胺(化合物E)。
所述5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物，其特征在于：5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物及其有机盐或无机盐在制备预防和治疗结肠癌、胃癌、肝癌或肾癌药物中的用途。
优选5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物及其有机盐或无机盐在制备治疗人结肠癌细胞HT-29、肝癌细胞Bel-7402药物中的用途。
药物组合，由权利1-6任一项所述的5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物或盐添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成。
本发明的有益效果：一方面，经过体内、外相关细胞试验，本发明化合物对结肠癌，胃癌，肝癌、肾癌等细胞具有明显抑制作用；另一方面，与苯并[d]噁唑跟卤代烃反应合成硫醚类的杂环化合物相比较，本发明化合物不易被氧化，所以具有药效持续作用时间较长等优点。
附图说明
图1是化合物A对人结肠癌细胞HT-29的体外作用(药物浓度为25μg/mL)图；
图2是相图1的对阴性对照图；
图3是化合物A对人肝癌细胞Bel7402的体外作用(药物浓度为25μg/mL)图；
图4是相图3的阴性对照图；
图5是化合物A对裸小鼠和人结肠癌细胞HT-29实体瘤的治疗作用图；
图6是化合物A对裸小鼠和人结肠癌细胞HT-29实体瘤的治疗作用(高剂量组给药前、后的肿瘤大小变化)图；
图7是化合物A对裸小鼠和人结肠癌细胞HT-29实体瘤的治疗作用(溶媒对照组给药前、后的肿瘤大小变化)图；
图8是化合物A对裸小鼠和人肝癌细胞Bel-7402实体瘤的治疗作用图；
图9是化合物A对裸小鼠和人肝癌细胞Bel-7402实体瘤的治疗作用(中剂量组给药前、后的肿瘤大小变化)图。
具体的实施方式
本发明解决技术问题在于提高一种新型的5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物，结构如通式(Ⅰ)所示：
其中，R1-R12表示氢、氟、氯、溴、(C1-C10)烷烃、取代的(C1-C10)烷烃，烷氧基，杂环基、取代的杂环基、芳基或取代的芳基；R11、R12表示氢、(C1-C10)烷烃、取代的(C1-C10)烷烃，烷氧基，杂环基、取代的杂环基、芳基或取代的芳基。
优选是R1-R12表示氢、(C1-C10)烷烃、取代的(C1-C10)烷烃，烷氧基，杂环基、取代的杂环基、芳基或取代的芳基。
进一步优选是R1、R2、R3、R11、R12表示氢，结构如通式(Ⅱ)所示：
R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10表示氢、氟、氯、溴、(C1-C10)烷烃、取代的(C1-C10)烷烃，烷氧基，杂环基、取代的杂环基、芳基或取代的芳基。
进一步优选是R4、R5、R6、R9、R10表示氢，结构如通式(Ⅲ)所示：
R7、R8表示氢、氟、氯、溴、(C1-C10)烷烃、取代的(C1-C10)烷烃，烷氧基，杂环基、取代的杂环基、芳基或取代的芳基。
本发明更进一步优选是的方案结构如下：
5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物及其有机盐或无机盐在制备预防和/或治疗结肠癌、胃癌、肝癌或肾癌药物中的用途。
5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物及其有机盐或无机盐在制备治疗人结肠癌细胞HT-29、肝癌细胞Bel-7402药物中的用途。
药物组合，由权利1-6任一项所述的5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物或盐添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成。
下面结合优选实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不仅限于下述实施例。
实施例1
(1)2-氨基-5-苯并噁唑硼酸酯(化合物4)的合成
第一步：2-硝基-4-溴苯酚-(化合物1)的合成
具体操作：把140ml的浓硫酸和60ml发烟硝酸混合，然后冷却到-10度左右，慢慢滴加到对溴苯酚(116g)的二氯甲烷(1.5L)溶液中，在这过程中反应温度不能高于10度，滴完后自然升到室温反应1-1.5小时，然后把反应液倒到1L的冰水中，萃取，用300ml的饱和食盐水洗涤2次，硫酸镁干燥，浓缩得到粗品，把粗品加到70ml的乙醇中搅拌1小时，降到0度静置过夜，过滤，50度真空干燥6小时得到123g的产物(收率为86％)。
MS(ESIpos):m/z＝217.85(M+H)+
1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ,10.47(s,1H),8.23(d，1H)，7.66(d，1H),7.07(d，1H)
第二步：2-氨基-4-溴苯酚-(化合物2)的合成
具体操作：把100g的化合物1和82.5g的保险粉加到1.5L的水中，保持温度不高于60度，慢慢加入39g的氢氧化钠，加完后室温反应18-24小时，第二天过滤得到粗品，再把粗品溶解到0.7L的乙酸乙酯中，用300ml的盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，浓缩得到43g的产物(收率为50％)。
MS(ESIpos):m/z＝189.90(M+H)+
1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ,9.23(s,1H),6.67(d，1H)，6.53(d，1H),6.45(d，1H),4.75(s,2H)
第三步：2-氨基-5-溴苯并[d]噁唑(化合物3)的合成
具体操作：把40g的化合物3加到200mlL的甲醇中，保持RT，慢慢加入30g的溴化氰，加完后室温反应7-8小时，然后用饱和碳酸钠溶液把反应液的PH值调到8-9，接着保持不高于40度减压整除甲醇，分别用500ml的乙酸乙酯萃取3次，用1L的盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，浓缩得到34g的产物(收率为75％)。
MS(ESIpos):m/z＝214.90(M+H)+
1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ,7.59(s,1H),7.34(d，1H)，7.29(d，1H),7.10(d，1H)
第四步：2-氨基-5-苯并[d]噁唑硼酸(化合物4)的合成
具体操作：把30g的化合物46g的频那醇脂，11g的dppf氯化钯和45g乙酸钾加到500ml的1,4二氧六环中，在氮气保护下回流2.5-3.5小时，降到室温，过滤，浓缩，把粗品溶解到500ml的乙酸乙酯中，用300l的盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，浓缩，然后加入300ml及70ml的6mol/L的盐酸室温搅拌16-32小时，过滤，50度真空干燥得到20.8g的产物(收率为70％)。
MS(ESIpos):m/z＝177(M+H)+
实施例2化合物A的合成
2.1化合物5的合成
具体操作：把56g(1eq)的6-溴-2-萘酚和38.2g(1eq)的金刚烷醇溶解在500ml的溶剂中(DCM和正庚烷按体积比2:3)，慢慢滴加15ml的浓硫酸，然后室温反应48-72小时，然后过滤，用正庚烷洗涤3次，接着溶解在500ml的乙醚中，加水洗涤，分层后，有机相用无水硫酸钠干燥1-2小时，过滤浓缩得到46.0g化合物5(收率为51.3％)。
MS(ESIpos):m/z＝358.21(M+H)+
2.2化合物6的合成
具体操作：把35.7g(1eq)的化合物5和27.6g的碳酸钾溶解在500ml的DMF中室温搅拌0.5-1小时，然后加入24.9g(2eq)的乙氧基甲氧基氯甲烷，室温反应16-24小时，过滤后浓缩母液，接着溶解在500ml的乙酸乙酯中，加水洗涤，分层后，有机相用无水硫酸钠干燥1-2小时，过滤浓缩至剩下溶剂30ml左右，静置过夜，第二天过滤得到18.2g化合物6(收率为41.1％)。
MS(ESIpos):m/z＝446.31(M+H)+
2.3化合物A的合成
具体操作：把4.45g(1eq)的化合物6,2.78g(1.3eq)的化合物4，1.15g(0.1eq)的四三苯基膦钯和6.36g(6eq)碳酸钠加到60ml的1,4二氧六环和20ml的水混合溶液中，在氮气保护下回流3小时，降到室温，过滤，浓缩得到粗品，把粗品加到100ml的水中激烈搅拌1小时，过滤，把过滤后的粗品加到甲醇和二氯甲烷按体积比2:1的100ml中使之溶解，然后50度浓缩之剩下一定量的溶剂，室温搅拌1-2小时，再过滤，50度真空干燥6小时后得到3.0g的化合物A(收率为60.0％)。
MS(ESIpos):m/z＝499.6(M+H)+
实施例3化合物B的合成
具体操作：把3.57g(1eq)的化合物5,2.78g(1.3eq)的化合物4，1.15g(0.1eq)的四三苯基膦钯和6.36g(6eq)碳酸钠加到60ml的1,4二氧六环和20ml的水混合溶液中，在氮气保护下回流3小时，降到室温，过滤，浓缩得到粗品，把粗品加到100ml的水中激烈搅拌1小时，过滤，把过滤后的粗品加到甲醇和二氯甲烷按体积比2:1的100ml中使之溶解，然后50度浓缩之剩下约10ml的溶剂，室温搅拌1-2小时，再过滤，50度真空干燥6小时后得到1.64g的化合物B(收率为40.1％)。
MS(ESIpos):m/z＝411.5(M+H)+
实施例4化合物C的合成
4.1化合物7的合成
具体操作：把11.9g(1eq)的化合物5和9.2g(2eq)的碳酸钾溶解在100ml的DMF中室温搅拌0.5-1小时，然后加入2ml的碘甲烷，室温反应6-8小时，过滤后浓缩母液，接着溶解在500ml的乙酸乙酯中，加水洗涤，分层后，有机相用无水硫酸钠干燥1-2小时，过滤浓缩至剩下溶剂10-15ml左右，静置过夜，第二天过滤得到3.8g化合物7(收率为30.7％)。
MS(ESIpos):m/z＝372.21(M+H)+
4.2化合物C的合成
具体操作：把3.70g(1eq)的化合物7,2.78g(1.3eq)的化合物4，1.15g(0.1eq)的四三苯基膦钯和6.36g(6eq)碳酸钠加到60ml的1,4二氧六环和20ml的水混合溶液中，在氮气保护下回流3小时，降到室温，过滤，浓缩得到粗品，把粗品加到100ml的水中激烈搅拌1小时，过滤，把过滤后的粗品加到甲醇和二氯甲烷按体积比4:1的100ml中使之溶解，然后50度浓缩之剩下约10ml的溶剂，室温搅拌1-2小时，再过滤，50度真空干燥6小时后得到2.60g的化合物C(收率为61.2％)。
MS(ESIpos):m/z＝426.50(M+H)+
实施例5化合物D的合成
5.1化合物8的合成
具体操作：把22.3g(1eq)的6溴-2-萘酚和15.7g(2eq)的乙酰氯溶解在200ml的DCM中，慢慢滴加5ml的浓硫酸，然后室温反应24-48小时，然后过滤，用石油醚洗涤3次，接着溶解在300ml的乙醚中，加水洗涤，分层后，有机相用无水硫酸钠干燥1-2小时，过滤浓缩得到11.4g化合物8(收率为32.0％)。
MS(ESIpos):m/z＝266.11(M+H)+
5.2化合物9的合成
具体操作：把8.8g(1eq)的化合物8和9.1g的碳酸钾溶解在200ml的DMF中室温搅拌0.5-1小时，然后加入8.2g(2eq)的乙氧基甲氧基氯甲烷，室温反应16-24小时，过滤后浓缩母液，接着溶解在500ml的乙酸乙酯中，加水洗涤，分层后，有机相用无水硫酸钠干燥1-2小时，过滤浓缩至剩下溶剂15ml左右，静置过夜，第二天过滤得到4.1g化合物9(收率35.0％)。
MS(ESIpos):m/z＝354.31(M+H)+
5.3化合物D的合成
具体操作：把3.53g(1eq)的化合物9，2.78g(1.3eq)的化合物4，1.15g(0.1eq)的四三苯基膦钯和6.36g(6eq)碳酸钠加到60ml的1,4二氧六环和20ml的水混合溶液中，在氮气保护下回流3小时，降到室温，过滤，浓缩得到粗品，把粗品加到100ml的水中激烈搅拌1小时，过滤，把过滤后的粗品加到甲醇和二氯甲烷按体积比4:1的100ml中使之溶解，然后50度浓缩之剩下约10ml的溶剂，室温搅拌1-2小时，再过滤，50度真空干燥6小时后得到2.36g的化合物D(收率为58.3％)。
MS(ESIpos):m/z＝407.42(M+H)+
实施例6化合物E的合成
6.1化合物10的合成
具体操作：把22.3g(1eq)的6溴-2-萘酚和6.0g(1eq)的异丙醇溶解在100ml的溶剂中(DCM和正庚烷按体积比2:3)，慢慢滴加5ml的浓硫酸，然后室温反应48-60小时，然后过滤，用正庚烷洗涤3次，接着溶解在500ml的乙醚中，加水洗涤，分层后，有机相用无水硫酸钠干燥1-2小时，过滤浓缩直到有白色固体析出，静置过夜后，过滤干燥得到5.31g化合物10(收率为20.0％)。
MS(ESIpos):m/z＝266.21(M+H)+
6.2化合物11的合成
具体操作：把5.0g(1eq)的化合物10和5.2g的碳酸钾溶解在500ml的DMF中室温搅拌0.5-1小时，然后加入4.7g(2eq)的乙氧基甲氧基氯甲烷，室温反应16-24小时，过滤后浓缩母液，接着溶解在200ml的乙酸乙酯中，加水洗涤，分层后，有机相用无水硫酸钠干燥1-2小时，过滤浓缩至剩下溶剂5ml左右，静置过夜，第二天过滤得到3.7g化合物11(收率55.6％)。
MS(ESIpos):m/z＝354.31(M+H)+
6.3化合物E的合成
具体操作：把3.53g(1eq)的化合物11,2.78g(1.3eq)的化合物4，1.15g(0.1eq)的四三苯基膦钯和6.36g(6eq)碳酸钠加到60ml的1,4二氧六环和20ml的水混合溶液中，在氮气保护下回流3小时，降到室温，过滤，浓缩得到粗品，把粗品加到100ml的水中激烈搅拌1小时，过滤，把过滤后的粗品加到甲醇和二氯甲烷按体积比6:1的100ml中使之溶解，然后50度浓缩之剩下约10ml的溶剂，室温搅拌1-2小时，再过滤，50度真空干燥6小时后得到1.83g的化合物E(收率为45.2％)。
MS(ESIpos):m/z＝407.4(M+H)+
实施例7化合物A、B、C、D、E的盐合成
7.1化合物A的盐酸盐合成
具体操作：把1g的化合物A加到30ml的无水乙醇中，然后通入氯化氢气体0.5H，然后过滤，50ml无水乙醇洗涤2次，50度真空干燥6小时后得到1.05g的化合物A的盐酸盐(收率为98.1％)。
7.2化合物B的硫酸盐合成
具体操作：把1g的化合物A加到30ml的无水乙醇中，然后加入浓硫酸(2eq)室温搅拌半小时，然后过滤，50ml无水乙醇洗涤2次，50度真空干燥6小时后得到1.06g的化合物B的硫酸盐(收率为85.6％)。
7.3化合物C的琥珀酸盐合成
具体操作：把1g的化合物C加到30ml的无水乙醇中，然后加入琥珀酸(2eq)搅拌半小时，然后过滤，50ml无水乙醇洗涤2次，50度真空干燥6小时后得到1.10g的化合物C的琥珀酸盐(收率为85.4％)。
7.4化合物D的马来酸盐合成
具体操作：把1g的化合物D加到30ml的无水乙醇中，然后加入马来酸(2eq)搅拌半小时，然后过滤，50ml无水乙醇洗涤2次，50度真空干燥6小时后得到1.09g的化合物C的马来酸盐(收率为85.3％)。
7.5化合物E的磺酸盐合成
具体操作：把1g的化合物E加到30ml的无水乙醇中，然后加入甲磺酸(2eq)搅拌半小时，然后过滤，50ml无水乙醇洗涤2次，50度真空干燥6小时后得到1.12g的化合物C的甲磺酸盐(收率为90.8％)。
7.6化合物A、B、C、D或E的有机盐或无机盐在制备预防和/或治疗结肠癌、胃癌、肝癌或肾癌药物中的用途。尤其是在制备治疗人结肠癌细胞HT-29、肝癌细胞Bel-7402药物中的用途。对于药物组合，化合物A、B、C、D或E的盐添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成。
实施例8体外、体内抗肿瘤药效学预试验
1.非常优选的5-{[7-(金刚烷胺-1-基)-6-(2-甲氧乙氧基甲氧基)]-萘-2-基}-苯并[d]噁唑-2-胺(化合物A)体外抗肿瘤药效学预试验。
1.1方法：
采用MTT法对化合物A进行了人体结肠癌细胞HT-29和人体肝癌细胞Bel-7402的体外抗肿瘤试验。
1.2操作：
将细胞浓度约为1×105个/mL，以200μL/孔加入96孔板中，CO2培养箱中培养24 h(CO2浓度为5％，温度为37℃)后，用一次性无菌注射器吸掉培养液，然后加入新鲜的含10％胎牛血清的RPMI1640培养液溶198μL/孔，再依次加入浓度为20 mg/L、10 mg/L和5 mg/L的化合物A溶液(溶剂为二甲基亚砜)，即最终浓度分别为100μg/mL、50μg/mL和25μg/mL。继续培养48 h后，以20μL/孔加入浓度为5 mg/mL的噻唑蓝(MTT)溶液，继续培养4h后用一次性无菌注射器吸掉孔中的上清液，以150μL/孔加入二甲基亚砜。然后用酶标仪测定其OD值，波长为492 nm；最后以下面公式计算抑瘤率。
结果见表1、表2以及说明书附图1～4所示。
抑瘤率IR(％)＝(1—OD值样品/OD值阴性对照)×100％
表1 化合物A对人结肠癌细胞HT-29体外抑瘤率
表2 化合物A对人肝癌细胞Bel-7402体外抑瘤率
根据表1、表2以及图1～4可知，实验结果表明：化合物A在药物浓度为100、50和25μg/mL时，对人结肠癌细胞HT-29的抑瘤率分别为：95.6％、91.7％和80.3％；对人肝癌细胞Bel-7402的抑瘤率分别为：98.1％、93.6％和87.2％。
2.非常优选的5-{[7-(金刚烷胺-1-基)-6-(2-甲氧乙氧基甲氧基)]-萘-2-基}-苯并[d]噁唑-2-胺(化合物A)体内抗肿瘤药效学预试验。
上述体外抗肿瘤试验结果表明，化合物A对人结肠癌细胞HT-29和人肝癌细胞Bel-7402具有较好的体外抗肿瘤活性，因此进一步就化合物A对人结肠癌细胞HT-29和人肝癌细胞Bel-7402进行体内抗肿瘤试验。
依据“细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则”和“抗肿瘤药物药效学指导原则”，采用IVIS Kinetics小动物活体成像系统，动态分析注射用rhCNB对裸小鼠荷人肝癌细胞Bel-7402和人结肠癌细胞HT-29实体瘤的治疗作用，进一步考察6号化合物对特定类型肿瘤细胞的杀伤和抑制作用，探索受试物产生药效作用的给药剂量、途径、频率和周期等。
2.1化合物A对人结肠癌细胞HT-29
方法：取SPF级健康的雌性裸小鼠数50只(6～8周龄)，用1 mL注射器在其背部皮下注入0.2 mL的肿瘤细胞混悬液(肿瘤细胞浓度约1×106个/mL)。注射前先用安尔碘消毒注射部位，注射完后应用干棉签轻轻按压针孔处片刻，以防止注入的肿瘤细胞混悬液流出。接种后d7用IVIS Kinetics小动物活体成像系统检测以成瘤的动物30只，随机分为化合物A高、中、低剂量组，注射用顺铂阳性对照组和溶媒对照组，各组6只，化合物A给药组的给药剂量分别为200 mg/kg、100 mg/kg和50 mg/kg，阳性对照组的给药剂量为6 mg/kg。化合物A给药组和溶媒对照组给药途径均为灌胃给药，阳性对照组的给药途径为尾静脉注射给药，给药体积均为10 mL/kg给药，7d后再用IVIS Kinetics小动物活体成像系统进行检测。给药前、给药后d 1、d 3和d 7分别用电子天平称量实验各组小鼠体重，实验结果如图5～7所示。
根据实验结果图5～7可知，实验结果表明：化合物A化合物对裸小鼠和人结肠癌细胞HT-29实体瘤具有明显的治疗效果，高、中、低剂量组和阴性对照组比较，抑瘤效果均为显著性差异，p＜0.05。此外，化合物A高、中、低剂量组小鼠体重给药后均
为增长趋势，且与阴性对照组小鼠体重比较差异不显著p＞0.05。
2.2化合物A对人肝癌细胞Bel-7402
方法：取SPF级健康的雌性裸小鼠数50只(6～8周龄)，将准备好的人肝癌细胞Bel-7402混悬液(肿瘤细胞浓度约1×106个/mL)以0.2 mL/只原位接种与动物的肝脏部位。接种后d 7用IVIS Kinetics小动物活体成像系统检测以成瘤的动物30只，随机分为化合物A高、中、低剂量组，注射用顺铂阳性对照组和溶媒对照组，各组6只，6号化合物给药组的给药剂量分别为200 mg/kg、100 mg/kg和50 mg/kg，阳性对照组的给药剂量为6 mg/kg。化合物A给药组和溶媒对照组给药途径均为灌胃给药，阳性对照组的给药途径为尾静脉注射给药，给药体积均为10 mL/kg，给药7 d和d 14后再用IVISKinetics小动物活体成像系统进行检测。给药前、给药后d 1、d 3、d 7和d 14分别用电子天平称量实验各组小鼠体重。实验结果如图8～9所示。
根据图8～9可知，实验结果表明：化合物A对裸小鼠荷人肝癌细胞Bel-7402实体瘤具有明显的治疗效果，高、中、低剂量组和阴性对照组比较，抑瘤效果均为显著性差异，p＜0.05，其中，高剂量组实体瘤细胞数量与给药前比较有所减少。此外，化合物A高、中、低剂量组小鼠体重给药后均为增长趋势，且与阴性对照组小鼠体重比较差异不显著p＞0.05。
实施例9另一体外、体内抗肿瘤药效学预试验
5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物的mTOR激酶活性抑制和P13KM酶活性抑制试验。
试验方法：根据需要配置好各种缓冲液，分别向加酶和不加酶的两个对照孔中加入2.5μl的DMSO(浓度与待测化合物最高浓度DMSO含量相一致)，再向各待测孔中加入2.5μl的一系列各浓度的化合物A、B、C、D、E；向加酶的对照孔及待测的各孔中加入ULight-4E-BP1(Thr37/46)Peptide/ATP mix(ATP终浓度为100μM)和5μl mTOR激酶，充分混合后，用封口膜封闭孵育2 h；随后加入5μl Stop Solution，孵育5min后，加入5μl Detection Mix(Eu-anti-phospho-4E-BP1(Thr37/46)Antibody终浓度为2 nM)，孵育1h后进行检测。HTRF(均相时间分辨荧光)数值按照下面的公式进行计算：
HTRF Radio＝Emission at 665 nm/Emission at 615nm×10000
相对抑制率(％)＝{1-(测试孔的HTRF值-加酶的对照孔的HTRF值)/(加酶的对照孔的HTRF值-不加酶的对照孔的HTRF值)}×100％。
相对抑制率对浓度作图通过GraphPad软件计算后得到IC50值。
本发明的化合物A、B、C、D和E对mTOR激酶和P13KM酶活性抑制筛选试验结果见表3。
表3 mTOR激酶和P13KM酶活性抑制筛选试验结果
备注1：表格中表示化合物A、B、C、D和E在mTOR酶及P13KM酶中作用效果。
备注2：++++less than 100nM；+++less than 1.0μM；
++less than 10μM；and+greater than 10μM.
通过筛选试验结果的表3表明：化合物A,B,C,D和E对mTOR激酶活性抑制和P13KM酶活性抑制作用效果都非常明显，但是相比较而言，化合物A效果最为显著，化合物B和E次之，化合物C和D较次之。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
Claims (4)
1.5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物，其特征在于如下通式(Ⅰ)结构所示：
其中，R1-R6、R9-R12表示为氢；R7表示为甲氧乙氧基甲氧基、甲氧基、羟基，R8表示为金刚烷基、乙酰基、异丙基。
2.根据权利要求1所述的5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物，其特征在于结构如下：
3.5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物化合物A、B、C、D、E的制备方法，其特征在于制备方法分别如下：
(1)以1,4-二氧六环和水按体积比3:1为反应溶剂，在回流和氮气保护状态下，2-氨基-5-苯并[d]噁唑硼酸盐酸盐、7-(金刚烷胺-1-基)-2-溴-6-甲氧乙氧基甲氧基萘、四三苯基膦钯和碳酸钠发生反应生成5-{[7-(金刚烷胺-1-基)-6-(2-甲氧乙氧基甲氧基)]-萘-2-基}-苯并[d]噁唑-2-胺(化合物A)；
(2)以1,4-二氧六环和水按体积比3:1为反应溶剂，在回流和氮气保护状态下，2-氨基-5-苯并[d]噁唑硼酸盐酸盐、7-(金刚烷胺基)-2-溴-6-萘酚、四三苯基膦钯和碳酸钠发生反应生成5-{[7-(金刚烷胺-1-基)-6-(2-羟基)]-萘-2-基}-苯并[d]噁唑-2-胺(化合物B)；
(3)以1,4-二氧六环和水按体积比3:1为反应溶剂，在回流和氮气保护状态下，2-氨基-5-苯并[d]噁唑硼酸盐酸盐、7-三环[3.3.1.1(3.7)]癸烷基-2-溴-6-甲氧基萘、四三苯基膦钯和碳酸钠发生反应生成5-{[7-(金刚烷胺-1-基)-6-(2-甲氧基)]-萘-2-基}-苯并[d]噁唑-2-胺(化合物C)；
(4)以1,4-二氧六环和水按体积比3:1为反应溶剂，在回流和氮气保护状态下，2-氨基-5-苯并[d]噁唑硼酸盐酸盐、7-乙酰基-2-溴-6-甲氧乙氧基甲氧基萘、四三苯基膦钯和碳酸钠发生反应生成5-[(7-乙酰基-6-(2-甲氧乙氧基甲氧基)-萘-2-基)]-苯并[d]噁唑-2-胺(化合物D)；
(5)以1,4-二氧六环和水按体积比3:1为反应溶剂，在回流和氮气保护状态下，2-氨基-5-苯并[d]噁唑硼酸盐酸盐、7-异丙基-2-溴-6-甲氧乙氧甲氧基萘、四三苯基膦钯和碳酸钠发生反应生成5-{[7-异丙基-6-(2-甲氧乙氧基甲氧基)]-萘-2-基}-苯并[d]噁唑-2-胺(化合物E)。
4.药物组合物，由权利1-2任一项所述的5-萘基-2-氨基-苯并[d]噁唑衍生物或盐添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成。
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