CN102627685A

CN102627685A - 一氧化氮供体型谷胱甘肽类化合物、其制备方法及医药用途

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Publication number: CN102627685A
Application number: CN2012100805656A
Authority: CN
Inventors: 黄张建; 张奕华; 爱德华·克瑙斯; 赖宜生; 彭司勋
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2012-03-26
Filing date: 2012-03-26
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2032-03-26
Also published as: CN102627685B

Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及通式I所示的O²-磺酰基乙基偶氮鎓二醇盐修饰的谷胱甘肽类化合物或其药学上可接受的盐或酯、它们的制备方法、含有这些化合物的药用组合物及其医药用途，特别是在制备抗肿瘤药物中的应用。药理实验结果表明，该类化合物具有良好的抗肿瘤活性，临床上可用于制备抗肿瘤药物。

Description

一氧化氮供体型谷胱甘肽类化合物、其制备方法及医药用途

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及一类O²-磺酰基乙基偶氮鎓二醇盐修饰的谷胱甘肽类化合物或其药学上可接受的盐或酯、它们的制备方法、含有这些化合物的药用组合物以及它们的医药用途，特别是在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤是一种常见的重大疾病，严重威胁人类的身体健康和生命安全。临床上虽有多种抗肿瘤药物，但由于肿瘤病理因素的复杂性、肿瘤的耐药性及抗肿瘤药物的毒副作用等原因，现有的药物仍然不能满足临床需要。因此，寻找疗效突出、靶向性作用强和毒副作用低的新型抗肿瘤药物具有重要意义。

谷胱甘肽S转移酶(GST)是一个同源二聚体酶的超基因家族，属II相代谢酶系，广泛分布于各种生物体内。人胞质GST具有基因多态性，它们根据基因结构的不同又具体分为A，M，P，T，S，K，Z和O等类别。细胞内的GST和谷胱甘肽(glutathione，GSH)系统是药物解毒作用的关键。GST能催化还原型GSH亲核进攻带有亲电的C、N或者S原子的非极性分子，形成一种水溶性更高、更易排泄的复合物，使底物利于从胆汁中或经肾脏排泄。在GST各个亚型种，GST-P与肿瘤的关系极为密切。在许多肿瘤组织中，90％以上有活性的GSTs为GST-P。此外，GST-P与肿瘤的耐药性关系非常密切(肿瘤防治杂志，2005，12，95-98)。因此，以GST-P为靶点的抗肿瘤药物研究具有良好的应用前景。

一氧化氮(NO)作为信使物质或效应分子在体内发挥极其重要的生理功能，NO生成不足或NO信号传导异常与多种疾病的形成和发展密切相关。其中NO在肿瘤的发生、发展和死亡中的作用已成为肿瘤生物学研究的热点之一。大量的研究表明，持续低浓度的NO可以促进肿瘤细胞的生长，而高浓度的NO则产生抗肿瘤作用(Free Radic.Biol.Med.，2004，37，745-752)。NO供体偶氮鎓二醇盐(diazen-1-ium-1，2-diolate，其中与氮鎓离子相连的O称之为O¹，与烯键氮原子相连的O为O²)能在生理条件下快速释放高浓度NO(一分子偶氮鎓二醇盐可释放两分子NO，其半衰期为数秒到数小时不等)，因此在抗肿瘤方面具有潜在应用价值，但需要解决的关键问题是如何控制偶氮鎓二醇盐在肿瘤部位靶向性释放NO。

偶氮鎓二醇盐

发明内容

基于GST-P在肿瘤细胞中过度表达，本发明以其底物谷胱甘肽为先导物，设计、合成了一系列结构新颖的O²-磺酰基乙基偶氮鎓二醇盐修饰的谷胱甘肽类化合物。实验结果表明，本发明化合物可以被GST-P活化和降解，释放NO，从而产生抗肿瘤作用。

本发明公开了通式I所示的化合物或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或外消旋混合物，或其药学上可接受的盐或酯：

其中：

R₁和R₂各自独立地代表氢原子、C₁-C₁₀直链或支链烷基、(C₁-C₁₀直链或支链亚烷基)-Q，其中Q代表羟基或卤素；

或者R₁和R₂与它们所连接的氮原子一起形成含或不含选自O或N的第二个杂原子的5-10个原子的饱和或不饱和杂环基团，所述的杂环基团是未取代的或被相同或不同的取代基一次至五次取代的杂环基团，所述的取代基选自C₁-C₈直链或支链烷基、(C₁-C₈直链或支链亚烷基)-Y、卤素、羧基、苯基、苄基、甲氧羰基、乙氧羰基、或叔丁氧羰基，其中Y代表羟基或卤素；

R₃代表氢原子、C₁-C₈直链或支链烷基、C₁-C₈直链或支链烷氧基、C₁-C₈直链或支链烷氧羰基、苯基、苄基、硝基、腈基或羧基；

R₄和R₅各自独立地代表氢原子、或C₁-C₁₀直链或支链烷基；

R₆代表氢原子、C₁-C₁₀直链或支链烷基、苯基或苄基，其中苯基或苄基未被取代或被1-5个取代基取代，所述的取代基选自羟基、C₁-C₈直链或支链烷基、卤素、硝基、腈基或羧基；

R₇和R₈各自独立地代表氢原子或C₁-C₁₀直链或支链烷基；

式I中四个手性中心(分别用^*1，^*2，^*3，^*4表示)为R构型或S构型。

进一步地，通式I所示的化合物，其特征在于：

或者R₁和R₂与它们所连接的氮原子一起形成含或不含选自O或N的第二个杂原子的5-7个原子的饱和杂环基团，所述的杂环基团未被取代或被取代基一次取代，所述的取代基选自 C₁-C₈直链或支链烷基、(C₁-C₈直链或支链亚烷基)-Y、卤素、羧基、甲氧羰基、乙氧羰基、或叔丁氧羰基，其中Y代表羟基或卤素；

R₃、R₄和R₅各自独立地代表氢原子；

R₆代表氢原子或苯基；

R₇和R₈各自独立地代表氢原子；

式I中手性中心^*2为S构型，手性中心^*3为R构型，手性中心^*4为S构型或R构型。

更进一步地，通式I所示的化合物，其特征在于：

R₁和R₂各自独立地代表C₁-C₁₀直链或支链烷基、(C₁-C₁₀直链或支链亚烷基)-Q，其中Q代表羟基或卤素；

或者R₁和R₂与它们所连接的氮原子一起形成含或不含N的第二个杂原子的5-7个原子的饱和杂环基团，所述的杂环基团未被取代或被取代基一次取代，所述的取代基选自(C₁-C₈直链或支链亚烷基)-Y、羧基、甲氧羰基或乙氧羰基，其中Y代表羟基；

R₃、R₄和R₅各自独立地代表氢原子；

R₆代表氢原子或苯基；

R₇和R₈各自独立地代表氢原子；

具体来说，通式I所示化合物优选自下列化合物：

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-(吡咯烷偶氮鎓二醇盐-O²-基)乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸(化合物编号：I₁，下同)：

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[(2-(S)-羟甲基)吡咯烷偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸(I₂)：

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[二(2-氯乙基)胺偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸(I₃)：

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[(N-乙氧羰基)哌嗪偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸(I₄)：

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[(4-羟基)哌啶偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸(I₅)：

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[(N-甲基-2-羟基)乙胺偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸(I₆)：

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[二(2-氯乙基)胺偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基-(R)-苯基甘氨酸(I₇)：

下面药理实验中化合物的代号等同于此处代号所对应的化合物。

本发明的另一目的在于提供本发明通式I化合物的制备方法，其特征在于：

在碱性条件下，O²-(2-卤代)烷基偶氮鎓二醇盐(II)和谷胱甘肽及其类似物(III)反应得到硫醚化合物(IV)，IV经氧化剂氧化制得通式I化合物；合成路线如下：

其中，X代表Cl或Br；R₁-R₈的定义如前所述；式II所示的化合物参考文献(Org.Lett.，2007，9，3409-3412)制得；

由II和III制备IV的特征在于，碱性条件为反应体系pH 8-12；溶剂选自水、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、丙酮、甲醇或乙醇中的一种或多种；

由IV制备通式I化合物的特征在于，氧化剂选自双氧水、过氧乙酸、高锰酸钾或间氯过氧苯甲酸；溶剂选自水、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、乙酸、甲酸、乙腈、丙酮、甲醇、或二氧六环中的一种或多种；反应温度为0℃至回流。

由II和III制备IV的特征在于，碱性条件为反应体系pH 10-11；采用水和乙醇混合溶剂。

由IV制备通式I化合物的特征在于，氧化剂选自双氧水；采用水和乙酸混合溶剂；反应温度为回流温度。

本发明的进一步目的在于提供一种含有效剂量的通式I化合物或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或外消旋混合物，或其药学上可接受的盐及可药用的载体的药物组合物。

本发明的再一目的是提供通式I化合物中任意一项的化合物在制备抗肿瘤药物中的用途，尤其是治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和白血病等药物中的应用。

如上所述的肿瘤疾病为人肿瘤。

本发明中，在给予哺乳动物通式I化合物及其药学上可接受的盐或酯，以及这些化合物的溶剂化物(这里统称为“治疗药物”)时，可以单独使用，或者最好是按照规范的制药方法将其与适于药用的载体或稀释剂配合后使用。给药方式可以经各种途径，包括口服，非胃肠道给药或局部给药。这里所指的非胃肠道给药包括但并不限于静脉注射，肌肉注射，腹腔注射，皮下注射和透皮给药。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，以下给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-(吡咯烷偶氮鎓二醇盐-O²-基)乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸(I₁)的制备

O²-(2-溴乙基)-吡咯烷偶氮鎓二醇盐参照文献(Org.Lett.，2007，9，3409-3412)制备。

谷胱甘肽(3.07g，0.01mol)溶于100mL水中，用1mol/L的NaOH水溶液调pH值到10-11。O²-(2-溴乙基)-吡咯烷偶氮鎓二醇盐(2.38g，0.01mol)于100mL乙醇中，加入上述谷胱甘肽的pH 10-11的水溶液中，室温剧烈搅拌反应4天。再把反应液pH值调至中性，浓缩，加入水，用乙酸乙酯洗涤。水层浓缩得到中间体后不进行纯化直接进行下一步反应。将中间体粗品溶于20mL水和20mL乙酸混合体系中，加入30％H₂O₂溶液5.1mL(0.05mol)，加热回流8小时，浓缩得到化合物I₁的粗品。快速柱层析得白色粉末状化合物I₁(3.12g，63％)。mp 188-190℃，ESI-MS：519[M+Na]⁺；¹H NMR(D₂O)：δ1.94-1.99(m，4H，pyrrolidin-1-yl H-3and H-4)，2.12-2.19(m，2H，CHCH₂CH₂)，2.50-2.5(m，2H，CHCH₂CH₂)，3.53-3.58(m，4H，pyrrolidin-1-ylH-2and H-5)，3.61-3.96(m，7H，CHCH₂CH₂，NHCH₂COOH and CH₂SO₂CH₂)，4.71(t，J＝5.5Hz，2H，SO₂CH₂CH₂O)，5.11(dd，J＝3.1，9.7Hz，NHCHCO)；¹³C NMR(D₂O)：δ21.6，25.1，30.7，42.7，36.8，48.4，50.3，50.5，52.5，65.5，169，173，174，175.Anal.Calcd for C₁₆H₂₈N₆O₁₀S·HCl·0.5H₂O：C，35.46；H，5.58；N，15.51，Found：C，35.84；H，5.53；N，15.11.

实施例2

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[(2-(S)-羟甲基)吡咯烷偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸(I₂)的制备

O²-(2-溴乙基)-(2-(S)-羟甲基)吡咯烷偶氮鎓二醇盐参照文献(Org.Lett.，2007，9，3409-3412)合成。

参考I₁的制备方法，以谷胱甘肽和O²-(2-溴乙基)-(2-(S)-羟甲基)吡咯烷偶氮鎓二醇盐为原料，制得白色粉末化合物I₂，产率55％。mp 173-175℃，ESI-MS：527[M+H]⁺，549[M+Na]⁺； ¹H NMR(D₂O)：δ1.83-1.99(m，6H，prolinol-1-yl H-3and H-4，CHCH₂CH₂)，2.50-2.53(m，2H，CHCH₂CH₂)，3.53-3.89(m，9H，CHCH₂CH₂，CH₂SO₂CH₂，prolinal-1-yl H-5and CH₂OH)，3.94(s，2H，NHCH₂COOH)，4.09-4.13(m，1H，prolinal-1-yl H-2)，4.72(t，J＝5.5Hz，2H，SO₂CH₂CH₂O)，5.10(dd，J＝3.6，9.7Hz，NHCHCO)；¹³C NMR(D₂O)：δ21.5，21.7，25.1，25.5，30.6，42.4，46.8，52.0，53.3，62.2，62.4，65.5，169，173，174，175.Anal.Calcd for C₁₇H₃₀N₆O₁₁S·H₂O：C，37.50；H，5.92；N，15.43，Found：C，37.82；H，5.76；N，15.21.

实施例3

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[二(2-氯乙基)胺偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸(I₃)的制备

O²-(2-溴乙基)-二(2-氯乙基)胺偶氮鎓二醇盐参照文献(Org.Lett.，2007，9，3409-3412)合成。ESI-MS：330and 332[M+Na]⁺；¹H NMR(D2O)：δ3.56-3.72(m，10H，(ClCH₂CH₂)₂N andBrCH₂CH₂O)，4.52(t，J＝6.1Hz，2H，BrCH₂CH₂O)；¹³C NMR(D₂O)：δ27.8，40.2，55.4，72.8.

参考I₁的制备方法，以O²-(2-溴乙基)-二(2-氯乙基)胺偶氮鎓二醇盐和谷胱甘肽为原料，制得淡黄色固体化合物I₃，产率56％，mp 160-162℃，ESI-MS：567and 579[M+H]⁺，589and591[M+Na]⁺，605and 607[M+K]⁺；¹H NMR(D2O)：δ2.12-2.22(m，2H，CHCH₂CH₂)，2.50-2.55(m，2H，CHCH₂CH₂)，3.62-3.96(m，15H，CHCH₂CH₂，NHCH₂COOH，CH₂SO₂CH₂，N(CH₂CH₂Cl)₂)，4.74(t，J＝8.5Hz，2H，SO₂CH₂CH₂O)，5.11(dd，J＝3.0，9.5Hz，NHCHCO)；¹³CNMR(D₂O)：δ28.4，33.9，42.9，45.9，50.1，55.3，56.6，57.1，57.3，69.4，172，176.2，176.3，177.Anal.Calcd for C₁₆H₂₈Cl₂N₆O₁₀S：C，33.83；H，4.97；N，14.81，Found：C，33.62；H，4.92；N，14.51.

实施例4

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[(N-乙氧羰基)哌嗪偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸(I₄)的制备

O²-(2-溴乙基)-(N-乙氧羰基)哌嗪偶氮鎓二醇盐参照文献(Org.Lett.，2007，9，3409-3412)合成。

参考I₁的制备方法，以谷胱甘肽和O²-(2-溴乙基)-(N-乙氧羰基)哌嗪偶氮鎓二醇盐为原料，制得白色粉末化合物I₄，产率59％，mp 168-169℃，ESI-MS：584[M+H]⁺，606[M+Na]⁺；¹HNMR(D₂O)：δ1.30(t，J＝5.6Hz，3H，OCH₂CH₃)，2.10-2.20(m，2H，CHCH₂CH₂)，2.53-2.58(m，2H，CHCH₂CH₂)，3.60-3.86(m，15H，CHCH₂CH₂，NHCH₂COOH，CH₂SO₂CH₂，N(CH₂CH₂)₂N)，4.19(q，J＝5.6Hz，2H，OCH₂CH₃)，4.77(t，J＝8.5Hz，2H，SO₂CH₂CH₂O)，5.13(dd，J＝3.1，9.5Hz，NHCHCO)；¹³C NMR(D₂O)：δ14.1，27.4，33.5，41.2，43.3，45.6，50.2，51.3，57.1，58.3，63.2，69.2，154，174，176，177，179.Anal.Calcd for C₁₉H₃₃N₇O₁₂S：C，39.10；H，5.70；N，16.80，Found：C，39.52；H，5.92；N，16.51.

实施例5

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[(4-羟基)哌啶偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸(I₅)的制备

O²-(2-溴乙基)-(4-羟基)哌啶偶氮鎓二醇盐参照文献(Org.Lett.，2007，9，3409-3412)合成。

参考I₁的制备方法，以谷胱甘肽和O²-(2-溴乙基)-(4-羟基)哌啶偶氮鎓二醇盐为原料，制得白色粉末化合物I₅，产率54％，mp 143-145℃，ESI-MS：527[M+H]⁺，549[M+Na]⁺；¹H NMR(D₂O)：δ1.79-1.91(m，4H，CH₂×2)，2.14-2.20(m，2H，CHCH₂CH₂)，2.53-2.63(m，2H，CHCH₂CH₂)，2.95-3.11(m，4H，CH₂×2)，3.60-3.80(m，8H，CHCH₂CH₂，NHCH₂COOH，CH₂SO₂CH₂，CHOH)，4.71(t，J＝8.3Hz，2H，SO₂CH₂CH₂O)，5.11(dd，1H，J＝3.2，9.5Hz，NHCHCO)；¹³C NMR(D₂O)：δ28.0，31.4，32.0，43.0，44.5，53.4，55.0，59.2，61.3，67.5，69.4，169，177.1，177.5，179.Anal.Calcd for C₁₇H₃₀N₆O₁₁S：C，38.78；H，5.74；N，15.96，Found：C，38.52；H，5.92；N，15.61.

实施例6

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[(N-甲基-2-羟基)乙胺偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸(I₆)的制备

O²-(2-溴乙基)-N-甲基乙醇胺偶氮鎓二醇盐参照文献(Org.Lett.，2007，9，3409-3412)合成。

参考I₁的制备方法，以谷胱甘肽和O²-(2-溴乙基)-N-甲基乙醇胺偶氮鎓二醇盐为原料，制得白色粉末化合物I₆，产率57％，mp 159-161℃，ESI-MS：501[M+H]⁺，523[M+Na]⁺；¹H NMR(D₂O)：δ2.10-2.18(m，2H，CHCH₂CH₂)，2.47(s，3H，NCH₃)，2.53-2.59(m，2H，CHCH₂CH₂)，2.75 (t，J＝6.5Hz，2H，NCH₂CH₂OH)，3.46(t，J＝6.5Hz，2H，NCH₂CH₂OH)，3.51-3.75(m，8H，CHCH₂CH₂，NHCH₂COOH，CH₂SO₂CH₂)，4.72(t，J＝8.3Hz，2H，SO₂CH₂CH₂O)，5.12(dd，1H，J＝3.2，9.5Hz，NHCHCO)；¹³C NMR(D₂O)：δ28.0，32.4，36.0，43.1，53.4，54.8，56.0，57.1，60.4，62.3，69.0，169，177，178，179.Anal.Calcd for C₁₅H₂₈N₆O₁₁S：C，36.00；H，5.64；N，16.79，Found：C，36.22；H，5.92；N，16.61.

实施例7

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[二(2-氯乙基)胺偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基-(R)-苯基甘氨酸(I₇)的制备

O²-(2-溴乙基)-二(2-氯乙基)胺偶氮鎓二醇盐参照文献(Org.Lett.，2007，9，3409-3412)合成。γ-谷氨酰基半胱氨酰基-(R)-苯基甘氨酸参照文献(J.Med.Chem.1994，37，1501-1507)合成。

参考I₁的制备方法，以γ-谷氨酰基半胱氨酰基-(R)-苯基甘氨酸和O²-(2-溴乙基)-二(2-氯乙基)胺偶氮鎓二醇为原料，制得淡黄色粉末化合物I₇，产率57％，mp 170-173℃，ESI-MS：643and 645[M+H]⁺，665and 667[M+Na]⁺.¹H NMR(D₂O)：δ2.10-2.19(m，2H，CHCH₂CH₂)，2.52-2.56(m，2H，CHCH₂CH₂)，3.61-3.86(m，13H，CHCH₂CH₂，CH₂SO₂CH₂，N(CH₂CH₂Cl)₂)，4.73(t，J＝8.6Hz，2H，SO₂CH₂CH₂O)，5.12(dd，J＝3.2，9.5Hz，NHCHCO)；5.52(s，1H，C₆H₅CH)，7.47-7.55(m，5H，C₆H₅).¹³C NMR(D₂O)：δ28.5，40.0，42.9，45.6，50.1，56.6，56.1，58.3，69.4，90.5，1226，127，129，136，172，176.2，176.3，177.Anal.Calcd for C₁₆H₂₈Cl₂N₆O₁₀S ：C，41.06；H，5.01；N，13.06，Found：C，30.87；H，4.93；N，13.51.

实施例8 GST-P分子对接实验

应用Argus计算机辅助药物设计软件，进行化合物I₁与GST-P酶模拟对接研究。分子对接结果如图1所示。图1显示，化合物I₁作为GSH类似物能很好和GST-P酶结合，GST-P的7位酪氨酸(Try)的酚氧负离子和化合物I₁中磺酰基α位置的两个氢中的其中一个氢距离仅为

该结果提示，化合物I₁极有可能被GST-P活化，促进其磺酰基α位置H的离去进而诱发β消除反应，从而释放偶氮鎓二醇盐部分。

实施例9GST-P催化降解实验

将化合物I₁与GST-P酶进行孵化，以考察体外环境下GST-P酶对化合物I₁的催化降解活性。具体的操作过程：1)配置化合物I₁的DMSO溶液，第一组将I₁的DMSO溶液加入到 PBS pH 7.4中，I₁的最终浓度为150μM，DMSO的体积比为5％；第二组将I₁的DMSO溶液加入到含有GST-P的PBS pH 7.4中，I₁的最终浓度为150μM，DMSO的体积比为5％，而GST-P的最终浓度为5μM；2)将上述两组溶液分别加入两个2.5mL的比色皿中，并置于37℃的水浴中进行孵化；3)记录各组比色皿在203-350nm处的吸收值随孵化时间的变化；4)利用最大吸收波长259nm下的吸收值的变化，计算两组溶液中，化合物I₁的半衰期。结果如图2所示。结果表明，化合物I₁在PBS pH 7.4中的半衰期为270mins，而在GST-P的PBS pH7.4中半衰期仅为70mins，由此可见GST-P的确能有效的促进化合物的活化和降解。

实施例10体外NO释放试验

利用Griess试剂法进行化合物I₁的体外GST-P酶催化NO释放实验。将化合物I₁与GST-P酶进行孵化，在不同时间检测NO的释放量，以确定GST-P的存在是否具有加速化合物释放NO的作用。具体的操作过程：1)配置化合物I₁的DMSO溶液，第一组将I₁的DMSO溶液加入到PBS pH 7.4中，I₁的最终浓度为150μM，DMSO的体积比为5％；第二组将I₁的DMSO溶液加入到含有GST-P的PBS pH 7.4中，I₁的最终浓度为150μM，DMSO的体积比为5％，而GST-P的最终浓度为5μM；2)将上述两组溶液分别加入两个2.5mL的比色皿中，并置于37℃的水浴中进行孵化；3)在各个时间点取出300μL的孵化溶液，加入100μL Griess试剂后静置5mins，读取该溶液在540nm处的吸光值；4)根据NaNO₂建立的标准曲线，计算出各个时间点化合物I₁释放NO的百分比(每分子I₁可以释放两分子NO)。结果如表1所示。从表1的实验数据可知，化合物I₁在GST-P的作用下明显加速NO的释放，此结果提示I₁具有GST-P介导的NO释放靶向性。

表1化合物I1体外NO释放试验结果

No.	1h	2h	4h	8h	24h
						PBS only	5.1％	9.4％	14％	22％	25％
PBS+GST-P	20％	28％	40％	51％	54％

实施例11体外抗肿瘤活性实验目的：选择过度表达GST-P的肿瘤细胞对本发明化合物I₁-I₇进行体外抗肿瘤作用评价。样品和试剂：化合物I₁-I₇注射液试验时临时配制；阳性对照药为紫杉醇注射液(厂家为太极集团四川太极制药有限公司)；细胞培养基RPMI-1640、F12、MEM、DMEM(高糖)购自GIBCO公司；胎牛血清(杭州四季清有限公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)和DMSO均购自Sigma 公司；其它常用试剂为市售分析纯。

细胞株：人乳腺癌细胞MNK-7；人非小细胞肺癌细胞NCI-H358；人结肠癌细胞HCT 116；人白血病细胞U937；人卵巢癌细胞OVCaR-3。

细胞株的培养：各实验细胞株(中国科学院上海细胞生物学研究所提供)由本实验室传代冻存。细胞在37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中常规培养。培养液为含10％热灭活胎牛血清，青霉素100u/ml和链霉素100u/ml的RPMI1640细胞培养基。48h更换培养液，细胞汇合时，用0.25％胰蛋白酶消化传代。实验用细胞均处于对数生长期，台盼蓝拒染法表明细胞活力＞95％。

实验方法：

1)细胞消化、计数、配制成浓度为4×10⁴个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液(每孔4×10³个细胞)；

2)96孔细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；

3)用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组，阳性对照组；

4)96孔细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养72小时；5)将96孔板进行MTT染色，λ＝490nm，测定OD值；

(1)每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，在培养箱继续培养4小时；

(2)弃去培养基，每孔加入150μLDMSO溶解，摇床10分钟轻轻地混匀；

(3)λ＝490nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率。

6)计算各组别抑制率及药物IC₅₀

应用SPSS(Staffstical Package for the Social Science)17.0通过机率单位加权回归法(Bliss法)计算IC₅₀。实验结果如表2所示。

表2.本发明部分化合物对五种肿瘤细胞增殖的抑制作用(IC₅₀：μM)

从表1的实验数据可知，本发明化合物均具有不同程度的抗肿瘤作用，其中化合物I₃的活性与阳性对照药紫杉醇相当；化合物I₇的活性强于紫杉醇。

附图说明

图1本发明化合物I₁和GST-P的分子对接示意图

图2本发明化合物I₁在不同条件下半衰期的测定。

Claims

1.通式I所示的O²-磺酰基乙基偶氮鎓二醇盐修饰的谷胱甘肽类化合物或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或外消旋混合物，或其药学上可接受的盐或酯：

其中：

2.根据权利要求1所述的通式I化合物，其特征在于：

或者R₁和R₂与它们所连接的氮原子一起形成含或不含选自O或N的第二个杂原子的5-7个原子的饱和杂环基团，所述的杂环基团未被取代或被取代基一次取代，所述的取代基选自C₁-C₈直链或支链烷基、(C₁-C₈直链或支链亚烷基)-Y、卤素、羧基、甲氧羰基、乙氧羰基、或叔丁氧羰基，其中Y代表羟基或卤素；

R₃、R₄和R₅各自独立地代表氢原子；

R₆代表氢原子或苯基；

R₇和R₈各自独立地代表氢原子；

3.根据权利要求1所述的通式I化合物，其特征在于：

R₃、R₄和R₅各自独立地代表氢原子；

R₆代表氢原子或苯基；

R₇和R₈各自独立地代表氢原子；

4.根据权利要求1所述的通式I化合物选自：

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-(吡咯烷偶氮鎓二醇盐-O²-基)乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸；

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[(2-(S)-羟甲基)吡咯烷偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸；

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[二(2-氯乙基)胺偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸；

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[(N-乙氧羰基)哌嗪偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸；

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[(4-羟基)哌啶偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸；

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[(N-甲基-2-羟基)乙胺偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基甘氨酸；

γ-(S)-谷氨酰基-α-(R)-胺基-β-{[2-[二(2-氯乙基)胺偶氮鎓二醇盐-O²-基]乙基]磺酰基}丙酰基-(R)-苯基甘氨酸。

5.权利要求1所述的通式I化合物的制备方法，其特征在于：

其中，X代表Cl或Br；R₁-R₈的定义如前所述；

6.权利要求5所述的方法，由II和III制备IV的特征在于，碱性条件为反应体系pH 10-11；采用水和乙醇混合溶剂。

7.权利要求5所述的方法，由IV制备通式I化合物的特征在于，氧化剂选自双氧水；采用水和乙酸混合溶剂；反应温度为回流温度。

8.一种药物组合物，其含有治疗有效量的权利要求1所述的通式I化合物或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或外消旋混合物，或其药学上可接受的盐及可药用的载体。

9.权利要求1-4中任意一项的化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

10.权利要求9的用途，其特征在于所述的肿瘤为卵巢癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和白血病。