CN108164520A - 缺氧抑制剂与抗肿瘤药物的偶联化合物及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一类缺氧抑制剂与抗肿瘤药物反应形成的偶联化合物，其中，抗肿瘤药物分别为谷胱甘肽巯基转移酶抑制剂NBDHEX、上市抗肿瘤药物伊立替康和上市抗肿瘤药物吉西他滨，该类偶联化合物的结构式分别如式I、式II和式Ⅲ所示；本发明还提供了该类偶联化合物的制备方法及其在抗肿瘤药物制备中的应用。

Description

缺氧抑制剂与抗肿瘤药物的偶联化合物及其制备和应用
技术领域
本发明涉及药物化合物及其制备与应用，尤其涉及一类缺氧抑制剂3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物与抗肿瘤药物活性化合物反应得到的偶联化合物；本发明还涉及该类偶联化合物的制备方法及其在抗肿瘤药物制备中的应用。
背景技术
化疗是指利用药物输注或口服来杀伤肿瘤的全身治疗，是大多数癌症患者所不可或缺的选择。然而临床研究表明，化疗药物抵抗是导致多种恶性实体瘤治疗失败的主要原因；相关数据表明缺氧细胞比正常细胞更容易引起化疗和放疗的抵抗，而缺氧只存于恶性实体瘤中，在正常组织中基本不存在；肿瘤缺氧是由于肿瘤细胞增值过程中氧气供应和氧气需求之间的不平衡引起的,大约50％的恶性实体瘤存在肿瘤缺氧区域；缺氧会加快恶性实体瘤的增殖和生长速度,增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力,诱发肿瘤对化疗药物的耐药，导致肿瘤预后不良。
现有技术中，借助纳米技术，采用聚乙二醇、脂质体或无机等纳米材料，可将化疗药物包裹起来，然后通过肿瘤微环境再把纳米粒子负载或胶囊包裹的化疗药物释放到肿瘤缺氧组织。然而，这些纳米材料载药量一般都低于10％,另外所采用的纳米材料大多也没有生物活性，而且在代谢过程中会造成肝脏和肾脏等器官的毒性。近年来的研究发现，缺氧诱导因子HIF-1α在实体肿瘤中普遍高度表达，其表达水平与肿瘤细胞对化疗药物抵抗直接相关，是预测肿瘤治疗效果的可靠指标。鉴于HIF-1α在恶性肿瘤增长和演变中的重要作用，以HIF-1α为靶标的肿瘤治疗手段已经成为克服肿瘤缺氧的研究热点之一；因此，将HIF-1α抑制剂通过化学反应引入到化疗药物中是克服肿瘤缺氧的一种有效的途径。作为缺氧抑制剂的3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑，除能特异性抑制HIF-1α外，还被证明对多种实体瘤例如胰腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌等具有良好的抗血管新生活性及肿瘤治疗活性,并且呈现剂量依赖性；文献(Cancer Research and Clinic, 2008,Vol.20,76-86)公开了一种缺氧诱导因子HIF-1α抑制剂，即3-(5’-羟甲基 -2’-呋喃基)-苯甲基吲唑和放疗联合治疗肿瘤的治疗手段，但是放疗容易引起放射性皮炎、放射性食管炎以及食欲下降、恶心、呕吐、腹痛、腹泻或便秘等诸多毒副反应，造成的损伤经常是不可逆的，治疗周期结束后，不可重复，一般不作为肿瘤治疗方案中的首选。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一类缺氧抑制剂3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物与抗肿瘤药物活性化合物反应形成的偶联化合物；本发明的第二目的是提供该类偶联化合物的制备方法；本发明的第三目的是提供该偶联化合物在抗肿瘤药物制备中的应用。
技术方案：一种偶联化合物，简称偶联化合物7，为3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)- 苯甲基吲唑的衍生物与谷胱甘肽巯基转移酶抑制剂NBDHEX反应形成的的偶联化合物，其结构如式I所示；
其中，3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物的结构如式Ⅵ所示；
谷胱甘肽巯基转移酶抑制剂NBDHEX的结构如式Ⅶ所示，
一种偶联化合物，简称偶联化合物8，为3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物与伊立替康反应形成的的偶联化合物，其结构如式II所示。
其中，3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物的结构如式VI所示；伊立替康的结构如式Ⅷ所示，
一种偶联化合物，简称偶联化合物6，为3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物与吉西他滨反应形成的的偶联化合物，其结构如式Ⅲ所示；
其中，3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物化学结构式如式VI所示；吉西他滨的化学结构式如式Ⅸ所示，
其中，所述伊立替康为上市抗肿瘤药物伊立替康的活性化合物；所述吉西他滨为上市抗肿瘤药物吉西他滨的活性化合物。
一种偶联化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1当量3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物加入二甲基甲酰胺(DMF)中,得到溶液A；
(2)将1.5当量的O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)作为偶联试剂和1.5当量的三乙胺(Et3N)加入到步骤(1)得到的溶液A中，得到反应液B；
(3)然后将1当量的谷胱甘肽巯基转移酶抑制剂NBDHEX或伊立替康加入到步骤(2)得到的反应液B中，得到反应液C；
(4)将步骤(3)得到的反应液C在30～50℃下搅拌24小时，减压除去溶剂，得到浓缩液，浓缩液经硅胶柱层析纯化，得到所述偶联化合物。
其中，步骤(3)中的硅胶柱层析纯化中使用的洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合溶液或者二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶液；优选地，二氯甲烷和甲醇的比例为 80:1；二氯甲烷和乙酸乙酯比例为30:1。
一种偶联化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1当量3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物加入二甲基甲酰胺(DMF)中,得到溶液A；
(2)将1.5当量的O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸作为偶联试剂(TBTU)和1.5当量的三乙胺(Et3N)加入到步骤(1)得到的溶液A中,得到反应液B；
(3)然后将1当量的吉西他滨中间体加入到步骤(2)得到的反应液B中，得到反应液C；
(4)将步骤(3)得到的反应液C在30～50℃下搅拌24小时，减压除去溶剂，得到浓缩液，浓缩液经硅胶柱层析纯化，得到偶联化合物的中间体。
(5)将步骤(4)得到的偶联化合物的中间体溶于四氢呋喃溶剂(THF)中，在0℃下加入三氟乙酸，然后移去冰浴，室温下反应，待反应结束后，使用饱和碳酸氢钠溶液调节反应液pH值至8，加入二氯甲烷，洗涤，有机相使用无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，得到浓缩液，浓缩液经硅胶柱层析纯化，洗脱液为乙酸乙酯和甲醇的混合溶液，得到所述偶联化合物。
其中，步骤(3)中使用吉西他滨中间体的目的是：由于吉西他滨拥有多个反应位点，需要将相关的氨基和羟基保护才能与3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物反应，因此按照文献方法，制备了所述的吉西他滨中间体。
步骤(5)的目的是：除去所述偶联化合物的中间体中相应的Boc保护基团。
优选地，步骤(5)中的反应时间为2小时；洗涤使用水洗，洗涤次数为2 次。
进一步地，步骤(3)中化合物吉西他滨中间体如式Ⅳ所示。
进一步地，步骤(4)中的偶联化合物的中间体，简称偶联化合物10，其结构如式Ⅴ所示。
其中，式Ⅳ和式Ⅴ中的基团Boc为叔丁氧羰基，进一步地，步骤(4)中的偶联化合物的中间体为3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物与吉西他滨中间体反应得到的偶联化合物的中间体。
该类偶联化合物在抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述的抗肿瘤药物为克服实体瘤缺氧的抗肿瘤药物。
进一步地，所述的肿瘤或癌症包括肺癌、卵巢癌和骨肉瘤。
有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点为：偶联化合物8如同其母体化合物缺氧诱导因子HIF-1α抑制剂一样，在缺氧条件下可以明显抑制HIF-1α蛋白，HIF-1α抑制剂和伊立替康的混合物抑制HIF-1α蛋白的能力弱于HIF-1α抑制剂和偶联化合物8，而单独的伊立替康则没有此性质。这些结果表明，HIF-1α抑制剂的衍生物与抗肿瘤药物反应形成的偶联物具有抑制缺氧诱导因子HIF-1α的能力。
同时，无论在常氧和缺氧条件下，偶联化合物6～8都显示良好的抗肿瘤活性。
其中，偶联化合物6对于人肺癌细胞A549，其IC50值在常氧条件下和缺氧条件下相对于吉西他滨分别降低了14.4倍和2.4倍；在常氧条件下，偶联化合物 6对卵巢癌细胞A2780的细胞毒活性相对于吉西他滨提高了6.7倍；但在缺氧条件下，偶联化合物6的细胞毒活性相对于吉西他滨提高了10.4倍。
在常氧条件下，偶联化合物7对所测的三株肿瘤细胞：人肺癌细胞A549、卵巢癌细胞A2780和骨肉瘤细胞U2-OS的IC50值都高于其母体化合物 NBDHEX；但在缺氧条件下，偶联化合物7对骨肉瘤细胞U2-OS的细胞毒活性相对于常氧条件下提高了25.7倍，并且相对于NBDHEX提高了16.3倍；此外，在A549细胞中也可以观察到类似的趋势；值得注意的是，NBDHEX对所测三株肿瘤细胞的细胞毒活性在缺氧条件下明显低于常氧条件下，其抗肿瘤活性在缺氧条件下都低于偶联化合物7。
无论在常氧或缺氧下，偶联化合物8相对于其母体化合物伊立替康显示出了强的抗肿瘤活性。在常氧条件下，偶联化合物8对人肺癌细胞A549细胞的细胞毒活性相对于伊立替康提高了1.6倍；而在缺氧条件下，偶联化合物8的细胞毒活性相对于伊立替康则提高了5.7倍。值得注意的是，在缺氧条件下，伊立替康对人肺癌细胞A549细胞的细胞毒活性相比其在常氧条件下出现了显著的下降, 而偶联化合物8对A549细胞的细胞毒活性在缺氧与常氧条件下基本相当。
以上结果表明,这些肿瘤细胞在缺氧的条件下对现有药物表现出明显的抗药性，而将缺氧诱导因子HIF-1α抑制剂的衍生物与抗肿瘤药物偶联，能够显著提高化疗药物在缺氧条件下的抗肿瘤活性,进而能有效的克服肿瘤缺氧这一缺陷。
另外，体内抗肿瘤活性的实验数据表明，等质量剂量偶联化合物8的抑瘤率(35.84％)与等质量剂量伊立替康的抑瘤率(36.18％)相当,而等摩尔剂量偶联化合物8的抑瘤率(51.19％)显著高于等摩尔剂量伊立替康的抑瘤率(36.18％)。此外,偶联化合物8和伊立替康对受试动物体重几乎都没有明显的影响。结果表明，偶联化合物8可有效抑制肿瘤生长，在等摩尔剂量下表现出显著优于伊立替康的体内抗肿瘤活性。
附图说明
图1A为偶联化合物8对人肺癌细胞A549裸鼠通过尾静脉给药之后代表性动物和肿瘤的实体照片；
图1B为偶联化合物8对受试动物体重影响的实验结果图；
图2A为偶联化合物8对人肺癌细胞A549裸鼠异种移植肿瘤体积增长影响的实验结果图；
图2B为偶联化合物8对人肺癌细胞A549裸鼠异种移植肿瘤重量增长影响的实验结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地说明。除特别指出的以外，本发明所用原料及试剂等均可以通过常规商业购买或通过现有技术制备获得。其中，原料药吉西他滨和伊立替康盐酸盐购自江苏豪森药业股份有限公司；缺氧抑制剂3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑参照文献Bioorg.Med.Chem.Lett.,2011, 21,6297-6300制备；3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物参照文献Chem. Commun.,2017,53,3749-3752制备；谷胱甘肽巯基转移酶抑制剂NBDHEX参照文献J.Biol.Chem.,2005,280，26397-26405制备；吉西他滨中间体参照文献 Bioconjugate Chem.,2016,27,1564-1568制备。
实施例1：偶联化合物7的制备
将200mg(0.495mmol)的3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物溶解在2mL干燥二甲基甲酰胺(DMF)中,然后将238mg(0.743mmol)的O- 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和75mg(0.743mmol)的三乙胺(Et3N)加入反应液中,随即加入147mg(0.495mmol)的NBDHEX,将油浴升温至30℃搅拌过夜,然后用TLC板检测反应,待反应结束后减压除去 DMF,加入100mL二氯甲烷溶解初产物,用饱和食盐水洗涤两次,有机相用无水硫酸钠干燥4小时,然后减压除去溶剂。将所得的粗产物用硅胶层析柱纯化, 洗脱剂为体积比为50:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液得到220mg黄色固体产物, 产率为65.1％。
所得产物的核磁氢谱和碳谱结果为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm) 8.41(d,J＝8.0Hz,1H),8.13(d,J＝8.5Hz,1H),7.51(d,J＝8.2Hz,1H),7.42(t,J＝ 8.0Hz,1H),7.28–7.21(m,6H),7.17(d,J＝8.5Hz,1H),6.94(d,J＝3.3Hz,1H), 6.64(d,J＝3.3Hz,1H),5.66(s,2H),5.24(s,2H),3.69(t,J＝6.4Hz,2H),3.29(d,J ＝7.3Hz,2H),2.65(d,J＝6.0Hz,4H),1.89(t,J＝7.5Hz,2H),1.65–1.40(m, 6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm)173.76,172.38,149.55,149.02,143.15, 140.80,140.50,137.75,135.48,132.80,129.07,128.04,127.73,127.40,126.89, 126.71,122.62,122.16,121.50,120.75,113.21,110.76,108.42,61.04,58.27,52.45, 32.80,31.09,29.09,29.07,28.58,27.95,25.48.；
所得产物的电喷雾质谱结果为：MS(m/z)(ESI):[M+H]+:684.2；即如式I所示。
实施例2：偶联化合物8的制备
将200mg(0.495mmol)的3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物溶解在2mL干燥二甲基甲酰胺(DMF)中,然后将238mg(0.743mmol)的O- 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和75mg(0.743mmol)的三乙胺(Et3N)加入反应液中，随即加入308mg(0.495mmol)伊立替康,将油浴升温至30℃搅拌过夜,然后用TLC板检测反应,待反应结束后减压除去DMF, 加入100mL二氯甲烷溶解初产物,用饱和食盐水洗涤两次,有机相用无水硫酸钠干燥4小时,然后将减压除去溶剂。将所得的粗产物用硅胶层析柱纯化,洗脱剂为体积比为80:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液得到黄色固体产物304mg,产率为63.2％。
所得产物的核磁氢谱和碳谱结果为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.11 (d,J＝9.2Hz,1H),7.88(d,J＝8.2Hz,1H),7.69(d,J＝2.4Hz,1H),7.48–7.45(m, 1H),7.28–7.24(m,2H),7.21–7.15(m,4H),7.15–7.06(m,3H),6.68(d,J＝3.4 Hz,1H),6.38(d,J＝3.4Hz,1H),5.59(d,J＝17.1Hz,1H),5.54(s,2H),5.30(d,J＝ 17.1Hz,1H),5.22–4.96(m,4H),4.36–4.25(m,2H),3.02–2.88(m,3H),2.87– 2.71(m,3H),2.69–2.58(m,2H),2.54–2.42(m,4H),2.19–2.14(m,1H),2.07– 2.01(m,1H),1.88(s,2H),1.58–1.55(m,5H),1.40(d,J＝4.9Hz,2H),1.25(t,J＝ 7.6Hz,3H),1.18(s,2H),0.89(t,J＝7.5Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ (ppm)171.60,171.23,167.48,157.35,153.11,151.47,150.38,149.41,148.83,147.07,146.79,146.08,145.19,140.46,136.58,135.94,131.53,128.72,127.80,127.48,127.15,127.06,126.88,125.84,121.67,121.55,121.31,119.59,114.49,112.41,109.52,107.58,96.23,76.33,67.02,62.33,58.71,53.18,50.26,49.24,44.40,44.08,31.72,29.69,28.94,28.89,28.25,27.57,26.15,24.59,23.03,13.93,7.60.
所得产物的电喷雾质谱结果为：MS(m/z)(ESI):[M+H+]:973.4；即如式II所示。
实施例3：偶联化合物10的制备
将200mg(0.495mmol)的3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物溶解在2mL干燥二甲基甲酰胺(DMF)中,然后将238mg(0.743mmol)的O- 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和75mg(0.743mmol)的三乙胺(Et3N)加入反应液中，随即加入279mg(0.495mmol)的吉西他滨中间体,将油浴升温至50℃搅拌过夜,然后用TLC板检测反应,待反应结束后减压除去DMF,加入100mL二氯甲烷溶解初产物,用饱和食盐水洗涤两次,有机相用无水硫酸钠干燥4小时,然后减压除去溶剂。将所得的粗产物用硅胶层析柱纯化,洗脱剂为体积比为30:1的二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液，得到白色固体产物270mg,产率为57.5％。
所得产物的核磁氢谱和碳谱结果为：1HNMR(300MHz,Methanol-d4)δ8.28 (d,J＝3.6Hz,1H),8.14(d,J＝8.2Hz,1H),7.52(d,J＝8.5Hz,1H),7.42(t,J＝7.6 Hz,1H),7.26(dd,J＝13.5,7.6Hz,6H),7.00(d,J＝2.5Hz,1H),6.95(d,J＝3.3Hz, 1H),6.64(d,J＝3.3Hz,1H),6.29–6.23(m,1H),5.66(s,2H),5.24(s,2H),5.21– 5.18(m,1H),4.28–4.16(m,1H),3.78(dd,J＝5.2,1.8Hz,1H),3.70(dd,J＝5.2, 1.8Hz,1H),2.65(s,4H),1.48(s,18H),1.44(s,9H)；
所得产物的电喷雾质谱结果为：MS(m/z)(ESI):[M+H]+:950.4；即如式V所示。
实施例4：偶联化合物6的制备
将200mg(0.210mmol)的偶联化合物10溶解在10mL四氢呋喃(THF)中,在 0℃下缓慢滴加2mL三氟乙酸,然后将反应液在室温下搅拌2小时。用TLC板检测反应,待反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液将pH值调到8.0,加入200mL水,用二氯甲烷萃取,有机相再用饱和食盐水洗涤两次,然后用无水硫酸钠干燥4小时，减压除去溶剂。将所得的粗产物用硅胶层析柱纯化,洗脱剂为体积比为50:1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶液，得到白色固体产物77mg,产率为56.8％。
所得产物的核磁氢谱和碳谱结果为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm) 8.29(d,J＝7.9Hz,1H),8.13(d,J＝8.2Hz,1H),7.52(d,J＝8.5Hz,1H),7.42(d,J ＝8.2Hz,1H),7.28–7.21(m,6H),7.01(d,J＝3.4Hz,1H),6.94(d,J＝3.4Hz,1H), 6.63(d,J＝7.9Hz,1H),6.25(t,J＝3.4Hz,1H),5.66(s,2H),5.24(s,2H),5.20(t,J ＝7.9Hz,1H),4.54(s,1H),4.20(d,J＝8.2Hz,1H),3.77(t,J＝7.8,1H),3.69(dd,J ＝7.8,5.4Hz,1H),2.66–2.64(m,4H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm) 173.79,172.40,160.08,149.53,149.00,147.65,143.74,140.79,137.76,135.46, 129.07,128.04,127.72,127.41,126.45,122.17,121.50,120.72,113.25,110.77, 108.43,95.21,92.91,81.90,79.86,59.14,58.27,52.43,29.08,29.05；
所得产物的电喷雾质谱结果为：MS(m/z)(ESI):[M+H]+:650.6；即如式III 所示。
实施例5：偶联化合物8抑制缺氧诱导因子HIF-1α蛋白的检测
人肺癌A549细胞经药物作用后，在缺氧条件下培养一定时间，进行Western Blot实验检测细胞内HIF-1α蛋白的表达水平：用PBS缓冲液冲洗细胞3次，用裂解液消化15分钟，超声分散。溶解产物与标准溶液(50mM Tris,pH 7.4,4％SDS, 10％甘油,4％2-巯基乙醇,50μg/mL溴酚蓝)4:1混合后，煮沸5min。用变性后的溶解物进行SDS凝胶电泳后，转移至PVDF膜(GE Healthcare Buckinghamshire, UK)。使用anti-HIF-1α(BD TransductionLaboratories,Lexington,KY)抗体免疫印迹后，加入辣根过氧化酶耦联的二级抗体，条带用EcL化学发光试剂盒(GE Healthcare)处理，用ChemiDoc XRS System(Bio-Rad,Hercules,CA)成像。
Western Blot实验(Western Bolt实验检测A549细胞内HIF-1α蛋白表达水平；1％O2下，药物浓度为20μM,作用时间为24h，GAPDH为内参)结果表明：偶联化合物8如同其母体化合物缺氧诱导因子HIF-1α抑制剂(3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑)一样，在缺氧条件下可以明显抑制HIF-1α蛋白，HIF-1α抑制剂和伊立替康的混合物抑制HIF-1α蛋白的能力弱于HIF-1α抑制剂和偶联化合物8，而单独的伊立替康则没有此性质。这些结果表明，HIF-1α抑制剂的衍生物与抗肿瘤药物反应形成的偶联物具有抑制缺氧诱导因子HIF-1α的能力。
实施例6：偶联化合物6的体外细胞毒活性测试
MTT法：取对数生长期的细胞计数,接种于96孔培养板内,每个孔的细胞约5×104个。将细胞在培养箱中过夜培养,待细胞贴壁后进行给药,分别设给药组,阳性对照组和阴性对照组。将待测的化合物用PBS或DMSO配制成贮液,在临用前用细胞培养基稀释成一系列浓度，其中DMSO的终浓度不超过4‰。每个浓度设5个复孔。加药后继续在培养箱中培养72小时，加10μL浓度为5mg/mL 的MTT，37℃孵育4小时，去除上清液,加入100μL的DMSO溶解甲瓒。用酶标仪在490nm波长下测定每孔的OD值。
在常氧或缺氧条件下，采用MTT方法测试了偶联化合物6对人肺癌细胞 A549、卵巢癌细胞A2780的体外抗肿瘤活性,HIF-1α抑制剂(3-(5’-羟甲基-2’- 呋喃基)-苯甲基吲唑)和吉西他滨作为阳性对照药物。
其中，常氧条件为：37℃，20％O2、5％CO2和75％N2；缺氧条件为：37℃， 1％O2、5％CO2和94％N2。观察待测化合物在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况,计算抑制率及其IC50值来评价药物的细胞毒活性，实验结果见表1。
表1.在常氧或缺氧下偶联化合物6的细胞毒活性
实施例7：偶联化合物7的体外细胞毒活性测试
MTT法：取对数生长期的细胞计数,接种于96孔培养板内,每个孔的细胞约5×104个。将细胞在培养箱中过夜培养,待细胞贴壁后进行给药,分别设给药组,阳性对照组和阴性对照组。将待测的化合物用PBS或DMSO配制成贮液,在临用前用细胞培养基稀释成一系列浓度,其中DMSO的终浓度不超过4‰。每个浓度设5个复孔。加药后继续在培养箱中培养72小时，加10μL浓度为5mg/mL 的MTT，37℃孵育4小时，去除上清液,加入100μL的DMSO溶解甲瓒。用酶标仪在490nm波长下测定每孔的OD值。
在常氧或缺氧条件下,采用MTT方法测试了偶联化合物7对人肺癌细胞 A549、卵巢癌细胞A2780、骨肉瘤细胞U2-OS的体外抗肿瘤活性，HIF-1α抑制剂(3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑)和化合物NBDHEX分别作为阳性对照药物。
其中，常氧条件为：37℃，20％O2、5％CO2和75％N2；缺氧条件为：37℃， 1％O2、5％CO2和94％N2。观察待测化合物在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况,计算抑制率及其IC50值来评价药物的细胞毒活性，实验结果见表2。
表2.在常氧或缺氧条件下偶联化合物7的细胞毒活性
实施例8：偶联化合物8的体外细胞毒活性测试
MTT法：取对数生长期的细胞计数,接种于96孔培养板内,每个孔的细胞约5×104个。将细胞在培养箱中过夜培养,待细胞贴壁后进行给药,分别设给药组,阳性对照组和阴性对照组。将待测的化合物用PBS或DMSO配制成贮液,在临用前用细胞培养基稀释成一系列浓度,其中DMSO的终浓度不超过4‰。每个浓度设5个复孔。加药后继续在培养箱中培养72小时，加10μL浓度为5mg/mL 的MTT，37℃孵育4小时，去除上清液,加入100μL的DMSO溶解甲瓒。用酶标仪在490nm波长下测定每孔的OD值。
在常氧或缺氧条件下,采用MTT方法测试了偶联化合物8对人肺癌细胞 A549的体外抗肿瘤活性,HIF-1α抑制剂(3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑) 和伊立替康分别作为阳性对照药物。
其中，常氧条件为：37℃，20％O2、5％CO2和75％N2；缺氧条件为：37℃， 1％O2、5％CO2和94％N2。观察待测化合物在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况,计算抑制率及其IC50值来评价药物的细胞毒活性，实验结果见表3。
表3.在常氧或缺氧条件下偶联化合物8的细胞毒活性
实施例9：偶联化合物8的体内抗肿瘤活性测试
采用由南京大学-南京生物医药研究院提供的BALB/c裸小鼠,实验动物生产许可证：SCXK(苏)2015-0001,合格证编号：201706658,实验动物使用许可证： SYXK(苏)2011-0036。日龄：6w,体重：22-25g,性别：雄性，动物数：每组5只，共20只。
接种方式为：收集培养的人肺癌A549细胞悬液，浓度为5×106个/ml,以每只0.1ml接种于裸小鼠背部皮下。裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径,接种 19天后,肿瘤生长至100mm3时将动物随机分组,每组5只。同时各组裸鼠开始给药。
给药方式为：尾静脉注射受试样品，每三天一次,共给药9次，采用的药物及试剂分为三组，分别为：0.1ml/10g生理盐水、10mg/kg用生理盐水溶解的伊立替康、10mg/kg用DMSO溶解的3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物与伊立替康的偶联化合物(简称伊立替康偶联物)、15.6mg/kg用DMSO溶解的伊立替康偶联物，评价其对人肺癌细胞A549裸鼠异种移植肿瘤生长有无抑制作用及作用强度；给药结束后，使用测量瘤径的方法,动态观察受试样品的抗肿瘤疗效。实验结束后,随即处死裸鼠,手术剥取瘤块称重。
肿瘤体积(Tumor Volume,TV)的计算公式为：TV＝1/2ab2,其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(Relative Tumor Volume,RTV),计算公式为：
RTV＝Vt/V0,其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积,Vt为每一次测量时的肿瘤体积。
抗肿瘤活性的评价指标：相对肿瘤增殖率T/C(％),计算公式如下：
其中,TRTV：治疗组RTV；CRTV：模型组RTV。
抗肿瘤活性的评价指标：肿瘤生长抑制率(％),计算公式如下：
偶联化合物8的体内抗肿瘤活性测试结果详见附图1A、1B、2A和2B。
附图2A、2B和偶联化合物8对人肺癌细胞A549裸鼠异种移植肿瘤的平均抑制率(P<0.05)的数据表明，等质量剂量偶联化合物8的抑瘤率(Tumor inhibitory rate)(35.84％)与等质量剂量伊立替康的抑瘤率(36.18％)相当,而等摩尔剂量偶联化合物8的抑瘤率(51.19％)显著高于等摩尔剂量伊立替康的抑瘤率(36.18％)。此外,附图1B的数据表明，偶联化合物8和伊立替康对受试动物体重(Body Weight)几乎都没有明显的影响。结果表明，偶联化合物8可有效抑制肿瘤生长，在等摩尔剂量下表现出显著优于伊立替康的体内抗肿瘤活性。

Claims (10)

1.一种偶联化合物，其特征在于：为3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物与谷胱甘肽巯基转移酶抑制剂NBDHEX反应形成的偶联化合物，其结构如式I所示。
2.一种偶联化合物，其特征在于：为3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物与伊立替康反应形成的偶联化合物，其结构如式II所示。
3.一种偶联化合物，其特征在于：为3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物与吉西他滨中间体反应形成的偶联化合物，其结构如式Ⅲ所示。
4.权利要求1～2中所述的一种偶联化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将1当量3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物加入二甲基甲酰胺中,得到溶液A；
(2)将1.5当量的O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸作为偶联试剂和1.5当量的三乙胺加入到步骤(1)得到的溶液A中，得到反应液B；
(3)然后将1当量的谷胱甘肽巯基转移酶抑制剂NBDHEX或伊立替康加入到步骤(2)得到的反应液B中，得到反应液C；
(4)将步骤(3)得到的反应液C在30～50℃下搅拌24小时，减压得到浓缩液，经硅胶柱层析纯化，得到所述偶联化合物。
5.权利要求3中所述的一种偶联化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将1当量3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-苯甲基吲唑的衍生物加入二甲基甲酰胺中,得到溶液A；
(2)将1.5当量的O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸作为偶联试剂和1.5当量的三乙胺加入到步骤(1)得到的溶液A中,得到反应液B；
(3)然后将1当量的吉西他滨中间体加入到步骤(2)得到的反应液B中，得到反应液C；
(4)将步骤(3)得到的反应液C在30～50℃下搅拌24小时，减压得到浓缩液，经硅胶柱层析纯化，得到偶联化合物的中间体。
(5)将步骤(4)得到的偶联化合物的中间体溶于四氢呋喃溶剂中，在0℃下加入三氟乙酸，室温下反应，待反应结束后，使用饱和碳酸氢钠溶液调节反应液pH值至8，加入二氯甲烷，洗涤，有机相使用无水硫酸钠干燥后，减压得到浓缩液，经硅胶柱层析纯化，洗脱液为乙酸乙酯和甲醇的混合溶液，得到所述偶联化合物。
6.根据权利要求5中所述的一种偶联化合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中的吉西他滨中间体的结构如式Ⅳ所示。
7.根据权利要求5中所述的一种偶联化合物的制备方法，其特征在于：步骤(4)中的偶联化合物的中间体的结构如式Ⅴ所示。
8.权利要求1～3中所述的偶联化合物在抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的偶联化合物在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的抗肿瘤药物为克服实体瘤缺氧的抗肿瘤药物。
10.根据权利要求8或9所述的偶联化合物在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤包括肺癌、卵巢癌和骨肉瘤。
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