CN103421006B - 2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶衍生物及其制备方法和应用。这是一种2,3-二取代苯基-5-取代芳甲基-7-取代苯亚甲基二氢吡唑并六氢吡啶衍生物，结构如式（I）。制备方法以取代芳甲胺和丙烯酸甲酯为原料，依次经过Michael加成、Dieckmann缩合、水解脱羧，与取代苯甲醛发生Aldol反应得到中间体N-取代芳甲基-3,5-双取代苄叉基-4-哌啶酮，再与取代苯肼缩合制得式（Ⅰ）化合物。该化合物能高效抑制人白血病、人食道癌、人肝癌、人卵巢癌、人乳腺癌等多种癌细胞系增殖，在人和大鼠肝微粒体中代谢稳定性较好；对CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2和CYP2C19等人肝微粒体的五种酶没有直接性和竞争性抑制作用；并具有较高的生物利用度，对正常细胞毒性较低，可用于在制备治疗上述人肿瘤药物。

Description

2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于有机合成及医药化学领域，涉及一种2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶衍生物，具体地说是一种2,3-二取代苯基-5-取代芳甲基-7-取代苯亚甲基二氢吡唑并六氢吡啶衍生物及其制备方法，并涉及其在制备抑制人白血病、人食道癌、人肝癌,、人卵巢癌和人乳腺癌,等多种人癌细胞系增殖的药物方面的应用。
背景技术
据世界卫生组织预计，我国现有癌症病人300多万，每年新发病160～200万人，并以3%速率增加，且呈年轻化趋势。例如，血细胞癌症白血病，它好发于青少年，其发病率排在青少年肿瘤的第一位，所以对人类的危害更为明显和突出。乳腺癌和卵巢癌是女性最常见的肿瘤疾病，严重影响妇女身心健康甚至危及生命。目前，大多数癌症仍采用多种细胞毒性药物联合化疗的方法来治疗。由于所用的化疗药物多缺乏特异性，对正常细胞和肿瘤细胞具有几乎相同的杀伤作用，所以毒性较大。更棘手的是，大多数复发癌症患者的癌细胞常常对现有的化疗药物产生耐药。
在我国“国家中长期发展纲要”中，将“重大新药创制”列为十六个专题之一。近年来，我国政府不断加大投资和政策的引导，希望加速我国创制新药的研究。然而，目前我国上市的抗癌新药，以及正处于临床前研究中的候选药物数量极少，特别是具有我国自主知识产权的候选药物的数量就更少。为此，寻找新型特异性高和毒性低的抗癌药物是目前面临的一大重要课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一类具有高效、低毒、广谱、代谢稳定，生物利用度较高的抗癌药物先导化合物2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶。
本发明2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶，是一种2,3-二取代苯基-5-取代芳甲基-7-取代苯亚甲基二氢吡唑并六氢吡啶衍生物，其结构式如式（Ⅰ）所示：
R为卤素、硝基或C1～C3烷氧基中的一种，n=1或2；Ar为苯基、取代苯基、呋喃基或吡啶基；苯环上的取代基为C1～C3烷氧基或卤素；R1为氢、卤素或吡啶基。
优选的，R1为氢、4位取代的卤素、3-吡啶基或2-吡啶基，尤其是4-氟或4-氯。
优选的，Ar为苯基、取代苯基、2-呋喃基或3-吡啶基，取代苯基上的取代基为4-甲氧基、4-氟或2-氟。
优选的，n=1时，R为硝基、氯或甲氧基，更优选为3位或4位的硝基、2位或3位的氯，或者4位的甲氧基；n=2时，R为硝基或氯，更优选为2位和4位的硝基，或者3位和4位的氯。
本发明提供了上述二氢吡唑并六氢吡啶衍生物的制备方法，该方法包括以下步骤：
（1）从式（A）所示的取代芳甲胺和丙烯酸甲酯出发，依次经过Michael加成，Dieckmann缩合和酸作用下水解脱羧得到黄色油状物，式（Ⅲ）的N-取代芳甲基-4-哌啶酮（Ⅲ）；
（2）式（Ⅲ）N-取代芳甲基-4-哌啶酮（Ⅲ）与式（B）的取代芳香醛发生Aldol反应，得到中间体式（II）的N-取代芳甲基-3,5-双取代苄叉基-4-哌啶酮；
（3）式（Ⅱ）的N-取代芳甲基-3,5-双取代苄叉基-4-哌啶酮（Ⅱ）与式（C）的取代苯肼进行缩合反应，得到通式为（I）的2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶。
其中Ar、R1、R和n的定义同上。
优选的是，步骤（1）所用溶剂为甲醇,所述醇钠为甲醇钠；步骤（2）所用碱为10%质量分数的NaOH溶液（溶度为2.75mol/L）；所用溶剂谓无水乙醇，反应在常温搅拌下0.5h～2h；步骤（3）所述缩合反应的缩合剂为乙醇钠，反应温度为乙醇回流温度。
本发明式（I）所示化合物的制备反应式是：
步骤（1）所述的Michael加成反应包括以下步骤：丙烯酸甲酯与醇混合后，搅拌下向反应体系中滴加取代芳甲胺与醇的混合液，使反应体系温度不超过50℃；滴加完毕后加热回流6～10小时；反应结束后回收醇和未反应的丙烯酸甲酯，减压蒸馏，得到N,N-双(β-丙酸甲酯)芳甲胺；丙烯酸甲酯与取代芳甲胺的摩尔比为1：2～1：4；所述的醇为甲醇或乙醇。
所述的Dieckmann缩合反应和水解脱羧包括以下步骤：
（a）在有机溶剂中加甲醇和钠，滴加N,N-双(β-丙酸甲酯)芳甲胺与有机溶剂混合液，滴加完毕后回流4～8小时；钠、甲醇与N,N-双(β-丙酸甲酯)芳甲胺的用量比为1mol：1.5～2ml：0.3～0.5mol；有机溶剂为甲苯；
（b）反应结束后冷却至室温，除去未反应的钠，反应混合物用质量浓度20%～30%的盐酸溶液提取，回流4～8小时，反应结束后冷却至室温；
（c）搅拌下加入碱中和至pH=8～9，用乙酸乙酯萃取，干燥有机相，去除乙酸乙酯，得到式（Ⅲ）的N-芳甲基4-哌啶-酮。
步骤（2）中，N-取代芳甲基-4-哌啶酮与取代芳香醛的摩尔比为1：2～1：2.5，Aldol反应的步骤包括：N-取代芳甲基-4-哌啶酮与取代芳香醛与醇混合，加入氢氧化钠或氢氧化钾，搅拌20～60分钟；反应结束后用醇洗涤，并用乙酸乙酯和石油醚重结晶。醇为甲醇或乙醇。
步骤（3）中，缩合反应的步骤包括：向乙醇钠与醇混合液中加入N-取代芳甲基-3,5-双取代苄叉基-4-哌啶酮和取代苯肼，回流20～30小时，得到的固体用二氯甲烷和乙醇重结晶纯化；N-取代芳甲基-3,5-双取代苄叉基-4-哌啶酮、取代苯肼和乙醇钠的摩尔比为1：2～4：1～3；醇为甲醇或乙醇。
上述式（Ⅰ）所示的化合物人和大鼠肝微粒体中代谢稳定性较好；对CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2和CYP2C19等人肝微粒体的五种酶没有直接性和竞争性抑制作用；能够抑制多种肿瘤细胞增殖，并具有较高的生物利用度和对正常细胞毒性较低等特点和优点。本发明化合物可以用于制备抑制人白血病K562细胞系、人白血病Jurkat细胞系、人白血病U937细胞系或人白血病THP-1细胞系、人肝癌SMMC-7721细胞系、人乳腺癌MCF-7细胞系或乳腺癌MDA-MB-231细胞系增殖的药物。或者用于制备治疗白血病、食道癌、肝癌、卵巢癌或乳腺癌的药物。
在制备治疗上述人肿瘤药物方面具有显著的实用性。用于制备治疗白血病、食道癌、肝癌、卵巢癌或乳腺癌的药物。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。
2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶衍生物的结构如通式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）中：R为氟、氯、硝基、C3及以下的烷氧基中的一种，n=1～2；Ar为苯基、取代苯基、2-呋喃基、3-吡啶基中的一种，苯环上的取代基为4-甲氧基、4-氟、2-氟；R1为氢、4-氯、4-氟、2-吡啶基、3-吡啶基中的一种。具体如表1。
1.本发明通式（Ⅰ）的实施例的结构式见表1。
表1实施例（Ⅰ1～Ⅰ36）的结构式
化合物 Ar R R1 化合物 Ar R R1
Ⅰ1 2-呋喃基* 4-NO2 4-F Ⅰ19 2-F-苯基 4-NO2 4-F
Ⅰ2 2-呋喃基 3-NO2 4-F Ⅰ20 2-F-苯基 3-NO2 4-F
Ⅰ3 2-呋喃基 2-Cl 4-F Ⅰ21 2-F-苯基 2-Cl 4-F4 -->
Ⅰ4 2-呋喃基 4-OCH3 4-F Ⅰ22 2-F-苯基 4-OCH3 4-F
Ⅰ5 2-呋喃基 2,4-NO2 4-F Ⅰ23 2-F-苯基 2,4-NO2 4-F
Ⅰ6 2-呋喃基 3,4-Cl 4-F Ⅰ24 2-F-苯基 3,4-Cl 4-F
Ⅰ7 2-呋喃基 4-NO2 4-Cl Ⅰ25 4-F-苯基 4-NO2 4-F
Ⅰ8 2-呋喃基 3-NO2 4-Cl Ⅰ26 4-F-苯基 3-NO2 4-F
Ⅰ9 2-呋喃基 2-Cl 4-Cl Ⅰ27 4-F-苯基 2-Cl 4-F
Ⅰ10 2-呋喃基 4-OCH3 4-Cl Ⅰ28 4-F-苯基 4-OCH3 4-F
Ⅰ11 2-呋喃基 2,4-NO2 4-Cl Ⅰ29 4-F-苯基 2,4-NO2 4-F
Ⅰ12 2-呋喃基 3,4-Cl 4-Cl Ⅰ30 4-F-苯基 3,4-Cl 4-F
Ⅰ13 4-OCH3苯基 4-NO2 4-F Ⅰ31 3-吡啶基* 4-NO2 4-Cl
Ⅰ14 4-OCH3苯基 3-NO2 4-F Ⅰ32 3-吡啶基 3-NO2 4-Cl
Ⅰ15 4-OCH3苯基 2-Cl 4-F Ⅰ33 3-吡啶基 2-Cl 4-Cl
Ⅰ16 4-OCH3苯基 4-OCH3 4-F Ⅰ34 3-吡啶基 4-OCH3 4-Cl
Ⅰ17 4-OCH3苯基 2,4-NO2 4-F Ⅰ35 3-吡啶基 2,4-NO2 4-Cl
Ⅰ18 4-OCH3苯基 3,4-Cl 4-F Ⅰ36 3-吡啶基 3,4-Cl 4-Cl
*2-furyl：2-呋喃基；3-pyridyl：3-吡啶基
2.本发明通式（Ⅰ）的实施例的制备方法
（1）室温下，向100mL三颈瓶中加入0.16mol丙烯酸甲酯和7mL甲醇，搅拌下将0.04mol式（A）所示的取代芳甲胺和4mL甲醇的混合液慢慢加入三颈瓶中，使反应体系温度不超过50℃。滴加完毕后，再加热回流8h，待反应结束后，回收甲醇和未反应的丙烯酸甲酯，减压蒸馏，经过Michael加成得到浅黄色油状液体N,N-双(β-丙酸甲酯)芳甲胺。
向250mL干燥的三颈瓶中加入15mL无水甲苯、0.122mol金属钠搅拌加热回流，加入0.2mL无水甲醇，然后慢慢滴加0.04molN,N-双(β-丙酸甲酯)芳甲胺和20mL无水甲苯混合液。待滴加完毕后，回流6h。反应结束后冷却至室温，加入10mL甲醇除去未反应完的Na，将混合物用25%(质量分数)的盐酸溶液120mL提取，油浴回流6h。冷却反应混合物，搅拌下加入浓NaOH溶液（质量分数20%～40%）中和至碱性(pH=8.5左右)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥,蒸馏回收乙酸乙酯，减压蒸馏剩余物质，得到式（Ⅲ）的淡黄色油状液体N-芳甲基4-哌啶-酮。
（2）向50mL干燥的圆底瓶中加入0.005mol式（Ⅲ）的N-芳甲基4-哌啶-酮和0.01mol式（B）的取代苯甲醛，加入15mL无水乙醇，搅拌加入1mL10%NaOH(质量分数)，室温搅拌30min，有黄色固体析出，薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，用乙醇洗固体，用乙酸乙酯和石油醚重结晶（v:v=1:2），得到式（Ⅱ）的N-取代芳甲基-3,5-双取代苄叉基-4-哌啶酮。
（3）向25mL干燥的圆底烧瓶中加入0.002mol乙醇钠和2mL无水乙醇，待其溶解后再加入0.001mol式（Ⅱ）的N-取代芳甲基-3,5-双取代苄叉基-4-哌啶酮和0.004mol式（C）的取代苯肼，回流反应约24h，得到黄色固体，用二氯甲烷与乙醇进行重结晶，纯化后得到2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶（Ⅰ1～Ⅰ36）。反应式如下。
化合物I1～I36的收率、熔点、红外、氢谱和元素分析测试数据分别如实施例1～36。
实施例1：2-（4-硝基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（2-呋喃甲基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ1）
收率86%；熔点245-246℃;1HNMR(CDCl3,400MHz)δ2.43-2.49(m,1H),3.16-3.42(m,3H),3.43-3.63(m,2H),4.06(d,J=14.1Hz,1H),4.47(d,J=12.7Hz,1H),6.11(s,1H),,6.37(s,1H),6.82(t,J=7.2Hz,1H),7.01-7.74(m,13H).IR(KBr,cm-1)3445,1640,1597,1495,1436,1082,747;;Anal.CalcdforC30H24F2N4O3:C,68.43;H,4.59;N,10.64.Found:C,68.45;H,4.63;N,10.61.
实施例2：2-（3-硝基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（2-呋喃甲基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ2）
收率77%；熔点259-260℃;1HNMR(400MHz,)δ2.44-2.51(m,1H),3.15-3.33(m,3H),3.47-3.63(m,2H),4.11(d,J=14.3Hz,1H),4.42(d,J=12.4Hz,1H),6.13(s,1H),,6.37(s,1H),6.87(t,J=7.2Hz,1H),7.03-7.72(m,13H);IR(KBr,cm-1)3447,1641,1598,1495,1436,1081,748;Anal.CalcdforC30H24F2N4O3:C,68.43;H,4.59;N,10.64;Found:C,68.41;H,4.61;N,10.61.
实施例3：2-（2-氯苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（2-呋喃甲基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ3）
收率72%；熔点221-222℃;1HNMR(400MHz,CDCl3)δ2.41-2.49(m,1H),3.05-3.27(m,3H),3.51-3.64(m,2H),4.09(d,J=12.5Hz,1H),4.53(d,J=12.7Hz,1H),6.17(s,1H),,6.38(s,1H),6.85(t,J=7.2Hz,1H),7.03-7.77(m,13H)；IR(KBr,cm-1)3446,1641,1598,1495,1436,1083,746;Anal.CalcdforC30H24ClF2N3O:C,69.83;H,4.69;N,8.14.Found:C,69.75;H,4.63;N,8.11.
实施例4：2-（4-甲氧基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（2-呋喃甲基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ4）
收率69%；熔点237-238℃;1HNMR(400MHz,CDCl3)δ2.43-2.51(m,1H),3.15-3.34(m,3H),3.45-3.63(m,2H),3.78(s，6H)，4.07(d,J=14.3Hz,1H),4.49(d,J=13.5Hz,1H),6.14(s,1H),,6.37(s,1H),6.80(t,J=7.3Hz,1H),7.01-7.75(m,13H);IR(KBr,cm-1)3446,1643,1595,1496,1437,1083,749;Anal.CalcdforC31H27F2N3O2:C,72.78;H,5.32;N,8.21.Found:C,72.87;H,5.36;N,8.24.
实施例5：2-（2，4-二硝基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（2-呋喃甲基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ5）
收率83%；熔点217-218℃;1HNMR(400MHz,)δ2.37-2.45(m,1H),3.13-3.35(m,3H),3.46-3.64(m,2H),4.05(d,J=14.5Hz,1H),4.47(d,J=12.8Hz,1H),6.09(s,1H),,6.39(s,1H),6.83(t,J=7.5Hz,1H),7.01-7.78(m,12H)；IR(KBr,cm-1)3448,1642,1596,1495,1436,1082,744;Anal.CalcdforC30H23F2N5O5:C,63.04;H,4.06;N,12.25.Found:C,63.05;H,4.03;N,12.35.
实施例6：2-（3,4二氯苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（2-呋喃甲基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ6）
收率90%；熔点209-210℃;1HNMR(400MHz,)δ2.46-2.59(m,1H),3.14-3.32(m,3H),3.56-3.63(m,2H),4.17(d,J=14.3Hz,1H),4.46(d,J=12.8Hz,1H),6.17(s,1H),,6.37(s,1H),6.71(t,J=7.4Hz,1H),7.06-7.78(m,12H)；IR(KBr,cm-1)3445,1643,1595,1495,1434,1081,746;Anal.CalcdforC30H23Cl2F2N3O:C,65.46;H,4.21;N,7.63.Found:C,65.49;H,4.23;N,7.67.
实施例7：2-（4-硝基苯基）-3-（4-氯苯基）-5-（2-呋喃甲基）-7-（4-氯苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ7）
收率72%；熔点163-164℃;1HNMR(CDCl3,400MHz)δ2.24-2.45(m,1H),3.13-3.31(m,3H),3.54-3.74(m,2H),4.09(d,J=14.3Hz,1H),4.63(d,J=12.6Hz,1H),6.27(s,1H),6.42(s,1H),6.96(t,J=7.3Hz,1H),7.14-7.78(m,13H).IR(KBr,cm-1)3446,1641,1601,1495,1435,1082,889;Anal.CalcdforC30H24Cl2N4O3:C,64.41;H,4.32;N,10.01.Found:C,64.39;H,4.38;N,10.11.
实施例8：2-（3-硝基苯基）-3-（4-氯苯基）-5-（2-呋喃甲基）-7-（4-氯苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ8）
收率74%；熔点154-155℃;1HNMR(400MHz,CDCl3)δ2.23-2.46(m,1H),3.12-3.31(m,3H),3.57-3.71(m,2H),4.04(d,J=14.1Hz,1H),4.61(d,J=12.6Hz,1H),6.26(s,1H),6.43(s,1H),6.94(t,J=7.2Hz,1H),7.14-7.75(m,13H);IR(KBr,cm-1)3447,1643,1601,1495,1437,1082,891;Anal.CalcdforC30H24Cl2N4O3:C,64.41;H,4.32;N,10.01.Found:C,64.39;H,4.34;N,9.98.
实施例9：2-（2-氯苯基）-3-（4-氯苯基）-5-（2-呋喃甲基）-7-（4-氯苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ9）
收率69%；熔点166-167℃;1HNMR(400MHz,)δ2.13-2.36(m,1H),3.09-3.35(m,3H),3.54-3.71(m,2H),4.09(d,J=14.3Hz,1H),4.71(d,J=12.7Hz,1H),6.27(s,1H),6.45(s,1H),6.96(t,J=7.3Hz,1H),7.14-7.81(m,13H)；IR(KBr,cm-1)3445,1641,1603,1495,1435,1083,887;Anal.CalcdforC30H24Cl3N3O:C,65.65;H,4.41;N,7.66.Found:C,65.63;H,4.44;N,7.65.
实施例10：2-（4-甲氧基苯基）-3-（4-氯苯基）-5-（2-呋喃甲基）-7-（4-氯苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ10）
收率67%；熔点149-150℃;1HNMR(400MHz,)δ2.33-2.41(m,1H),3.12-3.36(m,3H),3.64-3.78(m,2H),3.79（s，6H）,4.13(d,J=14.2Hz,1H),4.63(d,J=12.8Hz,1H),6.26(s,1H),6.42(s,1H),6.99(t,J=7.3Hz,1H),7.17-7.84(m,13H)；IR(KBr,cm-1)3444,1645,16051495,1435,1082,892;Anal.CalcdforC31H27Cl2N3O2:C,68.38;H,5.00;N,7.72.Found:C,68.43;H,5.04;N,7.75.
实施例11：2-（2，4-二硝基苯基）-3-（4-氯苯基）-5-（2-呋喃甲基）-7-（4-氯苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ11）
收率59%；熔点178-179℃;1HNMR(400MHz,)δ2.19-2.47(m,1H),3.12-3.31(m,3H),3.56-3.74(m,2H),4.06(d,J=14.1Hz,1H),4.71(d,J=12.7Hz,1H),6.27(s,1H),6.51(s,1H),6.97(t,J=7.2Hz,1H),7.11-7.79(m,12H)；IR(KBr,cm-1)3444,1643,1602,1496,1435,1082,887;Anal.CalcdforC30H23Cl2N5O5:C,59.61;H,3.84;N,11.59.Found:C,59.63;H,3.87;N,11.55.
实施例12：2-（3,4-二氯苯基）-3-（4-氯苯基）-5-（2-呋喃甲基）-7-（4-氯苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ12）
收率82%；熔点142-143℃;1HNMR(400MHz,)δ2.27-2.51(m,1H),3.14-3.33(m,3H),3.55-3.76(m,2H),4.06(d,J=12.8Hz,1H),4.67(d,J=12.7Hz,1H),6.27(s,1H),6.51(s,1H),6.96(t,J=7.4Hz,1H),7.08-7.76(m,12H)；IR(KBr,cm-1)3446,1643,1601,1493,1435,1084,887;Anal.CalcdforC30H23Cl4N3O:C,61.77;H,3.97;N,7.20.Found:C,61.73;H,3.94;N,7.25.
实施例13：2-（4-硝基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（4-甲氧基苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ13）
收率87%；熔点187-188℃;1HNMR(400MHz,)δ2.41(t,J=10.8Hz,1H),3.15-3.36(m,3H),3.57-3.73(m,2H),3.76(s,3H),4.08(d,J=12.8Hz,1H),4.55(d,J=11.4Hz,1H),6.83(t,J=7.2Hz,1H),6.92-7.23(m,16H)；IR(KBr,cm-1)2985,2876,1608,1554,1273,1147,1068;Anal.CalcdforC33H28F3N4O3:C,69.95;H,4.98;N,9.89.Found:C,69.97;H,5.03;N,9.87.
实施例14：2-（3-硝基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（4-甲氧基苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ14）
收率69%；熔点181-182℃;1HNMR(400MHz,)δ2.42(t,J=12.8Hz,1H),3.13-3.34(m,3H),3.59-3.75(m,2H),3.79(s,3H),4.06(d,J=12.5Hz,1H),4.56(d,J=11.4Hz,1H),6.87(t,J=7.2Hz,1H),6.91-7.33(m,16H)；IR(KBr,cm-1)2987,2876,1608,1554,1274,1145,1067;Anal.CalcdforC33H28F3N4O3:C,69.95;H,4.98;N,9.89.Found:C,69.93;H,5.04;N,9.85.
实施例15：2-（2-氯苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（4-甲氧基苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ15）
收率73%；熔点174-175℃;1HNMR(400MHz,)δ2.45(t,J=10.9Hz,1H),3.13-3.36(m,3H),3.55-3.75(m,2H),3.76(s,3H),4.05(d,J=12.7Hz,1H),4.51(d,J=11.4Hz,1H),6.88(t,J=7.2Hz,1H),6.82-7.21(m,16H)；IR(KBr,cm-1)2984,2875,1608,1556,1274,1146,1067;Anal.CalcdforC33H28ClF2N3O:C,71.28;H,5.08;N,7.56.Found:C,71.33;H,5.14;N,7.55.
实施例16：2-（4-甲氧基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（4-甲氧基苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ16）
收率69%；熔点160-161℃;1HNMR(400MHz,)δ2.37(t,J=10.9Hz,1H),3.11-3.35(m,3H),3.53-3.62(m,2H),3.78(s,3H),3.80(s,3H),4.03(d,J=12.7Hz,1H),4.54(d,J=11.4Hz,1H),6.82(t,J=7.2Hz,1H),6.93-7.24(m,16H)；IR(KBr,cm-1)2983,2876,1608,1556,1273,1146,1069;Anal.CalcdforC34H31F2N3O2:C,74.03;H,5.66;N,7.62.Found:C,74.13;H,5.64;N,7.65.
实施例17：2-（2,4-二硝基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（4-甲氧基苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ17）
收率82%；熔点201-202℃;1HNMR(400MHz,)δ2.43(t,J=10.6Hz,1H),3.11-3.35(m,3H),3.55-3.73(m,2H),3.79(s,3H),4.04(d,J=12.8Hz,1H),4.49(d,J=11.7Hz,1H),6.83(t,J=7.2Hz,1H),6.91-7.25(m,15H)；IR(KBr,cm-1)2983,2876,1607,1554,1273,1145,1067;Anal.CalcdforC33H27F2N5O5:C,64.81;H,4.45;N,11.45.Found:C,64.83;H,4.44;N,11.51.
实施例18：2-（3,4-二氯苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（4-甲氧基苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ18）
收率79%；熔点204-205℃;1HNMR(400MHz,)δ2.49(t,J=10.8Hz,1H),3.08-3.37(m,3H),3.56-3.77(m,2H),3.72(s,3H),4.11(d,J=12.8Hz,1H),4.51(d,J=11.4Hz,1H),6.87(t,J=7.2Hz,1H),6.89-7.25(m,15H)；IR(KBr,cm-1)2985,2878,1608,1552,1271,1145,1071;Anal.CalcdforC33H27Cl2F2N3O:C,67.12;H,4.61;N,7.12.Found:C,67.23;H,4.64;N,7.15.
实施例19：2-（4-硝基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（2-氟苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ19）
收率68%；熔点206-207℃;1HNMR(400MHz,)δ2.53(s,1H),3.15-3.43(m,3H),3.78(s,2H),4.17(d,J=13.9Hz,1H),4.63(d,J=12.3Hz,1H),6.89(t,J=7.2Hz,1H),7.01-7.41(m,16H)；IR(KBr,cm-1)3448,1598,1498,1088,1027,835;Anal.CalcdforC32H25F3N4O2:C,69.31;H,4.54;N,10.10.Found:C,69.33;H,4.57;N,10.15.554.56
实施例20：2-（3-硝基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（2-氟苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ20）
收率63%；熔点224-225℃;1HNMR(400MHz,)δ2.56(s,1H),3.15-3.49(m,3H),3.78(s,2H),4.17(d,J=13.8Hz,1H),4.63(d,J=12.5Hz,1H),6.89(t,J=7.2Hz,1H),7.04-7.45(m,16H)；IR(KBr,cm-1)3450,1597,1496,1089,1028,837;Anal.CalcdforC32H25F3N4O2:C,69.31;H,4.54;N,10.10.Found:C,69.35;H,4.56;N,10.05.
实施例21：2-（2-氯苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（2-氟苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ21）
收率56%；熔点184-185℃;1HNMR(400MHz,)δ2.49(s,1H),3.15-3.43(m,3H),3.78(s,2H),4.21(d,J=13.7Hz,1H),4.63(d,J=12.6Hz,1H),6.88(t,J=7.3Hz,1H),7.01-7.42(m,16H)；IR(KBr,cm-1)3450,1597,1498,1088,1027,837;Anal.CalcdforC32H25ClF3N3:C,70.65;H,4.63;N,7.72.Found:C,70.63;H,4.64;N,7.75.544.01
实施例22：2-（4-甲氧基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（2-氟苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ22）
收率82%；熔点151-152℃;1HNMR(400MHz,)δ2.55(s,1H),3.11-3.43(m,3H),3.78(s,2H),3.81(s,3H),4.17(d,J=13.9Hz,1H),4.62(d,J=12.3Hz,1H),6.89(t,J=7.2Hz,1H),7.02-7.43(m,16H)；IR(KBr,cm-1)3445,1596,1498,1089,1026,841;Anal.CalcdforC33H28F3N3O:C,73.45;H,5.23;N,7.79.Found:C,73.43;H,5.24;N,7.75.539.59
实施例23：2-（2,4-二硝基氯苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（2-氟苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ23）
收率78%；熔点157-158℃;1HNMR(400MHz,)δ2.54(s,1H),3.13-3.40(m,3H),3.78(s,2H),4.17(d,J=13.1Hz,1H),4.65(d,J=12.7Hz,1H),6.89(t,J=7.2Hz,1H),7.03-7.45(m,15H)；IR(KBr,cm-1)3449,1598,1498,1088,1027,836;Anal.CalcdforC32H24F3N5O4:C,64.10;H,4.03;N,11.68.Found:C,64.13;H,4.14;N,11.65.599.56
实施例24：2-（3,4-二氯苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（2-氟苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ24）
收率87%；熔点240-241℃;1HNMR(400MHz,)δ2.53(s,1H),3.16-3.46(m,3H),3.68(s,2H),4.23(d,J=13.7Hz,1H),4.62(d,J=12.4Hz,1H),6.89(t,J=7.2Hz,1H),7.01-7.43(m,15H)；IR(KBr,cm-1)3445,1598,1497,1088,1025,837;Anal.CalcdforC32H24Cl2F3N3:C,66.44;H,4.18;N,7.26.Found:C,66.43;H,4.14;N,7.25.578.45
实施例25：2-（4-硝基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（4-氟苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ25）
收率67%；熔点237-238℃;1HNMR(400MHz,)δ2.46(t,J=11.5Hz,1H),3.12-3.28(m,3H),3.54(d,J=13.0Hz,1H),3.68(d,J=13.4Hz,1H),4.04(d,J=13.5Hz,1H),4.55(d,J=12.6Hz,1H),6.87(t,J=7.5Hz,1H),6.92-7.33(m,16H)；IR(KBr,cm-1)3025,2917,1604,1584,1273,1200,1082;Anal.CalcdforC32H25F3N4O2:C,69.31;H,4.54;N,10.10.Found:C,69.33;H,4.57;N,10.15.
实施例26：2-（3-硝基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（4-氟苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ26）
收率71%；熔点211-212℃;1HNMR(400MHz,)δ2.49(t,J=11.4Hz,1H),3.13-3.35(m,3H),3.56(d,J=13.2Hz,1H),3.67(d,J=13.4Hz,1H),4.07(d,J=13.5Hz,1H),4.55(d,J=12.7Hz,1H),6.87(t,J=7.5Hz,1H),6.92-7.41(m,16H)；IR(KBr,cm-1)3023,2917,1605,1585,1273,1201,1081;Anal.CalcdforC32H25F3N4O2:C,69.31;H,4.54;N,10.10.Found:C,69.35;H,4.56;N,10.05.
实施例27：2-（2-氯苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（4-氟苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ27）
收率85%；熔点147-148℃;1HNMR(400MHz,)δ2.43(t,J=11.2Hz,1H),3.09-3.31(m,3H),3.53(d,J=13.2Hz,1H),3.1(d,J=13.4Hz,1H),4.06(d,J=13.7Hz,1H),4.52(d,J=12.6Hz,1H),6.86(t,J=7.5Hz,1H),6.91-7.35(m,16H)；IR(KBr,cm-1)3025,2917,1603,1586,1273,1205,1083；Anal.CalcdforC32H25ClF3N3:C,70.65;H,4.63;N,7.72.Found:C,70.63;H,4.64;N,7.75.
实施例28：2-（4-甲氧基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（4-氟苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ28）
收率67%；熔点185-186℃;1HNMR(400MHz,)δ2.46(t,J=11.5Hz,1H),3.14-3.31(m,3H),3.56(d,J=13.1Hz,1H),3.67(d,J=13.4Hz,1H),3.81(s,3H),4.06(d,J=13.6Hz,1H),4.53(d,J=12.6Hz,1H),6.84(t,J=7.5Hz,1H),6.91-7.35(m,16H)；IR(KBr,cm-1)3020,2918,1603,1584,1273,1203,1082;Anal.CalcdforC33H28F3N3O:C,73.45;H,5.23;N,7.79.Found:C,73.43;H,5.24;N,7.75.
实施例29：2-（2,4-二硝基苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（4-氟苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ29）
收率75%；熔点191-192℃;1HNMR(400MHz,)δ2.53(t,J=11.3Hz,1H),3.11-3.29(m,3H),3.46(d,J=13.0Hz,1H),3.65(d,J=13.4Hz,1H),4.03(d,J=13.5Hz,1H),4.54(d,J=12.6Hz,1H),6.86(t,J=7.5Hz,1H),6.89-7.35(m,15H)；IR(KBr,cm-1)3023,2918,1604,1584,1275,1203,1081;Anal.CalcdforC32H24F3N5O4:C,64.10;H,4.03;N,11.68.Found:C,64.13;H,4.14;N,11.65.
实施例30：2-（3,4-二氯苯基）-3-（4-氟苯基）-5-（4-氟苯基）-7-（4-氟苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ30）
收率81%；熔点278-279℃;1HNMR(400MHz,)δ2.54(t,J=11.4Hz,1H),3.16-3.29(m,3H),3.56(d,J=13.0Hz,1H),3.69(d,J=13.5Hz,1H),4.05(d,J=13.5Hz,1H),4.56(d,J=12.6Hz,1H),6.86(t,J=7.5Hz,1H),6.91-7.35(m,15H)；IR(KBr,cm-1)3024,2921,1603,1584,1271,1206,1084;Anal.CalcdforC32H24Cl2F3N3:C,66.44;H,4.18;N,7.26.Found:C,66.43;H,4.14;N,7.25.
实施例31：2-（4-硝基苯基）-3-（4-氯苯基）-5-（3-吡啶基）-7-（4-氯苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ31）
收率79%；熔点189-190℃;1HNMR(400MHz,)δ2.47-2.51(m,1H),3.11-3.27(m,3H),3.55-3.75(m,2H),4.15(d,J=14.2Hz,1H),4.56(d,J=12.6Hz,1H),6.88(t,J=7.2Hz,1H),7.02-7.59(m,14H),8.43(d,J=3.4Hz,2H)；IR(KBr,cm-1)3451,1643,1486,1416,1085,1021,833;Anal.CalcdforC31H25Cl2N5O2:C,65.27;H,4.42;N,12.28.Found:C,65.23;H,4.44;N,12.25.
实施例32：2-（3-硝基苯基）-3-（4-氯苯基）-5-（3-吡啶基）-7-（4-氯苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ32）
收率77%；熔点174-175℃;1HNMR(400MHz,)δ2.43-2.50(m,1H),3.13-3.27(m,3H),3.51-3.75(m,2H),4.13(d,J=14.3Hz,1H),4.57(d,J=12.8Hz,1H),6.88(t,J=7.2Hz,1H),7.02-7.59(m,14H),8.43(d,J=3.2Hz,2H)；IR(KBr,cm-1)3452,1645,1487,1416,1084,1021,835;Anal.CalcdforC31H25Cl2N5O2:C,65.27;H,4.42;N,12.28.Found:C,65.25;H,4.46;N,12.27.
实施例33：2-（2-氯苯基）-3-（4-氯苯基）-5-（3-吡啶基）-7-（4-氯苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ33）
收率54%；熔点267-268℃;1HNMR(400MHz,)δ2.49-2.53(m,1H),3.08-3.24(m,3H),3.52-3.77(m,2H),4.15(d,J=14.2Hz,1H),4.58(d,J=12.6Hz,1H),6.81(t,J=7.2Hz,1H),7.01-7.61(m,14H),8.45(d,J=3.3Hz,2H)；IR(KBr,cm-1)3454,1647,1486,1416,1085,1022,837;Anal.CalcdforC31H25Cl3N4:C,66.50;H,4.50;N,10.01.Found:C,66.43;H,4.54;N,10.15.
实施例34：2-（4-甲氧基苯基）-3-（4-氯苯基）-5-（3-吡啶基）-7-（4-氯苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ34）
收率61%；熔点171-172℃;1HNMR(400MHz,)δ2.39-2.47(m,1H),3.13-3.27(m,3H),3.54-3.74(m,2H),3.74(s,3H)，4.16(d,J=14.7Hz,1H),4.57(d,J=12.8Hz,1H),6.87(t,J=7.2Hz,1H),7.02-7.59(m,14H),8.51(d,J=3.3Hz,2H)；IR(KBr,cm-1)3457,1643,1486,1418,1085,1021,833;Anal.CalcdforC32H28Cl2F3N4O:C,69.19;H,5.08;N,10.09.Found:C,69.13;H,5.14;N,10.05.
实施例35：2-（2,4-二硝基苯基）-3-（4-氯苯基）-5-（3-吡啶基）-7-（4-氯苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ35）
收率72%；熔点251-252℃;1HNMR(400MHz,)δ2.41-2.46(m,1H),3.13-3.29(m,3H),3.52-3.72(m,2H),4.18(d,J=14.2Hz,1H),4.59(d,J=12.7Hz,1H),6.81(t,J=7.2Hz,1H),7.02-7.57(m,13H),8.37(d,J=3.3Hz,2H)；IR(KBr,cm-1)3451,1645,1486,1417,1085,1024,837;Anal.CalcdforC31H24Cl2N6O4:C,60.50;H,3.93;N,13.65.Found:C,60.43;H,5.04;N,13.67.
实施例36：2-（3,4-二氯苯基）-3-（4-氯苯基）-5-（3-吡啶基）-7-（4-氯苄叉基）-2H-吡唑并[4,3-c]六氢吡啶（Ⅰ36）
收率78%；熔点264-265℃;1HNMR(400MHz,)δ2.46-2.53(m,1H),3.14-3.27(m,3H),3.54-3.77(m,2H),4.12(d,J=13.8Hz,1H),4.59(d,J=12.6Hz,1H),6.89(t,J=7.1Hz,1H),7.01-7.52(m,13H),8.51(d,J=3.3Hz,2H)；IR(KBr,cm-1)3454,1645,1487,1416,1085,1022,838Anal.CalcdforC31H24Cl4N4:C,62.64;H,4.07;N,9.43.Found:C,62.63;H,4.14;N,9.45.
实施例37本发明通式（Ⅰ）实施例的抗肿瘤活性测试
主要采用CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssay法测试本发明通式（Ⅰ）化合物抑制人白血病K562等9种人癌细胞系增殖的活性.
1.受试细胞系：人白血病K562，Jurkat，U937，THP-1细胞系；人食道癌ECA-109细胞系；人肝癌SMMC-7721细胞系,人卵巢癌HO-8910细胞系,人乳腺癌MCF-7细胞系,乳腺癌MDA-MB-231细胞系。
2.抑制癌细胞系增殖实验的具体操作步骤：
正常培养K562细胞（含10%FBS的RPMI1640培养基），指数生长状态下，消化后取合适密度，约500个/孔，种板于384孔板，20μl/孔；种板1d后，加药。5μl/孔，2个复孔，5个给药浓度。52个化合物，及阳性药imatinib，起始给药浓度为3.333μM，依次3倍稀释；paclitaxol起始浓度为0.1μM。
化合物处理3d后，取细胞培养板室温平衡后，每孔加入25μlCellTiter-Glo反应液，震荡后稳定10min，Envision测定荧光信号值。按下列公式计算抑制率：抑制率（%）=(信号值对照－信号值给药)/信号值对照×100%。并根据各浓度下的细胞抑制率，采用LOGIT法计算50%抑制浓度（50%inhibitoryconcentration，IC50）。
3.测试结果：
本发明通式（Ⅰ）化合物抑制人白血病K562等9种人癌细胞系增殖的IC50见表2。
表2目标物（Ⅰ1～Ⅰ36）抑制肿瘤细胞系增殖的活性
aIC50:半数抑制浓度，即生长抑制率为50%的浓度；
b白血病细胞系；
c食道癌癌细胞系；
d乳腺癌细胞系；
e卵巢癌细胞系；
f肝癌细胞系；
g5-FU抑制白血病K562细胞的IC50为8.56uM。
4.结论：化合物（Ⅰ）高效抑制人白血病K562，Jurkat，U937，THP-1细胞系；人食道癌ECA-109细胞系；人肝癌SMMC-7721细胞系,人卵巢癌HO-8910细胞系,人乳腺癌MCF-7细胞系,乳腺癌MDA-MB-231细胞系增殖，有着明显的开发应用研究的前景。
实施例38本发明化合物（Ⅰ20）、（Ⅰ26）对人和大鼠肝微粒体的代谢稳定性
1.材料：人肝微粒体购自RILD公司(批号：PLYU)，大鼠肝微粒体购自RILD公司(批号：BDVH)，NADPH、咪达唑仑（midazolam）、心得安即普萘洛尔（propranolol）和美托洛尔即倍他乐克（metoprolol）购自Sigma。
2.实验方法：
2.1配药方法：将化合物Ⅰ20、Ⅰ26DMSO溶解后配制成10-2M的储备液，分装后存放于-80℃。分别用乙腈稀释至100μM和10μM。
2.2体外肝微粒体代谢实验：用体系为150μL的肝微粒体（最终浓度0.5mg/mL）进行代谢稳定性温孵，体系含NADPH（终浓度1mM）和1μM化合物、阳性对照及阴性对照，分别在0min、5min、10min和30min用含tid的乙腈终止反应，涡旋10min后，用转速为15000rmp离心10min，取50μL上清液于96孔板中进样。
通过测定原化合物的相对减少量计算其代谢稳定性。
3.测试结果：化合物Ⅰ20和Ⅰ26人和大鼠肝微粒体中代谢稳定性（RILD值）见表3。
表3化合物Ⅰ20和Ⅰ26人和大鼠肝微粒体中代谢稳定性（RILD值）
稳定性数据的单位为μl/min/mgprotein，RILD人肝微粒体数值小于50代谢稳定，RILD大鼠肝微粒体数值小于100稳定。化合物Ⅰ21在人肝微粒体中代谢稳定性较好；在大鼠肝微粒体中代谢稳定性都较差；化合物Ⅰ26在人和大鼠肝微粒体中代谢稳定性较好。
4.结论：化合物Ⅰ20和Ⅰ26在人和大鼠肝微粒体中代谢稳定性较好。
实施例39本发明化合物Ⅰ26对人肝微粒体的竞争性抑制作用
1.材料：人肝微粒体购自Xenotech公司(批号：H0610)。NADPH、三乙酰竹桃霉素troleandomycin、睾丸酮testosterone、帕罗西汀paroxetine、midazolam、替尼酸tienilicacid、呋喃菲林furafylline、右美沙芬dextromethorphan、双氯芬酸diclofenac、替硝唑tinidazole、阿替洛尔atenolol、S-(+)-氟西汀S-(+)-fluoxetine、非那西丁phenacetin、美芬妥因S-(+)-mephenytoin购自Sigma；atenolol标准品由药物所相赠。
2.实验方法：
2.1配药方法：将化合物Ⅰ26用DMSO溶解后配制成10-2M的储备液，分装后存放于-80℃。用乙腈稀释至1mM。
2.2体外机制性抑制实验：用体系为200μl的人肝微粒体（终浓度0.2mg/ml）进行机制性抑制温孵，10μM化合物、混合阳性抑制剂（Troleandomycin10μM、Paroxetine10μM、TienilicAcid10μM、Furafylline10μM）或10μM阴性对照PRO，在加入还原型辅酶Ⅱ即NADPH（终浓度1mM）或PBS后预温孵0min、5min、10minh和30min后加入NADPH（终浓度1mM）和混合探针底物（Midazolam5μM、Dextromethophan5μM、Testosterone50μM、Diclofenac10μM、Phenacetin50μM、S-(+)-mephenytoin50μM），温孵10min后终止反应。阳性抑制剂CYP2C19单独实验，抑制剂S-(+)-fluoxetine100μM。通过测定代谢物的相对生成量计算酶活性。计算kobs。
3.测试结果：
（Ⅰ26）对肝粒体的种代谢酶的抑制效应（TDI值）见表4。
表4化合物（Ⅰo）和（Ⅰn）、阳性对照及阴性对照对5种代谢酶的抑制效应
aTDI值用kobs表示，单位是10-4/min;
bTDI值超过200表明存在竞争性抑制效应.。
4.结论：人肝微粒体用（Ⅰ26）处理后，5种代谢酶CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19的TDI值都低于200，这明确的说明化合物（Ⅰo）和（Ⅰn）对人肝微粒体5种主要代谢酶的催化活性不存在竞争性抑制作用。
实施例40本发明化合物Ⅰ26在人肝微粒体的直接抑制作用
1.材料：人肝微粒体购自RILD公司(批号：PLYU)，PLYU)，NADPH、咪达唑仑midazolam、酮康唑ketoconazole、奎尼丁Quinidine、testosterone、磺胺苯吡唑Sulfaphenazole、苯环丙胺tranylcypromine、萘黄酮naphthoflavone、右美沙芬dextromethorphan、S-(+)-mephenytoin、双氯芬酸diclofenac、非那西丁phenacetin和替硝唑tinidazole购自Sigma。
2.实验方法
2.1配药方法：将化合物Ⅰ26用DMSO溶解后配制成10-2M的储备液，分装后存放于-80℃。用乙腈稀释至1mM。
2.2体外直接性抑制实验（DI试验）
用体系为100μl的人肝微粒体（终浓度0.2mg/ml）进行直接抑制温孵，体系含NADPH（终浓度1mM）、10μM化合物、阳性抑制剂cocktail（Ketoconazole10μM，Sulfaphenazole100μM，Quinidine10μM，Naphthoflavone10μM，Tranylcypromine1000μM），阴性对照10μM的DMSO和混合探针底物（Midazolam10μM、Testosterone100μM、Dextromethophan10μM、Diclofenac20μM、Phenacetin100μM，Mephenytoin100μM），37℃孵育20min后终止反应。通过测定代谢物的相对生成量计算酶的相对活性。
3.实验结果：
化合物（Ⅰ26）对人肝微粒体的直接性抑制作用的DI值见表5。
表5化合物Ⅰ26对于5CYP的直接抑制作用（DI%)
4.结论：本发明化合物Ⅰ26对于5种人主要的药物代谢酶(CYP3A4,CYP2D6,CYP2C9,CYP1A2,CYP2C19)没有直接抑制作用。
实施例41本发明化合物Ⅰ26在大鼠体内生物利用度的测试
1.材料：乙腈为HPLC纯试剂（Merck）。甲酸（HCOOH）为HPLC纯试剂（ACW）。其它分析纯有机试剂均由中国医药（集团）上海化学试剂公司提供。分析用纯水由去离子水经MilliQ纯水仪制备而成。
实验动物：SD大鼠，雄性，180～220g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供。
2.实验方法
2.1配药方法：将化合物Ⅰ26用DMSO溶解后配制成10-2M的储备液。
静脉注射：量取Ⅰ26上述储备液(10mM)359.4μL，溶于1.7mL给药溶液（704μLN.S+440μL乙醇+30μL1M盐酸），配制为1mg/mL溶液。溶液状态：澄清。
灌胃给药：称取Ⅰ26粉末6.23mg，加入8.3mL的CMC-Na（0.5%），配制为0.75%混悬液。溶液状态：浑浊。
2.2化合物Ⅰ26在大鼠体内生物利用度的实验
动物实验：SD大鼠5只，2只静脉注射给予3mg/kg的3e溶液（3mL/kg，1mg/mL），分别于给药前和给药后2、5、15、30、60、90、120、240、360、480、1440min于大鼠眼底静脉丛取血0.4mL。3只灌胃大鼠给予6mg/kg的3e混悬液（8mL/kg，0.75mg/mL），分别于给药前和给药后5、15、30、60、90、120、240、360、480、1440min于大鼠眼底静脉丛取血0.4mL。
血样于8000rpm离心5min，取血浆于离心管中4℃保存备用。
血浆样品处理：血浆样品50μL，加入200μL含内标的0.25μM乙腈（Ponatinib，）沉淀蛋白，涡旋10min后，6000rpm离心10min，取50μL上清液稀释6倍，6000rpm再离心10min，取上清50μL于96孔板中进样，进样量为5μL。
3.实验结果
本发明化合物Ⅰ26经静脉注射和灌胃后，在大鼠血浆中的药代动力学参数见表6。
表6经静脉注射和灌胃后化合物Ⅰ26大鼠血浆中的药代动力学参数
药代动力学参数 静脉注射（i..v） 灌胃（p.o)
AUC(0-t)uM*min 948.49±203.66 585.88±192.87
AUC(0-∞)uM*min 1065.71±39.30 595.79±192.94
MRT(0-t)min 199.70±56.12 324.23±56.71
MRT(0-∞)min 293.37±27.68 377.47±81.24
t1/2z min 198.73±65.95 240.80±50.3218 -->
CLz L/min/kg 0.006±0.001 /
Vdss L/kg 1.08±0.17 /
Vz L/kg 1.60±0.58 /
Cmax uM 13.28±6.68 1.86±0.91
Tmax min 2.00±0.00 140.00±91.65
给药量 mg/kg 3.00±0.00 6.00±0.00
BA% / 30.9%
4.结论：本发明化合物Ⅰ26经静脉注射给药后，在大鼠体内的半衰期为198.73±65.95min，CL为0.006±0.001L/min/kg，Vdss为1.08±0.17L/kg。灌胃给药后，三只大鼠均有一定吸收，生物利用度为30.9%。
实施例42本发明化合物Ⅰ26的急性毒性
1.材料和仪器
实验药品与试剂：自制化合物Ⅰ26，用CMC配至所需浓度(浓度=0.5%)，灭菌4℃保存。CMC是市售分析纯。实验小鼠（4周龄SPF级BALB/c小鼠）购自上海斯莱克实验动物有限公司。
仪器：超净工作台，洁净<3.5粒/L(>0.5μm尘粒)，上海上净净化设备有限公司；笼具，苏州市冯氏实验动物设备有限公司，型号：IVC-Ⅱ。
2.实验方法：小鼠单次灌胃
设置5个按等比级数增加的药物组20mg/kg，100mg/kg，200mg/kg，1000mg/kg和2000mg/kg将药物置于0.5%CMC溶液中研磨均匀，制备成混悬液，以0.2ml/10g剂量灌胃，采用区组随机法分组，每组10只。灌胃后SPF级条件下饲养48h，记录小鼠死亡时间。
3.实验结果：
本发明化合物Ⅰ26经小鼠单次灌胃后给药剂量与死亡百分数见表7.
表7化合物Ⅰ26小鼠单次灌胃后给药剂量与死亡百分数（%）
4.结论：当给药剂量为2000mg/kg时，10只小鼠死亡3只。LD50＞2000mg/kg。这说明化合物Ⅰ26对小鼠的急性毒性很小。

Claims (8)

1.一种2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶衍生物，其特征在于，结构通式如式(Ⅰ)所示，
R1为4-氟；Ar为取代苯基；
取代苯基的苯环上的取代基为2-氟时，R为3位的硝基，n＝1；
取代苯基的苯环上的取代基为4-氟时，R为3位或4位的硝基，n＝1。
2.权利要求1所述2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从式(A)的取代芳甲胺和丙烯酸甲酯出发，依次经过Michael加成、Dieckmann缩合和酸作用下水解脱羧得到式(Ⅲ)的N-取代芳甲基-4-哌啶酮；
(2)式(Ⅲ)的N-取代芳甲基-4-哌啶酮与式(B)所示的取代芳香醛发生Aldol反应，得到中间体式(II)的N-取代芳甲基-3,5-双取代苄叉基-4-哌啶酮；
(3)式(Ⅱ)的N-取代芳甲基-3,5-双取代苄叉基-4-哌啶酮与式(C)的取代苯肼进行缩合反应，得到通式为(I)的2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶；
R1为4-氟；Ar为取代苯基；
取代苯基的苯环上的取代基为2-氟时，R为3位的硝基，n＝1；
取代苯基的苯环上的取代基为4-氟时，R为3位或4位的硝基，n＝1。
3.权利要求2所述2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的Michael加成反应包括以下步骤：
丙烯酸甲酯与醇混合后，搅拌下向反应体系中滴加取代芳甲胺与醇的混合液，使反应体系温度不超过50℃；滴加完毕后加热回流6～10小时；反应结束后回收醇和未反应的丙烯酸甲酯，减压蒸馏，得到N,N-双(β-丙酸甲酯)芳甲胺；
所述的Dieckmann缩合反应和水解脱羧包括以下步骤：
(a)在有机溶剂中加甲醇和钠，滴加N,N-双(β-丙酸甲酯)芳甲胺与有机溶剂混合液，滴加完毕后回流4～8小时；
(b)反应结束后冷却至室温，除去未反应的钠，反应混合物用质量浓度20％～30％的盐酸溶液提取，回流4～8小时，反应结束后冷却至室温；
(c)搅拌下加入碱中和至pH＝8～9，用乙酸乙酯萃取，干燥有机相，去除乙酸乙酯，得到式(Ⅲ)的N-芳甲基-4-哌啶酮。
4.权利要求3所述2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶衍生物的制备方法，其特征在于，Michael加成反应中，丙烯酸甲酯与取代芳甲胺的摩尔比为1：2～1：4；所述的醇为甲醇或乙醇；
Dieckmann缩合反应和水解脱羧反应中，所述的有机溶剂为甲苯，步骤(a)中的钠、甲醇与N,N-双(β-丙酸甲酯)芳甲胺的用量比为1mol：1.5～2ml：0.3～0.5mol。
5.权利要求2所述2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，N-取代芳甲基-4-哌啶酮与取代芳香醛的摩尔比为1：2～1：2.5，Aldol反应的步骤包括：N-取代芳甲基-4-哌啶酮与取代芳香醛与醇混合，加入氢氧化钠或氢氧化钾，搅拌20～60分钟；反应结束后用醇洗涤，并用乙酸乙酯和石油醚重结晶。
6.权利要求2所述2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，缩合反应的步骤包括：
向乙醇钠与醇混合液中加入N-取代芳甲基-3,5-双取代苄叉基-4-哌啶酮和取代苯肼，回流20～30小时，得到的固体用二氯甲烷和乙醇重结晶纯化；
N-取代芳甲基-3,5-双取代苄叉基-4-哌啶酮、取代苯肼和乙醇钠的摩尔比为1：2～4：1～3。
7.权利要求1所述2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶衍生物用于制备治疗白血病、食道癌、肝癌、卵巢癌或乳腺癌的药物。
8.权利要求1所述2,3,5,7-四取代二氢吡唑并六氢吡啶衍生物用于制备抑制人白血病K562细胞系、人白血病Jurkat细胞系、人白血病U937细胞系或人白血病THP-1细胞系、人肝癌SMMC-7721细胞系、人乳腺癌MCF-7细胞系或乳腺癌MDA-MB-231细胞系增殖的药物。
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CN102276605A (zh) * 2011-09-06 2011-12-14 上海师范大学 二氢吡唑并六氢吡啶衍生物、其制备方法及应用

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