CN109010333A

CN109010333A - 脱氢弯孢霉素在抑制Hedgehog通路中的应用

Info

Publication number: CN109010333A
Application number: CN201811313542.9A
Authority: CN
Inventors: 陈峰阳; 周俐斐; 王丽薇; 章初龙; 林福呈; 冯晓晓; 周桂姣
Original assignee: Hangzhou Medical College
Current assignee: Hangzhou Medical College
Priority date: 2018-11-06
Filing date: 2018-11-06
Publication date: 2018-12-18

Abstract

本发明提供了一种脱氢弯孢霉素在抑制Hedgehog通路中的应用，属于医药技术领域。本发明所述脱氢弯孢霉素结构式如式I所示，在0.125μM以上浓度不仅能浓度依赖性地显著抑制Hh蛋白诱导的Hedgehog通路激活，还能显著抑制SMO激动剂SAG诱导的Hedgehog通路激活，且两方面作用强度无明显差异，证明与现有上市的Hedgehog通路抑制剂作用靶蛋白不同。因此，治疗范围更广，并具有克服上市药物耐药的潜能，有显著的优越性。

Description

脱氢弯孢霉素在抑制Hedgehog通路中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及脱氢弯孢霉素在抑制Hedgehog通路中的应用。

背景技术

Hedgehog(Hh)信号通路主要由胞外的Hh蛋白、跨膜受体Patched(Ptch)及迁移跨膜蛋白Smoothened(Smo)和转录因子Gli组成。其信号传递过程为：Hh蛋白与Ptch结合后，解除了Ptch对Smo的抑制作用，Smo迁移至初级纤毛位置，启动细胞内信号转导的级联反应，最终激活Gli转录因子，进入细胞核启动目的基因的转录，产生相应的细胞效应(VarjosaloM,Taipale J.Hedgehog signaling.J Cell Sci,2007,120(1):3-6)。

研究表明，基底细胞癌和髓母细胞瘤的生长都直接依赖于Hedgehog通路的激活。具体表现为：Hh蛋白分泌增加，Ptch或Smo突变性激活和Gli过表达(Marzuka AG,BookSE.Basal cell carcinoma:pathogenesis,epidemiology,clinical features,diagnosis,histopathology,and management.Yale J Biol Med.2015,88(2):167-79；Huang SY,Yang JY.Targeting the Hedgehog Pathway in PediatricMedulloblastoma.Cancers(Basel).2015,7(4):2110-23.)其他癌症如横纹肌肉瘤、胰腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌、白血病和多发性骨髓瘤的生长、转移和复发也与Hedgehog通路的异常激活密切相关(Amakye D,Jagani Z,Dorsch M.Unraveling thetherapeutic potential ofthe Hedgehog pathway in cancer.Nature Medicine,2013,19(11):1410-22)。目前，两个Hedgehog通路抑制剂Vismodegib(GDC-0449)和Sonidegib(LDE225)分别于2012年和2015年经FDA批准用于治疗局部晚期或转移性基底细胞癌(Sekulic A,Von Hoff D.Hedgehog Pathway Inhibition.Cell,2016,164(5):831)。另外，在临床试验中，Vismodegib对成人和儿童髓母细胞瘤也表现出较好的治疗作用(Gajjar A,Stewart CF,Ellison DW等,Phase I study of vismodegib in children withrecurrent or refractory medulloblastoma:a pediatric brain tumor consortiumstudy,Clin Cancer Res.2013,9(22):6305-12；Robinson GW,Orr BA,Wu G等,VismodegibExerts Targeted Efficacy Against Recurrent Sonic Hedgehog-SubgroupMedulloblastoma:Results From Phase II Pediatric Brain Tumor ConsortiumStudies PBTC-025B and PBTC-032.J Clin Oncol,2015,33(24):2646-54.)。

Hedgehog通路的异常激活引起上皮细胞-间充质细胞转换和细胞外基质过多沉积，同样主导了肺、肾、肝、胆管、皮肤、胰腺和心脏等组织的纤维化病变过程(Hu L,Lin X,Lu H等,An overview of hedgehog signaling in fibrosis.Mol Pharmacol,2015,87(2):174-82.)。动物实验研究表明，Hedgehog通路抑制剂Vismodegib对多种原因引起的肝纤维化具有较好的治疗作用(Elhenawy AA,Ashour RH,Nabih N,等.Possibleantifibrotic effect of GDC-0449(Vismodegib),a hedgehog-pathway inhibitor,inmice model of Schistosoma-induced liver fibrosis.Parasitol Int,2017,66(5):545-554；Pratap A,Singh S,Mundra V等，Attenuation of early liver fibrosis bypharmacological inhibition of smoothened receptor signaling.J DrugTarget.2012,20(9):770-82.)。Vismodegib联合吡非尼酮(Pirfenidone)治疗原发性肺纤维化也已完成临床试验(www.clinicaltrials.gov)。

综上所述，Hedgehog通路抑制剂可以用于治疗Hedgehog通路依赖性肿瘤和纤维化疾病，医药应用价值显著。但是，Vismodegib和Sonidegib在临床使用中均有原发性及继发性耐药的现象。其耐药机制主要是药物作用靶蛋白Smo点突变(Pricl S,Cortelazzi B,DalCol V等,Smoothened(SMO)receptor mutations dictate resistance to vismodegib inbasal cell carcinoma.Mol Oncol,2015,9:389-397.)。原发性及继发性耐药现象极大的制约了这两个Hedgehog通路抑制剂的治疗范围及临床疗效。目前国内外尚无能克服其耐药的新一代Hedgehog通路抑制剂进入临床试验，更无药物进入临床使用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种脱氢弯孢霉素在抑制Hedgehog通路中的应用，具有与Hedgehog通路抑制剂Vismodegib(GDC-0449)和Sonidegib(LDE225)不同的靶蛋白。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了脱氢弯孢霉素在抑制Hedgehog通路中的应用，所述脱氢弯孢霉素的结构式如式I所示：

优选的，所述脱氢弯孢霉素在抑制Hedgehog通路中的应用包括作为治疗Hedgehog通路依赖性疾病的药物的有效成分。

优选的，在所述治疗Hedgehog通路依赖性疾病的药物中，所述脱氢弯孢霉素的质量浓度为0.1～100％。

优选的，所述Hedgehog通路依赖性疾病包括：Hedgehog通路依赖性癌症和Hedgehog通路依赖性纤维化疾病。

优选的，所述Hedgehog通路依赖性癌症包括：基底细胞癌和髓母细胞瘤。

优选的，所述Hedgehog通路依赖性纤维化疾病包括：肺纤维化疾病、肾纤维化疾病、肝纤维化疾病、皮肤纤维化疾病和心纤维化疾病。

优选的，所述皮肤纤维化疾病包括：硬皮症和瘢痕症。

优选的，所述治疗Hedgehog通路依赖性疾病的产品的用量为0.01～100mg/kg/d。

本发明提供了一种脱氢弯孢霉素在抑制Hedgehog通路中的应用，将脱氢弯孢霉素(Dehydrocurvularin)应用于抑制Hedgehog通路，并且与现有上市的Hedgehog通路抑制剂作用靶蛋白不同。在本发明实施例中，当所述脱氢弯孢霉素高于0.125μM时，不仅能浓度依赖性地显著抑制Hh蛋白诱导的Hedgehog通路激活，还能显著抑制SMO激动剂SAG诱导的Hedgehog通路激活，且两方面作用强度无明显差异。

附图说明

图1为脱氢弯孢霉素对Hh蛋白或SMO激动剂诱导Hedgehog通路激活的抑制作用；

图2为GDC-0449对Hh蛋白或SMO激动剂诱导Hedgehog通路激活的抑制作用。

具体实施方式

在本发明所述应用中，所述脱氢弯孢霉素在抑制Hedgehog通路中的应用优选包括作为治疗Hedgehog通路依赖性疾病的药物的有效成分。本发明所述治疗Hedgehog通路依赖性疾病的药物中，所述脱氢弯孢霉素的质量浓度优选为0.1～100％。本发明对所述治疗Hedgehog通路依赖性疾病的药物的剂型并没有特殊限定，优选的可根据药剂领域的现有方法制备成各种剂型，通过口服、鼻吸、直肠、肠胃外或经皮给药等方式施用于需要这种治疗的患者。本发明对所述治疗Hedgehog通路依赖性疾病的药物的其他成分并没有特殊限定，优选包括药学上可接受的辅料，如稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、崩解剂、吸附载体、润滑剂以及香味剂和甜味剂。当所述药物为片剂时，具体制备方法为：将1.0g脱氢弯孢霉素、18.7g乳糖和5.0g玉米淀粉混合，用水均匀湿润，湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入0.3g硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，活性成分含量10mg。当所述药物为胶囊剂时，制备方法为：将1.0g脱氢弯孢霉素、18.8g乳糖和0.2g硬脂酸镁混合，过筛，装入硬胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量10mg。

在本发明中，当所述脱氢弯孢霉素化合物作为治疗Hedgehog通路依赖性疾病的药物的有效成分时，所述有效成分的使用日剂量优选为0.01～100mg/kg体重。本发明对所述脱氢弯孢霉素的来源并没有特殊限定，优选包括常规市售产品，如购于Abcam公司，也可参考常规方法自行制备。

在本发明中，所述Hedgehog通路依赖性疾病优选包括：Hedgehog通路依赖性癌症和Hedgehog通路依赖性纤维化疾病，所述Hedgehog通路依赖性癌症优选包括：基底细胞癌和髓母细胞瘤。本发明所述Hedgehog通路依赖性纤维化疾病优选包括：肺纤维化疾病、肾纤维化疾病、肝纤维化疾病、皮肤纤维化疾病和心纤维化疾病，所述皮肤纤维化疾病优选包括：硬皮症和瘢痕症。

下面结合实施例对本发明提供的脱氢弯孢霉素在抑制Hedgehog通路中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

脱氢弯孢霉素对Hedgehog通路的抑制作用

1.1试剂和仪器：Vismodegib和SMO激动剂SAG购于MedChemExpress公司；脱氢弯孢霉素购于Abcam公司；Shh-Light II细胞和Shh-N overexpression 293细胞由北京大学辛胜昌老师馈赠；噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthliazol-2-yl)-2,5-dipenyltetrazoliumbromide，MTT)购于美国Sigma公司；DMEM细胞培养液购自美国Thermo Fisher公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promege公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

Shh-Light II细胞培养于含10％灭活胎牛血清，400μg/mL G418和0.15mg/mLZeocin的DMEM培养基中；Shh-N overexpression 293细胞培养于含10％灭活胎牛血清，400μg/mL G418的DMEM培养基中；放置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。待细胞生长80％以上融合程度时，用0.25％胰酶消化传代。

1.2.2 SCM(Shh-conditioned Medium)制备

Shh-N overexpression 293细胞长约80％融合后，换成含2％胎牛血清的培养基培养24小时，取上清液，经0.22μm膜过滤，即得含Hh蛋白的SCM溶液。

1.2.3脱氢弯孢霉素对Hedgehog通路的抑制作用测定

取对数生长期的Shh-Light II细胞，调整浓度至1×10⁵个/mL，接种于白色96孔细胞培养板中100μL/孔。常规培养，待细胞长至80％融合时，小心移除培养液，各孔加入含0.5％胎牛血清的培养基100μL，加入20倍稀释的SCM溶液或SAG溶液50μL，再加入脱氢弯孢霉素或Vismodegib 50μL，同时设溶剂对照孔和阳性药物对照孔，各复3孔。培养30小时后，收集细胞，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒的说明测定双荧光素酶的活性。

实验结果如表1和图1所示，脱氢弯孢霉素在0.125～2μM不仅能浓度依赖性地显著抑制Hh蛋白诱导的Hedgehog通路激活，还能显著抑制SMO激动剂SAG诱导的Hedgehog通路激活，且两方面作用强度无明显差异。

对比例

以现有的Vismodegib(GDC-0449)作为对照，与实施例1进行相同的实验，实验结果如表1和图2所示，对照药Vismodegib能显著抑制Hh蛋白诱导的Hedgehog通路激活，但对SAG诱导的Hedgehog通路激活的抑制作用明显减弱。

表1.脱氢弯孢霉素和Vismodegib对Hedgehog通路激活的抑制作用

该结果表明脱氢弯孢霉素为Hedgehog通路抑制剂，并且与现有上市的Hedgehog通路抑制剂作用靶蛋白不同。

综上所述，本发明提供了一种脱氢弯孢霉素在抑制Hedgehog通路中的应用，所述脱氢弯孢霉素可作为Hedgehog通路抑制剂，并且与现有上市的Hedgehog通路抑制剂作用靶蛋白不同；同时2μM的脱氢弯孢霉素用量对Hh蛋白和SMO激动剂的抑制率高达97％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.脱氢弯孢霉素在抑制Hedgehog通路中的应用，所述脱氢弯孢霉素的结构式如式I所示：

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述脱氢弯孢霉素在抑制Hedgehog通路中的应用包括作为治疗Hedgehog通路依赖性疾病的药物的有效成分。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，在所述治疗Hedgehog通路依赖性疾病的药物中，所述脱氢弯孢霉素的质量浓度为0.1～100％。

4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述Hedgehog通路依赖性疾病包括：Hedgehog通路依赖性癌症和Hedgehog通路依赖性纤维化疾病。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述Hedgehog通路依赖性癌症包括：基底细胞癌和髓母细胞瘤。

6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述Hedgehog通路依赖性纤维化疾病包括：肺纤维化疾病、肾纤维化疾病、肝纤维化疾病、皮肤纤维化疾病和心纤维化疾病。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述皮肤纤维化疾病包括：硬皮症和瘢痕症。

8.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述治疗Hedgehog通路依赖性疾病的产品的用量为0.01～100mg/kg/d。