CN110386985A

CN110386985A - 一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白及其用途

Info

Publication number: CN110386985A
Application number: CN201810356331.7A
Authority: CN
Inventors: 杨浩; 卢晓风
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2018-04-19
Filing date: 2018-04-19
Publication date: 2019-10-29
Anticipated expiration: 2038-04-19
Also published as: CN110386985B

Abstract

本发明提供了一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白，它由TRAIL片段及肿瘤导向肽RGR连接而成。本发明还提供了该融合蛋白的制备方法和用途。本发明融合蛋白可以显著增强TRAIL片段的抗肿瘤活性，在体内外均对多种肿瘤模型表现出强大的杀伤甚至清除能力，可作为高效的潜在广谱抗肿瘤药物，临床应用前景良好。

Description

一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白及其用途

技术领域

本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白及其用途。

背景技术

癌症是致人类死亡的主要疾病之一，据WHO统计2015年全球约880万癌症相关死亡病例。目前，临床上治疗癌症主要依赖手术切除、放疗和化疗三种传统方法，存在着手术会造成创伤及并发症，放化疗具有毒副作用影响患者生活质量等缺点。肿瘤治疗的理想目标是药物能高效进入肿瘤组织杀伤肿瘤细胞但对正常细胞无损伤，避免给机体带来毒副作用(Yap et al.,Nat Rev Cancer 2009,9(3):167-81；Gotwals et al.,Nat Rev Cancer2017,17(5):286-301)。

TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)即Apo-2L，是肿瘤坏死因子超家族成员之一，是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，研究表明TRAIL主要通过两条不同的信号通路调控细胞凋亡，即死亡受体介导的外源性凋亡途径和线粒体介导的内源性凋亡途径。正常细胞则可通过上调诱骗受体等多种机制逃逸TRAIL诱导的凋亡反应。因此，TRAIL能选择性的诱导肿瘤细胞凋亡而对机体正常组织无明显损伤。目前，通过基因工程重组的胞外段(114-281aa)可溶性TRAIL(Soluble TRAIL，sTRAIL)作为抗肿瘤药物已进入临床试验II期。

然而，重组sTRAIL在体内的抗肿瘤效果远不及其体外作用效果。由于sTRAIL受体分布广泛，与正常细胞诱骗受体的结合可能会阻碍sTRAIL向肿瘤组织富集和活性的发挥。更为重要的是，肿瘤细胞常常表现出对sTRAIL的抗性，使得sTRAIL凋亡诱导能力不足(Dimberg et al.,Oncogene 2013,32(11):1341-50；de Miguel et al.,Cell DeathDiffer 2016,23(5):733-47)。通过改进sTRAIL蛋白，有望提高其对肿瘤的靶向性并增强对肿瘤细胞的凋亡诱导能力。

肿瘤导向肽是一类能够特异识别并结合肿瘤组织的小分子肽，可作为肿瘤靶向载体。公开号为EP 2567983 A1的专利申请报道了一种由肿瘤导向肽NGR与sTRAIL连接的重组多肽，其仅在一定程度上提高了sTRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对肿瘤细胞具有良好杀伤作用的肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白及其用途。

本发明提供了一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白，它由TRAIL片段及肿瘤导向肽RGR连接而成，其中肿瘤导向肽RGR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：CRGRRST

其中，所述TRAIL片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

VRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

其中，它还包含连接肽；优选地，连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.3：GGGGSGGGGSGGGGS

其中，所述肿瘤导向肽RGR连接在TRAIL片段的N端。

其中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.4：

CRGRRSTGGGGSGGGGSGGGGSVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

SED ID NO.5：

VRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGGGGSGGGGSGGGGSCRGRRST

本发明还提供了编码上述融合蛋白的核苷酸序列；其中，核苷酸序列如SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7所示。

SEQ ID NO.6：

tgccgtggccgccgtagcactggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggctaa；

SEQ ID NO.7：

gtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggcggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgtgccgtggccgccgtagcacttaa。

本发明还提供了上述融合蛋白的制备方法，步骤如下：

用上述核苷酸序列构建表达载体，并将其在宿主细胞中诱导表达纯化；

其中，所述表达载体为pQE30重组载体，所述宿主细胞为大肠杆菌M15，所说纯化方法为镍离子金属鳌合亲和层析法。

本发明还提供了上述融合蛋白、核苷酸序列在制备抗肿瘤药物中的用途。

其中，所述肿瘤为结肠癌、胆管癌、乳腺癌、肝癌、肺癌和/或宫颈癌。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，它是以上述融合蛋白或核苷酸序列为活性成分，加入其它辅料或辅助性成分制备而成。

本发明提供的融合蛋白，利用肿瘤导向肽RGR融合sTRAIL，可以显著增强sTRAIL片段的抗肿瘤活性，尤其是RGR-TRAIL重组融合蛋白，在体内外均对多种肿瘤模型表现出强大的杀伤甚至清除能力，可作为高效的潜在广谱抗肿瘤药物，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1RGR靶向的TRAIL突变体构建示意图

TRAIL胞外段114-281氨基酸部分为可溶表达结构域，命名为sTRAIL。将肿瘤导向肽RGR分别融合至sTRAIL的N端和C端，构建RGR-TRAIL和TRAIL-RGR重组蛋白。示意图基于Pathway Builder Tool 2.0版构建。

图2重组蛋白的SDS-PAGE还原电泳

图3融合RGR增强了TRAIL对肿瘤细胞的活性

细胞存活率测定显示，将RGR与sTRAIL融合，尤其是连接至sTRAIL的N末端，显著增强了sTRAIL对肿瘤细胞的杀伤活性，但对正常细胞HUVEC无明显细胞毒性。

图4RGR-TRAIL在体内的靶向性

重组蛋白用FAM染料标记后，通过尾静脉注射，不同时间点取瘤体冰冻切片进行免疫荧光染色。FAM标记的蛋白呈绿色荧光，CD31抗体染色的肿瘤血管内皮细胞呈红色荧光，细胞核复染为蓝色荧光。

图5不同融合方式对结肠癌COLO205的体内抑制效果比较

A.肿瘤生长至近160mm³时，尾静脉按照5mg/kg剂量给药1次(箭头所示)，绘制瘤体生长曲线。B.治疗观察结束后的瘤体重量比较。*P<0.05；***P<0.001。C.注射后16h，取肿瘤进行TUNEL染色显示细胞凋亡情况(绿色)，并以DAPI复染细胞核(蓝色)。

图6不同融合方式对结肠癌LS174T体内抑制效果比较

A.肿瘤生长至近150mm³时，尾静脉按照5mg/kg剂量注射(箭头所示)，绘制瘤体生长曲线。B.治疗观察结束后的瘤体重量比较。*P<0.05。

图7NGR-TRAIL和RGR-TRAIL体内外活性的比较(A)体外对COLO 205细胞的杀伤活性比较。(B)体内对COLO205肿瘤生长抑制。n.s.表示无显著性差异，*P<0.05，***P<0.001。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1本发明融合蛋白的制备

1.融合蛋白的设计和基因克隆

本发明的TRAIL是截取人胞外段TRAIL114-281氨基酸片段，该部分溶解较好，命名为sTRAIL。

肿瘤导向肽RGR由7个氨基酸组成，分别设计连接在sTRAIL的N末端和C末端，两片段之间加入柔性连接子，优选的为(G₄S)₃，防止两部分由于空间位阻效应影响对各自受体的结合。各自序列见表1。

RGR融合在sTRAIL的N末端和C末端形成的融合蛋白，分别命名为RGR-TRAIL和TRAIL-RGR(如图1所示)。

表1本发明涉及的氨基酸及核酸序列

利用核酸分析软件Vector NTI Advance 11.5.1，将各片段编码基因进行拼接，获得上述sTRAIL融合蛋白编码基因，然后交付南京金斯瑞公司合成。本实例中，蛋白的生产以pQE30(购自QIAGEN)大肠杆菌表达载体为代表。为方便克隆，在sTRAIL、RGR-TRAIL和TRAIL-RGR编码基因两端分别添加EcoR I和Sal I限制性内切酶位点，用常规基因克隆的方法将编码基因经过酶切和连接至表达载体pQE30，构建出表达质粒pQE30-sTRAIL、pQE30-RGR-TRAIL和pQE30-TRAIL-RGR。构建好的质粒通过DNA序列分析，确保序列正确(核酸和氨基酸序列参见表1)。

2.TRAIL变异体蛋白的诱导表达和分离纯化

利用常规工程蛋白制备方法，将表达质粒pQE30-sTRAIL、pQE30-RGR-TRAIL和pQE30-TRAIL-RGR转入大肠杆菌M15表达菌(购自QIAGEN)。然后用含氨苄西林(Amp，100μg/mL)和卡那霉素(Kan，30μg/mL)的LB固体培养平板筛选阳性克隆。接种阳性单克隆菌于含氨苄西林(Amp，100μg/ml)和卡那霉素(Kan，30μg/ml)的LB液体培养基中37℃、220rpm培养过夜。次日，扩大培养体积37℃、220rpm继续培养。培养至菌液浓度在OD600为0.8左右时，加入Zn²⁺和诱导剂IPTG至终浓度均为0.1mmol/L，25℃、150rpm振荡培养过夜。

将菌液7000g离心10min弃上清收集菌体沉淀。用裂解液(50mM磷酸盐缓冲液pH7.6，300mM NaCl，10％甘油，20mM咪唑)重悬，然后加入β-巯基乙醇和苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)使其工作浓度分别为10mM和1mM。以功率360W，工作3s间隔7s，共15min超声破菌。破菌完成后，25000g、4℃离心15min弃沉淀留上清液，重复5次。破菌上清首先与Ni-NTA层析填料(购自QIAGEN公司)4℃振荡结合2h，然后用含40mM咪唑的裂解液洗掉杂蛋白，再用含300mM咪唑的裂解液洗脱目的蛋白。蛋白按照1:100比例，对PBS缓冲液(10mMNa₂HPO₄,2mM KH₂PO₄，137mM NaCl,2.68mM KCl,40μM ZnSO₄，pH 7.4)于4℃透析(截留分子量3550Da)过夜。

纯化后的蛋白经还原性SDS-PAGE电泳(如图2所示)，各蛋白单体分子量分别为：sTRAIL，19.7KD；RGR-TRAIL，22.6KD；TRAIL-RGR，22.6KD，所有蛋白表观分子量均与预期分子量基本一致。纯化后的蛋白用内毒素去除试剂盒(购自Genscript公司)按说明书提供的方法去除内毒素备用，蛋白中内毒素含量<0.1EU/mL。

可见，本发明成功制备了纯化的sTRAIL、RGR-TRAIL、TRAIL-RGR蛋白。

实施例2本发明融合蛋白对肿瘤细胞的选择性杀伤

用肿瘤细胞和正常细胞体外测定各蛋白的抗肿瘤活性。

细胞培养按照ATCC推荐条件，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％FBS作为最终培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养各细胞。在96孔板中每孔接种1-2×10⁴个细胞，然后加入不同浓度的sTRAIL变异体蛋白作用过夜(16-20h)，最后加CCK8显色表征存活细胞的数量。用酶标仪测定450nm吸光值，扣除空白孔吸收值后，加药组吸收值与相应对照孔吸收值的百分比为蛋白作用后细胞的存活率。

结果见图3和表2。

表2重组蛋白对不同细胞杀伤的IC50值

结果显示，与单独使用sTRAIL蛋白相比，融合肿瘤导向肽RGR，能够普遍增强对结肠癌细胞(COLO 205、LS174T、HCT116)、胆管癌细胞(HUCCT-1)和乳腺癌细胞(MCF-7)的杀伤能力。

通过对其IC50的比较可知，RGR-TRAIL杀伤肿瘤细胞的活性是sTRAIL的6-30倍，TRAIL-RGR杀伤肿瘤细胞的活性是sTRAIL的1.5-6倍。表明将肿瘤导向肽RGR融合在TRAIL的N末端较C末端具有更强的肿瘤细胞清除能力，RGR-TRAIL活性较TRAIL-RGR强3-5倍。

此外，三种蛋白均对正常细胞人脐静脉内皮细胞(HUVEC)没有明显细胞毒性，表明本发明融合蛋白RGR-TRAIL和TRAIL-RGR均选择性地增强了对肿瘤细胞的杀伤活性。

因此，连接RGR能够提高sTRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用，其中，将RGR连接在N末端的效果显著优于C-末端。

实施例3本发明融合蛋白的体内抗肿瘤作用

1.体内肿瘤靶向性验证

TRAIL片段融合RGR后能大大增强对肿瘤细胞的杀伤活性，因此进一步对其体内的肿瘤靶向性进行评估。

首先利用绿色荧光染料FAM标记各重组蛋白。具体过程为：将FAM染料用DMSO溶解成100mM储备液；按照染料与蛋白摩尔比例为24:1，将FAM加入待标记蛋白(2mg/ml)，室温颠倒反应1h；反应后产物对PBS透析4次，每次4h，去除游离染料。

然后建立COLO 205裸鼠荷瘤模型，当移植肿瘤长到200-300mm³时，随机分为3组，每只尾静脉注射200μg FAM标记的sTRAIL或等摩尔量的RGR-TRAIL和TRAIL-RGR。5min至1h内不同时间点，处死模型取瘤体进行冰冻切片。抗CD31抗体染色肿瘤血管内皮细胞，并以DAPI复染肿瘤细胞核，荧光显微镜观察，结果见图4。

可见，注射后5min，使用单独sTRAIL在肿瘤血管处累积较少，而RGR-TRAIL和TRAIL-RGR均能大量在肿瘤血管处富集，且RGR-TRAIL在肿瘤血管的富集程度显著高于TRAIL-RGR。表明RGR与sTRAIL融合能提高其体内对肿瘤的靶向能力，且RGR融合在TRAIL的N末端时的体内肿瘤靶向能力最强。

蛋白注射后0.5-1h，在肿瘤血管处富集的RGR-TRAIL和TRAIL-RGR逐渐向远离血管的肿瘤实质细胞分布，表现为肿瘤内部远离血管的实质细胞上融合蛋白的富集量逐渐增强，而肿瘤血管处蛋白逐渐减少。这表明靶向富集于肿瘤血管的RGR-TRAIL和TRAIL-RGR能进一步释放进入瘤体内部与肿瘤实质细胞结合。

上述结果表明，连接RGR有助于TRAIL在肿瘤部位富集，其中，将RGR连接在N末端的效果优于C-末端。

2.体内抗肿瘤作用

RGR-TRAIL和TRAIL-RGR的肿瘤靶向性分布，可能会进一步增强TRAIL的体内抗肿瘤药效。

2.1以结肠癌COLO 205为例

(1)接种2×10⁶个COLO 205细胞于4-5周龄的BALB/c Nude雌性裸鼠右后肢背部皮下形成COLO 205裸鼠荷瘤模型。肿瘤生长过程中，测量肿瘤的长和宽，计算肿瘤体积＝长/2*宽²。当肿瘤长到约160mm³时，将荷瘤鼠随机分为4组，每组6-7只。按照5mg/kg剂量尾静脉注射sTRAIL、RGR-TRAIL和TRAIL-RGR仅一次，以相同体积的PBS作为对照组。给药后持续记录肿瘤的生长情况并观察裸鼠的健康状况，结果见图5。

可见，与PBS组相比，各种重组蛋白均不同程度抑制肿瘤的生长。其中，整体抑制效果RGR-TRAIL>TRAIL-RGR>sTRAIL。尤其是RGR-TRAIL组，给药后5天内肿瘤持续减小至约20mm³，且给药后8天内肿瘤仍无明显生长，此后瘤体的生长速度仍然受到抑制。TRAIL-RGR在给药2天内肿瘤减小至约50％，但瘤体随后恢复生长。与TRAIL-RGR相比，RGR-TRAIL体现出更为高效的肿瘤杀伤和抑制能力(P<0.001)(如图5A图所示)，与其体外活性一致。

(2)观察结束时(给药12天后)，将裸鼠处死并剥离瘤体称重。PBS、sTRAIL、TRAIL-RGR和RGR-TRAIL瘤体重量分别为0.314±0.083g、0.230±0.046g、0.179±0.052g和0.027±0.017g。RGR-TRAIL的肿瘤抑制效果分别约为sTRAIL和TRAIL-RGR的9倍和7倍，均具有显著差异(P<0.001)(如图5B图所示)。给药前后和整个观察过程中，裸鼠生长状态良好。

(3)为了确定体内治疗效果与凋亡诱导能力的关系，在COLO 205荷瘤小鼠中，当移植肿瘤长到200mm³左右时，按5mg/kg的剂量尾静脉注射sTRAIL、RGR-TRAIL、TRAIL-RGR或等体积的PBS。16h后剥离肿瘤组织冰冻切片，并按照TUNEL检测试剂盒(购自Promega)说明书染色检测瘤体内细胞凋亡情况，以DAPI复染细胞核，荧光显微镜采集分析。TUNEL法能将凋亡细胞核标记上绿色荧光。

可见，与sTRAIL相比，RGR-TRAIL和TRAIL-RGR在体内具有更强的凋亡诱导能力，且RGR-TRAIL诱导的凋亡细胞最多。不仅如此，RGR-TRAIL处理组细胞核密度显著降低，表明有大量肿瘤细胞核发生固缩或碎裂。这些结果显示RGR-TRAIL在体内能显著诱导肿瘤细胞凋亡，具有高效的抗肿瘤效果(如图5C图所示)。

上述结果表明，连接RGR能够提高sTRAIL的抗肿瘤活性，其中，将RGR连接在N末端的效果显著优于C-末端。

2.2以结肠癌LS174T为例

接种2×10⁶个LS174T细胞于4-5周龄的BALB/c Nude雌性裸鼠右后肢背部皮下，建立小鼠荷瘤模型。当肿瘤长到约150mm³时，将裸鼠随机分为4组，每组6只。按照5mg/kg剂量分别在接种后第8天和第11天尾静脉注射sTRAIL、RGR-TRAIL、TRAIL-RGR或相同体积的PBS，并持续记录肿瘤的生长情况。结果见图6。

可见，LS174T肿瘤细胞在体内生长迅速，未干预PBS组一周后肿瘤平均体积超过1000mm³，三种蛋白均能抑制肿瘤生长，其中，与sTRAIL相比，TRAIL-RGR并未体现出更好的抗肿瘤活性，而RGR-TRAIL的肿瘤抑制能力则显著强于sTRAIL(P<0.05)和TRAIL-RGR(P<0.01)。

RGR-TRAIL组瘤体生长非常缓慢，治疗结束时肿瘤平均体积仍维持在约200mm³，与治疗前150mm³相比，肿瘤生长显著得到了抑制。而sTRAIL和TRAIL-RGR组瘤体平均体积分别超过500mm³和700mm³(如图6A所示)。

治疗结束后，PBS、sTRAIL、RGR-TRAIL和TRAIL-RGR瘤重分别为0.796±0.150g、0.444±0.213g、0.577±0.211g和0.172±0.092g，RGR-TRAIL抗肿瘤效果最为显著，是sTRAIL和TRAIL-RGR的2到4倍(如图6B图所示)。

上述结果进一步证明，连接RGR能够提高sTRAIL的抗肿瘤活性，其中，将RGR连接在N末端的效果显著优于C-末端。

对比例1不同融合蛋白的活性比较

1.制备融合蛋白RGR-TRAIL和NGR-TRAIL

NGR序列见表3，利用相同方式融合于sTRAIL的N末端，制备方法同实施例1。

表3 NGR及融合蛋白NGR-TRAIL氨基酸及核酸序列

2.活性比较

(1)体外实验：实验方法同实施例2。

结果见图7A。

可见，sTRAIL、NGR-TRAIL对COLO 205细胞的IC50分别为1.151±0.049nM和0.873±0.010nM，NGR-TRAIL对COLO 205细胞的杀伤活性比sTRAIL略强。而RGR-TRAIL的IC50为0.191±0.045nM，较sTRAIL和NGR-TRAIL强5-6倍，杀伤活性大大提高。

(2)体内实验：

COLO205细胞接种后，待瘤体平均体积达到150mm³时，通过小鼠尾静脉注射sTRAIL(5mg/kg)、NGR-TRAIL(5mg/kg)或RGR-TRAIL(1，2.5，5mg/kg),每天测定瘤体大小。结果见图7B。箭头显示给药时间。

可见，5mg/kg NGR-TRAIL和TRAIL对肿瘤的生长抑制活性相近，二者无显著差异。而RGR-TRAIL即使在1mg/kg剂量下，对肿瘤的生长抑制活性仍显著强于5mg/kg TRAIL和NGR-TRAIL(P<0.05)。随着给药剂量增加，RGR-TRAIL对肿瘤抑制活性逐渐增强。5mg/kg的RGR-TRAIL给药后1周内瘤体持续减小，此后瘤体生长仍受到显著抑制。

观察最后一天统计各给药组瘤体大小，PBS、5mg/kg TRAIL和NGR-TRAIL组分别为617±266mm³、403±160mm³和328±126mm³。而1、2.5和5mg/kg RGR-TRAIL组分别为137±98mm³、57±46mm³和27±19mm³。可见同等剂量下，RGR-TRAIL的体内抗肿瘤活性约为NGR-TRAIL的10倍(P<0.001)。不仅如此，2.5和5mg/kg RGR-TRAIL组(n＝6)分别有1只和2只模型肿瘤完全消除，这表明RGR-TRAIL在体内对肿瘤具有较强的清除能力。

因此，RGR-TRAIL具有优良的抗肿瘤活性，不仅显著优于TRAIL蛋白，而且优于TRAIL连接其它肿瘤导向肽。

综上，本发明将TRAIL与特定肿瘤导向肽RGR融合后，可以显著增强TRAIL片段的抗肿瘤活性，尤其是RGR-TRAIL重组融合蛋白，在体内外均对各种肿瘤表现出强大的杀伤甚至清除能力，可作为高效的潜在广谱抗肿瘤药物，临床应用前景良好。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白及其用途

<130> GY026-18P1185

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence，肿瘤导向肽RGR)

<400> 1

Cys Arg Gly Arg Arg Ser Thr

1 5

<210> 2

<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence，TRAIL片段)

<400> 2

Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr

1 5 10 15

Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys

20 25 30

Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His

35 40 45

Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His

50 55 60

Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln

65 70 75 80

Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr

85 90 95

Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser

100 105 110

Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser

115 120 125

Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe

130 135 140

Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser

145 150 155 160

Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

165

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence，连接肽)

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence，融合蛋白1)

<400> 4

Cys Arg Gly Arg Arg Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala

20 25 30

Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro

35 40 45

Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu

50 55 60

Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn

65 70 75 80

Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln

85 90 95

Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp

100 105 110

Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro

115 120 125

Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala

130 135 140

Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys

145 150 155 160

Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp

165 170 175

Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

180 185 190

<210> 5

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence，融合蛋白2)

<400> 5

Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr

1 5 10 15

Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys

20 25 30

Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His

35 40 45

Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His

50 55 60

Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln

65 70 75 80

Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr

85 90 95

Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser

100 105 110

Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser

115 120 125

Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe

130 135 140

Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser

145 150 155 160

Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

165 170 175

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Arg Gly Arg Arg Ser Thr

180 185 190

<210> 6

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence，1)

<400> 6

tgccgtggcc gccgtagcac tggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 60

ggatcggtga gagaaagagg tcctcagaga gtagcagctc acataactgg gaccagagga 120

agaagcaaca cattgtcttc tccaaactcc aagaatgaaa aggctctggg ccgcaaaata 180

aactcctggg aatcatcaag gagtgggcat tcattcctga gcaacttgca cttgaggaat 240

ggtgaactgg tcatccatga aaaagggttt tactacatct attcccaaac atactttcga 300

tttcaggagg aaataaaaga aaacacaaag aacgacaaac aaatggtcca atatatttac 360

aaatacacaa gttatcctga ccctatattg ttgatgaaaa gtgctagaaa tagttgttgg 420

tctaaagatg cagaatatgg actctattcc atctatcaag ggggaatatt tgagcttaag 480

gaaaatgaca gaatttttgt ttctgtaaca aatgagcact tgatagacat ggaccatgaa 540

gccagttttt tcggggcctt tttagttggc taa 573

<210> 7

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence，2)

<400> 7

gtgagagaaa gaggtcctca gagagtagca gctcacataa ctgggaccag aggaagaagc 60

aacacattgt cttctccaaa ctccaagaat gaaaaggctc tgggccgcaa aataaactcc 120

tgggaatcat caaggagtgg gcattcattc ctgagcaact tgcacttgag gaatggtgaa 180

ctggtcatcc atgaaaaagg gttttactac atctattccc aaacatactt tcgatttcag 240

gaggaaataa aagaaaacac aaagaacgac aaacaaatgg tccaatatat ttacaaatac 300

acaagttatc ctgaccctat attgttgatg aaaagtgcta gaaatagttg ttggtctaaa 360

gatgcagaat atggactcta ttccatctat caagggggaa tatttgagct taaggaaaat 420

gacagaattt ttgtttctgt aacaaatgag cacttgatag acatggacca tgaagccagt 480

tttttcgggg cctttttagt tggcggtgga ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt 540

ggcggatcgt gccgtggccg ccgtagcact taa 573

Claims

1.一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白，其特征在于：它由TRAIL片段及肿瘤导向肽RGR连接而成，其中肿瘤导向肽RGR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述TRAIL片段的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：它还包含连接肽；优选地，连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白，其特征在于：所述肿瘤导向肽RGR连接在TRAIL片段的N端或C端。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.5所示。

6.编码权利要求1-5任意一项所述融合蛋白的核苷酸序列；

其中，核苷酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。

7.权利要求1-5任意一项所述融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤如下：

用权利要求6所述的核苷酸序列构建表达载体，并将其在宿主细胞中诱导表达纯化；

8.权利要求1-5任意一项所述的融合蛋白、权利要求6所述的核苷酸序列在制备抗肿瘤药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为结肠癌、胆管癌、乳腺癌、肝癌、肺癌和/或宫颈癌。

10.一种抗肿瘤药物，其特征在于：它是以权利要求1-5任意一项所述的融合蛋白或权利要求6所述的核苷酸序列为活性成分，加入其它辅料或辅助性成分制备而成。