CN104487415A

CN104487415A - 一种马来酰胺化合物、其制备方法及其用途

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Publication number: CN104487415A
Application number: CN201380009475.0A
Authority: CN
Inventors: 杨永亮
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Priority date: 2013-05-08
Filing date: 2013-05-08
Publication date: 2015-04-01
Anticipated expiration: 2033-05-08
Also published as: WO2014179943A1; CN104487415B

Abstract

本发明涉及一种马来酰胺化合物，其为通式(I)的化合物或其药用盐。所述马来酰胺化合物用于制备治疗皮肤类疾病、细菌感染和/或受STAT3蛋白调控的疾病的药物。与已报道的马来酰胺类化合物对比，此类化合物的毒副作用以及刺激较小，生物安全度较好，更适合施用于人体。

Description

一种马来酰胺化合物、其制备方法及其用途技术领域

本发明涉及药物领域，具体地，本发明涉及一种马来酰胺化合物、其制备方法及其用途。

背景技术

皮肤类疾病在人群中发病率很高。以银屑病为例，据估计世界范围内的患者在 1 亿 2千万到 1亿 8千万之多，其中：欧洲国家的平均患病率为 2-3%，以丹麦的平均患病率最高，达到 5-6%，其次为德国，患病率达到 4%; 俄罗斯的平均患病率为 4%; 北美地区如美国和加拿大的平均患病率为 2-3%; 中国的银屑病患病人数据估计也可达 1000万之多。目前的临床用皮肤类药物均存在依赖性和较强的副作用。

世界范围内，由细菌引发的各类临床感染每年造成大量死亡。由于抗生素的泛滥使用，也造成细菌对常见的抗生素产生耐药性，细菌感染的致死率逐年上升。因此，迫切需要有效、安全的抑菌化合物用于各类临床细菌感染的治疗。

研究表明， STAT3蛋白 (signal transducer and activator of transcription 3, 信号传导与转录激活因子 3 ) 与许多疾病如肿瘤和自身免疫性疾病的病理过程密切相关。此外， STAT3蛋白与细胞恶性转化相关，对干细胞起到直接调控作用，这些文献为： [What does Stat3 do? Levy DE, Lee CK. J Clin Invest. 109(9): 1143-8; 2002]。另有研究表明， STAT3 蛋白与皮肤类疾病如银屑病的病理过程密切相关，这些文献为： [Stat3 links activated keratinocytes and immuno cytes required for development of psoriasis in a novel transgenic mouse model. Sano S, Chan KS, Carbajal S, Clifford J, Peavey M, Kiguchi K et al. Nat Med. ll(l):43-9; 2005] SH2区域 (domain)是 STAT3蛋白的活性功能区域，与 SH2区域有效结合的分子可以直接抑制并调节 STAT3蛋白。

马来酸（Maleic acid) 又称为顺式丁烯二酸，结构中含有顺式的不饱和双键。已有相关报道发现，一类马来酰胺类化合物（Maleamide)具有抗真菌、用作杀虫剂、调节植物生长的效果，这些文献为： US3184475、 US3224936, US4125398 等。另有一些报道发现，马来酰胺类化合物具有治疗心肌细胞肥大的潜在效果，这些文献为：

[Suppression of HDAC nuclear export and cardiomyocyte hypertrophy by novel irreversible inhibitors of CRMl. Monovich L, Koch KA, Burgis R, Osimboni E, Mann T, Wall D et al.

Biochimica et Biophysica Acta. (1789): 422-431; 2009]。但是尚无其直接抑制并调节 STAT3蛋白、抑制各类临床细菌，从而用于治疗皮肤类疾病、细菌感染、肿瘤和自身免疫性疾病的报道。

目前尚没有一种可以有效治疗皮肤类疾病、细菌感染、肿瘤和自身免疫性疾病，并且具有较低毒副作用的药物。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种马来酰胺化合物，所述马来酰胺化合物为通式 ω化合物或其盐：

其中，和独立地选自氢、氘、氚、卤素、取代的或未取代的 C1-C3烷基、取代的或未取代的 C1-C3烷氧基、氰基、羟基或巯基中的 1种，和独立地选自氢、氘、氚、卤素、取代的或未取代的 C1-C4烷基、取代的或未取代的 C1-C4烷氧基、氰基、羟基或巯基中的 1种，！^和 L₂独立地选自化学键、取代或未取代的 C1-C5直链烷基或者取代或未取代的 C1-C5支链烷基中的 1种， \^和 W₂独立地选自取代的芳基或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基、 D-氨基酸组成的多肽、 L-氨基酸组成的多肽、 D-氨基酸和 L-氨基酸组成的多肽、氢原子中的 1种，双键的立体构型为顺式 (Z)。同一侧。

优选地，所述和独立地选自氢、氘、氚、卤素、取代的或未取代的甲基、取代的或未取代的甲氧基、氰基、羟基或巯基中的 1种，特别优选为氢、氘、氚、卤素或未取代的甲基中的 1种；本发明所述和可以相同也可以不同。

优选地，所述！^和独立地选自氢、氘、氚、卤素、取代的或未取代的甲基、取代的或未取代的乙基、取代的或未取代的甲氧基、取代的或未取代的乙氧基、氰基、羟基或巯基中的 1种，进一步优选为氢、卤素或未取代的甲基中的 1种，特别优选为氢；本发明所述 1^和可以相同也可以不同。

优选地，所述 W₁和W₂独立地选自取代或未取代的芳基、 D-氨基酸组成的多肽、 L-氨基酸组成的多肽或者 D-氨基酸和 L-氨基酸组成的多肽中的 1种。

优选地，所述和 L₂独立地选自化学键、未取代的 C1-C5直链烷基或者未取代的 C1-C5支链烷基中的 1种，特别优选！^和 L₂都为化学键；本发明所述！^和 L₂可以相同也可以不同。

所述芳基可以为碳环芳基，也可以为杂环芳基，可以为单环芳基，也可以为多环芳基、稠环芳基或与非芳基环稠合的芳基，例如：苯基、联苯基、萘基、蒽基、菲基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、吡啶基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、吡唑基、咪唑基、恶唑基、噻唑基、哒嗪基、嘧啶基或吡嗪基等；所述芳基可以是取代的或未取代的，例如由烷基、羟基、卤素、烷氧基、环烷基和 /或杂环基等取代。

优选地，所述 D-氨基酸组成的多肽具有 1-10个 D-氨基酸，特别优选具有 1-5个 D-氨基酸；

优选地，所述 L-氨基酸组成的多肽具有 1-10个 L-氨基酸，特别优选具有 1-5个 L-氨基酸；

优选地，所述 D-氨基酸和 L-氨基酸组成的多肽为 1-10个 D-氨基酸和 1-10个 L- 氨基酸通过酰胺键组成的多肽，特别优选为 1-5个 D-氨基酸和 1-5个 L-氨基酸通过酰胺键组成的多肽；

优选地，所述马来酰胺化合物的盐为其药学上可接受的盐；优选地，所述马来酰胺化合物的药学上可接受的盐为酸加成盐、碱加成盐和 /或季铵盐；优选地，所述酸加成盐为马来酰胺化合物与无机酸形成的盐和 /或马来酰胺化合物与有机酸形成的盐；优选地，所述马来酰胺化合物与无机酸形成的盐为盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硼酸盐、铬酸盐、碳酸盐、硼酸盐、亚硝酸盐、次氯酸盐、次溴酸盐或次碘酸盐中的 1种或至少 2种的组合；优选地，所述马来酰胺化合物与有机酸形成的盐为醋酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、水杨酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐或苦杏酸盐中的 1种或至少 2种的组合。

本发明的目的之一还在于提供一种所述马来酰胺化合物的制备方法。

所述马来酰胺化合物采用取代或未取代的马来酸酐与胺类反应得到，采用以下路

优选地，所述方法在有机溶剂中进行；优选地，所述有机溶剂为 THF (；四氢呋喃；)、氯仿、 DMF (；二甲基甲酰胺)或乙醚中的 1种或至少 2种的组合。所述 EDC1为 1-乙基 -(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。

所述 HOAt为 1-羟基 -7-偶氮苯并三氮唑。

所述反应可以在环境温度下进行，也可根据具体情况选择合适的反应温度。所述反应的时间根据具体情况而不同，从数小时到数天不等，所属领域技术人员可根据需要选择。

所述反应所需的各种原料皆为所属领域已知产品，可通过市售得到，也可由所属领域技术人员根据现有技术 /新技术制备得到。

本发明的目的之一还在于提供一种所述马来酰胺化合物的用途。

所述马来酰胺化合物可用于制备治疗皮肤类疾病、细菌感染和 /或受 STAT3 蛋白调控的疾病的药物。

优选地，所述皮肤类疾病为银屑病、湿疹、特应性皮炎、白癜风、环状肉芽肿、荨麻疹、扁平疣、传染性软疣、疱疹、麻疹、风疹、皮肤瘙痒、传染性红斑、疥疮、鱼鳞病、腋臭、青春痘、毛囊炎、斑秃、脱发、雀斑、黄褐斑、尖锐湿疣、梅毒、淋病、非淋菌性尿道炎、手足口病、猩红热、水痘或皮肤创伤中的 1种或至少 2种的组合，特别优选为银屑病、湿疹、特应性皮炎、白癜风、尖锐湿疣或皮肤创伤中的 1种或至少 2种的组合；优选地，所述皮肤创伤为擦伤、割伤、烫伤、烧伤、外科手术伤口或上皮组织溃疡中的 1种或至少 2种的组合；优选地，所述上皮组织溃疡为细菌感染造成的上皮组织溃疡和 /或糖尿病造成的上皮组织溃疡。

优选地，所述细菌感染为细菌性乳腺炎、细菌性蜂窝织炎、细菌性肺炎、细菌性上呼吸道感染、肺结核、细菌性脑脓肿、细菌性脑膜炎、细菌性胆囊炎、细菌性胆管炎、脓胸、细菌性腹盆腔脓肿、细菌性尿路感染、中耳炎、心包炎、心内膜炎、败血症、脓毒血症、细菌性淋巴管炎、细菌性胰腺炎、细菌性阴道炎、手术后切口感染、手术后肺部感染、细菌性关节感染、细菌性食物中毒、烫伤样皮肤综合症、细菌性烧伤创面感染、细菌性中毒休克综合症、假膜性肠炎中或细菌性眼部感染中的 1种或至少 2种的组合，特别优选为细菌性肺炎、肺结核、败血症、手术后切口感染、细菌性食物中毒或细菌性烧伤创面感染中的 1种或至少 2种的组合。

优选地，所述受 STAT3 蛋白调控的疾病为肿瘤和 /或自身免疫性疾病；优选地，所述自身免疫性疾病为多发性硬化、风湿性关节炎、移植物对抗宿主反应、系统性红斑狼疮、免疫性溶血性贫血、桥本氏甲状腺炎、 I 型糖尿病、过敏性哮喘、系统性脉管炎、重症肌无力、格雷夫斯病、胆汁性肝硬化或膜性肾小球肾炎中的 1种或至少 2 种的组合，特别优选为多发性硬化、风湿性关节炎、移植物对抗宿主反应或系统性红斑狼疮中的 1种或至少 2种的组合；优选地，所述肿瘤为血液肿瘤和 /或实体肿瘤，特别优选为急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性早幼粒白血病、 B-细胞淋巴瘤、 T-细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、喉癌、宫颈癌、皮肤癌、食道癌、甲状腺癌、卵巢癌、睾丸癌、神经胶质瘤或黑色素瘤中的 1种或至少 2种的组合。

所述药物还可以包含其它治疗剂，所述其它治疗剂例如用于肿瘤治疗及自身免疫性疾病治疗的其它化合物。

优选地，所述药物的施用方式为体外局部施用、全身经皮给药、口服、喷雾吸入给药、舌下给药、直肠灌注给药和 /或注射给药，进一步优选为体外局部施用、口服和 /或注射给药。

优选地，所述药物还含有载体基质；优选地，所述载体基质为聚乙二醇、凡士林、石蜡、硅油、硅酮、蜂蜡、硬脂酸、羊毛脂、甘油明胶、透皮渗透剂、悬浮剂、乳化剂、纳米载体、防腐剂、芳香剂或着色剂中的 1种或至少 2种的组合。

优选地，所述药物为软膏、无菌溶液剂、无菌混悬剂、片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、霜剂、洗剂、喷雾或凝胶形式。

本发明所述马来酰胺类化合物潜在的市场空间和经济效益巨大。到目前为止，还未见此类化合物在上述方面应用的相关报道。

与已报道的马来酰胺类化合物对比，此类化合物的毒副作用以及剌激较小，生物安全度较好，更适合施用于人体。

附图说明

图 1是实施例 1制备的代表化合物 M-01的核磁共振氢谱 (； H-NMR)谱图数据。图 2是代表化合物 M-01的液相质谱联用 (； LC-MS)谱图数据。

图 3是实施例 2制备的代表化合物 M-21的核磁共振氢谱 (； H-NMR)谱图数据。图 4是注射雌激素 7天后，小鼠阴道上皮溃疡面的 H.E.组织切片，其中，图中细胞染色呈现深色为处于有丝分裂期的组织细胞。

图 5是代表化合物 M-01配制软膏连续外用 7天后，对小鼠阴道上皮溃疡组织治疗实验的 H.E.组织切片，其中，图中细胞染色呈现深色为处于有丝分裂期的组织细胞。

图 6是代表化合物 M-01与 STAT3蛋白 SH2活性功能区域的分子对接模拟图。图 7是代表化合物抑制金黄色葡萄球菌（菌株: ATCC25923 ) 的实验数据。其中，图中的 PBS为磷酸盐缓冲液， DMSO为二甲亚砜， Amp为氨苄青霉素， TSB为大豆肉汤培养基， OD值为定量分光光度计记录的浊度。

图 8是代表化合物抑制肠道沙门氏菌（菌株: ATCC14028) 的实验数据。其中，图中的 PBS为磷酸盐缓冲液， DMSO为二甲亚砜， Amp为氨苄青霉素， TSB为大豆肉汤培养基， OD值为定量分光光度计记录的浊度。

具体实施方式

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。实施例 1 化合物 M-01的制备将间氯苯胺 (1.3g， lOmmol)溶解在 15ml乙醚中。将溶液滴加到顺酐的 (lg， lOmmol) 乙醚溶液中，室温搅拌， TLC检测， 3小时原料不再减少，反应完毕。抽滤，乙醚洗涤干燥，得类白色固体 2g。将此固体 (2g， 8.9mmol)、对氟苯胺 (lg， 8.9mmol)、 EDCI(1.9g， 9.7mmol)和 H0At(1.2g， 8.9mmol)溶于 100ml DCM中，氮气保护下不断搅拌。 TLC检测， 15小时原料不再减少，停止反应。反应液分别用饱和碳酸氢钠水溶液、水和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，蒸干，柱层析分离 (甲醇 /二氯甲垸， 5%)，进一步纯化用 DCM重结晶纯化，得到目标化合物 230mg，纯度 97%。实施例 2 其余化合物的制备其余化合物 M-02到 M-25的制备与实施例 1类似。实施例 1和实施例 2制备的化合物如表 1所示，其中 STAT3蛋白抑制活性用各化合物浓度为 ΙΟΟμΜ中 STAT3的转录抑制率表示。表 1代表性化合物的结构及活性数据

ID 化合物结构 MS, (m/e) STAT3 蛋白抑 ^-NMR: DMSO

分子量制活性， (%) 核磁共振氢谱 (300MHz) δ 10.70(1H, s), δ 10.42(1H, s), δ 7.84(1H, s), δ 7.70(2H, d), δ 7.51 (1H, m), δ 7.32(1H, m), δ

M-01 318.1 100 7.14 (3H, m), δ 6.46(2Η, s)

δ 7.65(1H, s), δ 7.62(2H, d), δ 7.18(1H, m)， δ 7.01(1H, m)， δ

。 6.95(3H, m), δ 6.41(2H, s)

M-02 320.1 100

π

/:>/: 80.0£SZZ>d/ O 366ZJHSAV

δ 10.70(1H, s), δ 10.42(1H, s), δ 6.46(2H, s), δ 3.10(4H, m), δ 1.20(6H, m)

M-23 170.2 25

δ 10.73(1H, s), δ 10.39(1H, s), δ 7.53(2H, d)， δ 7.41 (2H, d), δ 6.46(2H, s), δ 2.32(1H, m), δ

M-24 309.1 100 1.31 (4H, m) δ 10.71(1H, s), δ 10.39(1H, s), δ 7.53(2H, d), δ 7.41 (2H, d), δ 6.95(2H, s), δ 6.68(2H, s)， δ

M-25 431.3 100 6.46(2H, s), δ 3.87(1H, m), δ

3.21(1H, m), δ 2.97(1Η, m),

实施例 3 化合物对 STAT3蛋白抑制活性的测定

将稳定表达 STAT3报告基因的 HeLa细胞株以每孔 6000个 /细胞接种在 96孔细胞培养板。细胞培养至 18-24h时，加入用 DMSO溶液调整为不同浓度梯度的化合物，振荡混匀预培养 1小时。 1小时后，加入抑瘤素 M(10ng/ml)活化 STAT3蛋白，继续培养 4小时。 4小时后，利用多功能酶标仪测定荧光素酶活性，进而计算化合物针对 STAT3 蛋白的抑制活性，结果如表 1所示。

实施例 4 代表化合物对促进皮肤创伤愈合作用的实验

本实验旨在观察代表化合物配制的软膏外用对新西兰兔皮肤创伤模型的促进愈合作用。具体的实验主要步骤如下： ( 1 )将代表化合物用少量 DMSO溶解并配制成 0.5%的外用软膏，软膏基质为临床用标准羊毛脂基质；

(2) 健康新西兰兔 15只 (SPF级别)，体重 (2.5±0.2)kg。实验温度为 18°C〜20°C，每只动物分笼饲养；

(3 )将新西兰兔脊柱两侧脱毛，去毛面积为体表面积的 10% (约 120cm²)。将兔子麻醉后，利用消毒的无菌生检打孔器在去毛皮区右侧表面形成 2cmx2cm 的环形创伤，注意只剌伤表皮而不伤及真皮；

(4)每只兔脊柱左侧去毛区为空白软膏对照区，右侧为给药区，每日每只兔涂抹代表化合物配制软膏 (对照区涂空白软膏 )1次，连续涂抹 2周，涂药后用医用手术巾包扎 8h，然后用温水洗去药物，停药后再观察 1周；

(5 ) 观察并记录每日的红斑及水肿情况外，观察涂抹部位的伤口愈合面积情况，观察结痂情况，另外观察是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙等情况，折算每日的伤口愈合率，并制成表 2。

表 2实际测定代表化合物配制的外用软膏

对促进皮肤创伤愈合的实验

结果表明，代表化合物配制的软膏对于创伤皮肤模型具有较好的治疗效果，对于促进皮肤创伤愈合作用显著。

实施例 5 代表化合物对上皮组织溃疡的治疗实验

连续注射雌激素的小鼠阴道上皮组织会发生脱落、溃疡，可以模拟一些皮肤疾病及上皮组织溃疡的病理特征，本实验旨在观察代表化合物配制的乳膏外用对上皮组织溃疡的治疗作用。另外，溃疡组织中的 STAT3蛋白被激活，处于高表达状态，本实验也可以观察代表化合物对 STAT3蛋白的抑制作用。具体的实验主要步骤如下：

( 1 )将代表化合物用少量 DMSO溶解并配制成 0.5%的外用乳膏，乳膏基质为临床用标准羊毛脂基质；

(2) 健康 ICR系雌性小鼠（SPF级别） 80只，体重 22-25克，随机分为 8组，每组 10只；第 1组为单纯外用空白乳膏对照组，第 2组为注射过量雌激素并外用空白乳膏对照组，第 3-7组为 0.5%的代表化合物乳膏实验组，第 8组为商品化的他克莫司 ®乳膏（安斯泰来制药有限公司产品）实验组；

(3 ) 所有小鼠均腹腔注射乙烯雌酚 0.4mg/只 /天，注射 3天，从而诱导小鼠阴道上皮组织溃疡，之后每隔一天注射一次，直至实验结束；

(4) 连续雌化 4天后，第 5 日晨起对第 1组、第 2组每只小鼠阴道内小心灌注 0.05ml/只的空白乳膏，对第 3-8组每只小鼠阴道内小心灌注 0.05ml/只的药物乳膏；一日灌注两次，连续灌注 6天；

(5 )第 7日晨 8时最后一次给药， 9时腹腔注射秋水仙碱 2mg/kg，下午 2时处死小鼠，切取阴道组织，取阴道标本以 10%的福尔马林固定，制成 H.E.切片；

(6)光镜下计数每 500个基底细胞中的有丝分裂组织细胞数，折算出每 100个基底细胞的有丝分裂组织细胞数，结果如表 3所示，表中数字代表每 100个基底细胞的有丝分裂细胞数。表 3实际测定代表化合物配制的外用乳膏

对小鼠阴道上皮有丝分裂的抑制影响。

结果表明，代表化合物对上皮组织溃疡具有良好的治疗作用，经过治疗的上皮组织溃疡面变薄，溃疡细胞显著减少。

实施例 6 代表化合物对鼠尾鳞片颗粒层形成的影响实验

小鼠尾部鳞片表皮天然缺乏颗粒层。这个模型可用来模拟皮肤疾病中分化程度不足的皮肤细胞及角化不全的表皮细胞。故通过观察药物局部外用对鼠尾表皮颗粒层形成的影响，可以评估药物对皮肤疾病治疗的作用。另外，活化的 STAT3蛋白对于细胞的分化、移动也起到重要调控作用，本实验也可以观察代表化合物对 STAT3蛋白的抑制作用。具体的实验主要步骤如下：

( 1 )将代表化合物用少量 DMSO溶解并配制成 0.5%的外用软膏，软膏基质为临床用标准羊毛脂基质；

(2) 健康 ICR系雄性小鼠（SPF级别） 50只，体重 22-25克，随机分为 5组，每组 10只；第 1组为单纯外用空白软膏对照组，第 2-4组为 0.5%的代表化合物软膏实验组，第 5组为商品化的他克莫司⑧软膏（安斯泰来制药有限公司产品）实验组； (3 ) 各组小鼠鼠尾外涂空白软膏或各组外用药物软膏，每日 2次，连续 14天；

(4) 第 15天处死小鼠，取鼠尾距根部 1.5cm处背侧皮肤一长条， 10%福尔马林固定，制成 H.E.切片；

(5 ) 光镜下计数每 100个鳞片中有颗粒层形成的鳞片数，并制成表 4，表中数字代表每 100个鳞片中有颗粒层形成的鳞片数。

表 4实际测定代表化合物配制的外用软膏

对鼠尾鳞片颗粒层形成的影响实验。

结果表明，代表化合物对上皮组织细胞分化具有良好的促进作用，对于上皮组织细胞分化不足引起的皮肤类疾病具有良好的治疗效果。

实施例 7 代表化合物配制软膏外用的安全性实验

兔的皮肤对剌激性反应非常敏感，类似于人的皮肤反应，可用作药物体外局部施用的安全性及剌激作用实验。本实验旨在观察代表化合物配制的软膏外用对新西兰兔完好皮肤的毒副作用以及剌激反应。具体的实验主要步骤如下：

( 1 )将代表化合物 M-01、 M-07、 M-25用少量 DMSO溶解并配制成 0.5%的外用软膏，软膏基质为临床用标准羊毛脂基质；

(2)健康新西兰兔 9只（SPF级别），体重（2.5±0.2) kg。实验温度为 18°C〜20°C，每只动物分笼饲养； (3 ) 于给药前 24h将新西兰兔脊柱两侧脱毛，去毛面积为体表面积的 10% (约 120cm²),去毛后 24h检査去毛皮肤是否因去毛而受伤，受伤的皮肤不宜作完好皮肤的剌激性试验；

(4)每只兔脊柱左侧去毛区为空白软膏对照区，右侧为给药区。每日每只兔涂抹代表化合物配制软膏（对照区涂空白软膏） 1次，连续涂抹 2周，停药后再观察 1周。除观察并记录每日的红斑及水肿情况外，观察涂抹部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙等情况；

经记录观察，代表化合物 M-01、 M-07、 M-25配制软膏外用对新西兰兔无明显的毒性作用，对完好皮肤无任何剌激性反应，体外施用安全程度较高。

实施例 8 代表化合物的急性毒性实验

通过检査代表化合物的急性毒性数据，可以了解此类化合物的生物安全性。健康 ICR系小鼠 (SPF级别) 30只，体重 22-25克，随机分为 3个剂量组，每组 10只，雌雄各半。将代表化合物 M-01用少量 DMSO溶解并配制成不同浓度的溶液，经腹腔注射给药，按照 0.2ml/10g 体重来计算给药量，实验结果见表 5。结果表明，代表化合物 M-01的急性毒性值 LD₅₍₎ > 1.5g/kg，属低毒级，生物安全度较高。

表 5代表化合物 M-01的急性毒性实验数据。

实施例 9 代表化合物与 STAT3蛋白 SH2活性功能区域结合的对接模拟实验通过分子对接模拟实验，可以获得小分子与靶点蛋白活性功能区域的结合与直接相互作用信息。从 PDB公共数据库中（www.pdb.org)下载 STAT3蛋白的晶体结构 (PDB ID: 1BG1)。利用免费的分子对接程序 AutoDock 4.20，对接代表化合物 M-01和 STAT3 蛋白 (见图 5)。结果表明， M-01与 STAT3蛋白的 SH2活性功能区域有较好的结合，并且 M-01 结构中的不饱和顺式双键与 SH2区域的 Cys⁷¹²基团在有效接触范围内（3.8A)，容易发生迈克尔亲电反应。对接模拟实验进一步证实了代表化合物可以直接抑制并调节 STAT3蛋白。实施例 10 代表化合物对人骨髓瘤移植裸鼠的治疗在 6周龄的雄性裸鼠（BALB/cA-nu/nu) 的腹侧皮下接种 2 X 10⁷个人多发性骨髓瘤细胞 RPMI-8226。接种后，每隔 1天利用电子游标卡尺测定并计算 RPMI-8226荷瘤小鼠的肿瘤体积，观察体重变化。筛选肿瘤体积达到 100-250mm³的荷瘤小鼠，按照肿瘤体积进行分组，一组为 6只。代表化合物用 DMSO溶解，从给药开始日的 5天内，以 1天 1次每 kg体重 0.01ml进行腹腔注射给药。从代表化合物对 RPMI-8226荷瘤小鼠的肿瘤体积的影响来评价抗肿瘤的效果，结果如表 6所示，其中， T表示治疗组， C 表示空白对照组。 T/C为 (；化合物治疗组的 V/VoM空白对照组的 V/V( ，其中 V表示每测定日的小鼠肿瘤体积， V_Q表示给药开始日的小鼠肿瘤体积。表 6 代表化合物的抗肿瘤效果次死 1、:数

化物代

( m ku) ( 5人内）

对照组 100 0/6

M-01 80 31 0/6

M-07 95 25 0/6

M-18 80 68 0/6

M-20 85 47 0/6

M-21 85 62 0/6 M-22 100 49 0/6 结果表明，代表化合物具有优异的抗肿瘤效果。

实施例 11 代表化合物与伊马替尼联合使用对人肿瘤细胞株的影响

将人多发性骨髓瘤 ARH-77细胞株、人结直肠癌 HCT- 15细胞株、人早幼粒急性白血病 HL-60细胞株以每孔 6000个 /细胞接种在 96孔细胞培养板， 37 °C下培养 24小时。在对照组中，加入 0.5μΜ的伊马替尼或 0.02μΜ的代表化合物单独处理并培养。在实验组中，预先加入 0.02μΜ的代表化合物处理并培养 8小时，随后加入 0.5μΜ伊马替尼处理并培养。 72小时后，固定集落并以结晶紫染色，对集落数进行计数并统计。

表 7 与伊马替尼联合使用对人肿瘤细胞株的影响

结果表明， 0.5μΜ的伊马替尼或代表化合物单独处理三种肿瘤细胞株 72小时后的抑制率均低于 30%，而预先用 0.02μΜ较低剂量的代表化合物预先处理， 72小时候后对肿瘤细胞株的抑制率显著高于任一化合物单独使用的抑制率。这种组合效应显示了两者联用对于肿瘤细胞的良好抑制效果。因此，代表化合物增强了伊马替尼对于肿瘤细胞的抑制，代表化合物可以作为第二治疗剂与其他药物联用于肿瘤的临床治疗。

实施例 12代表化合物抑制临床感染常见细菌的实验

通过抑菌实验，可以观察代表化合物对于由各类细菌引起的常见临床感染的治疗效果。用 TSB肉汤琼脂斜面培养金黄色葡萄球菌 (菌株: ATCC25923)、肠道沙门氏菌 (菌株： ATCC14028)、屎肠球菌 (菌株： ATCC33 186)、肺炎克雷伯菌 (菌株： ATCC4352), 后用无菌水将菌落洗下，用 TSB肉汤培养基稀释，将 100 μ ΐ的稀释液加入 96孔板，将浓度控制在 10⁵个菌落单位 /每毫升。在实验组中，将代表化合物用少量 DMSO溶解并用 TSB肉汤溶液和 PBS溶液稀释至一定浓度。用排枪将 100 μ 1的化合物稀释溶液加入 96孔板的菌落孔，使得最终体积为 200μ1。将 96孔板在 37°C下孵育过夜，通过定量分光光度计记录浊度 (OD值；)，从而推算代表化合物的抑菌活性。在对照组中，将氨苄青霉素 (Amp)按照上述步骤操作，并通过定量分光光度计记录浊度 (OD值；)。在空白组中，通过定量分光光度计记录 DMSO和 PBS溶液加入菌落后的浊度 (OD值)， MIC 值的定义为抑制可见生长的最低浓度。

表 8显示了各代表化合物对屎肠球菌 (；菌株： ATCC33186)的最小抑制浓度 (MIC；)。如果 MIC≤l(^g/ml则活性标记为 'A'，如果 MIC为 10-5(^g/ml则标记为 'Β'，如果 MIC 大于 5(^g/ml则标记为' C'。

表 8代表化合物对屎肠球菌的抑菌试验 MIC值

表 9 显示了各代表化合物对肺炎克雷伯菌 (菌株： ATCC4352)的最小抑制浓度 (MIC)。如果 MIC≤l(^g/ml则活性标记为 'Α'，如果 MIC为 10-5(^g/ml则标记为 'Β'，如果 MIC大于 5(^g/ml则标记为' C'。

表 9代表化合物对肺炎克雷伯菌的抑菌试验 MIC值化合物活性化合物活性化合物活性化合物活性化合物活性 M-01 A M-06 C M-l l B M-16 A M-21 B

M-02 A M-07 A M-12 B M-17 B M-22 B

M-03 B M-08 A M-13 B M-18 C M-23 C

M-04 B M-09 B M-14 C M-19 B M-24 B

M-05 C M-10 B M-15 A M-20 A M-25 A 结果表明 (；参见表 8、表 9、图 7、图 8)，代表化合物对于金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌均具有较好的抑制活性，其抑菌活性与临床治疗常用的氨苄青霉素 (Amp)相当。

实施例 13 代表化合物在小鼠感染金黄色葡萄球菌败血症模型的治疗效果 4周龄的雄性 ICR小鼠 (SPF级别)共 30只。分为 1个对照组和 5个实验组，每组各 5只。每只动物腹膜内接种致死剂量的 4 X 10¹¹个菌落单位 /每毫升的金黄色葡萄球菌 (菌株: ATCC25923), 来模拟细菌感染所致的败血症模型。在实验组内，接种菌株的 2小时后，每只小鼠腹膜内注射 70mg/kg剂量的代表化合物 (少量 DMSO溶解)进行治疗。统计各组小鼠在治疗后第 3天的存活率，并制成表 10。

表疗

结果表明 (；参见表 10)，代表化合物对于小鼠感染金黄色葡萄球菌败血症模型具有较好的治疗效果。因此，代表化合物可以用于各类临床常见细菌感染的治疗。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

权利要求书

1、一种马来酰胺化合物，其为通式 (I)的化合物或其盐-

其中， X^P X₂独立地选自氢、氘、氚、卤素、取代的或未取代的 C1-C3烷基、取代的或未取代的 C1-C3烷氧基、氰基、羟基或巯基中的 1种，和独立地选自氢、氘、氚、卤素、取代的或未取代的 C1-C4烷基、取代的或未取代的 C1-C4烷氧基、氰基、羟基或巯基中的 1种， L n L₂独立地选自化学键、取代或未取代的 C1-C5直链垸基或者取代或未取代的 C1-C5支链烷基中的 1种， W P W₂独立地选自取代的芳基或未取代的芳基、取代或未取代的环垸基、 D-氨基酸组成的多肽、 L-氨基酸组成的多肽、 D-氨基酸和 L-氨基酸组成的多肽、氢原子中的 1种，双键的立体构型为顺式。
2、如权利要求 1所述的马来酰胺化合物，其特征在于，所述 X P X<sub>2</sub>独立地选自氢、氘、氚、卤素、取代的或未取代的甲基、取代的或未取代的甲氧基、氰基、羟基或巯基中的 1种，特别优选为氢、氘、氚、卤素或未取代的甲基中的 1种；

所述和独立地选自氢、氘、氚、卤素、取代的或未取代的甲基、取代的或未取代的乙基、取代的或未取代的甲氧基、取代的或未取代的乙氧基、氰基、羟基或巯基中的 1种，进一步优选为氢、卤素或未取代的甲基中的 1种，特别优选为氢；优选地，所述 W^n W₂独立地选自取代或未取代的芳基、 D-氨基酸组成的多肽、 L-氨基酸组成的多肽或者 D-氨基酸和 L-氨基酸组成的多肽中的 1种。
3、如权利要求 1或 2所述的马来酰胺化合物，其特征在于，所述 L P L<sub>2</sub>独立地选自化学键、未取代的 C1-C5直链垸基或者未取代的 C1-C5支链烷基中的 1种，特别 25

优选和 L₂都为化学键；

优选地，所述 D-氨基酸组成的多肽具有 1-10个 D-氨基酸，特别优选具有 1-5个 D-氨基酸；

优选地，所述 L-氨基酸组成的多肽具有 1-10个 L-氨基酸，特别优选具有 1-5个 L-氨基酸；

优选地，所述 D-氨基酸和 L-氨基酸组成的多肽为 1-10个 D-氨基酸和 1-10个 L- 氨基酸通过酰胺键组成的多肽，特别优选为 1-5个 D-氨基酸和 1-5个 L-氨基酸通过酰胺键组成的多肽；

优选地，所述马来酰胺化合物的盐为其药学上可接受的盐；优选地，所述马来酰胺化合物的药学上可接受的盐为酸加成盐、碱加成盐和 /或季铵盐；优选地，所述酸加成盐为马来酰胺化合物与无机酸形成的盐和 /或马来酰胺化合物与与有机酸形成的盐；优选地，所述马来酰胺化合物与无机酸形成的盐为盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硼酸盐、铬酸盐、碳酸盐、硼酸盐、亚硝酸盐、次氯酸盐、次溴酸盐或次碘酸盐中的 1种或至少 2种的组合；优选地，所述马来酰胺化合物与与有机酸形成的盐为醋酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、水杨酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐或苦杏酸盐中的 1种或至少 2种的组合。
4、一种如权利要求 1-3任一项所述的马来酰胺化合物的制备方法，其特征在于，所述马来酰胺化合物采用取代或未取代的马来酸酐与胺类反应得到。
5、如权利要求 4所述的方法，其特征在于，所述方法在有机溶剂中进行；优选地，所述有机溶剂为 THF、氯仿、 DMF或乙醚中的 1种或至少 2种的组合。
6、一种如权利要求 1-3任一项所述的马来酰胺化合物的用途，其特征在于，所述马来酰胺化合物用于制备治疗皮肤类疾病、细菌感染和 /或受 STAT3 蛋白调控的疾病 26

的药物。
7、如权利要求 6所述的用途，其特征在于，所述皮肤类疾病为银屑病、湿疹、特应性皮炎、白癜风、环状肉芽肿、荨麻疹、扁平疣、传染性软疣、疱疹、麻疹、风疹、皮肤瘙痒、传染性红斑、疥疮、鱼鳞病、腋臭、青春痘、毛囊炎、斑秃、脱发、雀斑、黄褐斑、尖锐湿疣、梅毒、淋病、非淋菌性尿道炎、手足口病、猩红热、水痘或皮肤创伤中的 1种或至少 2种的组合，特别优选为银屑病、湿疹、特应性皮炎、白癜风、尖锐湿疣或皮肤创伤中的 1种或至少 2种的组合；

优选地，所述皮肤创伤为擦伤、割伤、烫伤、烧伤、外科手术伤口或上皮组织溃疡中的 1种或至少 2种的组合；

优选地，所述上皮组织溃疡为细菌感染造成的上皮组织溃疡和 /或糖尿病造成的上皮组织溃疡；

优选地，所述细菌感染为细菌性乳腺炎、细菌性蜂窝织炎、细菌性肺炎、细菌性上呼吸道感染、肺结核、细菌性脑脓肿、细菌性脑膜炎、细菌性胆囊炎、细菌性胆管炎、脓胸、细菌性腹盆腔脓肿、细菌性尿路感染、中耳炎、心包炎、心内膜炎、败血症、脓毒血症、细菌性淋巴管炎、细菌性胰腺炎、细菌性阴道炎、手术后切口感染、手术后肺部感染、细菌性关节感染、细菌性食物中毒、烫伤样皮肤综合症、细菌性烧伤创面感染、细菌性中毒休克综合症、假膜性肠炎中或细菌性眼部感染中的 1种或至少 2种的组合，特别优选为细菌性肺炎、肺结核、败血症、手术后切口感染、细菌性食物中毒或细菌性烧伤创面感染中的 1种或至少 2种的组合。
8、如权利要求 6或 7所述的用途，其特征在于，所述受 STAT3蛋白调控的疾病为肿瘤和 /或自身免疫性疾病；

优选地，所述自身免疫性疾病为多发性硬化、风湿性关节炎、移植物对抗宿主反应、系统性红斑狼疮、免疫性溶血性贫血、桥本氏甲状腺炎、 I 型糖尿病、过敏性哮 27

喘、系统性脉管炎、重症肌无力、格雷夫斯病、胆汁性肝硬化或膜性肾小球肾炎中的

1种或至少 2种的组合，特别优选为多发性硬化、风湿性关节炎、移植物对抗宿主反应或系统性红斑狼疮中的 1种或至少 2种的组合。
9、如权利要求 8所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为血液肿瘤和 /或实体肿瘤，特别优选为急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性早幼粒白血病、 B-细胞淋巴瘤、 T-细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、喉癌、宫颈癌、食道癌、甲状腺癌、卵巢癌、睾丸癌、神经胶质瘤或黑色素瘤中的 1种或至少 2种的组合。
10、如权利要求 6-9任一项所述的用途，其特征在于，所述药物的施用方式为体外局部施用、全身经皮给药、口服、喷雾吸入给药、舌下给药、直肠灌注给药和 /或注射给药，进一步优选为体外局部施用、口服和 /或注射给药；

优选地，所述药物还含有载体基质；优选地，所述载体基质为聚乙二醇、凡士林、石蜡、硅油、硅酮、蜂蜡、硬脂酸、羊毛脂、甘油明胶、透皮渗透剂、悬浮剂、乳化剂、纳米载体、防腐剂、芳香剂或着色剂中的 1种或至少 2种的组合；

优选地，所述药物为软膏、无菌溶液剂、无菌混悬剂、片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、霜剂、洗剂、喷雾或凝胶形式。