CN103992236A - 一种新型靶向性抗肿瘤药物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种新型靶向性抗肿瘤药物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了作为靶向抗肿瘤药物的eEF2K小分子抑制剂，其具有式(I)、式(II)和式(III)的结构：

Description

一种新型靶向性抗肿瘤药物及其制备方法与应用
背景技术
恶性肿瘤严重威胁人类的生命健康，每年全世界约有700万人死于癌症，约占总死亡人数的四分之一。目前我国现有癌症患者死亡率逾30％，已成为我国居民死亡的第二大因素。药物治疗已成为对恶性肿瘤有效而又普遍使用的一种治疗方法。尽管自1942年耶鲁大学的Gilman等首次证明盐酸氮芥对小鼠Gardner淋巴瘤有治疗作用以来，肿瘤的药物治疗取得了长足的进展，并成为当前临床治疗不可或缺的主要措施。但高毒副作用、耐药等问题仍然是临床肿瘤药物治疗遇到的主要障碍。传统化疗能够引起健康细胞的破坏，主要作用于DNA、RNA和微管蛋白等与多有细胞生死相关的共有组分，致使其选择性低，毒性大。现在，发现一种新的杀死癌细胞的方法，该方法能够杀死癌细胞而对机体健康细胞没有影响，不像传统的治疗手段有很强的副作用。更重要的是，新发现有望在不影响正常细胞的同时能够治疗多种类型的癌症。研究人员表示，癌细胞生长分化过程比正常细胞快，这就意味着癌细胞需要更多的养分和氧气。eEF-2K(Eukaryoticelongation factor-2kinase，真核延伸因子-2激酶)使得癌细胞在营养短缺的情况下依然生存，而正常健康细胞不需要eEF-2K来生存。此外，eEF-2K还可以通过磷酸化eEF-2上的苏氨酸56位点来降低其与核糖体的亲和力，从而阻止新生肽链的延伸，进而终止蛋白质的合成。因此，阻断eEF-2K的功能可以有效的杀死癌细胞而不影响正常细胞的生物过程。这项研究发现了一个在正常细胞并不重要而在癌细胞生存必不可少的蛋白质eEF-2K，阻断它有望能够治疗癌症，靶向eEF-2K的抑制剂是很有潜力的抗肿瘤药物。
临床上应用的抗肿瘤药物种类繁多，其中化疗药物主要有烷化剂钼络合物抗肿瘤药物、蒽环类抗肿瘤药物、破坏DNA的抗生素等。此外，天然抗肿瘤药物的研究也占有相当大的比例，如目前临床上常用一些药物有喜树碱、长春新碱、紫杉醇等。
然而，现有的抗肿瘤药物存在着选择性较差、毒副作用、耐药性等问题。寻找高效低毒的抗肿瘤药物仍是科学家面临的重要课题。本发明针对杀死癌细胞而对机体健康细胞没有影响的小分子eEF-2K抑制剂，具有重要的开发应用前景。
发明内容
本发明提供了具有抗肿瘤活性的eEF-2K小分子抑制剂药物结构，具有重要的开发应用前景。eEF-2K小分子抑制剂有效的抑制某些癌细胞的生长，该类化合物对乳腺癌、神经胶质瘤、胃癌、肝癌细胞有明显的抑制作用。
本发明发现了一系列杀死癌细胞而对机体健康细胞没有影响的小分子eEF-2K抑制剂，该类化合物对多种肿瘤有明显的抑制作用。
其结构式如下：
及其药学上可接受的盐或
及其药学上可接受的盐
及其药学上可接受的盐
R1是氢、羟基、氰基、硝基、卤素、氨基、醛基、羧基、C1-10烷基、卤代C-10烷基、C3-C7环烷基、C1-10烷氧基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C6-10芳基、
R2是-H、-CmH(2m+1)、C3-7环烷基、C6-10芳基甲基，其中m是1-10的整数，优选1-5的整数，更优选1-3的整数；
优选R2是
R3是C1-10烷基，任选被一个或者多个卤素、硝基、羟基、氰基、氨基、羧基、醛基或C3-C7杂环取代的C6-10芳基；
X是碳，氮；
n是1-10的整数，优选1-5的整数，更优选1-3的整数；
这里术语“C1-10烷基”是指含有1-10个碳原子的直或支链烃，其可以被一个或者多个硝基、氰基、氨基、羧基、醛基或者C3-C7杂环取代，烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、n-丙基，i-丙基，n-丁基，i-丁基，t-丁基。
术语“卤代C1-10烷基”是指任意上述C1-C10烷基被一个或多个卤素原子取代的基团。
术语“C3-C7环烷基”意指为3-7元全碳单环，其可以包含一个或多个双键，但不具有完全共轭的π-电子系统。环烷基的实例是环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、环己烯、环己二烯、环庚烷、环庚烯、环庚二烯，但不限于此。
术语“C2-C6烯基”意指为例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、1-己烯基等的任意基团。
术语“C2-C6炔基”意指为例如乙炔基、2-丙炔基、4-戊炔基等的任意基团。
术语“卤素原子”意指为氟、氯、溴或碘原子。
术语“氰基”意指-CN基团。
术语“硝基”意指-NO2基团。
术语“C1-10烷氧基”、是指任意上述C1-C10烷基通过氧原子(-O-)与分子的其余部分连接。
术语“C6-10芳基”是指具有6-10个碳原子的芳环系统，实例包括：苯基或萘基。
优选R1选自-H、-NH2、-OH、-F、-Cl、-Br、-CF3、-NO2、-CN、-CHO、-COOH、等具体的取代基团。
所述的药学上可接受的盐包括无机酸盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、磷酸盐和硝酸盐)以及有机酸盐(如乙酸盐、三氟乙酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、草酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐)。
下面表示本发明的eEF-2K抑制剂的一些例子
下面表示本发明的化合物的其他一些例子：
上述化合物抑制癌症细胞生长。因此，在另一方面，本发明的特征还在于治疗癌症的方法。该方法包括给予需要其的接受治疗者有效的上述化合物之一。
为了将式(I)(II)化合物或式(III)化合物及其药学上可接受的盐用于哺乳动物包括人的治疗性治疗(包括预防性治疗)，一般根据标准药学实践将其制成药物组合物。
除本发明化合物外，本发明药物组合物还可包含一种或多种对治疗文中涉及的一种或多种疾病有价值的药物或与一种或多种对治疗文中涉及的一种或多种疾病有价值的药物共同(同时或序贯)给予。
术语“组合物”意在包括活性组分或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体的制剂。例如通过本领域已知的方法可将本发明化合物制成以下形式：例如片剂、胶囊剂、水性或油性溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、喷鼻剂、栓剂、用于吸入的细小分散的粉剂或气雾剂或喷雾剂和用于胃肠道外(包括静脉内、肌内或输注)的无菌水性或油性溶液或混悬剂或无菌乳剂。
液体形式的组合物包括溶液剂、混悬剂和乳剂。活性化合物的无菌水或水-丙二醇溶液可被提及作为适合于胃肠道外给药的液体制剂的实例。还可将液体组合物配制在聚乙二醇水溶液中。用于口服给予的水性溶液可通过将活性组分溶解在水中并按需要加入合适的着色剂、矫味剂、稳定剂和增稠剂来制备。口服使用的水性混悬剂可通过将细小分散的活性组分与粘性物质一道分散在水中，所述粘性物质如为天然合成胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素和其他药剂领域已知的悬浮剂。
药物组合物可为单位剂量形式。在这些形式中，将所述组合物分成含适量活性组分的单位剂量。该单位剂量形式可为包装制剂，包装中包括分隔量的制剂，例如盒装片剂、胶囊剂和在管形瓶或安瓿中的粉剂。单位剂量形式还可为胶囊剂、扁囊剂或片剂或其可为适当数量的任何这些包装形式。
组合物
可单独使用文中定义的抗癌治疗或除本发明化合物外可包括常规手术或放射治疗或化学治疗。这些化学治疗可包括一种或多种以下范围的抗肿瘤药：
(i)用于医学肿瘤学的抗增殖/抗肿瘤药及其组合，如烷化剂(例如顺铂、奥沙利铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、替莫唑胺和硝基脲)；抗代谢物(例如吉西他滨和抗叶酸剂如氟嘧啶类如5-氟脲嘧啶和替加氟、雷替曲塞、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和羟基脲)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类抗生素如多柔比星、博来霉素、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、放线菌素和普卡霉素)；抗有丝分裂剂(例如长春碱类如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨和紫杉烷如紫杉醇和多西紫杉醇和polokinase抑制剂)；和拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼脂素如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、托泊替康和喜树碱)；
(ii)细胞生长抑制剂，如抗雌激素类(例如他莫昔芬、氟维司群、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和iodoxyfene)、抗雄激素类(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和醋酸环丙孕酮)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素类(例如醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦)和5α-还原酶抑制剂(如非那雄胺)；
(iii)抗入侵药物(例如c-Src激酶家族抑制剂如4-(6-氯-2，3-亚甲二氧基苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基氧基喹唑啉(AZD0530；国际专利申请WO01/94341)和N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-{6-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基氨基}噻唑-5-甲酰胺(dasatinib，BMS-354825；J.Med.Chem.，2004，47，6658-6661)和金属蛋白酶抑制剂如马立马司他、尿激酶纤溶酶原激活受体功能抑制剂或Heparanase抗体)；
(iv)生长因子功能抑制剂：例如这些抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体抗体(例如抗erbB2抗体曲妥单抗[Herceptin TM]、抗EGFR抗体panitumumab、抗erbB1抗体西妥昔单抗[Erbitux，C225]和Stern等(Critical reviews in oncology/haematology，2005，第54卷，第11-29页)描述的任何生长因子或生长因子受体抗体；这些抑制剂还包括酪氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼(gefitinib)，ZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基))喹唑啉-4-胺(erlotinib，OSI-774)和6-丙烯基酰氨基(acrylamido)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)-喹唑啉-4-胺(CI1033)、erbB2酪氨酸激酶抑制剂如lapatinib、肝细胞生长因子家族抑制剂、血小板衍生生长因子家族抑制剂如imatinib、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂(例如Ras/Raf信号抑制剂如法尼基转移酶抑制剂，例如sorafenib(BAY43-9006))、通过MEK和/或AKT激酶的细胞信号抑制剂、肝细胞生长因子家族抑制剂、c-kit抑制剂、abl激酶抑制剂、IGF受体(胰岛素样生长因子)激酶抑制剂；aurora激酶抑制剂(例如AZD1152、PH739358、VX-680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX-528和AX39459)和周期蛋白依赖性激酶抑制剂如CDK2和/或CDK4抑制剂；
(v)抗血管生成剂，如那些抑制血管内皮生长因子作用的抗血管生成剂，[例如抗血管内皮生长因子抗体贝伐单抗(Avastin TM)和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474；WO01/32651中实施例2)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉和通过其他机制作用的化合物(例如利诺胺、整联蛋白αvβ功能抑制剂和血管生长素]；
(vi)血管损伤剂如考布他汀A4和国际专利申请WO99/02166、WO00/40529、WO00/41669、WO01/92224、WO02/04434和WO02/08213中公开的化合物；
(vii)反义疗法，如针对上述目标的疗法，如ISIS2503(抗ras反义)；
(viii)基因疗法，包括如替代畸变基因如畸变p53或畸变BRCA1或BRCA2的方法、GDEPT(基因导向性酶前药疗法)法如用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的方法以及提高患者对化疗或放疗耐受性的方法如多药耐药基因疗法；和
(ix)免疫疗法，包括如增加患者肿瘤细胞免疫原性的先体外后体内疗法和体内疗法，如用细胞因子如白介素2、白介素4或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子转染，降低T-细胞无反应性的方法，用转染免疫细胞如细胞因子转染的树突状细胞的方法，用细胞因子转染肿瘤细胞系的方法和用抗独特型抗体的方法；
通过同时、序贯或单独给予各种治疗成分可实现这种联合治疗。此类组合产品应用上述剂量范围内的本发明化合物和准许剂量范围内的其他药学活性剂。
附图说明
图1化合物44对乳腺癌细胞MCF-7抑制活性实验测定的生长曲线。
具体实施方式
实施例1：化合物2的合成
苯乙酮(25mmol)，甲胺盐酸盐(27.5mmol)，甲醛(35mmol)，浓盐酸(0.125mmol)加入乙醇(12.5mL)中，密闭容器中110℃加热20h。冷却至室温后，减压蒸馏除去溶剂，加入乙酸乙酯(25mL)。继续搅拌4h，过滤，用乙酸乙酯洗涤滤渣得到粗产品，用异丙醇重结晶可得产物2a。收率：60-70％。
将2a(0.5mmol)溶解于0.5mL甲醇中，室温下缓慢加入NaBH4(2.0mmol)，混合液室温搅拌1h。加入2mL饱和NH4Cl溶液。减压蒸馏除去溶剂。残留物加入5mLNaOH(1N)，用5mLCH2Cl2萃取4次。有机相收集后用无水硫酸钠干燥，浓缩后得粗产品。粗产品柱层析后的产物2b。收率：90％。1H NMR(CDCl3)：1.83-1.64(m,2H),2.27(s,3H),2.43(s,3H),2.76-2.84(m,2H),3.91(s,2H),5.07(dd,J＝2.5,8.3Hz,1H),7.07-7.24(m,3H),7.52(d,J＝7.4Hz,1H)；13C NMR(CDCl3)18.8,35.2,35.8,50.2,71.6,125.3,125.9,126.5,130.0,133.7,142.9；HRMS(M+1)m/z cal.For C11H18NO180.1383,found180.1399。
2b(6.6mmol)溶解于DMSO(2mL)中，反应液加入NaH(9.9mmol)，55℃下N2保护下搅拌30min。
4-Chlorobenzotrifluoride(9.9mmol)溶解于1.0mLDMSO中缓慢加入上述混合液，升温至90℃搅拌1小时。冷却至室温后加入NaOH10mL(2N)，甲苯萃取3次，合并萃取液，浓缩后得化合物2。1H NMR(CDCl3):1.40(s,1H),1.97-2.04(m,1H),2.16-2.23(m,1H),2.42(s,3H),2.73(t,J＝7.2Hz,2H),5.26-5.31(m,1H),6.88(d,J＝8.5Hz,2H),7.23-7.32(m,5H),7.40(d,J＝8.5Hz,2H)；13C NMR(CDCl3):36.7,39.0,48.4,78.7,115.8,123.1,125.8,126.1,126.8,127.8,128.8,141.1,160.5.MS:309[M]+。
实施例2：化合物20的合成
4-(苯氨基)苯酚(17.64mmol)溶解于DMF(20mL)。加入NaH(17.6mmol),搅拌30min后,加入N-(2-氯乙基)吡咯烷盐酸盐(5.88mmol),70℃搅拌1h,室温搅拌过夜，加入1N NaOH(100mL)和Et2O(50mL)。分层后水相用Et2O(50mL)萃取2次。合并Et2O，用0.1N NaOH(50mL),盐水洗,无水硫酸钠干燥过滤浓缩，柱层析得盐酸盐产物。用50％NaOH将溶液调至碱性用50mL CH2Cl2萃取3次，合并CH2Cl2相用无水MgSO4干燥,过滤浓缩得产物20a。收率：96％。1H NMR(CDCl3)1.81(m,4H),2.63(m,4H),2.89(t,J＝5.9Hz,2H),4.09(t,J＝6.1Hz,2H),5.48(bs,1H),6.79-6.93(m,5H),7.02-7.09(m,2H),7.17-7.24(m,2H)；MS：m/z283[M+H]+。
20a(0.230mmol)溶解于DMF(2mL)。N2保护下加入NaH(1.38mmol),搅拌10min,加入N-苄基-3-氯-N-甲基丙烷-1-氨基盐酸盐(0.460mmol),再加入NaH(1.4mmol),室温搅拌5min，70℃搅拌1h,冷却后加入Et2O(75mL),用0.1N NaOH(20mL),饱和盐水洗后无水MgSO4干燥,过滤浓缩。将此浓缩液(0.225mmol)和Pearlman's Catalyst(45.0mg)及IPA(3mL)H2下80℃搅拌4h,冷却，CH2Cl2(50mL)稀释，搅拌5min，过滤除去固体。滤液浓缩柱层析后得化合物20。收率：61％yield。1H NMR(CDCl3):1.75-1.87(m,6H),2.41(s,3H),2.63(m,6H),2.90(t,J＝6.1Hz,2H),3.69(t,J＝7.5Hz,2H),4.10(t,J＝5.9Hz,2H),6.70-6.77(m,3H),6.86-6.94(m,2H),7.02-7.09(m,2H),7.12-7.20(m,2H)；MS:m/z354[M+H]+。
实施例3：化合物30的合成
α-[2-(甲氨基)乙基]苄醇(10.6mmol)加入TFA(5mL)，再加入苯酚(10.63mmol),室温搅拌2天,浓缩成油状物，加入NaOH水溶液和CH2Cl2(50mL)。水相用CH2Cl2萃取2次。合并CH2Cl2相用无水MgSO4干燥，过滤，柱层析分离得化合物30。收率:28％。1H NMR(CDCl3):2.09-2.21(m,1H),2.28-2.51(m,3H),2.48(s,3H),2.75-2.82(m,1H),4.62(dd,J＝12.7,3.6Hz,1H),6.65-6.73(m,2H),6.90-6.95(m,1H),7.01-7.08(m,1H),7.18-7.24(m,1H),7.27-7.39(m,4H)；MS:m/z242[M+H]+
实施例4：化合物40的合成
40a(6.7g,50mmol),3-chloropropiophenone(8.4g,50mmol),无水K2CO3(14.0g,100mmol)溶解于乙腈(250mL)。室温搅拌16h。减压蒸去溶剂。残留物溶解于水中，用CH2Cl2萃取。有机相用水洗，无水Na2SO4干燥，过滤后得到油状物。NaBH4(3.8g,100mmol)滴加到油状物(11.7g,40mmol)的甲醇溶液中(100mL)0℃反应20min.继续搅拌16h后减压蒸去溶解.残留物溶解于水中，用CH2Cl2萃取。有机相用水洗，无水Na2SO4干燥，过滤后得到油状物40b。1H NMR(CDCl3):1.85-1.98(m,2H),2.68-2.94(m,6H),3.64(d,J＝16.8Hz,1H),3.78(d,J＝16.8Hz,1H),4.92-5.06(m,1H),7.03-7.15(m,4H),7.20-7.45(m,5H)；13C NMR(CDCl3)28.8,34.0,50.6,56.1,56.6,75.3,125.5,125.7,126.3,126.4,126.8,128.1,128.5,133.9,144.9。SOCl2(2.4mL,30mmol)滴加到40b(6.7g,25mmol)的CHCl3(30mL)。混合液室温搅拌16h。过滤后CH2Cl2萃取。有机相用水洗，无水Na2SO4干燥，过滤浓缩得油状物4.4g。收率：62％。油状物(1.2g,4mmol)，2-F苯酚(0.6g,5mmol),无水K2CO3(1.1g,8mmol)和DMF(20mL)60℃搅拌4h后加入水(100mL)。用Et2O萃取后盐水洗，浓缩有机相。残留物柱层析纯化后得化合物40。1H NMR(CDCl3):2.00-2.15(m,1H),2.30-2.45(m,1H),2.60-2.75(m,4H),2.85-2.95(m,2H),3.65(s,2H),5.25-5.35(m,1H),6.75-6.92(m,3H),7.05-7.15(m,5H),7.25-7.40(m,5H)；13C NMR(CDCl3)29.3,36.1,51.0,54.3,56.1,80.0,116.2(d,J＝18.4Hz),117.4,121.2(d,J＝6.5Hz),124.0(d,J＝3.9Hz),125.5,126.0,126.1,126.5,127.7,128.6,134.4,134.9,141.4,146.2(d,J＝10Hz),153.2(d,J＝241.2Hz)
实施例5：化合物1-45的谱图数据
实施例5：化合物1-45的激酶抑制活性测试
本实验的目的是检测所发明化合物对体外激酶的抑制活性，采用的方法为同位素标记法。本实验分别对eEF-2K，进行体外活性测试。受试化合物的激酶抑制活性用IC50来表示。
1.试验方法
在反应管中，依次加入缓冲液，待测激酶和待测激酶的底物，以及10mM的醋酸镁和γ33P-ATP溶液和不同浓度的受试化合物。反应以加入MgATP为起始，室温孵育40min。最终用5uL的3％磷酸盐缓冲液中止反应，并把10uL的反应液滴定到Filtermat A膜上，用75mM的磷酸盐溶液洗三次，甲醇洗一次。干燥Filtermat A膜并对其闪烁计数，闪烁计数数值大小反应底物被磷酸化的程度，从而可以表征激酶活性被抑制情况。
2.实验数据
IC50(uM)
化合物 eEF-2K TRPM7 pKA PI3K ERK2
1 1.8 56 78 34 No inhibition
2 0.1 45 65 37 No inhibition
3 2.6 34 21 43 85
4 1.3 26 31 37 77
5 1.2 46 22 35 No inhibition
6 0.9 25 32 67 59
7 0.8 17 32 18 No inhibition
8 0.9 36 52 47 No inhibition
9 0.8 62 54 55 87
10 1.1 74 67 43 68
11 1.2 85 43 35 No inhibition
12 0.9 44 28 75 89
13 1.3 52 23 47 87
14 2.2 26 25 35 No inhibition
15 0.9 47 46 63 49
16 1.3 27 63 45 57
17 0.8 28 27 35 32
18 2.1 53 34 42 37
19 2.2 31 28 37 41
20 1.6 37 57 56 62
21 1.7 49 48 57 43
22 1.5 43 49 65 52
23 1.2 44 53 62 65
24 0.8 42 46 62 74
25 0.9 43 75 73 55
26 1.0 37 41 52 68
27 0.7 47 63 57 58
28 0.8 55 44 29 63
29 1.1 35 38 42 41
30 1.2 22 47 61 53
31 1.4 21 36 27 63
32 1.3 31 78 25 89
33 0.7 83 64 51 60
34 0.9 55 29 21 73
35 1.0 45 67 79 88
36 1.2 64 56 33 45
37 0.6 70 58 68 52
38 1.5 28 32 43 30
39 0.8 42 45 27 64
40 2.0 19 27 28 34
41 2.2 60 53 41 25
42 0.9 48 23 49 21
43 1.3 35 46 20 50
44 0.1 99 107 86 No inhibition
45 1.1 23 16 17 23
实验结果表明，化合物1-45对eEF-2K激酶具有很强的抑制活性。
实施例6：eEF-2K抑制剂的体外肿瘤细胞增殖抑制实验
本发明得抑制eEF-2K的小分子是一类高效低毒的抗肿瘤活性化合物，对多种恶性肿瘤有明显疗效。其主要药效试验结果如下：
1.试验方法
用一组肿瘤细胞系，即MCF-7(乳腺癌细胞)，LN229(神经胶质瘤细胞)，HepG2(肝细胞癌)，MKN-45(胃癌)，A549(非小细胞肺癌)，OVCAR-3(卵巢癌)、HCT-116(结肠癌)、M4(黑色素瘤)来检测上述小分子的体外抗肿瘤活性。
将MCF-7，LN229，HepG2，MKN-45，A549，OVCAR-3，HCT-116，M4保存在充满5％胎牛血清的PRMI介质中的塑料器皿中。在96孔板中接种最终密度为10000个细胞/mL的肿瘤细胞。利用试验化合物处理细胞(至少5个不同浓度)，每浓度均作6个平行孔，另设空白孔和对照孔，药物作用期间，用倒置相差显微镜观察细胞的生长情况，在37度CO2培养箱中培养72小时后，每孔加入5g/L的MTT20yL，培养4h，弃上清液，加DMSO约100μL/孔，振荡10min，使紫色结晶物充分溶解，用酶标仪测定490nm处的吸光度。根据IC50的值表示试验化合物的细胞毒性。上述值表示6个平行样的平均值。
2.实验数据
结果表明，在上述测试的化合物1-45所有的化合物都有效的抑制即MCF-7，LN229，HepG2，MKN-45，A549，OVCAR-3，HCT-116，M4细胞的生长。出乎意料的是，它们中大多数都表示出的IC50值小于1mM，一些甚至小于100nM。
在上述测试的化合物1-45所有的化合物都有效的抑制即MCF-7，LN229，HepG2，MKN-45，A549，OVCAR-3，HCT-116，M4细胞的生长。化合物2，44，4对MCF-7细胞的IC50<1.0μM，化合物22对MKN-45细胞的IC50<1.0μM。
实施例7：化合物44的体内抗肿瘤实验
本实验的目的是检测发明化合物的体内抗肿瘤效果。本实验采用模型，测试发明化合物44的体内抗肿瘤活性。所用细胞株为MCF-7。
1.实验方法
将培养好的MCF-7细胞经消化胰酶消化后，再用PBS液清洗2次，然后用1％台盼兰染色，于细胞记数板上进行细胞记数，并调节活细胞浓度至1×107/mL，在无菌条件下施行裸鼠右侧胸壁第二乳垫，脂肪层下接种0.2mL/只，共接种3只，术后荷瘤裸鼠继续饲养于SPF环境中，待肿瘤长至0.8cm3时，行裸鼠间原位移植。在无菌条件下取出乳腺癌组织，剪切成1mm3左右的小块，分别移植于24只裸鼠右侧胸壁的第二乳垫脂肪层下，4d后即可见肿瘤生长，成瘤率100％。裸鼠分组(n＝6)并注射给药。
肿瘤生长曲线：从第一次注射开始每隔2天，观察一次荷瘤裸鼠的全身情况及各组肿瘤生长情况，在无菌的条件下测量各组荷瘤裸鼠移植瘤的直径，并连续观察纪录。以时间为横坐标，肿瘤的体积为纵坐标，肿瘤体积计算公式为：V＝1/2*ab2，a为肿瘤长径，b为短径，并据此绘制移植瘤生长曲线。
抑瘤率：注射药物28天后，脱颈处死各组裸鼠，用动物天平称取裸鼠体重，在分离各组瘤体，称取瘤重，计算抑瘤率。
观察指标：每3天观测一次裸鼠，观察有无腹泻，抽搐，皮疹，体重明显减轻等反应。
2实验数据
实验测定的生长曲线如下图1。实验结果表明，化合物44对乳腺癌细胞MCF-7具有明显的体内生长抑制活性，在每天2mg/kg及以上剂量下，可以明显抑制肿瘤生长或完全消退肿瘤。给药过程中未发现裸鼠出现体重降低、皮疹、腹泻等不良反应，表明在测试剂量下，化合物44在给药剂量范围内毒性低。

Claims (8)

1.式(I)或式(II)或式(III)化合物及其药学上可接受的盐在制备eEF2K小分子抑制剂的应用，其特征在于，式(I)和式(II)化合物的结构如下：
其中R1是氢、羟基、氰基、硝基、卤素、氨基、醛基、羧基、C1-10烷基、卤代C-10烷基、C3-C7环烷基、C1-10烷氧基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C6-10芳基、
R2是-H、-CmH(2m+1)、C3-7环烷基、C6-10芳基甲基，其中m是1-10的整数，优选1-5的整数，更优选1-3的整数；
R3是C1-10烷基，任选被一个或者多个卤素、硝基、羟基、氰基、氨基、羧基、醛基或C3-C7杂环取代的C6-10芳基；
X是碳，氮；
n是1-10的整数，优选1-5的整数，更优选1-3的整数。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，R1选自-H、-NH2、-OH、-F、-Cl、-Br、-CF3、-NO2、-CN、-CHO、-COOH、
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，R2是
4.式(I)或式(II)或式(III)化合物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物的应用，其特征在于，式(I)和式(II)化合物的结构如下：
其中R1是氢、羟基、氰基、硝基、卤素、氨基、醛基、羧基、C1-10烷基、卤代C-10烷基、C3-C7环烷基、C1-10烷氧基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C6-10芳基、
R2是-H、-CmH(2m+1)、C3-7环烷基、C6-10芳基甲基，其中m是1-10的整数，优选1-5的整数，更优选1-3的整数；
R3是C1-10烷基，任选被一个或者多个卤素、硝基、羟基、氰基、氨基、羧基、醛基或C3-C7杂环取代的C6-10芳基；
X是碳，氮；
n是1-10的整数，优选1-5的整数，更优选1-3的整数。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，R1选自-H、-NH2、-OH、-F、-Cl、-Br、-CF3、-NO2、-CN、-CHO、-COOH、
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，R2是
7.如权利要求4-6所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为乳腺癌、神经胶质瘤、胃癌或肝癌。
8.如权利要求4-6所述的应用，其特征在于，所述的药物是片剂、胶囊剂、水性或油性溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、喷鼻剂、栓剂、用于吸入的细小分散的粉剂或气雾剂或喷雾剂和用于胃肠道外的无菌水性或油性溶液或混悬剂或无菌乳剂。
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