CN105017245B

CN105017245B - 一种咪唑并吡啶化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105017245B
Application number: CN201410181135.2A
Authority: CN
Inventors: 胡文浩; 席建备; 马明亮; 吕思莹; 王文科; 章雄文; 方艳芬
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2034-04-30
Also published as: CN105017245A

Abstract

本发明提出了一种式(1)咪唑并吡啶化合物及其制备方法，以2‑氨基‑4‑羟基吡啶、4‑溴‑2‑羟基苯甲酸甲酯、二甲基乙醇胺、2‑(三氟甲基)苯基乙醇为原料，以碱、金属催化剂为催化剂，以有机溶剂为溶剂，经过多步反应后得到式(1)咪唑并吡啶化合物。本发明还提出式(1)咪唑并吡啶化合物作为NEK2抑制剂在调控肿瘤细胞生长中的应用。

Description

一种咪唑并吡啶化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药合成化工技术领域，具体涉及一种具有抗癌活性的咪唑并吡啶的骨架结构的化合物及其合成和应用。

背景技术

世界卫生组织及其下属的癌症研究机构(IARC)2012年发布研究报告称，全球约诊断1400万例新增癌症病例。全球的一半新发癌症病例发生在亚洲，其中大部分发生在中国[http：//china.caixin.com/2014-02-08/100636253.html？cx_from＝news.baidu.com]。据报告估计，20年后，全球每年新发癌症病例将增长至2200万例。与此同时，癌症致死人数将从目前每年约820万人增长至每年约1300万人。从本质上说，肿瘤是由于某些基因的突变引起的，目前的研究表明NEK2(NIMA相关激，丝氨酸/苏氨酸激酶)，是一种新发现的引起肿瘤发生的相关基因。在正常的细胞中，NEK2确保有丝分裂过程中染色体的正常分离。然而，如果NEK2异常表达，会诱导细胞中心体过早分离，从而致使染色体异常，染色体异常可产生癌细胞，继而会导致肿瘤的发生。在临床研究中发现，在细胞的分裂周期中，高活性的NEK2可以导致药物外排蛋白酶(ABC，ATP-binding cassette)活性的增加，增加药物的快速排出，从而导致恶性肿瘤(癌症)的化学耐药性。在乳腺癌，肝癌，前列腺癌，子宫颈癌，胰腺癌等癌症中，都存在NEK2异常表达，异常的NEK2活性会引起错误、有害的细胞有丝分裂，从而导致肿瘤的产生、恶化。

此外，体内、体外实验表明，NEK2基因敲除能有效阻止阳性癌症(良性肿瘤)的增生；降低NEK2表达，可以使已经对紫杉醇(paclitaxel)、多柔比星(doxorubicin)、硼替佐米(bortezomib)产生耐药性的肿瘤重新对药物敏感；临床研究表明，可以通过重启PPl/AKT调节系统降低AKT的活性来抑制NEK2。通过阻断异常NEK2的表达，可以提高药物的抗肿瘤活性，增强肿瘤化疗的敏感性，并降低肿瘤的耐药性，这就决定了NEK2基因是致癌基因的一个关键基因，也就是说，NEK2是一个关键的肿瘤药物靶标基，抑制NEK2基因表达异常，是一个有效抑制肿瘤发生的有效手段因。

至目前以NEK2作为治疗肿瘤靶标的药物研发工作非常之少，尚未见专利，仅见文献报道三种骨架结构的NEK2抑制剂[J.Med.Chem.，2010，53，7682-7698；J.Med.Chem.，2011，54，1626-1639；J.Med.Chem.，2012，55，3228-3241；J.Med.Chem.，2011，54，4133-4146]。因此，设计合成新型NEK2小分子抑制剂对由NEK2基因异常引起的肿瘤的潜在治疗效果显得尤为必要，以便发现抗肿瘤广、活性较好的可以用于临床前试验的先导化合物，为开发具有我国自主知识产权的癌症治疗药物打下坚实基础。

发明内容

本发明目的之一是，提供一种咪唑并吡啶化合物，其结构如式(1)所示，

本发明式(1)咪唑并吡啶化合物是一种具有抗癌活性的咪唑并吡啶的骨架结构的化合物。

本发明还提供了一种咪唑并吡啶化合物的制备方法，以2-氨基-4-羟基吡啶、4-溴-2-羟基苯甲酸甲酯、二甲基乙醇胺、2-(三氟甲基)苯基乙醇等为原料，以碱、金属催化剂等为催化剂，以有机溶剂为溶剂，在冰浴、室温以及加热等条件下，经过多步反应，柱层析提纯，制备得到所述式(1)咪唑并吡啶化合物。

本发明制备方法包括以下步骤：

(1)片段I的合成：

以2-氨基-4-羟基吡啶、氯乙醛、二甲基乙醇胺、吡唑硼酸酯等为原料，在有机试剂溶液中，在碱、金属催化剂、偶联试剂、碘化试剂的作用下，可以合成得到片段I。

(2)片段II的合成：

以4-溴-2-羟基苯甲酸甲酯、2-(三氟甲基)苯基乙醇、频哪醇酯等为原料，以有机溶剂为溶剂，在碱、金属催化剂以及偶联试剂等的作用下，可以得到片段II。

(3)式(1)咪唑并吡啶化合物的合成：

以片段I和II为基本原料，以有DMF和水为溶剂，在碱、金属催化剂、氨气以及加热的情况下，可以得到目标化合物式(1)咪唑并吡啶化合物。

本发明制备方法的反应过程及反应式为：

本发明中，以2-氨基-4-羟基吡啶、4-溴-2-羟基苯甲酸甲酯、二甲基乙醇胺、2-(三氟甲基)苯基乙醇等为原料。以碳酸氢钠、碳酸铯、醋酸钾等碱、Pd(dppf)C12、Pd(PPh3)4等为金属催化剂为催化剂。以乙醇、四氢呋喃、1，4-二氧六环、DMF、乙腈以及甲醇等有机溶剂和水为溶剂。

本发明还提供了一种式(1)咪唑并吡啶化合物在调控肿瘤细胞生长中的应用。本发明中，式(1)咪唑并吡啶化合物为一种具有抗癌活性的咪唑并吡啶的骨架结构的化合物，可作为针对NEK2靶点的小分子抑制剂，有效抑制肿瘤细胞增殖及肿瘤生长，应用于制备调控肿瘤细胞生长的药物中。本发明应用中，所述肿瘤细胞包括B细胞淋巴瘤细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞等。本发明研究表明，无论在B细胞淋巴瘤的细胞水平上还是体内移植瘤模型上以及胰腺癌细胞上，式(1)咪唑并吡啶化合物MLWH-10151均具有较好活性，是很好的NEK2抑制剂，具有很好的成药性，非常有潜力开发成临床前实验先导化合物，可开发应用于制备抗肿瘤药物。本发明实验表明，式(1)咪唑并吡啶化合物对B细胞淋巴瘤细胞(MDAMB-231)，胰腺癌细胞(IC50∶10μM)具有明显抗癌活性；在异种移植小鼠模型(Bx-PC3细胞株移植到重症综合性免疫缺陷小鼠SCID)上，口服(50mg/kg)和静脉注射(15mg/kg)实验都表明，该化合物可以在体内有效抑制肿瘤的生长。

附图说明

图1表示本发明式(1)咪唑并吡啶化合物在神经胶质瘤、胰腺肿瘤和乳腺癌等细胞上的抑制活性。

图2表示本发明式(1)咪唑并吡啶化合物的多药耐药逆转作用。

图3表示本发明式(1)咪唑并吡啶化合物有效调控肿瘤的生长。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1式(1)咪唑并吡啶化合物的合成

(1)片段I的合成：

化合物B的合成：将5.0g A以及4.89g NaHC03溶解于50mL乙醇溶液中，再向混合液加入氯乙醛(纯度40％)12mL。加热混合液回流6小时。反应结束后用硅藻土过滤反应液，将有机溶剂蒸干，再用50mL乙酸乙酯稀释残余物，用56mL水分两次洗有机相，得到的水相用40mL乙酸乙酯分两次萃取，得到的有机相用饱和食盐水洗涤后再用无水Na2S04干燥。干燥后的有机相经过浓缩后用硅胶柱层析法分离，洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚＝1∶1，最终得到白色固体B4.44g，收率78％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.98(d，J＝7.1Hz，1H)，7.80(s，1H)，7.57(d，J＝15.6Hz，2H)，6.86(d，J＝6.5Hz，1H).

化合物D的合成：将1.95g B、3.0g C、6.52g Cs2C03(碳酸铯)以及40mgPd(dppf)Cl2([1，1’-双(二苯基磷)二茂铁]二氯化钯)溶解于1，4-二氧环己烷与水的混合液50mL(1，4-二氧环己烷∶水＝4∶1)中，置换氮气三次后，将混合液升温至90℃，保持该温度19个小时。反应结束后用硅藻土滤去固体残渣，浓缩，所得粘稠固体直接用于下一步反应。

化合物E的合成：将2.80g D、3mL N，N-二甲基乙醇胺以及8.02g PPh3(四三苯基膦)溶解于550mL四氢呋喃溶液中，将反应瓶置于冰水混合物中。再将6mL DIAD(偶氮二甲酸二异丙酯，密度1.020g/mL)与20mL四氢呋喃混合，将该混合液用针筒逐滴加入之前的反应瓶中。加完后将反应瓶从冰水浴中取出，室温下搅拌过夜。待反应液澄清，经过浓缩后用硅胶柱层析法分离，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1，最终得到E2.41g，收率62％。

1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.96(d，J＝7.0Hz，1H)，7.71(d，J＝3.0Hz，2H)，7.55(s，1H)，7.47(s，1H)，7.40(s，1H)，6.79(dd，J＝7.0，1.6Hz，1H)，4.15(t，J＝6.5Hz，2H)，2.69(t，J＝6.5Hz，2H)，2.18(d，J＝1.3Hz，6H).

I的合成：将810mg E和730mg NIS溶解于30mL乙腈溶液中，室温下搅拌2个小时。反应液浓缩后用硅胶柱层析法分离，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1，最终得到I1.06g，收率88％。

1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.07(d，J＝7.1Hz，1H)，7.85(s，2H)，7.66(s，2H)，7.06(dd，J＝7.1，1.4Hz，1H)，4.28(t，J＝6.5Hz，2H)，2.82(t，J＝6.5Hz，2H)，2.31(s，6H).

(2)片段II的合成：

化合物H的合成：将2.3g G、0.75mL F以及2.62g PPh3溶解于40mL二氯甲烷溶液中，将反应瓶置于冰水混合物中。再将2.25mL DBAD(偶氮二羧酸二叔丁酯，密度1.020g/mL)与10mL二氯甲烷混合，将该混合液用针筒逐滴加入之前的反应瓶中。加完后将反应瓶从冰水浴中取出，室温下搅拌过夜。待反应液澄清，经过浓缩后用硅胶柱层析法分离，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7，最终得到白色固体H1.98g，收率51％。

1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.02(d，J＝7.8Hz，1H)，7.75(d，J＝8.1Hz，1H)，7.69(d，J＝7.8Hz，1H)，7.63(t，J＝7.6Hz，1H)，7.43(t，J＝7.6Hz，1H)，7.22-7.09(m，2H)，5.34(s，2H)，3.91(s，3H).

II的合成：将1.90g H、1.93g联硼酸频那醇酯990mg醋酸钾以及250mg Pd(dppf)Cl2([1，1’-双(二苯基磷)二茂铁]二氯化钯)溶解于30mL1，4-二氧环己烷中，置换氮气三次后，将混合液升温至90℃，保持该温度反应过夜。反应结束后用硅藻土滤去固体残渣，滤液经过浓缩后用硅胶柱层析法分离，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶30，最终得到白色固体II1.70g，收率80％。

1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.99(d，J＝7.8Hz，1H)，7.73(d，J＝7.6Hz，1H)，7.57(d，J＝7.8Hz，1H)，7.51(t，J＝7.6Hz，1H)，7.38(d，J＝7.8Hz，2H)，7.30(t，J＝7.6Hz，1H)，5.29(s，2H)，3.80(s，3H)，1.25(s，12H).

(3)本发明式(1)咪唑并吡啶化合物(MLWH-10151)的合成：

化合物J的合成：将900mg I、1.66gII、660mg醋酸钾以及580mg Pd(PPh3)4溶解于65mL DMF(N，N’-二甲基甲酰胺)与水的混合液(DMF：水＝10：1)中，置换氮气三次后，将混合液升温至90℃，保持该温度反应10个小时。反应结束后用硅藻土滤去固体残渣，滤液经过浓缩后用硅胶柱层析法分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝20∶1，最终得到白色固体J700mg，收率53％。

1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.14(s，2H)，8.06-7.97(m，2H)，7.79(s，1H)，7.76-7.57(m，3H)，7.45(t，J＝7.5Hz，1H)，7.27(s，1H)，7.22(d，J＝8.0Hz，1H)，7.11(s，1H)，6.90(d，J＝6.8Hz，1H)，5.46(s，2H)，4.47(s，2H)，3.97(s，3H)，3.20(s，2H)，2.53(s，6H).

化合物MLWH-10151的合成：将630mg J溶解于80mL的氨气/甲醇溶液(7M)中，封管、加热反应液至90℃，反应搅拌过夜。反应结束后待反应瓶降温至室温，蒸干有机溶剂后将残余物用硅胶柱层析法分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝20：1，最终得到白色固体本发明式(1)咪唑并吡啶化合物(MLWH-10151)486mg，收率79％。

1H NMR(400MHz，MeOD)δ8.30-8.12(m，2H)，7.99(d，J＝8.1Hz，1H)，7.94-7.82(m，1H)，7.70(dd，J＝7.4，4.7Hz，2H)，7.64-7.53(m，3H)，7.53-7.41(m，1H)，7.21(dt，J＝14.2，7.1Hz，1H)，7.17-7.11(m，1H)，7.05(dd，J＝7.2，1.4Hz，1H)，5.45(s，2H)，4.34(t，J＝6.3Hz，2H)，3.32-3.12(m，2H)，2.46(s，6H).

13C NMR(101MHz，MeOD)δ169.36，158.38，138.70，135.66，134.92，133.99，133.72，132.25，131.41，130.14，130.03，127.48，125.54，122.87，122.22，121.23，113.55，113.16，111.90，68.83，59.01，49.66，49.45，49.23，49.02，48.81，48.59，48.38，44.82.

HRMS(ESI)：Exact mass calcd for C29H27F3N602H[M+H]+：548.2148，Found.549.2205.

实施例2式(1)咪唑并吡啶化合物的体外抗肿瘤活性评价

本发明在细胞水平上的研究表明，式(1)咪唑并吡啶化合物(MLWH-10151)可作为对NEK2选择性较好的抑制剂。

(一)式(1)咪唑并吡啶化合物(MLWH-10151)对肿瘤细胞的增殖抑制作用

实验方法：取处于对数生长期的肿瘤细胞，接种于96孔培养板，待细胞贴壁后给予不同浓度的MLWH-10151(0、0.016、0.08、0.4、2、10和50μM)，在37℃、5％CO₂条件下培养72小时后，加5mg/mL的MTT溶液继续培养4小时，加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/LHCl)于CO2培养箱中过夜。待甲瓒完全溶解后用酶标仪测定其在570nm处测定吸光度，计算细胞存活率及IC₅₀值。结果显示，MLWH-10151对不同类型的肿瘤细胞(非小细胞肺癌细胞A549、结肠癌细胞HCT-116、胃癌细胞MGC-803和前列腺癌细胞PC3)均具有显著的增殖抑制作用，且呈明显的浓度依赖关系，其IC₅₀值分别为2.051、0.17、0.271和2.017μM。实验结果见图1：MLWH-10151对肿瘤细胞的增殖抑制作用。

(二)式(1)咪唑并吡啶化合物(MLWH-10151)的多药耐药逆转作用

取处于对数生长期的人鼻咽癌细胞KB及其耐药株KBV200，接种于96孔培养板，待细胞贴壁后给予不同浓度的MLWH-10151，在37℃、5％CO2条件下培养72小时后，加5mg/mL的MTT溶液继续培养4小时，加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/LHCl)于CO₂培养箱中过夜。待甲瓒完全溶解后用酶标仪测定其在570nm处测定吸光度，计算细胞存活率及IC₅₀值。如图2(MLWH-10151的多药耐药逆转作用)所示，抗肿瘤药物长春瑞宾(NVB)对KB细胞具有显著的增殖抑制作用，其IC₅₀值为0.007μM。而NVB对KBV200的抗肿瘤作用明显减弱，其IC₅₀值增至1.478μM，KBV200的耐药倍数为211倍。但是MLWH-10151能有效地逆转KBV200的耐药作用，能有效抑制KB和KBV200细胞增殖，其IC₅₀值分别为1.070和5.429μM。

实施例3式(1)咪唑并吡啶化合物的体内调控肿瘤生长实验

取处于对数生长期的PC3细胞接种于裸小鼠腋下，待瘤块长至100mm³时，采用口服(50mg/kg)和静脉注射(15mg/kg)进行给药，定期记录小鼠体重以及肿瘤体积。如图3(MLWH-1015对异种移植小鼠模型肿瘤的抑制效果)所示，两种给药方式均能有效抑制肿瘤生长，口服和静脉注射组对肿瘤的生长抑制率(TGI)分别为57.1％和92.9％。

Claims

1.一种咪唑并吡啶化合物，其特征在于，其结构如式(1)所示，

2.一种如权利要求1所述的式(1)所示的咪唑并吡啶化合物的制备方法，其特征在于，以2-氨基-4-羟基吡啶、4-溴-2-羟基苯甲酸甲酯、二甲基乙醇胺、2-(三氟甲基)苯基乙醇为原料，以碱、金属催化剂为催化剂，以有机溶剂为溶剂，经过多步反应，制备得到所述式(1)咪唑并吡啶化合物；

所述制备方法的反应过程为：

3.一种如权利要求1所述的式(1)所示的咪唑并吡啶化合物在制备调控肿瘤细胞生长的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述式(1)咪唑并吡啶化合物作为NEK2抑制剂。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞包括B细胞淋巴瘤细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞。