WO2013097470A1

WO2013097470A1 - 二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体及其制备方法与应用

Info

Publication number: WO2013097470A1
Application number: PCT/CN2012/080357
Authority: WO
Inventors: 邓宁; 姜浩武; 亢中奎; 王宏; 宋其芳
Original assignee: 暨南大学
Priority date: 2011-12-28
Filing date: 2012-08-20
Publication date: 2013-07-04
Also published as: CN102532319A; US20140350225A1; US9273131B2

Abstract

本发明公开了一种二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体及其制备方法与应用。该二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码该抗bFGF人源双链抗体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明是在单链抗体的基础上，通过定点突变引入2个半胱氨酸从而引入二硫键，构建成ds-Diabody。通过实验证明，得到的ds-Diabody具有如下优点：稳定性增强；其与抗原bFGF特异性结合，亲和力更好；相对分子质量适中，具有良好的肿瘤靶向、瘤组织穿透力和较长的血液清除率，在临床诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。

Description

二硫键稳定的抗 bFGF人源双链抗体及其制备方法与应用技术领域

本发明属于抗体领域，涉及一种双链抗体，特别涉及一种二硫键稳定的抗 bFGF人源双链抗体及其制备方法与应用。背景技术

bFGF称为碱性成纤维细胞生长因子，是一种广泛的有丝分裂原，可通过自分泌或旁分泌的方式促进多种细胞，包括肿瘤细胞及血管内皮细胞的增殖、分化以及抗凋亡作用。 bFGF 具有多种生物学作用，包括促生长、分裂、分化功能；对成纤维细胞具有强烈的促增殖作用。近年来越来越多的研究表明， bFGF在多种肿瘤组织中高表达并与肿瘤发生发展具有密不可分的关系。因此， bFGF可以作为一些肿瘤治疗的良好靶点。用抗体中和 bFGF, 阻断其与受体的结合也被认为是用于肿瘤治疗的一种有效方法。

治疗性单克隆抗体在临床上已研究了三十多年，有超过 400种治疗性单克隆抗体进入商业支持的临床阶段，现在单克隆抗体已经被建立成为针对多种疾病的关键治疗方式。 1995年，第一个鼠源性单抗 edrecolomab 在德国被批准，这次批准是开创性的，但是由于鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起针对异种蛋白的免疫反应，产生抗小鼠抗体（HAMA), 批准后的研究中证明这种治疗方法不及标准的治疗方法， edrecolomab最终退出了市场。随着分子生物学技术的进展和抗体结构的阐明， DNA重组技术开始应用于抗体的改造，出现了各种各样的基因工程抗体。最初出现的基因工程抗体是为了降低鼠单抗的异源性而进行的人源化改造，包括人鼠嵌合抗体和改型抗体。前者操作简便，但人源化程度稍低；后者技术难度较大，但人源化程度较高。抗体库技术的出现为人源化提供了新的手段，但技术路线尚需进一步成熟。接着为了改进抗体的性能陆续出现了各种小分子抗体和抗体融合蛋白等。其中小分子抗体作为具有抗原结合功能的抗体分子片段，具有分子量小、穿透力强、易于构建及表达等优点。

双链抗体（Diabody) 是在单链抗体的基础上构建的一种小分子抗体，具有分子量适中，双价等特点，是最好的肿瘤靶向抗体分子之一。且其亦具有瘤组织穿透力强和血液清除率适中等特点。二硫键稳定的双链抗体（ds-Diabody)是在 Diabody的基础上通过引物二硫键而成为稳定的 Diabody, 具有提高稳定性的作用。因此具有广阔的应用前景。到目前为止尚未见到任何关于抗 bFGF人源 Diabody的文献和专利报道。发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种二硫键稳定的抗 bFGF 人源双链抗体。该二硫键稳定的抗 bFGF人源双链抗体含有两个抗原结合位点，属于二价抗体，具有较好的亲和力；它是在单链抗体的基础上，通过定点突变引入 2个半胱氨酸从而引入二硫键，构建成 ds-Diabody，使两条肽链以共价键结合，大大提高了稳定性。

本发明的另一发明目的在于提供所述二硫键稳定的抗 bFGF人源双链抗体的制备方法。本发明的再一目的在于提供所述二硫键稳定的抗 bFGF人源双链抗体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种二硫键稳定的抗 bFGF人源双链抗体，其氨基酸序列如下所示：

编码所述的二硫键稳定的抗 bFGF人源双链抗体的基因的核苷酸序列如下所示:

编码所述的二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体的序列，是以编码如下所示的抗 bFGF 单链抗体的轻链可变区（VL)和重链可变（V_H) 区的基因为基础，通过重叠 PCR, 将抗体的 VL第 100位氨基酸 Gly和 V_H第 44位氨基酸 Gly定点突变为 Cys，引入共价键二硫键，同时用编码一个连接肽（氨基酸序列为 GGGGS ) 的基因将突变的轻重链可变区连接一起构建成为 V_L-GGGGS-VH基因片段。将其与真核表达载体（p3XFLAG-Myc-CMV-25， Sigma公司）重组，接着在人胚肾细胞 293T细胞中表达出的 Diabody分子之间会形成共价二硫键，从而形成二硫键稳定的 Diabody。

编码所述的抗 bFGF单链抗体的重链可变区（V_H) 的基因序列如下所示： GTCTCCTCA;

编码所述的抗 bFGF单链抗体的轻链可变区（VL) 的基因序列如下所示:

GTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGG;

所述的二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体的制备方法，包含以下步骤：

( 1 )以编码抗 bFGF单链抗体的 VL基因和 V_H基因片段为模板，通过重叠 PCR和 PCR, 将抗体 VL第 100位氨基酸 Gly和 VH第 44氨基酸 Gly定点突变为 Cys，轻重链可变区基因之间通过一个连接肽的基因片段相连，构建成编码 VL-GGGGS-V_h的基因片段；

( 2 )将步骤（1 )得到的 VL-GGGGS-V_h的基因片段克隆到真核表达载体中表达，纯化，得到二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体。

步骤（1 ) 中所述的的 V_H基因的核苷酸序列如下所示：

GTCTCCTCA;

步骤（1 ) 中所述的的 VL基因的核苷酸序列如下所示:

GTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGG;

步骤（1 ) 优选为具体如下： ①设计引物: 引物 1 '- GCGGCCGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCC -3'；

引物 2

引物 3 -CGAGCCACCGCCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCC-3'; 引物 4 -GGTGGCGGTGGCTCGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCT-3 '；引物 5 -CCCACTCCAGACACTTCCCTGGAGCCTGGCGGA-3'; 引物 6 -TCCAGGGAAGTGTCTGGAGTGGGTTTCATACAT-3 '；

引物 7

② PCR定点突变 VL第 100位氨基酸 Gly为 Cys，扩增得到基因片段 VL-GGGGS _:

A、以编码抗 bFGF单链抗体的 VL基因和 V_H基因片段为模板，以引物 1和引物 2 PCR 扩增得到第 100位氨基酸由 Gly突变为 Cys的 VL;

B、以步骤 A 得到的产物为模板，接着以引物 1 和引物 3 PCR扩增得到基因片段 V_L-GGGGS;

③ PCR定点突变 V_H第 44位氨基酸 Gly为 Cys，扩增得到基因片段 V_H-GGGGS_:

C、以编码抗 bFGF单链抗体的 VL基因和 V_H基因片段为模板，以引物 4和引物 5 PCR 扩增得到第 44位氨基酸 Gly突变为 Cys的 V_H-GGGGS;

D、以编码抗 bFGF单链抗体的 VL基因和 V_H基因片段为模板，接着以引物 6和引物 7 PCR 扩增得到带有 BamHI位点的部分的 V_H-GGGGS;

E、将步骤 C和步骤 D得到产物进行拼接，得到拼接产物；接着以该拼接产物为模板，以引物 4和引物 7为模板， PCR扩增得到完整的 V_H-GGGGS_;

④ PCR拼接、扩增基因片段 VL-GGGGS-V_h:将步骤②和步骤③最终得到产物进行拼接，得到拼接产物；接着以该拼接产物为模板，以引物 1 和引物 7 PCR 扩增得到完整的 V_L-GGGGS-VH;

步骤（2) 所述的真核表达载体优选为 p3XFLAG-Myc-CMV-25。

上述二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

( 1 ) bFGF是人源蛋白，本身并不能引起人的免疫反应，且 bFGF与肿瘤关系密切，所以不能直接用其开发疫苗，而本发明制备的二硫键稳定的抗 bFGF双链抗体作为一种全人源性的抗体，解决了鼠源单抗无法避免的人抗鼠抗体（HAMA) 反应，可以直接开发抗体药物用于人体治疗。

( 2 )本发明制备的二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体，是通过二硫键将两个单链抗体共价相联而形成的二聚体，含有两个抗原结合位点，是二价的，具有良好的亲和力；其次 ds-Diabody 中引入了二硫键，使两条肽链以共价键结合，大大增强了抗体的稳定性；而且 ds-Diabody的相对分子质量适中，具有良好的肿瘤靶向、瘤组织穿透力和较长的血液清除率，在临床诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。附图说明图 1是经过定点突变 PCR扩增构建的二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体基因片段的凝胶电泳结果图；泳道 M为核酸分子量标准；泳道 1为 PCR扩增获得的经过定点突变的 ds-Diabody基因片段。图 2是表达载体 p3XFLAG-Myc-CMV-25-ds-Diabody经双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果图；泳道 Mi 和泳道 M₂ 分别核酸分子量标准；泳道 1 是表达载体 p3XFLAG-Myc-CMV-25-ds-Diabody的双酶切结果。图 3是表达载体 p3XFLAG-Myc-CMV-25-ds-Diabody的构建图谱图。图 4是二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体的细胞表达上清经还原性和非还原性凝胶电泳 SDS-PAGE后的 Western blot结果图；泳道 1是 ds-Diabody细胞表达上清经非还原性 SDS-PAGE后进行的 Western blot分析结果；泳道 2是 ds-Diabody细胞表达上清经还原性 SDS-PAGE后进行的 Western blot分析结果。图 5是表达的二硫键稳定的抗 bFGF人源双链抗体经 Ni Sepharose™ 6 Fast Flow纯化后的 SDS-PAGE凝胶电泳结果图；其中泳道 M为蛋白分子量标准；泳道 1是纯化抗 bFGF人源性双链抗体 ds-Diabody。图 6是间接 ELISA检测抗 bFGF人源双链抗体 ds-Diabody结合抗原 bFGF的活性图。图 7 是抗 bFGF人源性双链抗体 ds-Diabody稳定性分析图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例 1

编码抗 bFGF单链抗体的 VL基因和 V_H基因片段的制备：

( 1 ) 噬菌体抗体库的筛选

首先将 bFGF (北京启维益成公司）用 0.05mol/L、 pH8.7 的碳酸盐缓冲液稀释至 50〜 10(^g/ml，用 1ml包被免疫管（Immunotube, NUNC公司）， 4°C过夜，次日以质量体积比 2.5% 的脱脂奶粉加满免疫管 37°C封闭 2 h，倒去封闭液，加入 1ml 噬菌体抗体库 (约 10¹³ CFU) (Enprobiotech公司）， 37°C孵育 2 h，吸去噬菌体抗体液，以含体积百分比 0.05%吐温 20的 PBS (0.01M、 pH7.2) 洗 2次（第二轮洗 10次，以后洗涤 20次以上），蒸馏水洗涤 1次。

然后用 2种方法回收结合于固相的噬菌体抗体：①先加入 1ml新鲜 XLl-Blue菌（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）， 37°C孵育 15 min后转入 10ml含 20μ_§/ηι1 Amp (氨苄青霉素）、 10μ_§/ηι1 Tet (四环素）的 SB培养基（每升培养基含细菌培养用胰化蛋白陈 309g，酵母提取物 209g， 19gMoPs, pH7.0); ②再将细菌感染回收后的免疫管用蒸馏水洗涤 2次，加入 1ml 洗脱液（0.1ml HCl、以甘氨酸调至 pH=2.2后加入 BSA至质量体积比为 0.1%)，于 37°C静置 15 min, 进行洗脱回收，将洗脱液吸出后，立即加入 4(^1 2mol/L Tris溶液中和，再加入 10 ml XLl-Blue细胞（OD600=0.8) 37°C静置 15 min，接着加入 10ml含 2(^g/ml Amp、 l(^g/ml Tet 的 SB培养基。从 2次回收的菌液分别取出适量铺盘测定 CFU，其余细菌 37°C培养 3 h，扩大体积到 50ml，加入 1.7 X 10¹²PFU辅助病毒 VCSM13 (广州英韦创津生物科技有限公司）， 30°C振荡培养过夜。次日回收上清，常规 PEG沉淀，所得的次级噬菌体抗体库可进行下一轮的筛选。按相同方法进行 3轮淘选，得到阳性噬菌体 scFv抗体克隆。

(2) 噬菌体抗体的制备及抗 bFGF特异性的检测

从筛选第 4轮的培养盘随机挑取集落在含有 5(^g/mLAmp的 2YT培养液中 37°C过夜培养，第二天取 30μ1细菌到 lml LB培养基中， 37°C培养至对数生长期，加入辅助病毒 VCSM13, 30 °C 培养过夜，收取上清。按以下程序进行 ELISA检测：将抗原（gPbFGF)稀释至 10μ_§/ηι1，用 50μ1 稀释后的抗原包被 ELISA板， 2h后弃去孔内液体，用质量体积比 3%脱脂奶 -PBS溶液（即用 0.01M、 pH7.2的 PBS配制的脱脂奶溶液）封闭后加入噬菌体抗体液（即第三轮筛选获得的阳性噬菌体）， 37°C孵育 l h，用质量体积比 0.05% Tween20-PBS溶液（即用 0.01M pH7.2的 PBS 配制的脱脂奶溶液）洗涤 3次，加入 HRP-抗 M13鼠单抗（Promega公司）进行反应，洗涤后加入 TMB底物显色，读取 A450值。筛选到的具有与 bFGF特异性结合的噬菌体抗体克隆。测序，得到编码抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性 scFv抗体的基因。

编码重链可变区的基因序列（V_H基因）如下所示：

ATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGG。

将测序正确的阳性克隆，通过下述引物扩增之后，连接到原核表达载体 pET32a (Promega 公司）中。

PCR的反应条件为：

反应体系为 50μ1:

扩增 ScFv的上游引物 5 ' -GGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGA-3 ' ；

下游引物： 5， -AAGCTTGCTGACCGTCCTAGGG-3 ' ；

lOxPCR Buffer (Mg²⁺) 5μ1, dNTP Mixture (2mM) 5 μ1，上下游引物各 Ιμΐ (10μ mol/L) ， Blendtaq-plus (Promega公司） 0.5μ1，阳性噬菌体抗体克隆 1μ1，灭菌去离子水补充至 50 μ1。

PCR扩增程序为：

94 °C预变性 4 min, 94°C变性 45s， 54°C退火 40s， 72°C延伸 60s， 28个循环后， 72°C延伸 10 min。反应产物经 1.2 %琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到 PCR扩增的 ScFv片段。

酶切反应：通过 BamHI ( Takara公司）和 Hindlll ( Takara公司）双酶切 pET32a载体，通过酶切产物回收试剂盒回收载体片段；通过 BamHI ( Takara公司）和 Hindlll ( Takara公司）双酶切 PCR扩增的 ScFv片段，通过酶切产物回收试剂盒回收 ScFv片段。

连接反应体系（ΙΟμΙ): pET32a酶切产物（50ng^l) 1μ1， ScFv酶切产物 5 uL ( 50ng), 连接缓冲液 2μ1， T4 DNA连接酶（Promega公司） 1 uL。加去离子水至终体积为 20μ1。 16°C连接过夜。连接产物转化大肠杆菌 HB2151 (Promega公司），挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定，将阳性克隆送上海生物工程公司测序，得到构建的 pET32a-ScFv重组载体。

实施例 2 本发明中二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体，是以实施例 1制备的编码抗 bFGF单链抗体的 VL基因和 VH基因片段为基础，通过 Overlap PCR和 PCR，将抗体 VL第 100位氨基酸 Gly 和 VH第 44位氨基酸 Gly定点突变为 Cys，引入共价键二硫键，同时用编码一个连接肽（氨基酸序歹 IJ为 GGGGS ) 的基因片段，构建得到 VL-GGGGS-VH基因片段（长度为 705bp)，表达的两个 VL-GGGGS-VH (分子量为 49.78KD) 分子间通过二硫键共价连接，形成二硫键稳定的双链抗体。

本发明中二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体的制备方法，步骤如下：

(一）制备 VL-GGGGS-VH

( 1 ) PCR定点突变 VL第 100位氨基酸 Gly为 Cys，扩增得到基因片段 VL-GGGGS:

反应 1 ): 设计引物：引物 1 : 5'- GCGGCCGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCC -3' (Not I )；

反应体系①为：

lOxPCR Buffer (Mg²⁺) 5μ1， dNTP混合物（浓度 2mM) 5μ1，引物 1 ( ΙΟμηιοΙ/υ

1μ1，引物 2 (

1μ1， Blendtaq-plus (2.5υ/μ1, Promega公司） 0.5μ1， pET32a-ScFv重组载体 Ιμΐ ( 5(^mol/L)，灭菌去离子水 36.5μ1; 总体积为 50μ1。

PCR扩增程序为：

94°C预变性 2min， 94°C变性 30s， 63°C退火 30s， 72°C延伸 40s， 30个循环后， 72°C延伸 10min。反应产物经 1.5 %琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到第 100位氨基酸 Gly突变为 Cys的 VL。

反应 2): 设计引物引物 1 : 5'- GCGGCCGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCC -3' (Not I )；引物 3 : 5^f-CGAGCCACCGCCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCC-3^f (Linker);

反应体系②为：

lOxPCR Buffer (Mg²⁺) 5μ1， dNTP Mixture (2mM)， 5μ1，引物 1 ( 10μ ηιο1/υ 1μ1，引物 3 ( ΙΟμ 1μ1， Blendtaq-plus (2.5υ/μ1) 0.5μ1，反应 1 ) 得到的胶回收产物为模板 1μ1，灭菌去离子水 36.5μ1; 总体积为 50μ1。

PCR扩增程序为：

94°C预变性 2min， 94°C变性 30s， 63°C退火 30s， 72°C延伸 40s， 30个循环后， 72°C延伸 10min。反应产物经 1.5 %琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到基因片段 VL-GGGGS。

(2) PCR定点突变 VH第 44位氨基酸 Gly为 Cys，扩增得到部分的基因片段 VH-GGGGS: 反应 3 ): 设计引物引物 4： 5 ' -GGTGGCGGTGGCTCGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCT-3 ' (Linker)；弓 I物 5: 5' -CCCACTCCAGACACTTCCCTGGAGCCTGGCGGA-3' (Cys);

反应体系③为：

lOxPCR Buffer (Mg²⁺) 5μ1， dNTP Mixture (2mM) 5μ1，引物 4 ( lO mol/L) 1μ1，引物 5 ( ΙΟμ ηιοΙ/υ 1μ1， Blendtaq-plus (2.5υ/μ1) 0.5μ1，抗 bFGF ScFv的质粒 1μ1，灭菌去离子水 36.5μ1; 总体积为 50μ1。

PCR扩增程序为：

94°C预变性 2min， 94°C变性 30s， 62°C退火 30s， 72°C延伸 20s， 30个循环后， 72°C延伸 5min。反应产物经 1.5 %琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到部分的 VH-GGGGS。

反应 4): 设计引物：弓 I物 6: 5' -TCCAGGGAAGTGTCTGGAGTGGGTTTCATACAT-3' (Cys);

lOxPCR Buffer (Mg²⁺) 5μ1， dNTP Mixture (2mM) 5μ1，引物 6 (

1μ1，引物 7 ( ΙΟμηιοΙ/ 1μ1， Blendtaq-plus (2.5υ/μ1) 0.5μ1， pET32a-ScFv重组载体质粒 1μ1，灭菌去离子水 36.5μ1; 总体积为 50μ1。

PCR扩增程序为：

94°C预变性 2min， 94°C变性 30s， 60°C退火 30s， 72°C延伸 30s， 30个循环后， 72°C延伸 5min。反应产物经 1.5 %琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到带有 BamHI 位点的部分的 VH-GGGGS。

反应 5 ): PCR拼接、扩增基因片段 VH-GGGGS。

Overlap PCR拼接反应体系（ 25μ1体系）

lOxPCR Buffer (Mg²⁺) 2.5μ1， dNTP Mixture (2mM) 2μ1，反应 3 ) 得到的产物 5μ1，反应 4) 得到的产物 5μ1， Blendtaq-plus (2.5υ/μ1) 0.5μ1，灭菌去离子水 10μ1。

PCR扩增程序为：

94°C预变性 2min， 94°C变性 30s， 60°C退火 30s， 72°C延伸 40s， 7个循环后， 72°C延伸 10min。

PCR扩增基因片段 VH-GGGGS, 向上述拼接产物中加入等体积的扩增反应溶液（25μ1)： lOxPCR Buffer ( Mg²⁺ ) 2.5μ1 ， dNTP Mixture ( 2mM ) 4μ1 ，弓 I 物 4 1μ1，引物 7 1μ1， Blendtaq-plus (2.5υ/μ1) 0.5μ1，灭菌去离子水 16μ1。

PCR扩增程序为：

94°C预变性 2min， 94°C变性 30s， 60°C退火 30s， 72°C延伸 40s， 30个循环后， 72°C延伸 10min。反应产物经 1.5 %琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到完整的 VH-GGGGS。

(3 ) PCR拼接、扩增基因片段 VL-GGGGS-VH

Overlap PCR拼接反应体系（ 25μ1体系）

lOxPCR Buffer (Mg²⁺) 2.5μ1， dNTP Mixture (2mM) 2μ1，反应 2) 得到的产物 5μ1，反应 5 ) 得到的产物 5μ1， Blendtaq-plus (2.5υ/μ1) 0.5μ1，灭菌去离子水 10μ1。

PCR扩增程序为：

94°C预变性 2min， 94°C变性 30s， 60°C退火 30s， 72°C延伸 lmin， 7个循环后， 72°C延伸 10min。扩增得到的产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图 1所示，根据片段长度推断已经得到 VL-GGGGS-VH片段。

( 二）构建克隆载体 PMD18-T-ds-Diabody 及重组表达质粒 p3XFLAG-Myc-CMV-25-ds-Diabody。

( 1 ) 构建克隆载体 PMD18-T-ds-Diabody

将扩增得到的基因片段 VL-GGGGS-VH连接到 pMD18-T载体（宝生物工程有限公司）上，连接反应体系 (ΙΟμΙ):

pMD18-T (SOng/μΙ) 1μ1， VL-GGGGS-VH片段 100ng， Solution I 10 μΐ, 加去离子水至终体积为 20μ1;

16°C连接 8h，连接反应产物转化大肠杆菌 DH5ct感受态细胞（宝生物工程有限公司），接种于 Amp⁺的 LB琼脂糖培养板上过夜，挑取单菌落扩增，提质粒，经 Not l和 BamH l酶切鉴定正确后，送上海生工测序，测序结果显示通过突变获得的 DsDiabody基因正确，克隆载体构建成功。

(2) 构建表达载体 p3XFLAG-Myc-CMV-25-ds-Diabody。

①用 Not l 禾 B BamH l 分别双酶切克隆载体 PMD18-T-ds-Diabody 和表达载体 p3XFLAG-Myc-CMV-25。

酶切体系（50μ1):

PMD18-T-ds-Diabody/ p3XFLAG-Myc-CMV-25 ^g , lOxBufFer K 2.5μ1， BSA 5μ1， Not I (4〜12 U/μΙ) 2μ1， BamH l (8〜20 U/μΙ) 2μ1，加去离子水至终体积为 50μ1;

37°C酶切 8h，酶切反应产物经 1.5 %琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，分别得到表达载体 p3XFLAG-Myc-CMV-25，以及带有 Not I和 BamH I酶切位点的 VL-GGGGS-VH。

②将从①酶切得到的基因片段 VL-GGGGS-VH 与酶切后表达载体 p3XFLAG-Myc-CMV-25进行连接。

连接反应体系（20μ1):

VL-GGGGS-VH 200ng, p3XFLAG-Myc-CMV-25 450ng, lOxBuffer 2μ1, T4 DNA连接酶 (350 U/μΙ) 1μ1，加去离子水至终体积 20μ1; 16°C连接 12h，连接反应产物转化大肠杆菌 DH5ct感受态细胞，接种于 Amp⁺的 LB琼脂糖培养板上过夜，挑取单菌落扩增，提质粒，经 Not I和 BamH l酶切鉴定，结果显示表达载体 p3XFLAG-Myc-CMV-25-ds-Diabody构建成功（如图 2所示），其结构示意图如图 3所示。

(三）二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体的表达与 western blot鉴定。

( 1 ) 二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体的表达

接种 3x l0⁶个人胚肾（HEK 293T )细胞（中科院上海细胞所）到 100mmx20mm的细胞培养皿中，以含体积百分比 10% 胎牛血清（FBS ) 的 DMEM 培养基于 37°C、 5% C0₂培养 15 小时，转染前将细胞培养基换为含有 ΙΟΟμηιοΙ/L 氯喹的 DMEM 基本培养基。将 p3XFLAG-Myc-CMV-25-ds-Diabody l(^g加入到 500μ opti-MEM I低血清培养基中，混匀后加入 4(^L的转染试剂 Fugene HD, 涡旋混匀后低速（800rpm) 离心，室温静置 15分钟，然后逐滴加入到细胞培养皿中，混匀后 37°C培养 6小时， 0.015 mol/L PBS (pH7.4) 洗涤细胞两次后，加入含有体积百分比 10% FBS、 4mmol/L丙戊酸的 DMEM培养基， 33 °C、 5% C0₂ 培养，每 64 h换液一次，共换液二次。将换掉的细胞培养上清收集起来用于纯化抗体。

(2) 二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体表达上清的 western blot鉴定。

取细胞表达上清 15μ 按分子克隆进行操作，经还原性和非还原性 SDS-PAGE后，进行 Western blot鉴定，结果（图 4) 显示经还原性 SDS-PAGE后，在分子量 30 kD 处有一条蛋白带；经非还原性 SDS-PAGE后，在分子量 50 kD 处有一蛋白带，说明 ds-Diabody构建成功。

(四）二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体的纯化与 SDS-PAGE鉴定。

将收集的细胞表达上清用 50%的饱和硫酸铵沉淀， 4°C放置过夜后， 8500r/min离心 20min，弃上清，于沉淀中加入 8ml PB (20mM 磷酸钠， 0.5M NaCl， pH7.4) 使之溶解，经 PB透析后，用 0.45μηι滤膜过滤，然后用 Ni SepharoseTM 6 Fast Flow进行纯化：先用水冲洗，再用平衡缓冲液（20mM磷酸钠， 0.5M NaCl, 5mM 咪唑， pH7.4) 冲洗平衡，然后以 250μ1/ηώι 的流速上样，上样后用平衡缓冲液（20mM 磷酸钠， 0.5M NaCl， 5mM咪唑， pH7.4) 冲洗，然后用含有 200mmol/L咪唑的 PB洗脱杂蛋白，用含有 300mmol/L咪唑的 PB洗脱目的蛋白。最后将所收集的目的蛋白 30KD超滤管超滤并用 PBS ( 0.015mol/L、 pH值 7.4)置换。纯化后的产物用 12% SDS-PAGE 电泳鉴定（如图 5所示），结果显示在分子量 30 kD 处有一条蛋白带，并且纯化后抗体的纯度达到了 95%。实施例 3

以下是根据上述方法制备出的二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体的相关生物学活性的测试，测试方法及结果如下：

(一）间接 ELISA检测二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体同抗原 bFGF结合活性。将重组人 bFGF (北京启维益成公司）用 0.05mol/L、 pH值 9.6 的碳酸盐缓冲液稀释至 0.5μ_§/ηι1, 以 100μΙ7孔包被 ELISA板， 37°C孵育 3h后弃去孔内液体， PBST (含体积百分比 0.05% Tween20的 0.015mol/L、 pH值 7.4的 PBS)洗涤 3次。用质量百分比 5%脱脂奶 -PBST 封闭后，以 100μΙ7孔加入一定浓度实施例 1制备的 ds-Diabody和抗 bFGF ScFv, 37°C孵育 lh，用 PBST洗涤 3次后， 100μΙ7孔加入 1 :20000 (体积比) 稀释的抗 His-tag鼠单抗（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）， 37°C孵育 lh，用 PBS-T洗涤 3次， 100μΙ7孔加入 1 :8000 (体积比) 稀释的 HRP标记的羊抗鼠多抗（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）， 37°C孵育 0.5h， PBS-T 洗涤 5次之后加入 TMB显色，测 A450值，实验以 PBS为阴性对照。

结果如图 6所示，显示相对于 ScFv, ds-Diabody能更好的与抗原 bFGF进行特异性结合，具有良好的亲和力。

(二）二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体体外血清的稳定性检测

将一定浓度纯化的 ds-Diabody和 ScFv置 37 °C含质量体积比 0.2% 人血清白蛋白（HAS) 的 PBS 中， 37°C 孵育 0 h、 lh、 2 h、 4 h、 8 h、 12 h、 24 h、 48 h禾卩 72 h; 于各时间点取孵育后的抗体， 100μΙ7孔加入到以 50ng/孔包被有 bFGF的 ELISA板中， 37°C孵育 lh，用 PBST 洗涤 3次后， 100μΙ7孔加入 1 :2万稀释的抗 His-tag鼠单抗， 37°C孵育 lh，用 PBS-T洗涤 3 次， 100μΙ7孔加入 1 :8000稀释的 HRP标记的羊抗鼠多抗， 37°C孵育 0.5h， PBS-T洗涤 5次之后加入 TMB显色，测 A450值。

结果如图 7所示，显示 ScFv在 37°C含 0.2% HSA的 PBS 中孵育 lh后活性就开始下降， 2h后活性仅剩约 1/2， 24h后活性完全丧失。而 ds-Diabody在 37°C含 0.2% HSA的 PBS 中孵育 72h后结合活性并无明显的改变，具有很好的稳定性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

权利要求书

1、一种二硫键稳定的抗 bFGF人源双链抗体，其特征在于其氨基酸序列如 SEQ ID N0.1 所示。

2、根据权利要求 1所述二硫键稳定的抗 bFGF人源双链抗体，其特征在于：编码所述的二硫键稳定的抗 bFGF人源双链抗体的基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0.2所示。

3、权利要求 1所述的二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

( 1 )以编码抗 bFGF单链抗体的 VL基因和 V_H基因片段为模板，通过重叠 PCR和 PCR, 将抗体 VL第 100位氨基酸 Gly和 VH第 44氨基酸 Gly定点突变为 Cys，轻重链可变区基因之间通过一个连接肽的基因片段相连，构建成编码 VL-GGGGS-V_h的基因片段； V_H基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0.3所示； V_L基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0.4所示。

4、根据权利要求 3所述的二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体的制备方法，其特征在于：步骤（1 ) 具体包含以下步骤：

①设计引物：引物 1： 5'- GCGGCCGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCC -3'；

引物 3 : 5 '-CGAGCCACCGCC ACCTAGGACGGTC AGCTTGGTCC-3 '；引物 4: 5' -GGTGGCGGTGGCTCGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCT-3^F; 弓 I物 5 : 5' -CCCACTCCAGACACTTCCCTGGAGCCTGGCGGA-3'; 引物 6： 5' -TCC AGGGAAGTGTCTGGAGTGGGTTTC ATAC AT-3 '；

B、以步骤 A 得到的产物为模板，接着以引物 1 和引物 3 PCR扩增得到基因片段 VL-GGGGS ;

④ PCR拼接、扩增基因片段 VL-GGGGS-V_h:将步骤②和步骤③最终得到产物进行拼接，得到拼接产物；接着以该拼接产物为模板，以引物 1 和引物 7 PCR 扩增得到完整的 V_L-GGGGS-V_H。

5、根据权利要求 3所述的二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体的制备方法，其特征在于：步骤（2) 所述的真核表达载体为 p3XFLAG-Myc-CMV-25。

6、权利要求 1或 2所述的二硫键稳定的抗 bFGF人源性双链抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。