CN107614502A - 激酶抑制剂的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

一种激酶抑制剂的制备方法及其应用，该激酶抑制剂为式I所示化合物，其中各基团的定义如说明书中所述，式I化合物具有激酶抑制活性，可以用于制备治疗与激酶活性相关的疾病的药物。

Description

[根据细则37.2由ISA制定的发明名称]　激酶抑制剂的制备及应用 技术领域
本发明属于药物化学领域，具体地，本发明涉及一种新型激酶抑制剂的制备和应用。
背景技术
细胞周期异常是癌症的一个标志性特征，周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinase,CDK)是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞周期中起中心作用，主导细胞周期的启动、进行和结束。CDK家族包括CDK1-13。
其中CDK4/6在许多癌症中均过度活跃，导致细胞增殖失控。研究发现，CyclinD1和CDK4的过表达可能参与食管癌的发生，两者的表达增加与食管癌的分化程度相关；无论在良性还是恶性的胰腺内分泌肿瘤中，CDK4都普遍表达。在肺癌组织中CDK4的表达也远高于正常肺组织，高阳性表达的程度与肺癌的组织病理学分类、淋巴结转移和临床分期恶性度呈正相关，是一个潜在的预后不良因素。CDK6在多种肿瘤细胞中也过量表达，例如对雄性激素敏感的前列腺癌细胞系CDK6被检测到稳定地过表达。而且外源性过表达CDK6导致了肿瘤细胞生长加速，而干扰了CDK6的肿瘤细胞生长速度则明显减慢。
CDK4与CDK6在氨基酸组成上有71％的同源性，这一结果提示了它们在功能上的相似性。近期研究还揭示CDK4/6-CyclinD可以磷酸化转录因子FOXM1，提高它在黑色素瘤中的稳定性和活性。因此，抑制CDK4/6可以实现从信号通路的下游抑制细胞增殖。CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗可以达到双重抑制的效果，在临床前研究中也证实了CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗具有显著的协同作用。
在过去的20年作为潜在的肿瘤治疗靶点，CDK家族抑制剂已经得到了广泛的关注。但是第一代的CDK抑制剂缺乏选择性，是泛抑制剂，例如flavopiridol可以抑制CDK1,CDK2,CDK4,CDK6,CDK7和CDK9。尽管flavopiridol可以诱导细胞周期阻滞，同时也表现出细胞毒作用，临床疗效差强人意。第二代CDK抑制剂致力于提高选择性，尤其是单纯靶向CDK4/6的选择性抑制剂表现出较好的临床疗效和较少的毒副作用备受关注。目前辉瑞的CDK4/6双抑制剂Palbociclib(商品名Ibrance)成为了第一个上市的CDK4/6双抑制剂，美国FDA批准其作为一线药物治疗ER阳性、HER2阴性乳腺癌。
诺华的LEE011是一种CDK4/CDK6的双重抑制剂，对恶性横纹肌样瘤和成神经细胞瘤最为敏感。在临床实验中，LEE011主要用于联合芳香酶类抑制剂以及PI3K抑制剂能够起到较好的抗肿瘤活性。LEE011联合来曲唑用于治疗转移性的HR阳性/HER2阴性乳腺癌处于临床III阶段；LEE011联合BYL719和来曲唑治疗转移性HR阳性乳腺癌处于临床Ib/II阶段。
此外，还有礼来的LY-2835219目前也处于临床三期研究阶段，如果这些临床试 验都能取得预期的效果，那么CDK4/CDK6的双重抑制剂必将给大批晚期乳腺癌患者带来更多的生存获益。
如上所述，CDK4/CDK6的选择性双重抑制剂的研发已成为抗肿瘤药物研究的前沿热点及重点领域，因此，亟需研究开发新的CDK激酶抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的CDK激酶抑制剂及其制备方法及用途。
本发明的第一方面提供了一种如式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐：
式中，
R1和R2各自独立地选自：H、取代或未取代的C1-C8烷基、C(O)OR8、CONR9R10、C(O)R11、取代或未取代的5～8元芳基、取代或未取代的5～8元杂芳基、取代或未取代的3～12元饱和或不饱和杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；所述的杂环包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；
此外，R1和R2可与相邻的N原子连接构成环状结构，所述的环状结构包括取代或未取代的3～12元饱和或不饱和的杂环或桥环或螺环；其中，所述的杂环是指环结构中除了包含连接母核的氮原子之外，还包含0-3个选自下组的杂原子：N、O或S；
R3选自：取代或未取代的C1-C8烷基、CN、C(O)OR12、CONR13R14、C(O)R15、取代或未取代的5～8元芳基、取代或未取代的5～8元杂芳基、取代或未取代的3～12元饱和或不饱和的杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；所述的杂环包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；
R4选自：H、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C1-C8烷氧基、卤素、OH、CN、C(O)OR12、CONR13R14、C(O)R15、取代或未取代的5～8元芳基、取代或未取代的5～8元杂芳基、取代或未取代的3～12元饱和或不饱和的杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；所述的杂环包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；
R5选自：H或C1-C4烷基；
X为CR16或N；
A、B和Z各自独立地选自：N或CR16；
R16为H、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；
L为选自下组的基团：无、C1-C6亚烷基、C(O)、CONR17或S(O)2；
Y为：H，R18，NR19R20，OH，或Y为选自下组基团的一部分：
其中，
R6为无、H、取代或未取代的C1-C8烷基、取代或未取代的C1-C8烷氧基、取代或未取代的C2-C6酰基、取代或未取代的C2-C6磺酰基、取代或未取代的C1-C6亚烷基羟基、CONR22R23或C(O)R24；
R7可以是0～3个取代基且R7为取代或未取代的C1-C8烷基、氧或卤素，或2个或更多R7形成桥环烷基；W为CR21、N或O(当W为O时，R6是不存在的)；
Ya为CR21或N；R21为H或卤素；
R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R17、R18、R19、R20、R22、R23和R24各自独立地选自：H、取代或未取代的C1-C8烷基、取代或未取代的C1-C8烷氧基、取代或未取代的C1-C6亚烷基-胺基、取代或未取代的C1-C6亚烷基-羟基、取代或未取代的5～8元芳基、或取代或未取代的5～8元杂芳基；取代或未取代的3～12元饱和杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含至少一个选自下组的杂原子：N、O或S，所述的杂环包含至少一个选自下组的杂原子：N、O或S；
n和t分别为0，1或2；
上述的任一“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：卤素、OH、NH2、CN、未取代或卤代的C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、未取代或卤代的C2-C6烯基、未取代或卤代的C2-C6炔基、未取代或卤代的C2-C6酰基、未取代或卤代的5～8元芳基、未取代或卤代的5～8元杂芳基、未取代或卤代的3～12元饱和杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S，所述的杂环包含1～3个选自下组的杂原子：N、O或S。
在另一优选例中，为取代或未取代的选自下组的基团：
其中，m是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9，所述“取代”如上文所述。
在另一优选例中，R1和R2与相邻的氮原子形成4-12元环状结构。
在另一优选例中，R1和R2与相邻的氮原子形成5-7元环状结构。
在另一优选例中，R1和R2与相邻的氮原子形成六元环状结构。
在另一优选例中，R13和R14与相邻的氮原子形成4-6元环状结构。
在另一优选例中，当L为无时，Y为含氮原子的六元杂环。
在另一优选例中，A、B、L、X、Y、Z、R1、R2、R3、R4或R5为实施例中所述具体化合物中所对应的基团。
在另一优选例中，所述式I化合物为如下所示的化合物：
本发明的第二方面提供了一种制备如本发明第一方面所述的式I化合物的方 法，所述方法包括以下步骤：
a)在惰性溶剂中，式I-6化合物和式I-7化合物反应，形成式I化合物，其中各基团的定义如上文中所述。
在另一优选例中，所述惰性溶剂选自下组：甲苯、二甲苯、乙二醇二甲醚、二氧六环、THF、DMF、DMSO、NMP，或其组合。
在另一优选例中，所述反应在钯催化剂存在下进行。
在另一优选例中，所述的钯催化剂选自下组：Pd(PPh3)4、Pd2(dba)3、Pd(dba)2、Pd(OAc)2、Pd(PPh3)2Cl2、Pd(dppe)Cl2、Pd(dppf)Cl2、Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2，或其组合。
在另一优选例中，所述反应在配体存在下进行。
在另一优选例中，所述的配体为单齿膦配体或双齿膦配体；更佳地，所述的配体选自下组：三苯基膦、三甲苯基膦、三环己基膦、三叔丁基膦、X-Phos、S-Phos、联萘二苯基膦、1,1'-双(二苯基膦)二茂铁、1，2-二(二苯基膦基)乙烷、Xant-Phos，或其组合。
在另一优选例中，所述反应在碱存在下进行。
在另一优选例中，所述的碱选自下组：Na2CO3、K2CO3、Cs2CO3、LiHMDS、NaHMDS、KHMDS、叔丁醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基胺、二异丙基乙胺，或其组合。
一种较为优选的制备方法包括以下步骤：
(1)化合物A3可由化合物A1和相应的肼A2在碱(包括但不限于二异丙基乙基胺，三乙胺)的催化下于惰性溶剂(乙醇，THF等)中反应。
(2)化合物A5可由化合物A3和相应的末端炔烃A4进行Sonogashira耦合(Sonogashira coupling)，在惰性溶剂(如THF、DMF、DMSO、二氧六环等)中，在催 化剂a(如四(三苯基膦)钯、三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd2(dba)3)、双(二亚苄基丙酮)钯、二氯二(三苯基膦)钯、双(三邻苯甲基膦)二氯化钯、1，2-二(二苯基膦基)乙烷二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物等)、催化剂b(如碘化亚铜、氯化锌、氧化银、碳酸银等)和碱(如碳酸钾、氟化钾、碳酸铯、氟化铯、氟化钠、磷酸钾、水合磷酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、三乙胺、二异丙基胺、二异丙基乙胺、吡啶或其组合等)的存在下，进行Sonogashira偶联反应(反应时间为2-8小时)，得到化合物A5；
(3)化合物A6可由化合物A5在惰性溶剂中(二氯甲烷，THF，乙腈等)，加入四丁基氟化铵(TBAF)，加热下反应得到。
(4)化合物A8可由化合物A6和相应的芳香胺A7进行布赫瓦尔德-哈特维希耦合(Buchwald–Hartwig coupling)，在惰性溶剂(如甲苯、THF、DMF、DMSO、二氧六环等)中，在催化剂(如四(三苯基膦)钯、三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd2(dba)3)、双(二亚苄基丙酮)钯、二氯二(三苯基膦)钯、双(三邻苯甲基膦)二氯化钯、1，2-二(二苯基膦基)乙烷二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物等)、配体(如三甲苯基膦、三环己基膦、三叔丁基膦、联萘二苯基膦等)和碱(如碳酸钾、氟化钾、碳酸铯、氟化铯、氟化钠、磷酸钾、水合磷酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、三乙胺、二异丙基胺、二异丙基乙胺、吡啶或其组合等)的存在下，进行Buchwald–Hartwig偶联反应(反应时间为2-8小时)，得到化合物A8。
本发明的第三方面提供了如本发明第一方面所述的式I化合物的用途，用于：
(a)制备治疗与CDK激酶活性或表达量相关的疾病的药物；
(b)制备CDK激酶靶向抑制剂；
(c)体外非治疗性地抑制CDK激酶的活性；
(d)体外非治疗性地抑制肿瘤细胞增殖；和/或
(e)治疗与CDK激酶活性或表达量相关的疾病。
在另一优选例中，所述CDK激酶选自下组：CDK4、CDK6，或其组合；和/或
所述的肿瘤细胞为白血病细胞株，较佳地为髓源白血病细胞株，更佳地为急性髓源白血病细胞株KG1细胞。
本发明的第四方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：(i)有效量的式I化合物，或其药学上可接受的盐；和(ii)药学上可接受的载体。
本发明的第五方面提供了一种抑制CDK激酶活性的方法，所述方法包括步骤：对抑制对象施用抑制有效量的如本发明第一方面所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，或对抑制对象施用抑制有效量的如本发明第四方面所述的药物组合物。
本发明第六方面提供了一种体外抑制肿瘤细胞的方法，所述方法包括：对抑制对象施用抑制有效量的如本发明第一方面所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，或对抑制对象施用抑制有效量的如本发明第四方面所述的药物组合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中 具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，制备了一类具有式I所示结构的化合物，并发现其具有CDK激酶抑制活性。且所述的化合物在极低浓度(可低至≤100nM)下，即对一系列CDK激酶产生抑制作用，抑制活性相当优异，因而可以用于治疗与CDK激酶活性或表达量相关的疾病如肿瘤。基于上述发现，发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“C1-C6烷基”指具有1～6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基，或类似基团。
如本文所用，术语“C2-C6酰基”指形如“具有1～6个碳原子的直链或支链烷基-羰基”结构的取代基，如乙酰基、丙酰基、丁酰基，或类似基团。
术语“C1-C6亚烷基”指如上文所述的C1～C6烷基失去一个氢原子之后形成的基团，例如-CH2-、-CH2-CH2-，或类似基团。
术语“C6-C10亚芳基”指具有6-10个碳原子的芳基失去一个氢原子形成的基团，包括单环或二环亚芳基，例如亚苯基、亚萘基，或类似基团。
术语“六元芳基”指苯基。
术语“5～8元芳基”指5～8元环的碳非饱和系的取代基，如苯基，或类似基团。
术语“5～8元杂芳基”指具有5～8元的环系上具有一个或多个选自O、S、N或P的杂原子的非饱和环系取代基，如吡啶基、噻吩基，或类似基团。
术语“饱和3～12元碳环”指具有3～12个碳原子的饱和碳环，例如环己基，或类似基团。
术语“3～12元杂环”指具有3～12元的环系上具有一个或多个选自O、S、N或P的杂原子的饱和环系取代基，如哌啶基，吡咯基，或类似基团。
术语“卤素”指F、Cl、Br和I。
本发明中，术语“含有”、“包含”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明中，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
在本文中，除特别说明之处，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自 下组的取代基取代：卤素、未取代或卤代的C1-C6烷基、未取代或卤代的C2-C6酰基、未取代或卤代的C1-C6烷基-羟基。
除非特别说明，本发明中，所有出现的化合物均意在包括所有可能的光学异构体，如单一手性的化合物，或各种不同手性化合物的混合物(即外消旋体)。本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为R构型或S构型，或R构型和S构型的混合物。
如本文所用，术语“本发明化合物”指式I所示的化合物。该术语还包括及式I化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
药物组合物和施用方法
由于本发明化合物具有优异的对CDK激酶例如CDK4、CDK6的抑制活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由与CDK活性或表达量相关的疾病。根据现有技术，本发明化合物可用于治疗以下疾病：乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、膀胱癌、淋巴癌、头颈癌等等；特别是，还能与PI3K、B-RAF、FGFR等激酶抑制剂联合用药，克服激酶抑制剂耐药，用于靶向药物耐药的黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、神经胶质瘤、结肠癌等肿瘤的治疗。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
式I化合物
本发明提供了一种如式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐：
式中，
R1和R2各自独立地选自：H、取代或未取代的C1-C8烷基、C(O)OR8、CONR9R10、C(O)R11、取代或未取代的5～8元芳基、取代或未取代的5～8元杂芳基、取代或未取代的3～12元饱和或不饱和杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；所述的杂环包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；
此外，R1和R2可与相邻的N原子连接构成环状结构，所述的环状结构包括取代或未取代的3～12元饱和或不饱和的杂环或桥环或螺环；其中，所述的杂环是指环结构中除了包含连接母核的氮原子之外，还包含0-3个选自下组的杂原子：N、O或S；
R3选自：取代或未取代的C1-C8烷基、CN、C(O)OR12、CONR13R14、C(O)R15、取代或未取代的5～8元芳基、取代或未取代的5～8元杂芳基、取代或未取代的3～12元饱和或不饱和的杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；所述的杂环包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；
R4选自：H、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C1-C8烷氧基、卤素、OH、CN、C(O)OR12、CONR13R14、C(O)R15、取代或未取代的5～8元芳基、取代或未取代的5～8元杂芳基、取代或未取代的3～12元饱和或不饱和的杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；所述的杂环包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；
R5选自：H或C1-C4烷基；
X为CR16或N；
A、B和Z各自独立地选自：N或CR16；
R16为H、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；
L为选自下组的基团：无、C1-C6亚烷基、C(O)、CONR17或S(O)2；
Y为：H，R18，NR19R20，OH，或Y为选自下组基团的一部分：
其中，
R6为无、H、取代或未取代的C1-C8烷基、取代或未取代的C1-C8烷氧基、取 代或未取代的C2-C6酰基、取代或未取代的C2-C6磺酰基、取代或未取代的C1-C6亚烷基羟基、CONR22R23或C(O)R24；
R7可以是0～3个取代基且R7为取代或未取代的C1-C8烷基、氧或卤素，或2个或更多R7形成桥环烷基；W为CR21、N或O(当W为O时，R6是不存在的)；
Ya为CR21或N；R21为H或卤素；
R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R17、R18、R19、R20、R22、R23和R24各自独立地选自：H、取代或未取代的C1-C8烷基、取代或未取代的C1-C8烷氧基、取代或未取代的C1-C6亚烷基-胺基、取代或未取代的C1-C6亚烷基-羟基、取代或未取代的5～8元芳基、或取代或未取代的5～8元杂芳基；取代或未取代的3～12元饱和杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含至少一个选自下组的杂原子：N、O或S，所述的杂环包含至少一个选自下组的杂原子：N、O或S；
n和t分别为0，1或2；
上述的任一“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：卤素、OH、NH2、CN、未取代或卤代的C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、未取代或卤代的C2-C6烯基、未取代或卤代的C2-C6炔基、未取代或卤代的C2-C6酰基、未取代或卤代的5～8元芳基、未取代或卤代的5～8元杂芳基、未取代或卤代的3～12元饱和杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S，所述的杂环包含1～3个选自下组的杂原子：N、O或S。
在另一优选例中，为取代或未取代的选自下组的基团：
其中，m是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9，所述“取代”如上文所述。
在另一优选例中，R1和R2与相邻的氮原子形成4-12元环状结构。
在另一优选例中，R1和R2与相邻的氮原子形成5-7元环状结构。
在另一优选例中，R1和R2与相邻的氮原子形成六元环状结构。
在另一优选例中，R13和R14与相邻的氮原子形成4-6元环状结构。
在另一优选例中，当L为无时，Y为含氮原子的六元杂环。
在另一优选例中，A、B、L、X、Y、Z、R1、R2、R3、R4或R5为实施例中所述具体化合物中所对应的基团。
在另一优选例中，所述式I化合物为如下所示的化合物：
式I化合物的制备方法
本发明提供了一种制备式I化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在惰性溶剂中，式I-6化合物和式I-7化合物反应，形成式I化合物，其中各基团的定义如上文中所述。
在另一优选例中，所述惰性溶剂选自下组：甲苯、二甲苯、乙二醇二甲醚、二氧六环、THF、DMF、DMSO、NMP，或其组合。
在另一优选例中，所述反应在钯催化剂存在下进行。
在另一优选例中，所述的钯催化剂选自下组：Pd(PPh3)4、Pd2(dba)3、Pd(dba)2、Pd(OAc)2、Pd(PPh3)2Cl2、Pd(dppe)Cl2、Pd(dppf)Cl2、Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2，或其组合。
在另一优选例中，所述反应在配体存在下进行。
在另一优选例中，所述的配体为单齿膦配体或双齿膦配体；更佳地，所述的配体选自下组：三苯基膦、三甲苯基膦、三环己基膦、三叔丁基膦、X-Phos、S-Phos、联萘二苯基膦、1,1'-双(二苯基膦)二茂铁、1，2-二(二苯基膦基)乙烷、Xant-Phos，或其组合。
在另一优选例中，所述反应在碱存在下进行。
在另一优选例中，所述的碱选自下组：Na2CO3、K2CO3、Cs2CO3、LiHMDS、NaHMDS、KHMDS、叔丁醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基胺、二异丙基乙胺，或其组合。
一种较为优选的制备方法包括以下步骤：
(1)化合物A3可由化合物A1和相应的肼A2在碱(例如但不限于二异丙基乙基胺，三乙胺)的催化下于惰性溶剂(乙醇，THF等)中反应。
(2)化合物A5可由化合物A3和相应的末端炔烃A4进行Sonogashira耦合 (Sonogashira coupling)，在惰性溶剂(如THF、DMF、DMSO、二氧六环等)中，在催化剂a(如四(三苯基膦)钯、三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd2(dba)3)、双(二亚苄基丙酮)钯、二氯二(三苯基膦)钯、双(三邻苯甲基膦)二氯化钯、1，2-二(二苯基膦基)乙烷二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物等)、催化剂b(如碘化亚铜、氯化锌、氧化银、碳酸银等)和碱(如碳酸钾、氟化钾、碳酸铯、氟化铯、氟化钠、磷酸钾、水合磷酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、三乙胺、二异丙基胺、二异丙基乙胺、吡啶或其组合等)的存在下，进行Sonogashira偶联反应(反应时间为2-8小时)，得到化合物A5；
(3)化合物A6可由化合物A5在惰性溶剂中(二氯甲烷，THF，乙腈等)，加入四丁基氟化铵(TBAF)，加热下反应得到。
(4)化合物A8可由化合物A6和相应的芳香胺A7进行布赫瓦尔德-哈特维希耦合(Buchwald–Hartwig coupling)，在惰性溶剂(如甲苯、THF、DMF、DMSO、二氧六环等)中，在催化剂(如四(三苯基膦)钯、三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd2(dba)3)、双(二亚苄基丙酮)钯、二氯二(三苯基膦)钯、双(三邻苯甲基膦)二氯化钯、1，2-二(二苯基膦基)乙烷二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物等)、配体(如三甲苯基膦、三环己基膦、三叔丁基膦、联萘二苯基膦等)和碱(如碳酸钾、氟化钾、碳酸铯、氟化铯、氟化钠、磷酸钾、水合磷酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、三乙胺、二异丙基胺、二异丙基乙胺、吡啶或其组合等)的存在下，进行Buchwald–Hartwig偶联反应(反应时间为2-8小时)，得到化合物A8。
式I化合物的应用
本发明提供了式I化合物的应用，用于：
(a)制备治疗与CDK激酶活性或表达量相关的疾病的药物；
(b)制备CDK激酶靶向抑制剂；
(c)体外非治疗性地抑制CDK激酶的活性；
(d)体外非治疗性地抑制肿瘤细胞增殖；和/或
(e)治疗与CDK激酶活性或表达量相关的疾病。
在另一优选例中，所述CDK激酶选自下组：CDK4、CDK6，或其组合；和/或
所述的肿瘤细胞为白血病细胞株，较佳地为髓源白血病细胞株，更佳地为急性髓源白血病细胞株KG1细胞。
本发明的主要优点包括：
1.提供了一种如式I所示的化合物。
2.提供了一种结构新颖的CDK激酶抑制剂及其制备和应用，所述的抑制剂在极低浓度下即可抑制各类CDK激酶的活性。
3.提供了一类治疗与CDK激酶活性相关疾病的药物组合物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
各实施例中：
LCMS仪器：PumpAgilent1100UV检测器：Agilent1100DAD；
MassSpectrometer：API3000；
层析柱：WaterssunfireC18,4.6×50mm,5um；
流动相：A—乙腈；B-H2O(0.1％FA)。
实施例1
在干燥的250mL三口瓶中加入化合物1(5.00g，21.94mmol)和乙醇(100.0mL)，-20℃缓慢滴加1-氨基哌啶2(3.30g，32.91mmol)和N,N-二异丙基乙胺(4.25g，32.91mmol)。-20℃下搅拌3小时，反应液旋干溶剂并过硅胶柱纯化得白色固体化合物3(2.9g，45.24％)。LCMS:293(M+H)+,RT＝0.50mim.
化合物3(2.5g，8.56mmol)和[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(0.35g，0.4281mmol)溶入四氢呋喃(12mL),在室温下加入三乙胺(1.3g，12.84mmol)和3,3-二乙氧基-1-丙炔4(1.64g,12.84mmol)。氮气置换1分钟，室温下搅拌10分钟。然后加入碘化亚铜(65.1mg，0.3425mmol)，氮气置换3次。100℃下微波6小时，混合物拌硅胶过柱纯化得到黄色油状化合物5(1.512g，52.25％)。LCMS:339(M+H)+,RT＝1.72mim.
把化合物5(1.512g，4.47mmol)溶入四氢呋喃(80ml)，在室温下加入四丁基氟化氨(7.13g,27.29mmol)。65℃下搅拌2小时，反应液旋干溶剂并过硅胶柱纯化得黄色油状化合物6(1.208g，79.89％)。LCMS:339(M+H)+,RT＝1.72mim。
1HNMR(CD3Cl3,400MHz)δ(ppm)8.723(s，1H)，6.512(s，1H),5.728(s，1H)，3.967(t，2H，J＝11Hz)，3.646-3.729(m，4H)，3.104(d，2H,J＝10Hz)，1.689-1.838(m，6H)，1.261(t,6H，J＝7Hz)。
化合物6(0.98g，2.899mmol)溶入1，4-二氧六环(15ml)室温下加入浓盐酸(8ml)，搅拌10分钟。反应液用60mL水稀释，80mL乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得褐色固体化合物7(0.765g，100％),无需纯化直接用于下一步。LCMS:265(M+H)+,RT＝1.34mim。
化合物7(0.765g，2.899mmol)溶入N,N-二甲基甲酰胺(5ml)中，室温下加入过氧单磺酸钾(1.96g，3.1875mmol)，室温搅拌过夜。反应液加水，固体析出，过滤得到黄色固体化合物8(0.812g，100％)。LCMS:281(M+H)+，RT＝0.92mim。
化合物8(0.54g，1.929mmol)和二甲胺盐酸盐9(0.189g，2.3143mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(6ml)，室温下加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.733g，1.929mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.784g，5.786mmol)， 搅拌1小时。反应液油泵旋干并过硅胶柱纯化得黄色固体化合物10(0.118g，19.93％)。LCMS:308(M+H)+，RT＝1.42mim.
把化合物11a(13.7g，73.9mmol)、化合物11b(10g，49.3mmol)、碘化钾(81.8mg，0.493mmol)和碳酸钾(13.6g，98.6mmol)加入DMSO(100mL)中，反应液在120℃下搅拌过夜。把反应液降温至室温，用1mol盐酸调pH约为7，用DCM萃取，水相再用饱和碳酸钠碱化，接着水相再用DCM萃取。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，浓缩，再用水打浆，得到化合物11c(9.2g，60％)。LCMS:309(M+H)+,RT＝1.710min。
把化合物11c(9.2g，29.9mmol)和湿钯碳(2g)加入甲醇(100mL)中，反应液中的空气用氢气置换4-5次，然后在氢气氛围下室温搅拌过夜。反应液过滤，用少量甲醇洗涤，浓缩得到化合物11(7.1g，85％)。LCMS:279(M+H)+,RT＝1.120min。
将化合物10(90mg,0.2932mmol)，4-(6-氨基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯11(122.2mg,0.4397mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(26.8mg,0.02932mmol)溶入1，4-二氧六环(1ml)并加入叔丁醇钠(50.7mg,0.5277mmol)和联萘二苯磷(36.5mg,0.05863mmol),氮气置换3次。在110℃下微波1.5小时。混合物旋干并纯化得褐色固体化合物12(68mg，42.3％)。LCMS:550(M+H)+，RT＝1.41mim。
1HNMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)8.931(s,1H),8.280(s，1H)，8.118(s，1H)， 7.916(s,1H)，6.455(s，1H),3.719(s,4H),3.647(s，2H)，3.300(s,5H),3.147(s，3H),3.006(s，3H),3.243(t,1H,J＝7.6Hz),1.990-2.018(m，4H),1.481(s.9H),1.427(s,2H)。
把化合物12(68mg,0.1239mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中并加入三氟乙酸(2ml)，室温下搅拌过夜。旋干得粗产品，pre-TLC纯化后，得33mg黄色固体产物13，产率为59.34％。LCMS:450(M+H)+，RT＝1.12mim。
1HNMR(MeOD,400MHz)δ(ppm)8.680(s，1H)，8.308(d，1H，J＝9.2Hz),7.972(d，1H，J＝2.8Hz)，7.498-7.528(m，1H)，6.413(s，1H)，3.990(s，2H)，3.344(s，1H)，3.138(t，6H,J＝4.8Hz)，3.056(s,3H),2.987-3.011(m，4H),2.121-2.205(m,1H),1.986-2.088(m,1H)1.581-1.737(m,6H)。
使用类似方法可得到如下化合物：
N，N-二甲基-2-((5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺，
LCMS:464(M+H)+，RT＝1.13mim
1HNMR(DMSO,400MHz)δ(ppm)9.361(s,1H),8.732(s，1H)，8.240(d，1H，J＝9.2Hz)，8.006(d,1H,J＝2.4Hz)，7.465-7.493(m，1H),6.379(s,1H),3.857(s，2H)，3.132(s,5H),3.020(s，3H),2.952(m，3H),2.479-2.490(m,4H),2.234(s，3H),1.196(s,1H),1.547-1.703(m,6H)。
7-(环己亚胺-1-基)N，N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
LCMS:464(M+H)+，RT＝1.18mim
1HNMR(MeOD,400MHz)δ(ppm)8.686(s,1H),8.373(d，1H,J＝8.8Hz)，8.006(d，1H，J＝2.8Hz)，7.565-7.595(m，1H)，6.397(s，1H),5.338(t,1H,J＝4.8Hz),3.958(s，2H)，3.221-3.245(m,4H),3.158(s，3H),3.065(s，3H),2.156-2.209(m,1H),2.002-2.048(m，2H),1.781(s,6H),1.581-1.674(m,4H)。
氮杂环丁-1-基(2-((5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)甲酮，
LCMS:476(M+H)+，RT＝1.16mim
1HNMR(MeOD,400MHz)δ(ppm)8.696(s,1H),8.316(d，1H,J＝8.8Hz)，7.985(d，1H，J＝2.8Hz)，7.514-7.544(m，1H)，6.593(s，1H),4.288(t,2H,J＝7.6Hz),4.208(t,2H,J＝7.6Hz),3.953(s，2H)，3.232(t,4H,J＝4.8Hz),2.710(s，4H),2.367-2.424(m，4H),2.152-2.187(m,1H),2.019-2.033(m，1H),1.787(s,5H),1.598(m,1H)。
氮杂环丁-1-基(2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)甲酮，
LCMS:462(M+H)+，RT＝1.19mim
1HNMR(MeOD,400MHz)δ(ppm)8.706(s,1H),8.351(d，1H,J＝8.4Hz)，8.008(d，1H，J＝2.8Hz)，7.543-7.573(m，1H)，6.602(s，1H),4.290(t,2H,J＝7.6Hz), 4.210(t,2H,J＝8Hz),3.952(s，2H)，3.215-3.229(m,6H),2.349-2.427(m，2H),2.152-2.205(m，2H),2.008-2.033(m,1H),1.788(m，1H),1.787(s,5H),1.598(t,1H,J＝6.4Hz)。
N-甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺，
LCMS:436(M+H)+，RT＝1.15mim
1HNMR(MeOD,400MHz)δ(ppm)8.777(s,1H),8.7251(d，1H,J＝9.2Hz)，7.994(d，1H，J＝2.8Hz)，7.511-7.542(m,1H)，7.130(s，1H),4.201(t,2H,J＝10.8Hz),3.132-3.166(m，5H)，3.004(s,5H),2.187(t，2H,J＝7.6Hz),2.019-2.003(m，1H),1.944(s,2H),1.790(d，2H,J＝13.6Hz),1.580-1.616(m,2H)。
叔丁基4-(6-((6-(二甲基氨基甲酰基)-7-(吡咯烷-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸酯，
LCMS:536(M+H)+，RT＝1.36mim
1HNMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)8.723(s,1H),8.395(d，1H,J＝9.2Hz)，7.713(d，1H，J＝9.2Hz)，7.593(s,1H)，6.374(s，1H),3.604(d,7H,J＝13.6Hz),3.494(s，1H)，3.163(s,3H),3.121(s，4H),3.031(s，3H),2.075(s,4H),1.497(s，9H)。
2-((5-(3,3-二甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-N，N-二甲基-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
LCMS:478(M+H)+，RT＝1.20mim
1HNMR(MeOD,400MHz)δ(ppm)8.720(s,1H),8.277(s，1H)，8.018(s，1H)，7.624(s，1H)，6.434(s，1H),4.003(m,2H),3.477(m，1H)，3.141(m,4H),3.049(s，3H),2.177(d，2H,J＝8Hz),2.026(d,4H,J＝5.6Hz),1.735-1.757(m，3H),1.580-1.616(m,3H),1.471(s,4H),1.401(s,2H)。
(2-((5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)–吡咯烷-1-基甲酮
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.37(d,1H,J＝3.2Hz),8.72(s,1H),8.24(d,1H,J＝5.6Hz),8.00(d,1H,J＝0.8Hz),7.48(m,1H),6.45(s,1H),3.45(m,4H),3.15(m,6H),2.28(m,4H),1.96(s,3H),1.84(m,6H),1.64(m,8H).
N，N-二甲基-2-((5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-吗啡啉基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.36(s,1H),8.74(s,1H),8.16(d,1H,J＝9.2Hz),8.00(d,1H,J＝2.4Hz),7.39(dd,1H,J＝2.8Hz),6.42(s,1H),3.71(m,4H),3.12(t,4H,J＝4.6Hz),3.03(s,3H),2.97(s,3H),2.47(m,8H),2.23(s,3H).
(2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6- 基)–吡咯烷-1-基甲酮
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.38(s,1H),8.73(s,1H),8.23(d,1H,J＝8.4Hz),8.00(d,1H,J＝1.2Hz),7.46(dd,1H,J＝6Hz),6.45(s,1H),3.48(m,4H),3.10(m,8H),2.93(m,6H),1.65(m,8H).
N，N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-(吡咯烷-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
1HNMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.69(s,1H),8.20(d,1H,J＝9.2Hz),7.97(d,1H,J＝2.4Hz),7.52(dd,1H,J＝2.8Hz),6.43(s,1H),3.63(m,4H),3.14(m,4H),3.13(s,3H),3.08(s,3H),3.00(m,4H),2.06(m,4H).
N，N-二甲基-2-((5-吗啡啉基吡啶-2-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
LCMS:450(M+H)+，RT＝6.41mim。
1HNMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)8.661(s,1H),8.414(d，1H，J＝8.8Hz)，8.014(d，1H，J＝2.4Hz)，7.895(s，1H)，7.349-7.320(m，1H)，6.288(s,1H),3.967-3.882(m，6H),3.240-3.133(m，9H),3.016(s,3H),1.776-1.630(m，6H，)。
N，N-二甲基-2-((5-(4-乙基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H- 吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
LCMS:477(M+H)+，RT＝5.56mim
1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm)9.385(s，1H)，8.730(s，1H)，8.248(d，1H，J＝8.8Hz)，8.009(S，1H)，7.493(d，1H，J＝8.4Hz),6.377(S，1H)，3.146(S，6H)，3.014-2.949(m，7H)，2.567(m，5H)，1.706-1.552(m，4H)，1.235(s，4H)，1.054(s，3H)。
2-((5-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-N，N-二甲基-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
LCMS:478(M+H)+,RT＝1.20min.
1HNMR(d6-DMSO,400MHz)δ(ppm)9.30(s,1H),8.72(s,1H),8.22(d,1H,J＝8.0Hz),7.97(s,1H),7.46(d,1H,J＝8.0Hz),6.37(s,1H),3.83(s,1H),3.49(d,2H,J＝8.0Hz),3.01(s,3H),2.94(s,3H),2.89(m,2H),2.33(s,1H),2.14(m,2H),2.01(m,2H),1.23(s,6H),1.04(d,6H,J＝8.0Hz),0.85(m,1H).
N，N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-吗啡啉基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.47
(s,1H),8.77(s,1H),8.17(d,1H,J＝4Hz),8.01(s,1H),7.40(m,1H),6.43(s,1H),3.71(m,8H),3.03(s,6H),3.00(m,4H),2.87(m,4H),
N，N-二乙基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺，
1HNMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.72
(s,1H),8.35(d,1H,J＝4Hz),8.02(d,1H,J＝4Hz),7.55(t,1H,J＝3Hz),6.42(s,1H),4.01(m,2H),3.61(q,2H,J＝8Hz),3.39(m,4H),3.17(m,4H),3.03(m,4H),1.83(m,4H),1.64(m,4H),1.34(m,8H),
N-N-二甲基-2-((5-(4-氘代甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm)9.34(s,1H),8.72(s,1H),8.23(d,J＝9.2Hz,1H),8.00(s,1H),7.47(dd,J＝9.2Hz,1H),6.37(s,1H),3.51(m,2H),3.21(s,6H),3.01(s,3H),2.95(s,3H),1.68(m,10H).
N-N-二甲基-2-((5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-(高哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm)9.34(s,1H),8.71(s,1H),8.29(d,J＝9.2Hz,1H),8.01(s,1H),7.50(m,1H),6.34(s,1H),3.83(m,2H),3.20(m,8H),3.03(s,3H),2.95(s,3H),1.67(m,10H).
N-N-二甲基-2-((5-(4-甲基-1,4-高哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm)9.16(s,1H),8.70(s,1H),8.15(d,J＝8.0Hz,1H),7.87(d,J＝2.8Hz,1H),7.27(m,1H),6.36(s,1H),3.66(s,3H),3.48(m,3H),3.01(m,10H),2.60(s,3H),2.08(s,3H),1.64(m,6H).
N-N-二甲基-2-((5-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
1H NMR(甲醇-d4,400MHz)δ(ppm)8.98(s,1H),8.31(s,1H),8.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,1H),6.64(s,1H),3.98(s,2H),3.71(s,2H),3.57-3.43(m,2H),3.34(m,2H),3.16(s,6H),3.06(s,4H),2.91(s,3H),2.52(s,2H),1.76-1.60(s,6H).
N-N-二甲基-2-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm)9.37(s,1H),8.69(s,1H),7.75(d,J＝8.0Hz,2H),6.95(d,J＝8.4Hz,2H),6.33(s,1H),3.86(m,2H),3.26-3.13(m,6H),3.01(s,4H),2.95(s,6H),2.57(s,3H),1.73-1.55(m,6H).
N-N-二甲基-2-((5-(4-环丙基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm)9.31(s,1H),8.72(s,1H),8.23(d,J＝8.8Hz,1H),7.99(d,J＝2.8Hz,1H),7.48(m,1H),6.37(s,1H)3.18(d,J＝5.6Hz,4H),3.01(s,3H),2.95(s,3H),2.70(t,J＝8.8Hz,4H),1.67(m,8H),0.45(d,J＝4.4Hz,2H),0.35(d,J＝2.8Hz,2H).
N-N-二甲基-2-((6-(4-甲基哌嗪-1-基)哒嗪-3-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm)9.85(s,1H),8.73(s,1H),8.29(d,1H,J＝10Hz),7.45(d,1H,J＝9.6Hz),6.39(s,1H),3.80-3.71(m,2H),4.45(s,4H),3.02(s,3H),2.95(s,3H),2.45(s,4H),2.24(s,3H),1.66-1.58(m,6H),1.24(s,2H),
2-((5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)甲醇
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm)11.02(s,1H),10.23(s，1H)，8.83(s，1H)，8.01(s，1H),7.89(d,1H,J＝8.4Hz)，7.71(d,1H,J＝8.8Hz),6.44(s，1H),4.61(s,2H),4.06-3.79(m，6H)，3.27-2.89(m,6H),2.89(s，3H),1.77-1.65(m,6H).
N-N-二甲基-2-((5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-5-甲基-7-(哌啶-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺
1HNMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)8.58(s,1H),7.93(s,2H),7.37(s,1H),3.98-3.93(t,3H,J＝8.8Hz,10.8Hz),3.49(s,9H),3.18-2.71(m,12H),2.44(s,3H),2.04-1.62(m,6H).
以下化合物也可采用类似方法制备：
实施例2本发明化合物对CDK激酶活性的测定
1.试验材料
本实验使用的CDK激酶：CDK4/CyclinD1(invitrogen，货号PV4400)；CDK6/CyclinD1(invitrogen,货号PV4401)；CDK1/CyclinB(invitrogen,货号：PV3292)。
使用试剂：底物是ULight-4E-BP1(PerkinElmer，货号TRF0128)；抗体是Eu-labeledanti-phospho-eIF4E-bindingprotein1(Thr37/46)(Perkin-Elmer，货号TRF0216)。
2.试验方法
将受试化合物溶解于二甲亚枫中，并根据试验需要用缓冲液(50mMHEPES、10mMMgCl2、1mMEGTA、2mMDTTand0.01％Tween20)稀释至各浓度梯度，二甲亚枫浓度为4％；再用缓冲液稀释ATP和底物ULight-4E-BP1配制成浓度为800μMATP和200nM底物溶液的混合物待用；在反应孔中加上2.5μL底物和ATP混合液或者2.5μL底物，再加入2.5μL化合物或者4％二甲亚枫的缓冲液，最后加入5μL酶(终浓度0.66μg/mL)，室温避光孵育60分钟。每孔加入5μL1xdetectionbuffer(LANCEDetectionBuffer，10x，PerkinElmer，货号CR97-100)稀释的EDTA终止液(终浓度6mM)，再加入5μL1xdetectionbuffer稀释的抗体(终浓度2nM)室温避光孵育60分钟。用Perkin Elmer EnTRFRETmode(激发波长:320nm，发射波长:615nm和665nm)测板。
样品的抑制率通过下列公式求得：
IC50值采用GraphPadPrism软件计算求得。
3.结果
所得结果见表1。符号+代表IC50小于100nM，符号++代表IC50为100nM至500nM，符号+++代表IC50大于500nM，符号N/A代表暂无数据。
表1
结果显示，本发明化合物在极低浓度(≤100nM)下，即可有效抑制CDK4激酶的活性，同时对CDK1激酶有较弱的抑制活性。
实施例3本发明化合物对人结肠癌细胞株Colo205的增殖抑制活性测定
1.试验方法
以下所述的体外细胞试验可测定受试化合物对人结肠癌细胞株的增殖抑制活性，其活性可用IC50值来表示。
将Colo205细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)以适宜细胞浓度2000个/孔接种在96孔培养板上，每孔140μL培养基，在二氧化碳恒温箱内37℃培养过夜后，加入10μL不同浓度的受试化合物作用96小时，并设定溶剂对照组(阴性对照)。96小时后，用CCK8(CellCountingKit-8，货号:CK04，购于同仁化学)方法进行测试化合物对肿瘤细胞的增殖抑制活性。用全波长式微孔板酶标仪SpectraMax190读数，测定波长为450nm。
样品的抑制率通过下列公式求得：
IC50值采用酶标仪随机附带软件以四参数法回归求得。
2.结果
所得结果见表2。符号+代表IC50小于0.5uM，且符号++代表IC50为0.5uM至2uM，符号+++代表IC50大于2uM，符号N/A代表暂无数据。
表2
结果显示，本发明化合物在低浓度(≤2uM)下，即可有效抑制肿瘤细胞增殖。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

  1. 一种如式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐：
    式中，
    R1和R2各自独立地选自：H、取代或未取代的C1-C8烷基、C(O)OR8、CONR9R10、C(O)R11、取代或未取代的5～8元芳基、取代或未取代的5～8元杂芳基、取代或未取代的3～12元饱和或不饱和杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；所述的杂环包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；
    此外，R1和R2可与相邻的N原子连接构成环状结构，所述的环状结构包括取代或未取代的3～12元饱和或不饱和的杂环或桥环或螺环；其中，所述的杂环是指环结构中除了包含连接母核的氮原子之外，还包含0-3个选自下组的杂原子：N、O或S；
    R3选自：取代或未取代的C1-C8烷基、CN、C(O)OR12、CONR13R14、C(O)R15、取代或未取代的5～8元芳基、取代或未取代的5～8元杂芳基、取代或未取代的3～12元饱和或不饱和的杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；所述的杂环包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；
    R4选自：H、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C1-C8烷氧基、卤素、OH、CN、C(O)OR12、CONR13R14、C(O)R15、取代或未取代的5～8元芳基、取代或未取代的5～8元杂芳基、取代或未取代的3～12元饱和或不饱和的杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；所述的杂环包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S；
    R5选自：H或C1-C4烷基；
    X为CR16或N；
    A、B和Z各自独立地选自：N或CR16；
    R16为H、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；
    L为选自下组的基团：无、C1-C6亚烷基、C(O)、CONR17或S(O)2；
    Y为：H、R18、NR19R20、OH、或Y为选自下组基团的一部分：
    其中，
    R6为无、H、取代或未取代的C1-C8烷基、取代或未取代的C1-C8烷氧基、取代或未取代的C2-C6酰基、取代或未取代的C2-C6磺酰基、取代或未取代的C1-C6亚烷基羟基、CONR22R23或C(O)R24；
    R7可以是0～3个取代基且R7为取代或未取代的C1-C8烷基、氧或卤素，或2个或更多R7形成桥环烷基；
    W为CR21、N或O(当W为O时，R6是不存在的)；
    Ya为CR21或N；
    R21为H或卤素；
    R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R17、R18、R19、R20、R22、R23和R24各自独立地选自：H、取代或未取代的C1-C8烷基、取代或未取代的C1-C8烷氧基、取代或未取代的C1-C6亚烷基-胺基、取代或未取代的C1-C6亚烷基-羟基、取代或未取代的5～8元芳基、或取代或未取代的5～8元杂芳基；取代或未取代的3～12元饱和杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含至少一个选自下组的杂原子：N、O或S，所述的杂环包含至少一个选自下组的杂原子：N、O或S；
    n和t分别为0，1或2；
    上述的任一“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：卤素、OH、NH2、CN、未取代或卤代的C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、未取代或卤代的C2-C6烯基、未取代或卤代的C2-C6炔基、未取代或卤代的C2-C6酰基、未取代或卤代的5～8元芳基、未取代或卤代的5～8元杂芳基、未取代或卤代的3～12元饱和杂环或碳环；其中，所述的杂芳基包含1-3个选自下组的杂原子：N、O或S，所述的杂环包含1～3个选自下组的杂原子：N、O或S。
  2. 如权利要求1所述的式I化合物，其特征在于，所述式I化合物为如下所示的化合物：
  3. 如权利要求1所述的式I化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
    a)在惰性溶剂中，式I-6化合物和式I-7化合物反应，形成式I化合物，其中各基团的定义如权利要求1中所述。
  4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述惰性溶剂选自下组：甲苯、二甲苯、乙二醇二甲醚、二氧六环、THF、DMF、DMSO、NMP，或其组合。
  5. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述方法具有以下一个或多个特征：
    所述反应在钯催化剂存在下进行，且所述的钯催化剂选自下组：Pd(PPh3)4、Pd2(dba)3、Pd(dba)2、Pd(OAc)2、Pd(PPh3)2Cl2、Pd(dppe)Cl2、Pd(dppf)Cl2、 Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2，或其组合；
    所述反应在配体存在下进行，所述的配体为单齿膦配体或双齿膦配体，且所述的配体选自下组：三苯基膦、三甲苯基膦、三环己基膦、三叔丁基膦、X-Phos、S-Phos、联萘二苯基膦、1,1'-双(二苯基膦)二茂铁、1，2-二(二苯基膦基)乙烷、Xant-Phos，或其组合；和/或
    所述反应在碱存在下进行，且所述的碱选自下组：Na2CO3、K2CO3、Cs2CO3、LiHMDS、NaHMDS、KHMDS、叔丁醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基胺、二异丙基乙胺，或其组合。
  6. 如权利要求1所述的式I化合物的用途，其特征在于，用于：
    (a)制备治疗与CDK激酶活性或表达量相关的疾病的药物；
    (b)制备CDK激酶靶向抑制剂；
    (c)体外非治疗性地抑制CDK激酶的活性；
    (d)体外非治疗性地抑制肿瘤细胞增殖；和/或
    (e)治疗与CDK激酶活性或表达量相关的疾病。
  7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述CDK激酶选自下组：CDK4、CDK6，或其组合；和/或
    所述的肿瘤细胞为白血病细胞株，较佳地为髓源白血病细胞株，更佳地为急性髓源白血病细胞株KG1细胞。
  8. 一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：(i)有效量的式I化合物，或其药学上可接受的盐；和(ii)药学上可接受的载体。
  9. 一种抑制CDK激酶活性的方法，其特征在于，包括步骤：对抑制对象施用抑制有效量的如权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，或对抑制对象施用抑制有效量的如权利要求8所述的药物组合物。
  10. 一种体外抑制肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：对抑制对象施用抑制有效量的如权利要求1所述的式I化合物，或如权利要求8所述的药物组合物。
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