CN117304321A - 结合小鼠SiglecE胞外域的羊驼源抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能以高亲和力结合小鼠SiglecE胞外域的羊驼源抗体，该抗体又称为纳米抗体，其能够用于预防、治疗和/或诊断与SiglecE相关的病症，例如肿瘤。

Description

结合小鼠SiglecE胞外域的羊驼源抗体
技术领域
本发明属于生物制药领域，并且特别涉及用于治疗和诊断的抗小鼠SiglecE胞外域的纳米抗体。
背景技术
唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(SiglecE)是一类免疫球蛋白超家族的成员，Siglecs受体家族是一种唾液酸识别受体，被认为是肿瘤唾液酸聚糖调节肿瘤浸润免疫细胞的主要靶点。Siglecs在哺乳动物免疫系统中的各种细胞上广泛表达，Siglecs家族通过与肿瘤细胞上的唾液酸聚糖结合，形成免疫抑制，使得肿瘤细胞逃脱免疫系统的监视，肿瘤发生发展。人源Siglecs家族主要包括9个成员，在小鼠中的同源成员有5个。SiglecE，是一个一次跨膜的膜蛋白，膜外部分包括3个Ig结构域，膜内具有一个ITIM基序。
SiglecE的结构包括胞外域(19-353位氨基酸残基，SEQ ID NO:16)，跨膜域(354-374，20个氨基酸残基)及胞内域(375-467，92个氨基酸残基)。胞外域包括一个可变V结构域(21-141位氨基酸残基，SEQ ID NO:17)和两个恒定结构域C1(152-239位氨基酸残基，SEQID NO:18)和C2(242-339位氨基酸残基，SEQ ID NO:19)。
肿瘤细胞表面的配体与SiglecE的结合使得肿瘤发生发展。干扰配体与SiglecE的相互作用可能可以提高抗肿瘤免疫能力。因此，对于SiglecE的研究可能逆转免疫抑制肿瘤微环境(Tumor micro-environment,TME)，同时靶向SiglecE可能可以作为联合治疗癌症的潜在靶点。因此，需要研制拮抗SiglecE及其与其生理配体的结合的药物。
SiglecE的V可变域被认为是主要的配体结合域，因此靶向SiglecE的V可变域的小分子抑制剂可能具有临床价值，例如单域抗体。单域抗体，也称为纳米抗体(Nbs)，是骆驼科(骆驼、美洲驼、羊驼)动物产生的小型抗体。该纳米抗体具有最小的可变抗原结合片段，被称为VHH结构域，其分子量约为15kDa。与常规抗体相比，纳米抗体具有独特的优势：1)纳米抗体结构简单、分子量小，更有利于表达和使用；2)更方便在大肠杆菌和各种真核系统中高效大量表达；3)由于其只有一个结合位点，属于单域抗体，作为诊断试剂有更好的通透性、特异性和检测线性；4)便于与各种融合蛋白偶联或更容易被各种标记物标记；5)更易于制备双功能抗体，更有利于靶向药物开发和细胞靶点定向运输；6)作为药物开发，其对于人免疫原性小，不容易产生免疫排斥。
发明内容
本发明提供了能以高亲和力结合小鼠SiglecE胞外域的羊驼源抗体，该抗体又称为纳米抗体，其能够用于预防、治疗和/或诊断与SiglecE相关的病症，例如肿瘤。
本发明人使用重组的SiglecE胞外域对羊驼进行了4次免疫，然后分离出外周血淋巴细胞，并抽提细胞的总RNA，随后反转录为cDNA，将cDNA用作模板以扩增纳米抗体序列。我们分离获得了4种纳米抗体，分别命名为aSE1、aSE4、aSE12和aSE17。这些纳米抗体的氨基酸序列分别如下：
aSE1的氨基酸序列：
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGLTFDHYAMRWFRQAPGKEREGVSCISISNSSTYYAESVKGRFTVSRDSAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYHCATVDGGRAWCSPLWARSTYDDDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:12)
aSE4的氨基酸序列：
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTFSANPIGWYRQSPGKQRELVAVIHSGGDTNYIPSMKGRFTISRDNAKNMVYLQINNLKPEDTAVYYCNAFNSLNGRPLSSWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:13)
aSE12的氨基酸序列：
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGLTFDYYAMRWFRQAPGKEREGVSCISVSNSSTYYADSVKGRFTISRDDAKNTVYLEMNSLKPEDTAVYYCATVDGGRGWCSPLWARSSYDDDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:14)
aSE17的氨基酸序列：
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLTFDQYAMRWFRQAPGKEREGVSCISVSNSSTYYSDSAKGRFTISRDDAKNTVYLEMNSLKPEDTAVYYCATVDGGRGWCSPLWARANYDDDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:15)
这4种纳米抗体的三个抗原互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)如划线部分所示，具体如下：
aSE1的抗原互补决定区：
CDR1:GLTFDHYAM(SEQ ID NO:1)
CDR2:GVSCISISNSS(SEQ ID NO:2)
CDR3:ATVDGGRAWCSPLWARSTYD(SEQ ID NO:3)
aSE4的抗原互补决定区：
CDR1:GSTFSANPI(SEQ ID NO:4)
CDR2:LVAVIHSGGD(SEQ ID NO:5)
CDR3:NAFNSLNGRPLSS(SEQ ID NO:6)
aSE12的抗原互补决定区：
CDR1:GLTFDYYAM(SEQ ID NO:7)
CDR2:GVSCISVSNSS(SEQ ID NO:8)
CDR3:ATVDGGRGWCSPLWARSSYD(SEQ ID NO:9)
aSE17的抗原互补决定区：
CDR1:GLTFDQYAM(SEQ ID NO:10)
CDR2:GVSCISVSNSS(SEQ ID NO:8)
CDR3:ATVDGGRGWCSPLWARANYD(SEQ ID NO:11)
具体地，本发明提供了一种纳米抗体或其抗原结合片段，该纳米抗体能够高亲和力结合SiglecE，并能阻断肿瘤细胞表面的配体与SiglecE的结合。该纳米抗体与Fc融合后能够高亲和力结合SiglecE，能够在体外高效中和各种肿瘤细胞表面的配体，且能够在小鼠体内起到抗肿瘤的功效。四株纳米抗体结合在SiglecE的不同表位上，aSE1、aSE12和aSE17结合在SiglecE的V可变域，而aSE4结合在SiglecE的第一个恒定结构域。将aSE1纳米抗体Fc的融合蛋白的N端通过(GGGGS)4接头蛋白与aSE4的纳米抗体C端融合后形成一个双表位抗体(或称双特异性抗体)，该双表位抗体能够更高亲和力地结合SiglecE，能够更强的中和各种肿瘤细胞；腹腔注射该双表位抗体也能在小鼠体内起到抗肿瘤的功效。
具体地，本发明提供了以下实施方案：
1.抗体或其抗原结合片段，其优选特异性结合SiglecE胞外域，优选所述抗体或其抗原结合片段源自羊驼，优选地，所述抗体为仅包括重链抗体的纳米抗体，其特征在于，所述抗体包含：
CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；
CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；
CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
2.根据项目1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括选自如下组的序列：
(a)如SEQ ID NO:1所示的CDR1，如SEQ ID NO:2所示的CDR2和如SEQ ID NO:3所示的CDR3；
(b)如SEQ ID NO:4所示的CDR1，如SEQ ID NO:5所示的CDR2和如SEQ ID NO:6所示的CDR3；
(c)如SEQ ID NO:7所示的CDR1，如SEQ ID NO:8所示的CDR2和如SEQ ID NO:9所示的CDR3；和
(d)如SEQ ID NO:10所示的CDR1，如SEQ ID NO:8所示的CDR2和如SEQ ID NO:11所示的CDR3。
3.根据项目1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括选自如下组中的一个或多个的序列：
(a)如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；
(b)与如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(c)如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；
(d)与如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(e)如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；
(f)与如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(g)如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；
(h)与如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列。
4.根据项目1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其进一步包含Fc结构域，优选小鼠Fc结构域和人Fc结构域，其中小鼠Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，人Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
5.双表位抗体，其(例如以N端到C端的顺序)包括两个根据项目1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段相互结合，所述纳米抗体或其抗原结合片段之间用接头序列(例如柔性多肽链，例如GS接头，优选(GGGGS)4接头)连接。
6.多核苷酸，其编码根据项目1-4中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或项目5所述的双表位抗体。
7.表达载体，其包含根据项目6所述的多核苷酸。
8.宿主细胞，其包含项目7所述的表达载体或项目6所述的多核苷酸，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，例如细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
9.药物组合物，其含有项目1-4中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或项目5所述的双表位抗体，以及药用载体。
10.项目1-4中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或项目5所述的双表位抗体在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
11.治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的项目1-4中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或项目5所述的双表位抗体或项目9所述的药物组合物。
在一些实施方案中，所述肿瘤选自结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、头颈癌、乳腺癌、食管癌、口腔癌、舌癌、牙龈癌、肝癌、骨癌、胃癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、甲状腺癌和脑癌。
定义
MC38：小鼠结肠癌细胞。
B16F10：小鼠黑色素瘤细胞。
RM-1：小鼠前列腺癌细胞。
MB49：小鼠膀胱癌细胞。
本发明的优点和积极效果
(1)本发明提供的抗体源自天然羊驼重链抗体，因此其具有表达量高、亲和力高和稳定性高的特点。
(2)本发明提供的结合SiglecE胞外域的抗体用哺乳动物细胞(293F)表达和分泌，将抗体与Fc融合，克隆至哺乳动物表达载体pTT5中，将载体转染哺乳动物细胞293F，培养5天后收集上清。采用Protein A柱子对上清中的融合蛋白进行纯化，3种纳米抗体的产量均大于60mg/L。4种纳米抗体均显示出与SiglecE胞外域高亲和力的结合。
(3)本发明提供的纳米抗体融合Fc后能在体外强效中和多种肿瘤细胞。中和RM-1、MC38、B16和MB49的半抑制浓度(IC50)分别是19.53、1.662、6.503和30.15nM。
(4)本发明提供的四株纳米抗体和一株双表位抗体，经过体外实验比较后，发现双表位抗体能在体外更好的强效中和多种肿瘤细胞。中和RM-1、MC38、B16和MB49的半抑制浓度(IC50)分别是6.55、14.90、9.189和14.48nM。所以在小鼠实验中选择双表位抗体验证体内抗肿瘤活性。
本公开所述的双表位纳米抗体融合Fc后以10mg/kg单剂量腹腔给药能够显著减小小鼠肿瘤的生长。
本公开所述的纳米抗体aSE1融合另一个靶向受体SiglecE一个恒定结构域的纳米抗体aSE4，融合Fc后，从而形成双表位抗体aSE4-1-Fc，aSE4-1-Fc能够更高亲和力地结合SiglecE，能够超强中和与肿瘤细胞的结合，腹腔注射aSE1-aSE4-Fc也能在小鼠体内起到抗肿瘤的功效。
附图说明
图1示出了噬菌体展示本公开的4个纳米抗体的结果。A示出了两轮淘选的噬菌体计数结果；B示出了单克隆噬菌体ELISA结果。
图2示出了纳米抗体(A)及其与Fc融合蛋白(B)的SDS-PAGE凝胶电泳结果。图A分别展示了纳米抗体aSE1、aSE4、aSE12和aSE17蛋白的纯化图。图B分别展示了aSE1、aSE4、aSE12和aSE17蛋白的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳图，以及其与Fc融合蛋白aSE1-Fc、aSE4-Fc、aSE12-Fc和aSE17-Fc的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳图。泳道为aSE1、aSE12、aSE4、aSE17及其与Fc融合蛋白。
图3示出了采用ELISA检测纳米抗体的Fc融合蛋白与SiglecE胞外段蛋白之间的结合的结果图和采用流式细胞术检测纳米抗体的Fc融合蛋白与完整表达SiglecE蛋白的293T细胞结合的结果图。其中A示出了采用ELISA检测纳米抗体的Fc融合蛋白与SiglecE胞外段蛋白之间的结合的结果图。B示出了采用流式细胞术检测纳米抗体的Fc融合蛋白与完整表达SiglecE蛋白的293T细胞结合的结果图。
图4示出了采用竞争性ELISA检测所述4株纳米抗体的Fc融合蛋白是否结合在不同的表位的结果图、ELISA方法检测所述4株纳米抗体结合在SiglecE蛋白的不同结合域上的结果图及构建的双表位纳米抗体的结构图。其中A示出了采用竞争性ELISA检测所述4株纳米抗体的Fc融合蛋白是否结合在不同的表位的结果图，B示出了ELISA方法检测所述4株纳米抗体结合在SiglecE蛋白的不同结合域上的结果图，C示出了按照结合结果，构建的双表位纳米抗体的结构图。
图5示出了采用竞争性ELISA检测双表位纳米抗体aSE4-1纳米抗体蛋白阻断SiglecE与四株肿瘤细胞表面配体结合的结果图。其中A示出了与MB49表面配体结合的结果图，B示出了与RM-1表面配体结合的结果图，C示出了与MC38表面配体结合的结果图，D示出了与B16表面配体结合的结果图。
图6示出了采用ELISA和竞争性ELISA检测双表位纳米抗体aSE4-1纳米抗体与单表位抗体，发现相比单表位抗体，双表位抗体结合SiglecE的能力和阻断SiglecE与四株肿瘤细胞表面配体结合的效果更好。其具体的结合效果和抑制效果如表格中展示。
图7示出了动物实验表征双表位抗体aSE4-1-Fc在小鼠体内的抗肿瘤作用的结果图。首先在结直肠癌小鼠模型中双表位抗体aSE4-1-Fc的治疗效果(图A、B、C)。A图是结直肠癌小鼠模型构建的示意图以及纳米抗体的免疫策略；B图展示了整个小鼠治疗过程中肿瘤的生长曲线；C图展示了在整个治疗结束后，剥离小鼠肿瘤，对小鼠的肿瘤进行称重的统计图。其次在膀胱癌小鼠模型中双表位抗体aSE4-1-Fc的治疗效果(图D、E、F)。D图是在小鼠体内构建膀胱癌肿瘤模型的示意图以及纳米抗体的治疗策略；E图展示了在整个治疗过程中小鼠肿瘤的增长曲线；F图展示了在实验结束后剥离小鼠肿瘤的称重统计图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1纳米抗体的筛选、制备、阻断能力检测及其SiglecE结合亲和力表征
1)SiglecE免疫文库构建
采用HEK293F细胞(ATCC，CBP60437)表达纯化的SiglecE(NM_031181.2，aa 19-353，SEQ ID NO:16)与弗氏佐剂(Sigma F5508)混匀，以500μg/次的剂量皮下注射免疫羊驼三次，每次间隔2星期，免疫1头6个月大小的母羊驼。第三次免疫2周后，静脉取血并分离血液中的白细胞。采用omegabiotek公司的RNA抽提试剂盒提取总RNA，同时采用DNA酶除去基因组DNA。采用TAKARA公司的PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit对RNA进行反转录，将RNA反转录为cDNA。采用羊驼VHH特异性引物(引物1：AGCAGCCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAG，SEQ ID NO:23；引物2：CCATAGCAGGCTGTGCAGCATAGAAAGGTACCACTAAAGGAATTGC，SEQ ID NO:24)，用以上cDNA作为模板进行PCR扩增获得VHH的编码基因片段，采用Gibson组装的方法将扩增的VHH序列克隆至噬菌粒pR2(MRC Laboratoryof Molecular Biology)的NcoI和NotI位点中，得到的Gibson组装产物即为初始纳米抗体噬菌粒文库。采用10％甘油洗涤法制备大肠杆菌TG1(MRC Laboratory of MolecularBiology)感受态细胞，然后将以上Gibson组装产物电转化至TG1感受态细胞中，涂布5块150mm的LB(含有2％葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素，每1L里面有10g胰蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母粉)平板中以扩增噬菌粒文库。刮板后取适量菌液接种200mL 2TY(含2％葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素，每1L里面有16g胰蛋白胨，10g酵母粉，5g氯化钠)培养至对数生长期，加入1012pfu的KM13辅助噬菌体(MRC Laboratory of Molecular Biology)，37℃侵染45分钟，取100mL菌液离心，菌体用200mL的2TY(含0.1％葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素，每1L里面有16g胰蛋白胨，10g酵母粉，5g氯化钠)重悬，25℃培养20小时以扩增展示纳米抗体的噬菌体(phage)。采用PEG沉淀的方法浓缩噬菌体，最终用PBS重悬，冰面保存。
2)纳米抗体的筛选
采用HEK293F细胞(ATCC，CBP60437)表达纯化SiglecE(NM_031181.2，aa 19-353，SEQ ID NO:16)，用PBS稀释至0.1mg/mL，取100μL加入96孔免疫板(Nunc maxsorp plate)的1个孔，4℃包被过夜，同时设置1个无抗原对照孔。采用PBS洗3次，每孔加入300μL MPBS(含5％脱脂牛奶的PBS)室温封闭2小时。采用PBS洗3次，每孔加入1×1011pfu以上制备的噬菌体文库噬菌体(溶于100μL MPBS)，80rpm室温孵育1小时。采用PBST(0.1％Tween 20，1L水里面溶解3.6g磷酸氢二钠，8g氯化钠，0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾)洗30次。每孔加入100μL浓度为0.5mg/mL的胰蛋白酶(Macklin P913714)，室温消化1小时，结合在孔中的噬菌体被洗脱，此为第一轮筛选洗脱的噬菌体。将洗脱的噬菌体侵染3mL对数生长期TG1细菌，37℃水浴45分钟，涂布1块150mm LB平板(含2％葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素，每1L里面有16g胰蛋白胨，10g酵母粉，5g氯化钠)，37℃过夜培养。加入4mL 2TY至以上150mm平板中，将菌落刮下，将菌液混匀后接种100μL至100mL2TY(含2％葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素，每1L里面有16g胰蛋白胨，10g酵母粉，5g氯化钠)中，培养至对数生长期后加入KM13侵染以完成第一轮洗脱的噬菌体扩增。随后将SiglecE蛋白用PBS稀释至0.02mg/mL，取100μL加入96孔免疫板的1个孔，4℃包被过夜，同时设置1个无抗原对照孔。采用PBS洗3次，每孔加入300μL MPBS(含5％脱脂牛奶的PBS)室温封闭2小时。采用PBS洗3次，每孔加入1×109pfu以上扩增的第一轮洗脱噬菌体(溶于100μL MPBS)，80rpm室温孵育1小时。采用PBST(0.2％Tween 20，1L水里面溶解3.6g磷酸氢二钠，8g氯化钠，0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾)洗30次。每孔加入100μL浓度为0.5mg/mL的胰蛋白酶，室温消化1小时，结合在孔中的噬菌体被洗脱，从而完成第二轮筛选。将洗脱的噬菌体侵染TG1并涂布LB平板(含2％葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素，每1L里面有16g胰蛋白胨，10g酵母粉，5g氯化钠)，培养12小时后形成克隆。
分别从以上2轮筛选洗脱的噬菌体克隆中随机挑取95个单克隆接种至每孔含有100μL 2TY培养基(含2％葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素，每1L里面有16g胰蛋白胨，10g酵母粉，5g氯化钠)的96孔细胞培养板中，1个克隆1个孔，37℃、250rpm震荡培养12小时。转移5μL以上菌液至新的每孔含有200μl 2TY培养基(含2％葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素，每1L里面有16g胰蛋白胨，10g酵母粉，5g氯化钠)的96孔板中进行培养(剩余的菌液加入终浓度为15％甘油，-80℃储存)，37℃、250rpm震荡培养1.5小时至OD600为约0.5，每孔吸除100μL菌液。每孔加入50μL含有4×108pfu KM13的2TY(每1L里面有16g胰蛋白胨，10g酵母粉，5g氯化钠)，混匀，37℃孵育45分钟。3500g离心10分钟，弃上清，沉淀用200μL含有0.1％葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的2TY重悬，25℃、250rpm震荡培养20小时。3500g离心10分钟，取75μL上清转移至每孔含有225μL MPBS的96孔板的孔中，混匀，4℃暂存备用，至此单克隆噬菌体制备完成。
将SiglecE蛋白(NM_031181.2，aa 19-353，SEQ ID NO:16)用PBS稀释至1μg/mL，分别取100μL/孔对96孔免疫板进行包被，另外设置空白对照(PBS孔)，4℃包被过夜。用PBS洗3次，每孔加入300μL MPBS，室温封闭2小时。每孔加入以上制备的噬菌体MPBS混合液100μL，室温孵育1小时。采用PBST洗板4次。采用MPBS适度稀释HRP-anti M13抗体(义翘神州)，分别加100μL至以上免疫板的各孔中，室温孵育1小时。采用PBST洗板4次。每孔加入100μL TMB显色底物(碧云天)，用铝箔纸包好避光，室温反应5分钟。每孔加入50μL的1M H2SO4终止反应，测量OD450 nm值。将所有OD450 nm值大于1的阳性克隆送公司进行测序，分析比对测序结果，获得aSE1、aSE4、aSE12和aSE17序列，其单克隆噬菌体ELISA结果如图1B所示。
3)纳米抗体aSE1、aSE4及其Fc融合蛋白的制备
设计引物，引物1：GTCAAGCTGCTCTCTGGGCGTCTACCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTG GGG，SEQ ID NO:25，引物2：CCTTGGAAATAAAGATTCTCAGAACCTCTAGATGAGGAGACGGTGAC CTGGGTCCC，SEQ ID NO:26，将所述纳米抗体aSE1、aSE4、aSE12和aSE17的基因序列N端融合IFNα蛋白信号肽(ASPFALLMVLVVLSCKSSCSLG，SEQ ID NO:27)以引导分泌表达，C末端融合Fc，同时在它们之间引入一个TEV酶切位点(ENLYFQGS，SEQ ID NO:28)或(GGGGS)3接头，随后克隆至哺乳动物表达载体pTT5(NRC Biotechnology Research Institute)中。将构建的载体分别用PEI瞬时转染哺乳动物细胞HEK293F(ATCC，CBP60437)中，培养3天后收集上清，采用ProteinA柱子对上清中的融合蛋白进行纯化，纯化图如图2A所示；进行SDS-PAGE电泳，结果如图2B所示，从上清中，我们获得了高纯度的aSE1-Fc、aSE4-Fc、aSE12-Fc和aSE17-Fc融合蛋白。采用TEV酶切(带有6His标签)带有TEV位点的aSE1-Fc、aSE4-Fc、aSE12-Fc和aSE17-Fc融合蛋白，随后将酶切产物分别流过Protein A和镍柱，从而分别除去未酶切完全的蛋白、Fc和TEV酶，收集流穿，浓缩后进行SDS-PAGE电泳，结果如图2B所示，从流穿中，我们获得了高纯度的aSE1、aSE4、aSE12和aSE17纳米抗体蛋白。
采用ELISA表征纳米抗体aSE1、aSE4、aSE12和aSE17的Fc融合蛋白与SiglecE蛋白(NM_031181.2，aa 19-353，SEQ ID NO:16)结合的情况，SiglecE蛋白用PBS稀释至2μg/mL，每个孔100μL加入免疫板中进行包被，经过洗涤和封闭后，加入1:3梯度稀释的aSE1、aSE4、aSE12和aSE17的Fc融合蛋白溶液，在室温下孵育1小时。洗涤后，加入HRP偶联的抗人IgG1Fc的二抗(北京义翘神州)。孵育1小时，洗涤后加入TMB显色，并加入硫酸终止，检测OD450值，对OD450值和浓度进行拟合分析，结果如图3A所示，aSE1-Fc能够高亲和力结合SiglecE蛋白，结合EC50值为0.1031±0.01nM；aSE4-Fc、aSE12-Fc和aSE17-Fc的结合EC50值分别为1.716±0.63nM、0.3518±0.17nM和0.1637±0.03nM。同时也采用了流式细胞术在细胞表面检测纳米抗体aSE1、aSE4、aSE12和aSE17的Fc融合蛋白与SiglecE结合的情况，以检测纳米抗体能否与在细胞表面原位有活性的抗原结合。首先构建全长的SiglecE(SEQ ID NO:22)的质粒，使用lipo6000(碧云天)转染到HEK293T(ATCC，CBP60437)中，培养2天后收集HEK293T细胞，加入预冷的PBS重悬细胞，每孔计数约300万个细胞。将收集的细胞平均分成五个等份，置于冰面上。分别孵育纳米抗体aSE-1-Fc、aSE4-Fc、aSE12-Fc和aSE17-Fc，浓度为100nM。以及不加抗体组。冰上孵育1个小时，结束后离心，使用预冷的PBS清洗1次后，加入0.5μL FITC标记山羊抗人IgG(H+L)抗体(碧云天)，冰上孵育30分钟后，清洗一次后加入500μL PBS，流式细胞术检测。结果如图3B所示，图3B展示了4株纳米抗体均能和在293T表面表达的全长的有活性的抗原结合。
4)纳米抗体aSE1、aSE4、aSE12和aSE17及其Fc融合蛋白的结合表征及其阻断功能
采用竞争性ELISA的方法对筛选所得的纳米抗体结合进行表征。采用aSE1与aSE4-Fc、aSE12-Fc和aSE17-Fc；aSE4与aSE12-Fc和aSE17-Fc；aSE12与aSE17-Fc的组合策略，利用竞争性ELISA方法，检测这四种纳米抗体是否结合在不同的结构域上。将上述蛋白用PBS稀释至1μg/mL，每个孔加100μL用于包被，经过常规洗涤和封闭。将aSE4-Fc、aSE12-Fc和aSE17-Fc稀释至5nM，然后用该溶液依次1:4梯度稀释纳米抗体aSE1、aSE4和aSE12，每个梯度的混合物取100μL分别加入包被抗原SiglecE的孔中，室温孵育1小时。洗涤4次后加入HRP偶联的抗IgG1 Fc抗体(北京义翘神州)检测，结果如图4A所示，发现aSE1与aSE12和aSE17结合在同一个结构域上，aSE1、aSE12和aSE17与aSE4结合在不同的结构域上。接下来纯化了SiglecE第一个恒定结构域C1(SiglecE Ig2，SEQ ID NO:18)、SiglecE第二个恒定结构域C2(SiglecE Ig3，SEQ ID NO:19)，采用ELISA方法表征所述纳米抗体aSE1、aSE4、aSE12和aSE17的Fc融合蛋白与SiglecE Ig2、SiglecE Ig3结合的情况，SiglecE Ig2、SiglecE Ig3蛋白用PBS稀释至2μg/mL，每个孔100μL加入免疫板中进行包被，经过洗涤和封闭后，加入1:3梯度稀释的aSE1、aSE4、aSE12和aSE17的Fc融合蛋白溶液，在室温下孵育1小时。洗涤后，加入HRP偶联的抗人IgG1 Fc的二抗(北京义翘神州)。孵育1小时，洗涤后加入TMB显色，并加入硫酸终止，检测OD450值，对OD450值和浓度进行拟合分析，结果如图4B、4C所示，发现aSE1与aSE12和aSE17结合在第一个结构域上(SiglecE Ig1)、aSE4结合在第二个结构域上(SiglecE Ig2)。根据上述的结果，构建双表位抗体aSE4-1-Fc，构建方式如图4C。
上文中，SiglecE Ig1为胞外域第一个结构域，即为背景技术中提到的可变V结构域(21-141位氨基酸残基，SEQ ID NO:17)，SiglecE Ig2为胞外第二个结构域，即为背景中提到第一个恒定结构域C1(152-239位氨基酸残基，SEQ ID NO:18)；SiglecE Ig3为胞外第三个结构域，即为背景技术中提到的第二个恒定结构域C2(242-339位氨基酸残基，SEQ IDNO:19)。
5)双表位纳米抗体aSE4-1-Fc融合蛋白的阻断功能表征
采用竞争性ELISA的方法对构建的双表位纳米抗体阻断功能进行表征。首先复苏4株肿瘤细胞系：MC38、B16F10、RM-1和MB49(ATCC号分别为CRL2638、CRL-6475、CRL-3310、TCP-1020)，培养细胞，将生长状态良好的细胞铺板到96孔板中，待细胞在96孔板中长到80-90％汇合度，拿出96孔板，用1％戊二醛室温孵育15分钟，固定细胞。接下来经过常规洗涤和封闭。将SiglecE-Fc蛋白(将SiglecE胞外段氨基酸序列克隆至哺乳动物表达载体pTT5(NRCBiotechnology Research Institute)中。将构建的载体分别用PEI瞬时转染哺乳动物细胞HEK293F(ATCC，CBP60437)中，培养3天后收集上清，采用Protein A柱子对上清中的融合蛋白进行纯化，纯化后获得该蛋白。稀释至500nM，然后用该SiglecE-Fc溶液去依次1:3梯度稀释双表位纳米抗体aSE4-1，每个梯度的混合物取100μL分别加入包被抗原的孔中，室温孵育1小时。用PBST洗涤4次后，加入HRP偶联的抗人IgG1 Fc的二抗(北京义翘神州)。孵育1小时，洗涤后加入TMB显色，并加入硫酸终止，检测OD450值，对OD450值和浓度进行拟合分析，结果如图5所示，aSE4-1对四株肿瘤细胞系均具有抑制SiglecE-Fc与四株肿瘤细胞系结合的功能。抑制500nM的SiglecE-Fc与四株肿瘤细胞系结合的IC50分别是30.15、19.53、6.503和1.662nM。按照上述相同的方法，比较了双表位抗体和单表位抗体的对肿瘤细胞系与SiglecE-Fc结合的抑制能力，发现相比于单表位抗体，双表位抗体的抑制能力更强一点，所以以下小鼠实验选择双表位抗体验证纳米抗体的功能。
实施例2在体内表征所述双表位纳米抗体aSE4-1的Fc融合蛋白对小鼠肿瘤的治疗效果
因为体外的结合和抑制试验都证明了双表位抗体的结合抗原的能力和竞争性结合配体的能力都比单表位的抗体要好。所以本发明用双表位抗体进行了治疗效果的衡量。在进行小鼠体内实验时，因为之前构建的双表位抗体连接的是人IgG1Fc，在小鼠实验时换成了小鼠Fc，进行后续的动物实验。
此实验在SPF级动物实验室开展，评估抗体在C57BL/6小鼠(江苏集萃药康生物科技公司NO.N000295)体内对肿瘤的治疗效果(操作步骤参见图7A)。为评估治疗效果，按照图7A的免疫方法，首先构建小鼠肿瘤模型，待肿瘤生长到一定体积后，免疫抗体(10mg/kg剂量，合计体积200μL)注射到C57BL/6小鼠腹腔中，对照组分别为Fc和PBS，在治疗过程中，每两天用游标卡尺测量小鼠肿瘤体积。待肿瘤生长到一定体积后，将小鼠安乐死并剖杀，取小鼠肿瘤块，称量肿瘤块的重量。给药组每组包含15只小鼠，未给药的对照组包含15只小鼠。结果如图7B、C所示，相比于对照组，使用双表位抗体治疗组，肿瘤生长显著低于对照组，肿瘤的重量也显著低于对照组。用纳米抗体治疗组相比于对照组(给予PBS对照组)，肿瘤生长的速度减缓，最终的肿瘤体积是抗体治疗组的3倍，同时称量小鼠的肿瘤重量，抗体治疗组较对照组PBS组，肿瘤重量是治疗组的2倍。说明双表位抗体有一定对结直肠癌肿瘤的治疗效果。统计检验方法是t检验，*表示显著性差异P小于0.05，**表示显著性差异P小于0.01，***表示显著性差异P小于0.0001。
按照图7D所述的免疫方式，构建MB49膀胱癌皮下瘤模型，待肿瘤长成后，免疫双表位抗体和对照组Fc和PBS，免疫抗体(10mg/kg剂量，合计体积200μL)注射到小鼠(集萃药康)腹腔中。每隔两天使用游标卡尺测量小鼠的肿瘤体积，待肿瘤生长到一定体积后，将小鼠安乐死并剖杀，取小鼠肿瘤块，称量肿瘤块的重量。给药组每组包含15只小鼠，未给药的对照组包含15只小鼠。*表示显著性差异P小于0.05，**表示显著性差异P小于0.01，****表示显著性差异P小于0.0001。相比于对照组，使用双表位抗体治疗组，肿瘤生长显著低于对照组，肿瘤的重量也显著低于对照组。在肿瘤增长过程中，相比于对照组PBS组，肿瘤增长速度减缓，最终的肿瘤体积，PBS组为治疗组的3倍，同时PBS组肿瘤重量为治疗组的2倍。说明双表位抗体有一定对膀胱癌肿瘤的治疗效果。统计检验方法是t检验，*表示显著性差异P小于0.05，**表示显著性差异P小于0.01，***表示显著性差异P小于0.0001。
序列
SEQ ID NO:1aSE1的CDR1
GLTFDHYAM
SEQ ID NO:2aSE1的CDR2
GVSCISISNSS
SEQ ID NO:3aSE1的CDR3
ATVDGGRAWCSPLWARSTYD
SEQ ID NO:4aSE4的CDR1
GSTFSANPI
SEQ ID NO:5aSE4的CDR2
LVAVIHSGGD
SEQ ID NO:6aSE4的CDR3
NAFNSLNGRPLSS
SEQ ID NO:7aSE12的CDR1
GLTFDYYAM
SEQ ID NO:8aSE12或aSE17的CDR2
GVSCISVSNSS
SEQ ID NO:9aSE12的CDR3
ATVDGGRGWCSPLWARSSYD
SEQ ID NO:10aSE17的CDR1
GLTFDQYAM
SEQ ID NO:11aSE17的CDR3
ATVDGGRGWCSPLWARANYD
SEQ ID NO:12aSE1的氨基酸序列
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGLTFDHYAMRWFRQAPGKEREGVSCISISNSSTYYAESVKGRFTVSRDSAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYHCATVDGGRAWCSPLWARSTYDDDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:13aSE4的氨基酸序列
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTFSANPIGWYRQSPGKQRELVAVIHSGGDTNYIPSMKGRFTISRDNAKNMVYLQINNLKPEDTAVYYCNAFNSLNGRPLSSWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:14aSE12的氨基酸序列
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGLTFDYYAMRWFRQAPGKEREGVSCISVSNSSTYYADSVKGRFTISRDDAKNTVYLEMNSLKPEDTAVYYCATVDGGRGWCSPLWARSSYDDDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:15aSE17的氨基酸序列
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLTFDQYAMRWFRQAPGKEREGVSCISVSNSSTYYSDSAKGRFTISRDDAKNTVYLEMNSLKPEDTAVYYCATVDGGRGWCSPLWARANYDDDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:16SiglecE的胞外域的氨基酸序列，aa 19-353
QNPQEVFTLNVERKVVVQEGLCVLVPCNFSYLKKRLTDWTDSDPVHGFWYREGTDRRKDSIVATNNPIRKAVKETRNRFFLLGDPWRNDCSLNIREIRKKDAGLYFFRLERGKTKYNYMWDKMTLVVTALTNTPQILLPETLEAGHPSNLTCSVPWDCGWTAPPIFSWTGTSVSFLSTNTTGSSVLTITPQPQDHGTNLTCQVTLPGTNVSTRMTIRLNVSYAPKNLTVTIYQGADSVSTILKNGSSLPISEGQSLRLICSTDSYPPANLSWSWDNLTLCPSKLSKPGLLELFPVHLKHGGVYTCQAQHALGSQHISLSLSPQSSATLSEMMMGT
SEQ ID NO:17SiglecE的胞外域的可变V结构域的氨基酸序列
PQEVFTLNVERKVVVQEGLCVLVPCNFSYLKKRLTDWTDSDPVHGFWYREGTDRRKDSIVATNNPIRKAVKETRNRFFLLGDPWRNDCSLNIREIRKKDAGLYFFRLERGKTKYNYMWDKM
SEQ ID NO:18SiglecE的胞外域的恒定结构域C1的氨基酸序列
PQILLPETLEAGHPSNLTCSVPWDCGWTAPPIFSWTGTSVSFLSTNT TGSSVLTITPQPQDHGTNLTCQVTLPGTNVSTRMTIRLNVS
SEQ ID NO:19SiglecE的胞外域的恒定结构域C2的氨基酸序列
PKNLTVTIYQGADSVSTILKNGSSLPISEGQSLRLICSTDSYPPANLSWSWDNLTLCPSKLSKPGLLELFPVHLKHGGVYTCQAQHALGSQHISLSLS
SEQ ID NO:20小鼠Fc氨基酸序列
PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO:21人Fc氨基酸序列
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:22SiglecE的全长氨基酸序列
QNPQEVFTLNVERKVVVQEGLCVLVPCNFSYLKKRLTDWTDSDPVHGFWYREGTDRRKDSIVATNNPIRKAVKETRNRFFLLGDPWRNDCSLNIREIRKKDAGLYFFRLERGKTKYNYMWDKMTLVVTALTNTPQILLPETLEAGHPSNLTCSVPWDCGWTAPPIFSWTGTSVSFLSTNTTGSSVLTITPQPQDHGTNLTCQVTLPGTNVSTRMTIRLNVSYAPKNLTVTIYQGADSVSTILKNGSSLPISEGQSLRLICSTDSYPPANLSWSWDNLTLCPSKLSKPGLLELFPVHLKHGGVYTCQAQHALGSQHISLSLSPQSSATLSEMMMGTFVGSGVTALLFLSVCILLLAVRSYRRKPARPAVVAPHPDALKVSVSQNPLVESQADDSSEPLPSILEAAPSSTEEEIHYATLSFHEMKPMNLWGQQDTTTEYSEIKFPQRTAWP
SEQ ID NO:23羊驼VHH特异性引物1
AGCAGCCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAG
SEQ ID NO:24羊驼VHH特异性引物2
CCATAGCAGGCTGTGCAGCATAGAAAGGTACCACTAAAGGAATT GC
SEQ ID NO:25引物1
GTCAAGCTGCTCTCTGGGCGTCTACCAGGTGCAGCTCGTGGAGT CTGGGG
SEQ ID NO:26引物2
CCTTGGAAATAAAGATTCTCAGAACCTCTAGATGAGGAGACGGT GACCTGGGTCCC
SEQ ID NO:27信号肽的氨基酸序列
ASPFALLMVLVVLSCKSSCSLG
SEQ ID NO:28TEV酶切位点的氨基酸序列
ENLYFQGS
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.抗体或其抗原结合片段，其优选特异性结合SiglecE胞外域，优选所述抗体或其抗原结合片段源自羊驼，优选地，所述抗体为仅包括重链抗体的纳米抗体，其特征在于，所述抗体包含：
CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；
CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；和
CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括选自如下组的序列：
(a)如SEQ ID NO:1所示的CDR1，如SEQ ID NO:2所示的CDR2和如SEQ ID NO:3所示的CDR3；
(b)如SEQ ID NO:4所示的CDR1，如SEQ ID NO:5所示的CDR2和如SEQ ID NO:6所示的CDR3；
(c)如SEQ ID NO:7所示的CDR1，如SEQ ID NO:8所示的CDR2和如SEQ ID NO:9所示的CDR3；和
(d)如SEQ ID NO:10所示的CDR1，如SEQ ID NO:8所示的CDR2和如SEQ ID NO:11所示的CDR3。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括选自如下组中的一个或多个的序列：
(a)如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；
(b)与如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(c)如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；
(d)与如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(e)如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；
(f)与如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(g)如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；
(h)与如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其进一步包含Fc结构域，优选人Fc结构域和小鼠Fc结构域，其中人Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，小鼠Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
5.双表位抗体，其(例如以N端到C端的顺序)包括两个根据权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段相互结合，所述纳米抗体或其抗原结合片段之间用接头序列(例如柔性多肽链，例如GS接头，优选(GGGGS)4接头)连接。
6.多核苷酸，其编码根据权利要求1-4中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的双表位抗体。
7.表达载体，其包含根据权利要求6所述的多核苷酸。
8.宿主细胞，其包含权利要求7所述的表达载体或权利要求6所述的多核苷酸，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，例如细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
9.药物组合物，其含有权利要求1-4中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的双表位抗体，以及药用载体。
10.权利要求1-4中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的双表位抗体在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，优选地，所述肿瘤选自结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、头颈癌、乳腺癌、食管癌、口腔癌、舌癌、牙龈癌、肝癌、骨癌、胃癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、甲状腺癌和脑癌。
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