CN103153347A - 用于寡核苷酸递送的新型低分子量阳离子脂质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可以与其它脂质组分如胆固醇和PEG-脂质联合使用以与寡核苷酸形成脂质纳米粒的新型阳离子脂质。本发明的一个目的是提供表现出增强的效力以及由于肝中较低的脂质水平而导致的较低的肝毒性的阳离子脂质支架。本发明使用包含至少一个短脂质链的低分子量阳离子脂质以增强siRNA的体内递送的效率和耐受性。

Description

用于寡核苷酸递送的新型低分子量阳离子脂质
背景技术
本发明涉及可以与其它脂质组分如胆固醇和PEG-脂质联合使用以与寡核苷酸形成脂质纳米粒、促进细胞摄取和内体逃逸以及在体外和体内敲低靶mRNA的新型阳离子脂质。
之前已经公开了阳离子脂质和阳离子脂质在用于递送寡核苷酸，特别是siRNA和miRNA的脂质纳米粒中的用途。之前已经公开了脂质纳米粒和脂质纳米粒用于递送寡核苷酸，特别是siRNA和miRNA的用途。之前已经公开了寡核苷酸（包括siRNA和miRNA）和寡核苷酸的合成。（参见美国专利申请：US 2006/0083780、US 2006/0240554、US 2008/0020058、US 2009/0263407和US 2009/0285881和PCT专利申请：WO 2009/086558、WO2009/127060、WO2009/132131、WO2010/042877、WO2010/054384、WO2010/054401、WO2010/054405、WO2010/054406和WO2010105209）。也参见Semple S. C.等人，Rational design of cationic lipids for siRNA delivery，Nature Biotechnology，于2010年1月17日在线刊载；doi:10.1038/nbt.1602。
在美国专利申请：US 2009/0263407、US 2009/0285881、US 2010/0055168、US 2010/0055169、US 2010/0063135、US 2010/0076055、US 2010/0099738和US 2010/0104629中公开了其它阳离子脂质。
此外，阳离子脂质DLin-M-C3-DMA（即，4-(二甲氨基)丁酸[(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基]酯）公开于WO2010/105209。
传统阳离子脂质，如CLinDMA和DLinDMA已用于向肝递送siRNA，但受困于非最佳的递送效率以及在较高剂量下的肝毒性。本发明的一个目的是提供表现出增强的效力以及由于肝中较低的脂质水平而导致的较低的肝毒性的阳离子脂质支架（scaffold）。本发明使用包含至少一个短脂质链的低分子量阳离子脂质以增强siRNA的体内递送的效率和耐受性。
发明内容
本发明提供可以与其它脂质组分如胆固醇和PEG-脂质联合使用以与寡核苷酸形成脂质纳米粒的新型阳离子脂质。本发明的一个目的是提供表现出增强的效力以及由于肝中较低的脂质水平而导致的较低的肝毒性的阳离子脂质支架。本发明使用具有一个短脂质链的低分子量阳离子脂质以增强siRNA的体内递送的效率和耐受性。
附图说明
图1：小鼠中LNP（化合物1）效力。
图2：大鼠中LNP（化合物2）效力。
图3：大鼠肝中脂质（化合物2）水平。
具体实施方式
本发明的各种方面和实施方案涉及可用在脂质纳米粒中的新型阳离子脂质用于向任何靶基因递送寡核苷酸，特别是siRNA和miRNA的用途。（参见美国专利申请：US 2006/0083780、US 2006/0240554、US 2008/0020058、US 2009/0263407和US 2009/0285881和PCT专利申请：WO 2009/086558、WO2009/127060、WO2009/132131、WO2010/042877、WO2010/054384、WO2010/054401、WO2010/054405、WO2010/054406和WO2010/105209）。也参见Semple S. C.等人，Rational design of cationic lipids for siRNA delivery，Nature Biotechnology，于2010年1月17日在线刊载；doi:10.1038/nbt.1602。
本发明的阳离子脂质是用于递送寡核苷酸，尤其是siRNA和miRNA的脂质纳米粒中的有用组分。
在本发明的第一实施方案中，该阳离子脂质如式A或者其任何药学上可接受的盐或立体异构体所示：
Figure 381024DEST_PATH_IMAGE001
其中：
R1和R2独立地选自H、(C1-C6)烷基、杂环基和多胺，其中所述烷基、杂环基和多胺任选被1至3个选自R'的取代基取代，或者R1和R2可以与它们相连的氮一起形成除所述氮外还任选含有一个或两个选自N、O和S的额外杂原子的4-7元单环杂环，所述单环杂环任选被1至3个选自R'的取代基取代；
R3选自H和(C1-C6)烷基，所述烷基任选被1至3个选自R'的取代基取代；
R'独立地选自卤素、R''、OR''、SR''、CN、CO2R''和CON(R'')2；
R''独立地选自H和(C1-C6)烷基，其中所述烷基任选被卤素和OH取代；
n是0、1、2、3、4或5；
X选自O、NR''、(C=O)O、NR''(C=O)、O(C=O)O、NR''(C=O)NR''、O(C=O)NR''和NR''(C=O)O；
L1选自C4-C24烷基和C4-C24烯基，所述烷基和烯基任选被一个或多个选自R'的取代基取代；和
L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基，所述烷基和烯基任选被一个或多个选自R'的取代基取代。
在第二实施方案中，本发明涉及式A的化合物或者其任何药学上可接受的盐或立体异构体，
其中：
R1和R2各自是甲基；
R3是H；
n是3；
X是(C=O)O；
L1选自C4-C24烷基和C4-C24烯基；和
L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基。
具体的阳离子脂质是：
4-(二甲氨基)丁酸[(20Z,23Z)-二十九碳-20,23-二烯-10-基]酯（化合物1）；和
4-(二甲氨基)丁酸[(18Z)-二十七碳-18-烯-10-基]酯（化合物2）；
或者其任何可药用的盐或立体异构体。
在另一实施方案中，所公开的阳离子脂质可用于制备脂质纳米粒。
在另一实施方案中，所公开的阳离子脂质是用于递送寡核苷酸的脂质纳米粒中的有用组分。
在另一实施方案中，所公开的阳离子脂质是用于递送siRNA和miRNA的脂质纳米粒中的有用组分。
在另一实施方案中，所公开的阳离子脂质是用于递送siRNA的脂质纳米粒中的有用组分。
本发明的阳离子脂质可具有不对称中心、手性轴和手性面（如E.L. Eliel和S.H. Wilen, Stereochemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, 第1119-1190页中所述）并作为外消旋物、外消旋混合物和独立的非对映体存在，所有可能的异构体及其混合物，包括旋光异构体都包括在本发明中。此外，本文中所公开的阳离子脂质可作为互变异构体存在，且本发明的范围旨在包括这两种互变异构形式，尽管仅描绘了一种互变异构结构。
要理解的是，本领域普通技术人员可以选择本发明的阳离子脂质上的取代基和取代型式以提供化学稳定并可容易由易得的原材料通过本领域中已知的技术以及下文阐述的那些方法合成的阳离子脂质。如果取代基本身被多于一个基团取代，要理解的是，这多个基团可以在相同碳上或在不同碳上，只要产生稳定结构。
要理解的是，本领域普通技术人员可以将一个或多个Si原子并入本发明的阳离子脂质中以提供化学稳定并可容易由易得的原材料通过本领域中已知的技术合成的阳离子脂质。
在式A的化合物中，原子可能表现出它们的天然同位素丰度，或一个或多个原子可以人为地富集具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于自然界中主要发现的原子质量或质量数的特定同位素。本发明意在包括式A的化合物的所有合适的同位素变体。例如，氢(H)的不同同位素形式包括氕(1H)和氘(2H)。氕是自然界中发现的主要氢同位素。富集氘可提供某些治疗优点，如提高体内半衰期或降低剂量要求，或可提供可用作生物样品的表征的标准的化合物。无需过度实验，可通过本领域技术人员公知的常规技术或通过与本文中的方案和实施例中描述的那些类似的方法使用适当的同位素富集试剂和/或中间体制备式A内的同位素富集化合物。
如本文所用，“烷基”是指具有规定的碳原子数的直链、环状或支链饱和脂族烃。
如本文所用，“烯基”是指具有规定的碳原子数的直链、环状或支链不饱和脂族烃，包括但不限于二烯、三烯和四烯不饱和脂族烃。
环状“烷基”或“烯基”的实例是：
Figure 173530DEST_PATH_IMAGE002
。
如本文所用，“杂环基”或“杂环”是指含有1至4个选自O、N和S的杂原子的4-至10-元芳族或非芳族杂环，并包括双环基团。“杂环基”因此包括下列：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、indolazinyl、吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘吡啶基、噁二唑基、噁唑基、噁唑啉、异噁唑啉、氧杂环丁烷基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢吡喃基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮杂环丁烷基、1,4-二氧杂环己烷基、六氢氮杂䓬基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噁唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异噁唑基、二氢异噻唑基、二氢噁二唑基、二氢噁唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲二氧基苯甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基和它们的N-氧化物，所有这些都任选被1至3个选自R''的取代基取代。
本文所用的“多胺”意指具有两或更多个氨基的化合物。示例包括腐胺、尸胺、亚精胺和精胺。
如本文所用，“卤素”是指Br、Cl、F和I。
在式A的一个实施方案中，R1和R2独立地选自H和(C1-C6)烷基，其中所述烷基任选被1至3个选自R'的取代基取代，或者R1和R2可以与它们相连的氮一起形成除所述氮外还任选含有一个或两个选自N、O和S的额外杂原子的4-7元单环杂环，所述单环杂环任选被1至3个选自R'的取代基取代。
在式A的一个实施方案中，R1和R2独立地选自H、甲基、乙基和丙基，其中所述甲基、乙基和丙基任选被1至3个选自R'的取代基取代，或者R1和R2可以与它们相连的氮一起形成除所述氮外还任选含有一个或两个选自N、O和S的额外杂原子的4-7元单环杂环，所述单环杂环任选被1至3个选自R'的取代基取代。
在式A的一个实施方案中，R1和R2独立地选自H、甲基、乙基和丙基。
在式A的一个实施方案中，R1和R2各自是甲基。
在式A的一个实施方案中，R3独立地选自H和甲基。
在式A的一个实施方案中，R3是H。
在式A的一个实施方案中，R'是R''。
在式A的一个实施方案中，R''独立地选自H、甲基、乙基和丙基，其中所述甲基、乙基和丙基任选被一个或多个卤素和OH取代。
在式A的一个实施方案中，R''独立地选自H、甲基、乙基和丙基。
在式A的一个实施方案中，n是0、1、2、3或4。
在式A的一个实施方案中，n是2、3或4。
在式A的一个实施方案中，n是3。
在式A的一个实施方案中，X是O、NR''、(C=O)O、NR''(C=O)、O(C=O)O、NR''(C=O)NR''、O(C=O)NR''或NR''(C=O)O。
在式A的一个实施方案中，X是(C=O)O。
在式A的一个实施方案中，L1选自C4-C24烷基和C4-C24烯基，它们任选被卤素和OH取代。
在式A的一个实施方案中，L1选自C4-C24烷基和C4-C24烯基。
在式A的一个实施方案中，L1选自C4-C24烯基。
在式A的一个实施方案中，L1选自C12-C24烯基。
在式A的一个实施方案中，L1是C19烯基。
在式A的一个实施方案中，L1是：
Figure 890951DEST_PATH_IMAGE003
。
在式A的一个实施方案中，L1是
Figure 286160DEST_PATH_IMAGE004
。
在式A的一个实施方案中，L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基，它们任选被卤素和OH取代。
在式A的一个实施方案中，L2选自C5-C9烷基和C5-C9烯基，它们任选被卤素和OH取代。
在式A的一个实施方案中，L2选自C7-C9烷基和C7-C9烯基，它们任选被卤素和OH取代。
在式A的一个实施方案中，L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基。
在式A的一个实施方案中，L2选自C5-C9烷基和C5-C9烯基。
在式A的一个实施方案中，L2选自C7-C9烷基和C7-C9烯基。
在式A的一个实施方案中，L2是C3-C9烷基。
在式A的一个实施方案中，L2是C5-C9烷基。
在式A的一个实施方案中，L2是C7-C9烷基。
在式A的一个实施方案中，L2是C9烷基。
在式A的一个实施方案中，“杂环基”是吡咯烷、哌啶、吗啉、咪唑或哌嗪。
在式A的一个实施方案中，“单环杂环基”是吡咯烷、哌啶、吗啉、咪唑或哌嗪。
在式A的一个实施方案中，“多胺”是腐胺、尸胺、亚精胺或精胺。
在一个实施方案中，“烷基”是具有规定的碳原子数的直链饱和脂族烃。
在一个实施方案中，“烯基”是指具有规定的碳原子数的直链不饱和脂族烃。
在本发明中包括式A的阳离子脂质的游离形式，及其药学上可接受的盐和立体异构体。本文中例举的一些分离的特定阳离子脂质是胺阳离子脂质的质子化盐。术语“游离形式”是指非盐形式的胺阳离子脂质。包含的药学上可接受的盐不仅包括为本文所述的特定阳离子脂质例举的分离的盐，还包括式A的阳离子脂质的游离形式的所有典型的药学上可接受的盐。可以使用本领域中已知的技术分离所述特定的盐阳离子脂质的游离形式。例如，可以通过用合适的稀碱水溶液，如稀NaOH、碳酸钾、氨和碳酸氢钠水溶液处理该盐来再生游离形式。游离形式在某些物理性质，如在极性溶剂中的溶解度方面可能略微不同于它们各自的盐形式，但对本发明的目的而言，酸盐和碱盐在其它方面在制药学上等同于它们各自的游离形式。
可以由含有碱性或酸性部分的本发明的阳离子脂质通过常规化学方法合成本发明的阳离子脂质的药学上可接受的盐。通常，通过离子交换色谱法或通过使游离碱与化学计算量或与过量的所需成盐无机酸或有机酸在合适的溶剂或各种溶剂组合中反应制备碱性阳离子脂质的盐。类似地，通过与适当的无机碱或有机碱的反应形成酸性化合物的盐。
因此，本发明的阳离子脂质的药学上可接受的盐包括通过使本发明碱性阳离子脂质与无机酸或有机酸反应形成的本发明的阳离子脂质的常规无毒盐。例如，常规无毒盐包括衍生自无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的那些，以及由有机酸，如乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯基乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸、三氟乙酸（TFA）等制成的盐。
当本发明的阳离子脂质是酸性时，合适的“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱，包括无机碱和有机碱制成的盐。衍生自无机碱的盐包括铝、铵、钙、铜、三价铁、亚铁、锂、镁、三价锰盐、亚锰、钾、钠、锌等。特别优选的是铵、钙、镁、钾和钠盐。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺，包括天然存在的取代的胺、环状胺和碱性离子交换树脂，如精氨酸、甜菜碱咖啡因、胆碱、N,N1-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡萄糖胺、葡糖胺、组氨酸、哈胺、异丙胺、赖氨酸、甲基葡萄糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等的盐。
Berg等人, “Pharmaceutical Salts,” J. Pharm. Sci., 1977:66:1-19更充分描述了上述药学上可接受的盐和其它典型的药学上可接受的盐的制备。
还要指出，本发明的阳离子脂质可能是内盐或两性离子，因为在生理条件下，该化合物中的脱质子酸性部分，如羧基可能是阴离子型的，并且这种电子电荷可能随后被质子化或烷基化的碱性部分，如季氮原子的阳离子电荷内部平衡掉。
实施例
提供的实施例意在助于进一步理解本发明。所用的特定材料、种类和条件意在进一步例示本发明而非限制其合理范围。用于合成阳离子脂质的试剂可商购得到或容易由本领域普通技术人员制备。
新阳离子脂质的合成是从脂质酸（i）起始的线性过程。与N,O-二甲基羟胺的偶联得到Weinreb酰胺ii。格氏加成生成酮iii。所述酮还原生成醇iv。经EDC偶联进行的酯化得到v型酯。
一般方案 1
Figure 100532DEST_PATH_IMAGE005
4-( 二甲氨基 ) 丁酸 [(20Z,23Z)- 二十九碳 -20,23- 二烯 -10- 基 ] 酯（化合物 1 ）
Figure 356283DEST_PATH_IMAGE006
在环境温度，将(11Z,14Z)-11,14-二十碳二烯酸（50g、162 mmol）、N,O-二甲基羟胺盐酸化物（31.6 g、324 mmol）、HOAt（44.1 g、324 mmol）、Et3N（45.2 mL、324 mmol）和 EDC（62.1 g、324 mmol）在DCM（810 mL）中混合并搅拌过夜。反应体系随后用5 x 700 mL水洗涤，然后用1 x 600 mL 1 M NaOH洗涤，用硫酸钠干燥，经硅藻土过滤并蒸发，得到 53.06 g（93%）(11Z,14Z)-N-甲氧基-N-甲基-11,14-二十碳二烯酰胺，为澄清的金色油。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 5.35（m，4H），3.68（s，3H），3.18（s，3H），2.77（m，2H），2.41（t，J = 7 Hz，2H），2.05（m，4H），1.63（m，2H），1.40-1.26（m，18H），0.89（t，J = 7 Hz，3H）。
Figure 623316DEST_PATH_IMAGE007
在250 mL烧瓶中，将(11Z,14Z)-N-甲氧基-N-甲基-11,14-二十碳二烯酰胺（4 g、11.38 mmol）溶于干燥THF（50.0 mL），然后在环境温度、氮气下添加1 M壬基溴化镁（22.76 mL、22.76 mmol）。10分钟后，反应体系慢慢地用过量的饱和NH4Cl水溶液淬灭。用己烷和水将反应体系冲入分液漏斗中，振摇，弃去下部水层，上层用硫酸钠干燥、过滤并蒸发，得到粗制酮，为金色油。将该粗制酮直接带入下一反应。
将酮（6.32 g、15.1 mmol、1当量）溶于EtOH（75 mL），添加NaBH4（2.86 g、75 mmol、5当量）。室温搅拌15分钟后，蒸发反应体系得到残余物，将残余物溶解于己烷（200mL）和水（200mL）中，分离有机层，用硫酸钠干燥、过滤并蒸发，得到(20Z,23Z)-20,23-二十九碳二烯-10-醇（iv），为白色固体，其即可使用而无需进一步提纯。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ 5.35（m，4H），3.58（m，1H），2.77（m，2H），2.05（m，4H），1.48-1.22（m，39H），0.89（m，6H）。
Figure 428778DEST_PATH_IMAGE009
将4-(二甲氨基)丁酸盐酸化物（3.03 g、18.05 mmol、1.2当量）、(20Z,23Z)-20,23-二十九碳二烯-10-醇（iv）（6.33 g、15.04 mmol、1当量）、EDC（3.46 g、18.05 mmol、1.2当量）、DMAP（0.368 g、3.01 mmol、0.2当量）和 DIEA（7.88 mL、45.1 mmol、3当量）在DCM（100mL）中混合，并在环境温度搅拌16小时。然后，反应体系用1 x 250 mL饱和NaHCO3溶液洗涤，之后将下部有机层直接注入到 330 g二氧化硅柱，用0-15% MeOH/DCM洗脱30分钟以进行纯化。收集4-(二甲氨基)丁酸[(11Z,14Z)-1-壬基-11,14-二十碳二烯-1-基]酯（1），为黄色油。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ 5.35（m，4H），4.87（m，1H），2.77（m，2H），2.34-2.26（m，4H），2.22（s，6H），2.05（m，4H），1.79（m，2H），1.51（m，4H），1.38-1.22（m，34H），0.88（m，6H）。
4-( 二甲氨基 ) 丁酸 [(18Z)- 二十七碳 -18- 烯 -10- 基 ] 酯（化合物 2 ）
Figure 359825DEST_PATH_IMAGE010
以与上文针对化合物1所述类似的方式制备化合物2。HRMS（M+H）计算值508.5088，实测值508.5091。
化合物3是如WO 2010/054401和WO 2010/144740 A1所述的MC3。
Figure 114155DEST_PATH_IMAGE011
化合物4是如Nature Biotechnology，2010，28，172-176、WO 2010/042877 A1、WO 2010/048536 A2、WO 2010/088537 A2和WO 2009/127060 A1所述的DLinKC2DMA。
LNP组合物
本发明的以下脂质纳米粒组合物（LNP）可用于递送寡核苷酸，特别是siRNA和miRNA：
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG 56.6/38/5.4；
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG 60/38/2；
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG 67.3/29/3.7；
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG 49.3/47/3.7；
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG 50.3/44.3/5.4；
阳离子脂质/胆固醇/PEG-C-DMA/DSPC 40/48/2/10；
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG/DSPC 40/48/2/10；和
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG/DSPC 58/30/2/10。
LNP 工艺描述：
通过撞击射流法制备脂质纳米粒(LNP)。通过将溶解在醇中的脂质与溶解在柠檬酸盐缓冲液中的siRNA混合，形成粒子。脂质与siRNA的混合比目标为45-55%脂质和65-45% siRNA。该脂质溶液含有本发明的新型阳离子脂质、辅助脂质（胆固醇）、PEG（例如PEG-C-DMA、PEG-DMG）脂质和DSPC（浓度为5-15 mg/mL，目标为9-12 mg/mL，在醇（例如乙醇）中）。脂质的比率具有25-98（目标为35-65）的阳离子脂质的摩尔%范围，0-75（目标为30-50）的辅助脂质的摩尔%范围，1-15（目标为1-6）的PEG脂质的摩尔%范围，0-15（目标为0-12）的DSPC的摩尔%范围。该siRNA溶液在pH为3.5-5的柠檬酸钠缓冲的盐溶液中以0.3至1.0 mg/mL的浓度范围（目标是0.3-0.9 mg/mL）含有一种或多种siRNA序列。将这两种液体加热至15-40℃（目标是30-40℃）的温度，然后在撞击射流混合器中混合，立即形成LNP。该teeID具有0.25至1.0 mm的范围且总流速为10-600 mL/min。流速和管ID的组合具有将LNPs的粒度控制在30至200纳米之间的作用。然后将该溶液与更高pH的缓冲溶液以1:1至1:3体积:体积，但目标是1:2体积:体积的混合比混合。这种缓冲溶液处于15-40℃（目标是30-40℃）的温度。该混合LNPs在阴离子交换过滤步骤之前保持30分钟至2小时。培养过程中的温度为15-40℃，目标是30-40℃。在培养后，该溶液经含有阴离子交换分离步骤的0.8微米过滤器过滤。这种方法使用1 mm ID至5 mm ID的管ID和10至2000 mL/min的流速。该LNPs通过超滤法浓缩和渗滤，在所述超滤法中除去醇并将柠檬酸盐缓冲液交换成最终缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水。该超滤法使用切向流过滤模式（TFF）。这种方法使用30-500 KD的膜标称分子量筛截。膜形式可以是中空纤维或平板盒（flat sheet cassette）。具有适当的分子量筛截的TFF法使LNP保留在渗余物中，且滤液或渗透液含有醇；柠檬酸盐缓冲剂；最终缓冲废物。该TFF法是最初浓缩至1-3 mg/mL的siRNA浓度的多步骤法。在浓缩后，该LNPs溶液针对最终缓冲液渗滤10-20体积以除去醇和进行缓冲液交换。然后将该材料浓缩另外的1-3倍。该LNP法的最终步骤是无菌过滤该浓缩的LNP溶液并将产物装入小瓶。
分析程序：
1 ） siRNA 浓度
通过强阴离子交换高效液相色谱法(SAX-HPLC)使用带有2996 PDA检测器的Waters 2695 Alliance系统(Water Corporation, Milford MA)测定siRNA双链体浓度。LNPs，也称作RNAi递送载体（Delivery Vehicles）（RDVs）用0.5% Triton X-100处理以释放总siRNA并通过使用具有在254 nm的UV检测的Dionex BioLC DNAPac PA 200 (4 × 250 mm)柱的SAX分离分析。流动相由A: 25 mM NaClO4, 10 mM Tris, 20% EtOH, pH 7.0和B: 250 mM NaClO4, 10 mM Tris, 20% EtOH, pH 7.0构成，线性梯度为0-15 min，流速为1 ml/min。通过与siRNA标准曲线比较，测定siRNA量。
2 ）包封率
荧光试剂SYBR Gold用于RNA量化以监测RDVs的包封率。使用具有或不具有Triton X-100的RDVs测定游离siRNA和总siRNA量。使用来自Molecular Devices (Sunnyvale, CA)的SpectraMax M5e微量培养板分光光度计进行检测。样品在485纳米下激发并在530纳米下测量荧光发射。通过与siRNA标准曲线比较，测定siRNA量。
包封率 =（1 - 游离siRNA/总siRNA）×100%
3 ）粒度和多分散性
将含有1微克siRNA的RDVs用1 × PBS稀释至3毫升的最终体积。通过使用ZetaPALS仪器(Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY)的动态光散射法测量样品的粒度和多分散性。用He–Ne激光器在25℃下以90°的散射角测量散射强度。
4 ）ζ电位分析
将含有1微克siRNA的RDVs用1 mM Tris缓冲液(pH 7.4)稀释至2毫升的最终体积。使用带有电极和作为光源的He–Ne激光器的ZetaPALS仪器(Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY)测定样品的电泳迁移率。在ζ电位的计算中假设Smoluchowski极限（Smoluchowski limit）。
5 ）脂质分析
通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）使用带有电晕带电气溶胶检测器（CAD）（ESA Biosciences, Inc, Chelmsford, MA）的Waters 2695 Alliance系统(Water Corporation, Milford MA)测定各脂质浓度。使用带有CAD的Agilent Zorbax SB-C18 (50 × 4.6 mm, 1.8 μm粒度)柱在60℃下分析RDVs中的各脂质。流动相由A: 在H2O中的0.1% TFA和B: 在IPA中的0.1% TFA构成。梯度从时间0的60%流动相A和40%流动相B变成1.00分钟的40%流动相A和60%流动相B；1.00至5.00分钟为40%流动相A和60%流动相B；从5.00分钟的40%流动相A和60%流动相B变成10.00分钟的25%流动相A和75%流动相B；从10.00分钟的25%流动相A和75%流动相B变成15.00分钟的5%流动相A和95%流动相B；和从15.00分钟的5%流动相A和95%流动相B变成20.00分钟的60%流动相A和40%流动相B，流速为1 ml/min。通过与RDVs中的所有脂质组分采用二次曲线拟合的标准曲线比较，测定各脂质浓度。基于其分子量计算各脂质的摩尔百分比。
利用上述LNP法，鉴定了具有以下比率的特定LNP：
标称组成：
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG 60/38/2；和
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG/DSPC 58/30/2/10。
寡核苷酸的合成在本领域中是众所周知的。(参见US专利申请：US 2006/0083780、US 2006/0240554、US 2008/0020058、US 2009/0263407和US 2009/0285881；和PCT专利申请：WO 2009/086558、WO2009/127060、WO2009/132131、WO2010/042877、WO2010/054384、WO2010/054401、WO2010/054405和WO2010/054406)。结合到实施例所公开和使用的LNP中的Luc和ApoB siRNA经标准固相程序合成。
Luc siRNA
5'-iB-A U AAGG CU A U GAAGAGA U ATT-iB 3'（SEQ.ID.NO.:1）
3'-UUUAUUCCGAUACUUCUC UAU-5'（SEQ.ID.NO.:2）
AUGC―核糖
iB―反向脱氧脱碱基（Inverted deoxy abasic）
UC―2' 氟
AGT―2' 脱氧
AGU―2' OCH3
标称组成
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG 60/38/2
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG/DSPC 40/48/2/10
阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG/DSPC 58/30/2/10
ApoB siRNA
5'-iB-CUUUAACAAUUCCUGAAAUTsT-iB-3'（SEQ ID NO.:3）
3'-UsUGAAAUUGUUAAGGACUsUsUsA-5'（SEQ ID NO.:4）
AUGC―核糖
iB―反向脱氧脱碱基
UC―2' 氟
AGT―2' 脱氧
AGU―2' OCH3
UsA―硫代磷酸酯连接键。
实施例 1
小鼠体内效力评估
评估使用上文刚描述的标称组成中的化合物1的LNPs的体内效力。所述siRNA靶向萤火虫（北美萤火虫（Photinus pyralis））荧光素酶基因（Accession # M15077）的mRNA转录物。上面显示了荧光素酶siRNA的基本序列和化学修饰模式。体内荧光素酶模型使用转基因小鼠，其中在所有细胞中都存在萤火虫荧光素酶编码序列。通过首先用重组Ad-Cre病毒（Vector Biolabs）除去LSL序列，诱发Dana Farber Cancer Institute许可的ROSA26-LoxP-Stop-LoxP-Luc (LSL-Luc)转基因小鼠表达荧光素酶基因。由于该病毒的亲器官性质，在通过尾静脉注射递送时，表达仅限于肝。通过在给药虫荧光素底物（Caliper Life Sciences）后使用IVIS图像仪(Xenogen)测量光输出，量化肝中的荧光素酶表达水平。在给药RDVs之前测量给药前的发光水平。以150微升的体积腹膜内（IP）注射在PBS中的虫荧光素（15毫克/毫升）。在4分钟培养期后，小鼠用异氟烷麻醉并置于IVIS图像仪中。以0.2毫升体积尾静脉注射在PBS赋形剂中的RDVs（含有siRNA）。最终剂量水平为0.1至0.5 mg/kg siRNA。PBS赋形剂作为对照物单独给药。小鼠在给药后48小时使用上述方法成像。虫荧光素光输出的变化与荧光素酶 mRNA水平直接相关并代表荧光素酶siRNA活性的间接量度。体内效力结果以与给药前发光水平相比发光的抑制%表示。荧光素酶siRNA RDVs的全身给药以剂量依赖性方式降低荧光素酶表达。在被给予含有化合物1的RDVs的小鼠中观察到比被给予含有辛基-CLinDMA (OCD)阳离子脂质的RDV的小鼠中更高的效力（图1）。OCD是已知并在WO2010/021865中描述的。
实施例 2
大鼠体内效力和毒性评估
在Sprague-Dawley (Crl:CD(SD)雌性大鼠(Charles River Labs))中评估使用上述标称组成中的化合物的LNPs的体内效力和丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶的升高。siRNA靶向ApoB基因（Accession # NM 019287）的mRNA转录物。上面显示了ApoB siRNA的基本序列和化学修饰模式。将在PBS赋形剂中的RDVs（含有siRNA）以1至1.5毫升的体积尾静脉注射。输注速率为大约3毫升/分钟。在各给药组中使用五只大鼠。在LNP给药后，将大鼠置于存在正常饮食和水的笼子中。在给药后6小时，从笼中取出食物。在LNP给药后24小时进行动物尸体剖检。大鼠在异氟烷下麻醉5分钟，然后将它们放置在继续输送异氟烷的头锥体（nose cone）中以保持麻醉，直至完成放血。使用23号计量蝶式静脉穿刺套件（butterfly venipuncture set）从腔静脉收集血液并等分到血清分离器真空采血管（vacutainers）中以进行血清化学分析。取离体尾状肝叶的打孔切片（Punches）并置于RNALater (Ambion)中以用于mRNA分析。将保存的肝组织匀浆并使用Qiagen砂磨机和Qiagen miRNA-Easy RNA提取试剂盒依据制造商的说明书提取总RNA。通过定量RT-PCR测定肝ApoB mRNA水平。利用大鼠ApoB商业探针套件（Applied Biosystems Cat # RN01499054_m1）从纯化RNA中放大信息(Message)。在带有96-孔Fast Block的ABI 7500仪器上进行PCR反应。将ApoB mRNA水平标准化至管家PPIB (NM 011149) mRNA。使用商业探针套件（Applied Biosytems Cat. No. Mm00478295_m1）通过RT-PCR测定PPIB mRNA水平。结果以ApoB mRNA/PPIB mRNA的比率表示。所有mRNA数据相对于PBS对照剂量表示。在Siemens Advia 1800 Clinical Chemistry Analyzer上使用Siemens 丙氨酸转氨酶(Cat# 03039631)和天冬氨酸转氨酶(Cat# 03039631)试剂进行血清ALT和AST分析。与含有阳离子脂质DLinKC2DMA（化合物4）或MC3（化合物3，图2）的RDV相比，在被给予含有化合物2的RDV的大鼠中观察到类似的效力。此外，用3 mg/kg DLinKC2DMA（化合物4）处理的4只大鼠中有3只没能活过48小时，用3 mg/kg MC3（化合物3）处理的4只大鼠中有2只没能活过48小时。用6 mg/kg化合物2处理的4只大鼠中有3只在给药后48小时存活。
实施例 3
大鼠肝中阳离子脂质水平的测定
将肝组织称到20毫升小瓶中并在9 v/w水中使用GenoGrinder 2000 (OPS Diagnostics, 1600下/分钟, 5min)匀浆。将50微升各组织匀浆的等分试样与300微升提取/蛋白质沉淀溶剂（含有500 nM内标的50/50乙腈/甲醇）混合并将该板离心以使沉淀的蛋白质沉降。然后将200微升体积的各上清液转移到96孔板的单独的孔中并通过LC/MS-MS直接分析10微升样品。
通过将已知量的化合物的甲醇储备溶液掺入未处理的大鼠肝匀浆（9体积水/重量肝）中，制备标样。将各标样/肝匀浆的等分试样（50微升）与300微升提取/蛋白质沉淀溶剂（含有500 nM内标的50/50乙腈/甲醇）混合并将该板离心以使沉淀的蛋白质沉降。将200微升体积的各上清液转移到96孔板的单独的孔中并通过LC/MS-MS直接分析10微升各标样。
使用偶联到API 4000三重四极质谱仪（Applied Biosystems）上的Aria LX-2 HPLC系统（Thermo Scientific）进行对照由肝匀浆制备和提取的标样的绝对量化。对各运行而言，在环境温度下将总共10微升样品注射到BDS Hypersil C8 HPLC柱 (Thermo, 50 x 2mm, 3 µm)上。
流动相 A: 95% H2O/5% 甲醇/10 mM甲酸铵/0.1%甲酸。流动相B: 40%甲醇/60%正丙醇/10 mM甲酸铵/0.1%甲酸。流速为0.5 mL/min且梯度洗脱分布如下：保持80% A 0.25分钟，经1.6分钟线性升至100% B，在100% B保持2.5分钟，然后恢复并保持在80% A 1.75分钟。总运行时间为5.8分钟。API 4000源参数为CAD: 4、CUR: 15、GS1: 65、GS2: 35、IS: 4000、TEM: 550、CXP: 15、DP: 60、EP: 10。在被给予含有化合物2的RDV的大鼠中，肝水平比被给予含有阳离子脂质DLinKC2DMA（化合物4）或MC3（化合物3，图3）的RDV的大鼠的肝水平更低。
序列表
<110> Merck Sharp & Dohme Corp.
Colletti, Stephen L.
Stanton, Matthew G.
<120> 用于寡核苷酸递送的新型低分子量阳离子脂质
<130> MRL-MIS-00046
<150> US 61/405,413
<150> 2010-10-21
<160> 4
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 酶促核酸
<221> misc_feature
<222> (1)...(1)
<223> 2'-脱氧
<221> misc_feature
<222> (2)...(2)
<223> 2'-氟
<221> misc_feature
<222> (3)...(6)
<223> 2'-脱氧
<221> misc_feature
<222> (7)...(8)
<223> 2'-氟
<221> misc_feature
<222> (9)...(9)
<223> 2'-脱氧
<221> misc_feature
<222> (10)...(10)
<223> 2'-氟
<221> misc_feature
<222> (11)...(17)
<223> 2'-脱氧
<221> misc_feature
<222> (18)...(18)
<223> 2'-氟
<221> misc_feature
<222> (19)...(21)
<223> 2'-脱氧
<400> 1
auaaggcuau gaagagauat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 酶促核酸
<221> misc_feature
<222> (1)...(3)
<223> 核糖
<221> misc_feature
<222> (4)...(9)
<223> 2'-氟
<221> misc_feature
<222> (10)...(10)
<223> 2'-o-甲基
<221> misc_feature
<222> (11)...(11)
<223> 2'-氟
<221> misc_feature
<222> (12)...(13)
<223> 2'-o-甲基
<221> misc_feature
<222> (14)...(17)
<223> 2'-氟
<221> misc_feature
<222> (18)...(18)
<223> 2'-o-甲基
<221> misc_feature
<222> (19)...(19)
<223> 2'-氟
<221> misc_feature
<222> (20)...(21)
<223> 2'-o-甲基
<400> 2
uuuauuccga uacuucucua u 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 氨基连接体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 反向脱氧脱碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 2' 氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 针对此序列所描述的未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> 2' 脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> 2' 氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(9)
<223> 2' 脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> 2' 氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 2' 脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 2' 氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 2' 脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> 2' 氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> 2' 脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 2' 氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 2' 脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 反向脱氧脱碱基
<400> 3
cuagcuggac acgucgauat t 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 2' 氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> 2' O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 2' 氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 2' O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 2' 氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> 2' O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(13)
<223> 2' 氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 2' O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> 2' 氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(21)
<223> 2' O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<400> 4
uaucgacgug uccagcuagu u 21

Claims (7)

1.式A的阳离子脂质或者其任何药学上可接受的盐或立体异构体：
Figure 410534DEST_PATH_IMAGE001
其中：
R1和R2独立地选自H、(C1-C6)烷基、杂环基和多胺，其中所述烷基、杂环基和多胺任选被1至3个选自R'的取代基取代，或者R1和R2可以与它们相连的氮一起形成除所述氮外还任选含有一个或两个选自N、O和S的额外杂原子的4-7元单环杂环，所述单环杂环任选被1至3个选自R'的取代基取代；
R3选自H和(C1-C6)烷基，所述烷基任选被1至3个选自R'的取代基取代；
R'独立地选自卤素、R''、OR''、SR''、CN、CO2R''或CON(R'')2；
R''独立地选自H和(C1-C6)烷基，其中所述烷基任选被卤素和OH取代；
n是0、1、2、3、4或5；
X选自O、NR''、(C=O)O、NR''(C=O)、O(C=O)O、NR''(C=O)NR''、O(C=O)NR''和NR''(C=O)O；
L1选自C4-C24烷基和C4-C24烯基，所述烷基和烯基任选被一个或多个选自R'的取代基取代；和
L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基，所述烷基和烯基任选被一个或多个选自R'的取代基取代。
2.根据权利要求1的式A的阳离子脂质或者其任何药学上可接受的盐或立体异构体，
其中：
R1和R2各自是甲基；
R3是H；
n是3；
X是(C=O)O；
L1选自C4-C24烷基和C4-C24烯基；和
L2选自C3-C9烷基和C3-C9烯基。
3.一种阳离子脂质，其是：
4-(二甲氨基)丁酸[(20Z,23Z)-二十九碳-20,23-二烯-10-基]酯（化合物1）；和
4-(二甲氨基)丁酸[(18Z)-二十七碳-18-烯-10-基]酯（化合物2）；
或者其任何药学上可接受的盐或立体异构体。
4.根据权利要求1的阳离子脂质用于制备脂质纳米粒的用途。
5.根据权利要求1的阳离子脂质作为用于递送寡核苷酸的脂质纳米粒中的组分的用途。
6.根据权利要求5的用途，其中所述寡核苷酸是siRNA或miRNA。
7.根据权利要求5的用途，其中所述寡核苷酸是siRNA。
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