CN104356233B - 一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用。本发明公开一种制备人热休克蛋白gp96的scFv抗体的方法，是将gp96抗体的重链可变区和compα螺旋在原核细胞中进行融合表达得到融合蛋白。本发明公开的人热休克蛋白gp96的scFv抗体具有抑制癌细胞的生长或增殖、诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞侵袭或转移、抑制肿瘤生长等作用，对于癌症的治疗具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种人热休克蛋白gp96的抗体及其制备方法与应用；特别涉及一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用。
背景技术
热休克蛋白(gp96蛋白)存在于人和动物几乎所有细胞的内质网膜中，也存在于某些细胞的质膜上，它是热休克蛋白90家族(HSP90)中的成员。
人的全长gp96蛋白由803个氨基酸组成，自N末端第1至21个氨基酸残基组成信号肽，因此成熟的gp96蛋白由782个氨基酸组成。gp96蛋白是糖蛋白，该分子拥有6个潜在的糖基化位点。
犬类的gp96(与人的gp96高度同源，有98.5％的同源性)与ATP结合的晶体结构已经解析，单个分子分为N端结构域、中间(M)结构域和C端结构域，gp96蛋白以同源二聚体的形式存在，其N端结合ATP，C端形成二聚化，整个二聚体从C端到N端围绕分子中轴左旋扭曲形成扭曲的V字形。
gp96蛋白与ATP的结合及发挥水解ATP的功能与其构象变化相关，其构象变化涉及N端结构域和M段结构域的90°的旋转，gp96蛋白构象变化引发与其它蛋白的结合或释放。
新型小分子抗体单链可变区片段(scFv)是由一弹性接头(linker)将VH和VL连接而成的两个可变区首尾相接的单一肽链,通过正确折叠，两个可变区由非共价键形成具有抗原结合功能的Fv段，此单一肽链的结构既有利于表达和进行基因重组操作，也增加了Fv的稳定性。scFv抗体具有抗原结合部位的最小功能结构单位，由于其分子量小、体内半衰期短、免疫原性低、易于基因工程操作等特点而倍受关注。
Comp是来源于软骨寡聚基质蛋白的α螺旋肽段，该肽段自然存在于人类多种蛋白质中，主要参与蛋白的寡聚化。
发明内容
本发明的目的是提供一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用。
本发明提供一种制备人热休克蛋白gp96的scFv抗体的方法，是将gp96抗体的重链可变区和compα螺旋在原核细胞中进行融合表达得到融合蛋白；
所述gp96抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第3位至第116位所示；
所述compα螺旋的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第123位至第170位所示；
所述融合蛋白为由含有gp96抗体的重链可变区和compα螺旋的抗体单体在所述原核细胞中自动组装形成的多聚体。
上述方法中，所述gp96抗体的重链可变区和所述compα螺旋分别在所述含有gp96抗体的重链可变区和compα螺旋的抗体单体中的N端和C端。
上述任一所述的方法中，所述融合表达的方法是将5’-3’方向依次含有gp96抗体的重链可变区编码基因和compα螺旋编码基因的DNA片段导入所述原核细胞中。
上述任一所述的方法中，所述gp96抗体的重链可变区编码基因如SEQ ID No.1中自5’末端起第7位至第348位核苷酸所示；
所述compα螺旋编码基因如SEQ ID No.1中自5’末端起第367位至第510位核苷酸所示。
上述任一所述的方法中，所述5’-3’方向依次含有gp96抗体的重链可变区编码基因和compα螺旋编码基因的DNA片段如SEQ ID No.1所示；
所述含有gp96抗体的重链可变区和compα螺旋的抗体单体的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示；
所述DNA片段是通过重组表达载体导入所述原核细胞中的，所述重组表达载体具体是将SEQ ID No.1所示的DNA分子插入pET28a(+)质粒EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点间得到的；
所述原核细胞为大肠杆菌；
所述大肠杆菌具体为BL21(DE3)。
上述任一所述的方法中，所述表达之后还包括细胞裂解、离心收集沉淀并将沉淀进行层析分离的步骤；
所述细胞裂解的方法具体为超声破碎。
上述任一所述的方法中，所述层析分离包括镍离子亲和层析和分子筛层析；
所述镍离子亲和层析的步骤如下：
a、用8M的尿素溶液预平衡镍离子柱；
b、将所述离心收集的沉淀溶解后得到的上清加入镍离子柱；
c、用8M的尿素溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去非特异性结合的蛋白；
d、用60mM咪唑溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去杂蛋白；
所述60mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述60mM咪唑溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述60mM咪唑溶液中的浓度为0.5M,所述尿素在所述60mM咪唑溶液中的浓度为8M,所述咪唑在所述60mM咪唑溶液中的浓度为60mM，所述60mM咪唑溶液的pH为7.7；
e、用500mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，记作蛋白液1；
所述500mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述500mM咪唑溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述500mM咪唑溶液中的浓度为0.5M,所述尿素在所述500mM咪唑溶液中的浓度为8M,所述咪唑在所述500mM咪唑溶液中的浓度为500mM，所述500mM咪唑溶液的pH为7.7；
所述8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述8M的尿素溶液中的浓度为0.5M,所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M,所述咪唑在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述8M的尿素溶液的pH为7.7；
所述分子筛层析具体为Superdex 200分子筛层析；
所述Superdex 200分子筛层析的步骤如下：
a、用pH7-7.4的PBS溶液预平衡Superdex 200分子筛至少2个柱体积；
b、将蛋白液1加入分子筛；
c、用pH7-7.4的PBS溶液冲洗分子筛，收集洗脱液，在280nm处测定洗脱液的吸收值，收集分子量为440kD-669kD的洗脱峰，即为所述人热休克蛋白gp96的scFv抗体。
上述任一所述的方法中，所述离心收集沉淀和所述将沉淀进行层析分离之间还包括如下洗涤和调pH的步骤：
a、用1M的尿素溶液洗涤所述离心收集的沉淀，离心收集沉淀，记作沉淀1；
所述1M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl和尿素，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述1M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述1M的尿素溶液中的浓度为0.1M,所述尿素在所述1M的尿素溶液中的浓度为1M，所述1M的尿素溶液的pH为7.7；
b、用2M的尿素溶液洗涤沉淀1，离心收集沉淀，记作沉淀2；
所述2M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl和尿素，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述2M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述2M的尿素溶液中的浓度为0.1M,所述尿素在所述2M的尿素溶液中的浓度为2M，所述2M的尿素溶液的pH为7.7；
c、用3M的尿素溶液洗涤沉淀2，离心收集沉淀，记作沉淀3；
所述3M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl和尿素，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述3M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述3M的尿素溶液中的浓度为0.1M,所述尿素在所述3M的尿素溶液中的浓度为3M，所述3M的尿素溶液的pH为7.7；
d、将沉淀3用8M的尿素溶液溶解，得到蛋白溶液；
所述8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述8M的尿素溶液中的浓度为0.5M,所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M,所述咪唑在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述8M的尿素溶液的pH为7.7；
e、将步骤d得到的蛋白溶液pH值调至10.0；
所述蛋白溶液pH值调至10.0时所用的试剂具体为NaOH水溶液，再具体为1M的NaOH水溶液；
f、离心取上清，记作上清1；
g、将上清1的pH值调回至7.7；
所述将上清1的pH值调回至7.7时所用的试剂具体为HCl的水溶液，再具体为体积百分含量为10％的HCl的水溶液；
h、离心取上清，记作上清2，即为所述镍离子亲和层析中所述步骤b中的所述沉淀溶解后得到的上清；
所述镍离子亲和层析和所述分子筛层析之间还包括将所述蛋白液1透析和浓缩的步骤；
所述浓缩为用10kD的超滤管超滤浓缩。
上述任一所述的方法中，所述人热休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其编码基因序列如SEQ ID No.3所示。
由上述任一所述的方法制备得到的人热休克蛋白gp96的scFv抗体也属于本发明的保护范围。
上述抗体在制备具有抗人热休克蛋白gp96的活性的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
上述抗体在制备抑制癌细胞的生长或增殖、促进癌细胞凋亡、抑制癌细胞侵袭或转移或抑制肿瘤生长的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
所述癌细胞具体为乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞或胃癌细胞；
所述乳腺癌细胞具体为SKBr3细胞；
所述肝癌细胞具体为SK-Hep-1细胞；
所述肺癌细胞具体为NCI-H460细胞；
所述前列腺癌细胞具体为PC-3细胞；
所述胃癌细胞具体为BGC-823细胞；
所述肿瘤具体为乳腺肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤、胃肿瘤或肝肿瘤；
或，
上述抗体在制备预防和/或治疗癌症的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
所述癌为乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌或肝癌。
本发明提供的人热休克蛋白gp96的scFv抗体是将Comp肽段与gp96抗体重链可变区在大肠杆菌中融合表达，所表达的融合蛋白在细菌体内自然形成的多聚体，该多聚体蛋白经复性后大大增强了与癌细胞表面gp96蛋白的结合能力，从而达到抑制肿瘤的目的。
本发明提供的人热休克蛋白gp96的scFv抗体具有抑制癌细胞的生长或增殖、诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞侵袭或转移、抑制肿瘤生长等作用，对于癌症的治疗具有重大价值。
附图说明
图1为Superdex 200分子筛分离纯化结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
ATCC即美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写，网址为http://www.atcc.org/。
JCRB即日本细胞库，网址为http://cellbank.nibio.go.jp。
PBS缓冲液的制备：将8g NaCl、0.2g KCl、3.625g Na2HPO4·12H2O、0.24g KH2PO4溶解在适量水中，并用水定容至1L，调pH为7.3。
SKBr3细胞(又称SK-BR-3细胞，属于乳腺癌细胞)购自ATCC，ATCC编号为HTB-30。
MDA-MB-231细胞(属于乳腺癌细胞)购自ATCC，ATCC编号为HTB-26。
SK-Hep-1细胞(又称SK-HEP-1细胞，属于肝癌细胞)购自ATCC，ATCC编号为HTB-52。
Bel-7402细胞(属于肝癌细胞)购自中国典型培养物保藏中心CCTCC，CCTCC编号为GDC0035。
NCI-H460细胞(属于肺癌细胞)购自ATCC，ATCC编号为HTB-177。
A549细胞(属于肺癌细胞)购自ATCC，ATCC编号为CCL-185。
PC-3细胞(属于前列腺癌细胞)购自ATCC，ATCC编号为CRL-1435。
DU-145细胞(又称DU 145，属于前列腺癌细胞)购自ATCC，ATCC编号为HTB-81。
BGC-823细胞(属于胃癌细胞)在文献“Wu XM,Shao XQ,Meng XX,Zhang XN,Zhu L,Liu SX,Lin J,Xiao HS.Genome-wide analysis of microRNA and mRNA expressionsignatures in hydroxycamptothecin-resistant gastric cancer cells.ActaPharmacol Sin 2011；32:259-69.”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
MNK-45细胞(又称MNK45细胞，属于胃癌细胞)购自JCRB，JCRB编号为JCRB0254。
pET28a(+)购自武汉华美生物工程有限公司，产品目录号为CSB-PL200040。
大肠杆菌BL21(DE3)购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为CB105-02。
Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒购自同仁化学研究所，货号为CK04-05。
Apoptosis Assay kit购自Invitrogen公司，产品目录号为V13244。
BALB/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实施例1、人热休克蛋白gp96的scFv抗体gp96-scFv-comp的制备
一、pET28a-gp96-scFv-comp载体的构建
1、gp96-scFv-comp基因的合成
合成SEQ ID No.1所示的DNA分子，SEQ ID No.1所示的DNA分子自5’末端起第1位至第6位为EcoRⅠ酶切位点、第7位至第348位为gp96抗体重链可变区(gp96-scFv)的编码基因序列、第349位至第357位为甘氨酸(3个)的编码基因序列、第358位至第366位为NotI酶切位点、第367位至第510位为compα螺旋编码基因序列、第511位至第519位为甘氨酸(3个)的编码基因序列，第520位至第528位为XbaI酶切位点及保护性碱基。
2、EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切SEQ ID No.1所示的DNA分子，得到基因片段；EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pET28a(+)质粒，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pET28a-gp96-scFv-comp，将pET28a-gp96-scFv-comp送测序，结果正确。
二、原核表达gp96-scFv-comp抗体
利用大肠杆菌表达gp96-scFv-comp抗体蛋白，具体方法如下：
1、将重组质粒pET28a-gp96-scFv-comp转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，从平板上挑取单菌落接入含100mg/mL卡那霉素的2×YT培养基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，加水定容至1000mL)活化，得到活化液；取活化液接入2×YT培养基，37℃培养至OD600值为0.6-1.0，然后加入IPTG(使其终浓度为1mmol/L)，37℃诱导4h，离心收集菌体。
2、菌体用PBS缓冲液重悬，冰浴条件下超声破碎(200W，破碎4s停6s，99次3个循环)，然后4℃12000转/min离心20min，去上清，收集沉淀。
3、用干净的玻璃棒轻轻刮去沉淀表层暗黄色的杂质。
4、用1M的尿素溶液(由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl和尿素，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述1M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述1M的尿素溶液中的浓度为0.1M,所述尿素在所述1M的尿素溶液中的浓度为1M，所述1M的尿素溶液的pH为7.7)洗涤沉淀两遍，然后4℃12000转/min离心20min，去上清，收集沉淀。
5、用2M的尿素溶液(由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl和尿素，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述2M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述2M的尿素溶液中的浓度为0.1M,所述尿素在所述2M的尿素溶液中的浓度为2M，所述2M的尿素溶液的pH为7.7)洗涤沉淀两遍，然后4℃12000转/min离心20min，去上清，收集沉淀。
6、用3M的尿素溶液(由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl和尿素，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述3M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述3M的尿素溶液中的浓度为0.1M,所述尿素在所述3M的尿素溶液中的浓度为3M，所述3M的尿素溶液的pH为7.7)洗涤沉淀两遍，然后4℃12000转/min离心20min，去上清，收集沉淀。
三、gp96-scFv-comp抗体的纯化
1、将步骤二收集的沉淀用8M的尿素溶液(溶质为Na2HPO4、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na2HPO4在8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在8M的尿素溶液中的浓度为0.5M,所述尿素在8M的尿素溶液中的浓度为8M,所述咪唑在8M的尿素溶液中的浓度为20mM，8M的尿素溶液的pH为7.7)溶解，得到蛋白溶液。
2、加入1M的NaOH水溶液将蛋白溶液的pH值调至10.0，室温下搅拌混匀10分钟。
3、4℃12000转/min离心20min，去沉淀，取上清，记作上清1。
4、加入体积百分含量10％的HCl水溶液将上清1的pH值调回至7.7。
5、4℃12000转/min离心20min，去沉淀，取上清，记作上清2。
6、利用镍离子柱亲和层析法纯化上清2，步骤如下：
a、用8M的尿素溶液(溶质为Na2HPO4、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na2HPO4在8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在8M的尿素溶液中的浓度为0.5M,所述尿素在8M的尿素溶液中的浓度为8M,所述咪唑在8M的尿素溶液中的浓度为20mM，8M的尿素溶液的pH为7.7)预平衡镍离子柱(至少3个柱体积，具体为3-5个柱体积)；
b、将上清2缓慢加入镍离子柱；
c、用8M的尿素溶液(溶质为Na2HPO4、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na2HPO4在8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在8M的尿素溶液中的浓度为0.5M,所述尿素在8M的尿素溶液中的浓度为8M,所述咪唑在8M的尿素溶液中的浓度为20mM，8M的尿素溶液的pH为7.7)冲洗镍离子柱(至少5个柱体积，具体为5个柱体积)；
d、用60mM咪唑溶液(由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；Na2HPO4在所述60mM咪唑溶液中的浓度为20mM，NaCl在所述60mM咪唑溶液中的浓度为0.5M,尿素在所述60mM咪唑溶液中的浓度为8M,咪唑在所述60mM咪唑溶液中的浓度为60mM，所述60mM咪唑溶液的pH为7.7)冲洗镍离子柱(至少5个柱体积，具体为5个柱体积)；
e、用500mM咪唑溶液(由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；Na2HPO4在所述500mM咪唑溶液中的浓度为20mM，NaCl在所述500mM咪唑溶液中的浓度为0.5M,尿素在所述500mM咪唑溶液中的浓度为8M,咪唑在所述500mM咪唑溶液中的浓度为500mM，所述500mM咪唑溶液的pH为7.7)(约3个柱体积)洗脱目的蛋白。
7、将步骤6洗脱得到的目的蛋白溶液置于4℃PBS透析液中透析。
8、透析后的蛋白溶液经10kD规格的超滤管超滤浓缩至2mL，得到浓缩液。
9、将浓缩液经Superdex 200分子筛分离纯化，步骤如下：
a、用pH7-7.4(具体为pH7.4)的PBS溶液预平衡Superdex 200分子筛(至少2个柱体积，具体为2个柱体积)；
b、用上样环将浓缩液加入分子筛中；
c、用pH7-7.4(具体为pH7.4)的PBS溶液冲洗分子筛，并在280nm处测定洗脱液的吸收值，结果如图1中A所示；
d、在图1A中的多聚体蛋白主峰处(图1A中箭头所示)收集蛋白，蛋白经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，将该多聚体命名为gp96-scFv-comp抗体。
在上述Superdex 200分子筛分离纯化相同条件下建立各个已知分子量蛋白的洗脱曲线，结果如图1中B所示，根据图1得到gp96-scFv-comp抗体的分子量为440kD-669kD。
gp96-scFv-comp抗体是由gp96-scFv-comp抗体单体在大肠杆菌中自动连接而成的，这是Comp蛋白的特性。
10、采用BCA法测定蛋白浓度，最后将蛋白分装，贮存于-80℃。
gp96-scFv-comp抗体单体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，SEQ ID No.2中自N端起第3位到第116位为gp96抗体重链可变区(gp96-scFv)氨基酸序列，第117位到第119位为甘氨酸(三个)序列，第123位到第170位为compα螺旋的氨基酸序列，第171位到173位为甘氨酸(三个)序列。
gp96重链可变区(gp96-scFv)的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第33位到第37位氨基酸所示，其编码基因序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第97位至第111位核苷酸所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第52位到第68位氨基酸所示，其编码基因序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第154位至第204位核苷酸所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第101位到第105位氨基酸所示，其编码基因序列如SEQ IDNo.1中自5’末端起第301位至第315位核苷酸所示。
人热休克蛋白gp96的编码基因序列如SEQ ID No.3所示，其氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。
实施例2、gp96-scFv-comp抗体对肿瘤细胞增殖的抑制
通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒分别检测实施例1制备的gp96-scFv-comp抗体对各种癌细胞(SKBr3细胞、SK-Hep-1细胞、NCI-H460细胞、PC-3细胞或BGC-823细胞)增殖的抑制作用。具体操作步骤如下：
一、将浓度为50000个细胞/ml的各细胞液加入96孔板中，每种细胞设置24个复孔，每孔加入0.1ml。
二、分组处理
实验组：待细胞贴壁后，向各细胞的12个孔中分别加入0.1ml浓度为100ug/ml的gp96-scFv-comp抗体；
对照组：待细胞贴壁后，向各细胞的另外12个孔中分别加入0.1ml PBS缓冲液；
实验组和对照组的细胞均在37℃正常培养，从分组处理开始计时，分别在不同检测时间点(0，24，48，72小时)取各细胞的各组样本进行细胞增殖抑制率的检测，每次检测取各细胞的各组的3个孔的样本。
三、每孔样本加入CCK-8检测试剂(CCK-8试剂盒自带)10ul，37℃孵育2小时后测定490nm的OD值，得到OD490nm。
细胞增殖抑制率＝(对照组OD490nm值的平均值-实验组OD490nm值的平均值)/对照组OD490nm值的平均值×100％。
对照组OD490nm值的平均值即为对照组各检测时间点各个样本孔OD490nm值的平均值。
实验组OD490nm值的平均值即为实验组各检测时间点各个样本孔OD490nm值的平均值。
结果表明，72小时后，gp96-scFv-comp抗体对SKBr3细胞的增殖抑制率为60％，对SK-Hep-1细胞的增殖抑制率为63％，对NCI-H460细胞的增殖抑制率为57％，对PC-3细胞的增殖抑制率为62％，对BGC-823细胞的增殖抑制率为65％。
实验证明，实施例1制备的gp96-scFv-comp抗体能显著抑制SKBr3细胞、SK-Hep-1细胞、NCI-H460细胞、PC-3细胞和BGC-823细胞的增殖。
实施例3、gp96-scFv-comp抗体对肿瘤细胞的诱导凋亡
分别检测实施例1的gp96-scFv-comp抗体对各种癌细胞(SKBr3细胞、SK-Hep-1细胞、NCI-H460细胞、PC-3细胞或BGC-823细胞)凋亡的促进作用。具体步骤如下：
一、将各细胞液接种于6孔细胞培养板，每孔1ml，20万个细胞/孔。
二、分组处理
实验组(每种细胞设置3个复孔)：待细胞贴壁后，每孔加入0.1ml浓度为100ug/ml的gp96-scFv-comp抗体，37℃正常培养48小时；
阴性对照组(每种细胞设置3个复孔)：待细胞贴壁后，每孔加入0.1mlPBS缓冲液，37℃正常培养48小时。
三、按照试剂盒Apoptosis Assay kit说明对各孔细胞染色后通过流式细胞仪分析结果，具体操作步骤如下：
1、用胰酶常规消化细胞，用PBS缓冲液洗细胞两遍。
2、用20ul 1×Annexin V Buffer将细胞轻轻悬起来，加入1ul的FITC annexin V后轻轻混匀，室温避光染色15分钟。
3、向反应管中加入1×Annexin V Buffer使终体积为200ul。
4、加入浓度为100ug/ml的PI，使其终浓度为1ug/ml，室温避光染色3分钟左右即可上机检测(凋亡率由流式细胞仪直接测出)。
实验组比阴性对照组增加的细胞凋亡率的计算公式为：实验组细胞凋亡率-阴性对照组细胞凋亡率。
结果均取三个复孔的平均值。
采用gp96-scFv-comp抗体诱导时：对于SKBr3细胞，阴性对照组的细胞凋亡率为3.0％，实验组比阴性对照组增加的细胞凋亡率为50％；对于SK-Hep-1细胞，阴性对照组的细胞凋亡率为4.3％，实验组比阴性对照组增加的细胞凋亡率为50％；对于NCI-H460细胞，阴性对照组的细胞凋亡率为5％，实验组比阴性对照组增加的细胞凋亡率为53％；对于PC-3细胞，阴性对照组的细胞凋亡率为4.7％，实验组比阴性对照组增加的细胞凋亡率为54％；对于BGC-823细胞，阴性对照组的细胞凋亡率为3.6％，实验组比阴性对照组增加的细胞凋亡率为49％。
实验证明，实施例1制备的gp96-scFv-comp抗体能明显促进SKBr3细胞、SK-Hep-1细胞、NCI-H460细胞、PC-3细胞和BGC-823细胞的凋亡。
实施例4、gp96-scFv-comp抗体对肿瘤细胞侵袭的抑制
分别检测实施例1的gp96-scFv-comp抗体对对各种癌细胞(SKBr3细胞、SK-Hep-1细胞、NCI-H460细胞、PC-3细胞或BGC-823细胞)侵袭作用的抑制效应。具体步骤如下：
一、将各细胞液接种于6孔细胞培养板，每孔1ml，20万个细胞/孔。
实验组：六孔板中铺入各种癌细胞，待细胞贴壁后，每孔加入0.1ml浓度为100ug/ml的gp96-scFv-comp抗体，37℃正常培养48小时；
阴性对照组：待细胞贴壁后，每孔加入0.1mlPBS缓冲液，37℃正常培养48小时。
二、将Matrigel Membrane Matrix(购自Invitrogen)放入4℃冰箱过夜融化，将transwell、EP管和枪头过夜预冷。
三、将Matrigel Membrane Matrix用预冷的PBS缓冲液以1:9的比例稀释后，在每个transwell中加入80μl。
四、37℃过夜，使Matrigel Membrane Matrix充分凝固。
五、将各细胞消化、计数，用对应细胞的无血清的细胞培养基稀释成细胞悬液。
六、在transwell的上部加入体积为100μl的1x105个细胞的各细胞悬液(含100ug/ml的gp96-scFv-comp抗体)。
七、在transwell的下部加入600μl含体积百分含量为10％的胎牛血清的对应细胞的正常细胞培养基。
八、将细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中培养24-48小时(取决于各细胞周期和侵袭能力)。
九、将预冷的甘油和PBS缓冲液以体积比1:1的比例混合，加入DAPI，使其终浓度达到1μg/mL，得到DAPI溶液。
十、取出transwell，弃去上部培养基，用棉棒轻轻刮去Matrigel MembraneMatrix。
十一、用镊子轻轻撕下transwell底部的膜，放入DAPI溶液中2分钟。
十二、预冷的PBS缓冲液洗三遍。
十三、封片。
十四、显微镜下观察结果，随机选取5-10个视野计数。
细胞侵袭抑制率＝(对照组视野中细胞总数-实验组视野中细胞总数)/对照组视野中细胞总数×100％。
采用gp96-scFv-comp抗体处理各种癌细胞，相对于阴性对照组，SKBr3细胞的侵袭抑制率为60％，SK-Hep-1细胞的侵袭抑制率为70％，NCI-H460细胞的侵袭抑制率为63％，PC-3细胞的侵袭抑制率为67％，BGC-823细胞的侵袭抑制率为65％。
实验证明，实施例1制备的gp96-scFv-comp抗体能明显抑制SKBr3细胞、SK-Hep-1细胞、NCI-H460细胞、PC-3细胞和BGC-823细胞的侵袭能力。
实施例5、gp96-scFv-comp抗体抑制乳腺肿瘤的生长
分别检测实施例1的gp96-scFv-comp抗体对乳腺癌细胞(SKBr3细胞或MDA-MB-231细胞)的移植瘤生长的抑制作用。具体步骤如下：
一、将培养至对数生长期的乳腺癌细胞皮下接种BALB/c裸鼠，每只接种500万SKBr3细胞或MDA-MB-231细胞。
二、7-14天后，待小鼠肿瘤长至100mm3，将形成肿瘤的小鼠随机分成两组，分别进行如下治疗处理：
gp96-scFv-comp抗体组(5只小鼠)：用gp96-scFv-comp抗体溶液(用PBS缓冲液稀释)进行腹腔注射治疗，每次每只注射0.5ml(含200ug gp96-scFv-comp抗体蛋白)，每周治疗两次(分别于该周的第二天和第五天)；
阴性对照组(5只小鼠)：用PBS缓冲液进行腹腔注射治疗，每次每只注射0.5ml，每周治疗两次(分别于该周的第二天和第五天)。
三、连续治疗5周后处死裸鼠，称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率(均计算该组的平均值)。
肿瘤抑制率的计算公式如下：(阴性对照组小鼠的肿瘤重量-gp96-scFv-comp抗体组小鼠的肿瘤重量)/阴性对照组小鼠的肿瘤重量×100％。
对于接种SKBr3细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为1.2g(p<0.01)，gp96-scFv-comp抗体对于接种SKBr3细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为74％；对于接种MDA-MB-231细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为1.1g(p<0.01)，gp96-scFv-comp抗体对于接种MDA-MB-231细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为77％。
实验证明，实施例1制备的gp96-scFv-comp抗体能有效抑制乳腺癌肿瘤生长。
实施例6、gp96-scFv-comp抗体抑制肺癌肿瘤的生长
分别检测实施例1的gp96-scFv-comp抗体对肺癌细胞(NCI-H460细胞或A549细胞)的移植瘤生长的抑制作用。具体步骤如下：
一、将培养至对数生长期的肺癌细胞皮下接种BALB/c裸鼠，每只接种500万NCI-H460细胞或A549细胞。
二、7-14天后，待小鼠肿瘤长至100mm3，将形成肿瘤的小鼠随机分成两组，分别进行如下治疗处理：
gp96-scFv-comp抗体组(5只小鼠)：用gp96-scFv-comp抗体溶液(用PBS缓冲液稀释)进行腹腔注射治疗，每次每只注射0.5ml(含200ug gp96-scFv-comp抗体蛋白)，每周治疗两次(分别于该周的第二天和第五天)；
阴性对照组(5只小鼠)：用PBS缓冲液进行腹腔注射治疗，每次每只注射0.5ml，每周治疗两次(分别于该周的第二天和第五天)。
三、连续治疗5周后处死裸鼠，称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率(均计算该组的平均值)。
肿瘤抑制率的计算公式如下：(阴性对照组小鼠的肿瘤重量-gp96-scFv-comp抗体组小鼠的肿瘤重量)/阴性对照组小鼠的肿瘤重量×100％。
对于接种NCI-H460细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为1.1g(p<0.01)，gp96-scFv-comp抗体对于接种NCI-H460细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为80％；对于接种A549细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为1.3g(p<0.01)，gp96-scFv-comp抗体对于接种A549细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为77％。
实验证明，实施例1制备的gp96-scFv-comp抗体能有效抑制肺癌肿瘤生长。
实施例7、gp96-scFv-comp抗体抑制前列腺癌肿瘤生长
分别检测实施例1的gp96-scFv-comp抗体对前列腺癌细胞(PC-3细胞或DU-145细胞)的移植瘤生长的抑制作用。具体步骤如下：
一、将培养至对数生长期的前列腺癌细胞皮下接种BALB/c裸鼠，每只接种500万PC-3细胞或DU-145细胞。
二、7-14天后，待小鼠肿瘤长至100mm3，将形成肿瘤的小鼠随机分成两组，分别进行如下治疗处理：
gp96-scFv-comp抗体组(5只小鼠)：用gp96-scFv-comp抗体溶液(用PBS缓冲液稀释)进行腹腔注射治疗，每次每只注射0.5ml(含200ug gp96-scFv-comp抗体蛋白)，每周治疗两次(分别于该周的第二天和第五天)；
阴性对照组(5只小鼠)：用PBS缓冲液进行腹腔注射治疗，每次每只注射0.5ml，每周治疗两次(分别于该周的第二天和第五天)。
三、连续治疗5周后处死裸鼠，称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率(均计算该组的平均值)。
肿瘤抑制率的计算公式如下：(阴性对照组小鼠的肿瘤重量-gp96-scFv-comp抗体组小鼠的肿瘤重量)/阴性对照组小鼠的肿瘤重量×100％。
对于接种PC-3细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为1.4g(p<0.01)，gp96-scFv-comp抗体对于接种PC-3细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为75％；对于接种DU-145细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为1.2g(p<0.01)，gp96-scFv-comp抗体对于接种DU-145细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为91％。
实验证明，实施例1制备的gp96-scFv-comp能有效抑制前列腺癌肿瘤生长。
实施例8、gp96-scFv-comp抗体抑制胃癌肿瘤生长
分别检测实施例1的gp96-scFv-comp抗体对胃癌细胞(BGC-823细胞或MNK-45细胞)的移植瘤生长的抑制作用。具体步骤如下：
一、将培养至对数生长期的胃癌细胞皮下接种BALB/c裸鼠，每只接种500万BGC-823细胞或MNK-45细胞。
二、7-14天后，待小鼠肿瘤长至100mm3，将形成肿瘤的小鼠随机分成两组，分别进行如下治疗处理：
gp96-scFv-comp抗体组(5只小鼠)：用gp96-scFv-comp抗体溶液(用PBS缓冲液稀释)进行腹腔注射治疗，每次每只注射0.5ml(含200ug gp96-scFv-comp抗体蛋白)，每周治疗两次(分别于该周的第二天和第五天)；
阴性对照组(5只小鼠)：用PBS缓冲液进行腹腔注射治疗，每次每只注射0.5ml，每周治疗两次(分别于该周的第二天和第五天)。
三、连续治疗5周后处死裸鼠，称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率(均计算该组的平均值)。
肿瘤抑制率的计算公式如下：(阴性对照组小鼠的肿瘤重量-gp96-scFv-comp抗体组小鼠的肿瘤重量)/阴性对照组小鼠的肿瘤重量×100％。
对于接种MNK-45细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为1.2g(p<0.01)，gp96-scFv-comp抗体对于接种MNK-45细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为74％；对于接种BGC-823细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为1.4g(p<0.01)，gp96-scFv-comp抗体对于接种BGC-823细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为82％。
实验证明，实施例1制备的gp96-scFv-comp抗体能有效抑制胃癌肿瘤生长。
实施例9、gp96-scFv-comp抗体抑制肝癌肿瘤生长
分别检测实施例1的gp96-scFv-comp抗体对肝癌细胞(SK-Hep-1细胞或Bel-7402细胞)的移植瘤生长的抑制作用。具体步骤如下：
一、将培养至对数生长期的肝癌细胞皮下接种BALB/c裸鼠，每只接种500万SK-Hep-1细胞或Bel-7402细胞。
二、7-14天后，待小鼠肿瘤长至100mm3，将形成肿瘤的小鼠随机分成两组，分别进行如下治疗处理：
gp96-scFv-comp抗体组(5只小鼠)：用gp96-scFv-comp抗体溶液(用PBS缓冲液稀释)进行腹腔注射治疗，每次每只注射0.5ml(含200ug gp96-scFv-comp抗体蛋白)，每周治疗两次(分别于该周的第二天和第五天)；
阴性对照组(5只小鼠)：用PBS缓冲液进行腹腔注射治疗，每次每只注射0.5ml，每周治疗两次(分别于该周的第二天和第五天)。
三、连续治疗5周后处死裸鼠，称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率(均计算该组的平均值)。
肿瘤抑制率的计算公式如下：(阴性对照组小鼠的肿瘤重量-gp96-scFv-comp抗体组小鼠的肿瘤重量)/阴性对照组小鼠的肿瘤重量×100％。
对于接种SK-Hep-1细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为1.4g(p<0.01)，gp96-scFv-comp抗体对于接种SK-Hep-1细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为70％；对于接种Bel-7402细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为1.3g(p<0.01)，gp96-scFv-comp抗体对于接种Bel-7402细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为73％。
实验证明，实施例1制备的gp96-scFv-comp抗体能有效抑制肝癌肿瘤生长。
Claims (14)
1.一种制备人热休克蛋白gp96的scFv抗体的方法，是将gp96抗体的重链可变区和compα螺旋在原核细胞中进行融合表达得到融合蛋白；
所述gp96抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第3位至第116位所示；
所述compα螺旋的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第123位至第170位所示；
所述融合蛋白为由含有gp96抗体的重链可变区和compα螺旋的抗体单体在所述原核细胞中自动组装形成的多聚体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述gp96抗体的重链可变区和所述compα螺旋分别在所述含有gp96抗体的重链可变区和compα螺旋的抗体单体中的N端和C端。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述融合表达的方法是将5’-3’方向依次含有gp96抗体的重链可变区编码基因和compα螺旋编码基因的DNA片段导入所述原核细胞中。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述gp96抗体的重链可变区编码基因如SEQ ID No.1中自5’末端起第7位至第348位核苷酸所示；
所述compα螺旋编码基因如SEQ ID No.1中自5’末端起第367位至第510位核苷酸所示。
5.根据权利要求3任一所述的方法，其特征在于：所述5’-3’方向依次含有gp96抗体的重链可变区编码基因和compα螺旋编码基因的DNA片段如SEQ ID No.1所示；
所述含有gp96抗体的重链可变区和compα螺旋的抗体单体的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示；
所述DNA片段是通过重组表达载体导入所述原核细胞中的，所述重组表达载体具体是将SEQ ID No.1所示的DNA分子插入pET28a(+)质粒EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点间得到的；
所述原核细胞为大肠杆菌。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述表达之后还包括细胞裂解、离心收集沉淀并将沉淀进行层析分离的步骤。
7.根据权利要求6任一所述的方法，其特征在于：所述层析分离包括镍离子亲和层析和分子筛层析；
所述镍离子亲和层析的步骤如下：
a、用8M的尿素溶液预平衡镍离子柱；
b、将所述离心收集的沉淀溶解后得到的上清加入镍离子柱；
c、用8M的尿素溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去非特异性结合的蛋白；
d、用60mM咪唑溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去杂蛋白；
所述60mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述60mM咪唑溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述60mM咪唑 溶液中的浓度为0.5M,所述尿素在所述60mM咪唑溶液中的浓度为8M,所述咪唑在所述60mM咪唑溶液中的浓度为60mM，所述60mM咪唑溶液的pH为7.7；
e、用500mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，记作蛋白液1；
所述500mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述500mM咪唑溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述500mM咪唑溶液中的浓度为0.5M,所述尿素在所述500mM咪唑溶液中的浓度为8M,所述咪唑在所述500mM咪唑溶液中的浓度为500mM，所述500mM咪唑溶液的pH为7.7；
所述8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述8M的尿素溶液中的浓度为0.5M,所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M,所述咪唑在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述8M的尿素溶液的pH为7.7；
所述分子筛层析具体为Superdex 200分子筛层析；
所述Superdex 200分子筛层析的步骤如下：
a、用pH7-7.4的PBS溶液预平衡Superdex 200分子筛至少2个柱体积；
b、将蛋白液1加入分子筛；
c、用pH7-7.4的PBS溶液冲洗分子筛，收集洗脱液，在280nm处测定洗脱液的吸收值，收集分子量为440kD-669kD的洗脱峰，即为所述人热休克蛋白gp96的scFv抗体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述离心收集沉淀和所述将沉淀进行层析分离之间还包括如下洗涤和调pH的步骤：
a、用1M的尿素溶液洗涤所述离心收集的沉淀，离心收集沉淀，记作沉淀1；
所述1M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl和尿素，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述1M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述1M的尿素溶液中的浓度为0.1M,所述尿素在所述1M的尿素溶液中的浓度为1M，所述1M的尿素溶液的pH为7.7；
b、用2M的尿素溶液洗涤沉淀1，离心收集沉淀，记作沉淀2；
所述2M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl和尿素，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述2M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述2M的尿素溶液中的浓度为0.1M,所述尿素在所述2M的尿素溶液中的浓度为2M，所述2M的尿素溶液的pH为7.7；
c、用3M的尿素溶液洗涤沉淀2，离心收集沉淀，记作沉淀3；
所述3M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl和尿素，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述3M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述3M的尿素溶液中 的浓度为0.1M,所述尿素在所述3M的尿素溶液中的浓度为3M，所述3M的尿素溶液的pH为7.7；
d、将沉淀3用8M的尿素溶液溶解，得到蛋白溶液；
所述8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HPO4、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na2HPO4在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述8M的尿素溶液中的浓度为0.5M,所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M,所述咪唑在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述8M的尿素溶液的pH为7.7；
e、将步骤d得到的蛋白溶液pH值调至10.0；
f、离心取上清，记作上清1；
g、将上清1的pH值调回至7.7；
h、离心取上清，记作上清2，即为所述镍离子亲和层析中所述步骤b中的所述沉淀溶解后得到的上清；
所述镍离子亲和层析和所述分子筛层析之间还包括将所述蛋白液1透析和浓缩的步骤。
9.由权利要求1-8任一所述的方法制备得到的人热休克蛋白gp96的scFv抗体。
10.权利要求9所述的抗体在制备具有抗人热休克蛋白gp96的活性的产品中的应用。
11.权利要求9所述的抗体在制备抑制癌细胞的生长或增殖、促进癌细胞凋亡、抑制癌细胞侵袭或转移或抑制肿瘤生长的产品中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述癌细胞为乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞或胃癌细胞；
所述肿瘤为乳腺肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤、胃肿瘤或肝肿瘤。
13.权利要求9所述的抗体在制备预防和/或治疗癌症的产品中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述癌为乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌或肝癌。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |